Effets des fongicides, nabame et zinebe, sur l'activite des oxygenases et sur la teneur en thiolates dans les microsomes hepatiques du rat

Fd Co,wwr. Jmiwl. Vol. 19. pp. 761 to 763. 1981 Printed in Great Britain. All rights reserved

Copyright

0015-6264 81;060761-03SO2.0@0 0 I981 Printed in Great Britain

EFFETS DES FONGICIDES, NABAME ET ZINEBE, SUR L’ACTIVITE DES OXYGENASES ET SUR LA TENEUR EN THIOLATES DANS LES MICROSOMES HEPATIQUES DU RAT . N.

MILADI,

S. ATT&BA.

E. D~~H-PRIKI,

C. DESFONTAINES

et R. ALBRECHT

Laboratoire de Biologie et Institut Scientifque et Technique de fA/imentotion National des Arts et M&tiers,292 rue Saint Martin, 75141 Paris Cedex

(Recu

le 9 mars

du Conservutoire 03. France

1981)

R&sum&L’ingestion unique (1 mmol/kg poids corporel)du fongicide nabame ou zinbber&W, aprbs 24 h, les biotransformations de I’aminopyrine et de i’aniline dans les microsomeshtpatiques de rat. L’effet du nabameest plus pronon& que celui du zinibe. Les fongicidesabaissentla teneur en P-450 et induisent la formation de I’esptceinactiveP-420. Notre expCriencene permet pas de r&vbler une liaison des dithiocarbamates

aux restes cysteine de l’h6moprottine.

Abstract-A single oral dose of nabam or zineb (I mmol/kg body weight) causes, in 24 hr. a reduction in the biotransformation of aminopyrine and of aniline in the hepatic microsomes of the rat. The effect of nabam is more pronounced than that of zineb. Both fungicides reduce the level of P-450 and induce the formation of the inactive P-420. Our findings do not establish any linking of the dithiocarbamates to the cysteine residues of the haemoprotein.

Introduction

Les dithiocarbamates constituent un groupe chimique important en phytopharmacie comprenant, outre de nombreux fongicides, des herbicides et des insecticides. Les dithiocarbamates fongicides remplacent de plus en plus les produits minCraux, soufrCs et cupriques (Fishbein, 1976). Le nabame est le 1,2GthjGnebis(dithiocarbamate) disodique. Tres phytotoxique, il n’est commercialise que pour deux emplois bien dtfinis: la lutte contre le mildiou du poivron et la destruction des algues dans les riziQes. Chez le rat, la DLso par voie orale, est 395 mg/kg (Blackwell Smith, Finnegan, Larson, Sahyoun, Dreyfuss & Haag, 1953). La dose journal&e maximum admissible pour I’homme (acceptable daily intake) est de 5 pg/kg (FAO/OME. 1975). Le zinkbe est le 1,2kthyl&ebis(dithiocarbamate) de zinc. Dans la pratique phytosanitaire, on I’utilise contre le mildiou et le black-ror de la vigne, le mildiou de la pomme de terre, les tavelures des arbres fruitiers B p&pins. la cercosporiose du bananier et les maladies des cultures legumibes. La toxicitt aigue de ce dithiocarbamate est trb faible puisque la DL5,,. par voie orale. chez le rat, est iuperieure d 5200 mg/kg (Blackwell Smith et a/. 1953). Une Ctude de Kurbat (1968) suggQe cependant que la toxicite serait plus elevke chez le lapin. Le zinhbe, g forte dose et g plus long terme, peut provoquer une hypertrophie et une hyperplasie thyrdidiennes (Ivanova, Sheytanov & MoshevaIzmirova, 1967) et des adtnomes du poumon (Chernov & Khitsenko, 1969). et il peut prtsenter des effets ttratogenes (Ryasanova, 1967). La dose journalitre 761

admissible pour I’homme est de 5 pg/kg (FAO/OMS, 1975). Dans le prCsent travail. nous ttudions les effets d’une ingestion unique de nabame ou de zinbbe (ou de Zn+ ’ ) sur I’activitt des enzymes dkpendantes du P-450 dans les microsomes hCpatiques du rat. M&odes

expbimentales

Les animaux (36 individus) sont des rats miles Sprague-Dawley Pg& de 10 semaines (poids moyen 231.5 f 2,96g). IIs sont rtpartis en deux groupes: ttmoin et trait& Le traitement consiste en I’ingestion de nabame. zintbe ou ZnCl, g raison de 1 mmol/kg poids corporel. Le nabame et le ZnCl, sont dissous dans I’eau; le zinhbe, insoluble, est administrC en suspension dans du carboxymCthylcellulose a 0.5%. Aprts 24 h, nous tuons les animaux par ponction cardiaque et prCparons les microsomes htpatiques suivant le proctdC que nous avons dtcrit (Albrecht. Pelissier, Manchon & Rospars, 1973). Nous appr& cions dans ces microsomes la teneur en protkines, les activitts de I’aminopyrine N-dCmCthylase(APDM) et de I’aniline hydroxylase (AH) (cf. Ptlissier, Faudemay, Manchon & Albrecht, 1978), les concentrations des cytochromes P-450 et P-420 (Omura & Sato, 1967) et les quantitCs de thiolates prottiques (Sedlak & Lindsay, 1968). Resultats et Discussion

Anttrieurement. nous avons notC que. chez le rat. I’ingestion quotidienne de 0,15 mmol de zin&be/kg

762

N.

MILADI,

S. AI-T~BA,

E. DCXBH-PRIKI.

poids corporel pendant 4 semaines,rlilentit les biotransformations de l’aminopyrine et de l’aniline; l’ingestion totale correspondait g 4,2 mmol/kg (Pklissier, Faudemay, Dooh-Priso, Atttba & Albrecht, 1981). Par la prtsente exp&ience, nous constatons un effet semblable de ce fongicide lors d’une administration orale unique, g raison de 1 mmol/kg poids corporel (Tableau 1). Le zinkbe Ctait le seul dithiocarbamate fongicide pour lequel on ait signalt une diminution des activitCs des oxygbnasesmicrosomales hbpatiques. Nous montrons que son homologue disodique, le nabame, donnC en quantite Cquivalente. prksente aussi cette proprittt; il faut mbme noter que les effets de ce demier sont plus prononcts: on voit sur le Tableau 1 que le zinebe ne diminue pas significativement l’activitt de I’APDM alors que le nabame l’abaisse de -23% (P c 0.05); en ce qui concerne I’AH, les diminutions sont respectivement de -28 et -49% (P < 0,Ol). On sait que le zinkbe administrt par voie orale est peu absorb6 par le tractus gastrointestinal (Blackwell Smith et al. 1953). Ceci suggtre que leseffets plus accent& du nabame rksultent probablement en partie de sa meilleure absorption (Falk. Thompson & Kotin, 1965). Les diminutions d’activit& enzymatiques, sous I’effet des deux fongicides, varient selon le type de subs&at. L.e metabolisme de la molCcule de type II, aniline, est plus affecte que celui de type I, aminopyrine-par exemple, avec le nabame: APDM -23% (P < 0,05) et AH -49% (P < 401). Nous confirmons ainsi un travail anttrieur du laboratoire (Lowy, Albrecht, Ptlissier & Manchon, 1977; Ptlissier et al. 1978). De mime Zemaitis & Greene (1978) ont not6 que le disulfure de tttramtthylthiurame et le disulfirame administrks au rat per OS,g taison de 1 g/kg, rtduisent l’hydroxylation de l’aniline mais n’ont pas d’effet sur le mCtabolisme de Whylmorphine (type I). Chvapil, Ludwig, Sipes & Misiorowski (1976) ont remarquk que l’addition de Zn+ + g des microsomes h6patiques conduit g une diminution de I’activitk de I’AH (Is0 = 60~). Etant donnt que le zinebe comPorte du zinc dans sa molCcule, nous nous sommes PO&Sla question: l’effet inhibiteur du fongicide sur les oxygknasesne provient-il pas en partie de la prtsence de Zn dans sa mol&cule? Par ce travail nous constatons que l’administration per OSde Zn+ + (1 mmol/kg) ne modifie jamais l’activitt des enzymes Ii&es au P-450.

Tableau 1. ActivitPs

C. DESFONTAINES

APDM

Tkmoins Nabame Tkmoins Zin&e

0.790 + 0.0454 0.609 f 0,0565*

des microsomes

Ttmoins

Zn++ -- - __--

0,681 f 0,0341 0,751 + 0,0658 0,584 f 0.0515 0.543 f 0.0569

hhpatiques

P-450

P-420

(nmol/mg prottines)

AH 0,539 0.277 0.603 0.433 0,743 0.673

R. ALBRECHT

Vingt quatre heures aprb I’administration des deux .fongicides (1 mmol/kg), nous remarquons une baisse sensible de la teneur en P-450 (nabame -37%, P < 0,Ol; zintbe - 16x, P < 0.05). Signalons que, comme pour le mttabolisme de l’aminopyrine et de I’aniline, le nabame prCsente davantage d’effet. Une moindre teneur en P-450 signifie un ralentissement de sa biosynthtse etfou une ac<ration de sa dt!gradation. I1 apparait que les deux mCcanismes puissent intervenir. En effet, rCcemment Yoshida 8c Neal (1978) ont clairement ttabli que I’ingestion d’EBIS (sulfure d’tthyltnebis-(2-nitrobenzkne), un des principaux mttabolites des dithiocarbamates fongicides, rCprime in vivo la &aminolCvulinate synthttase dont on connait le rble rtgulateur dans la voie de la biosynthkse de l’heme (Granick & Urata, 1963; Marver, Collins, Tschudy & Rechcigl. 1966). D’autre part, le mCtabolisme des dithiocarbamates lib&e in situ du soufre kltmentaire (Hunter & Neal, 1975). Or le soufre trts Clectrophile peut se lier aux sites nuclCophiles des microsomes, vraisemblablement au P-450 qu’il dCnature (formation de P-420) et/au meme detruit (Dalvi, Hunter & Neal, 1975; Savolainen, Jlrvisalo & Vainio, 1977). Dans notre travail, nous montrons que les deux fongicides induisent la formation du P-420. On connait ma1 le mCcanismede denaturation du P-450 en sa forme inactive P-420, mais on suppose qu’il met en jeu l’environnement hydrophobe voisin de I’htmine (Imai & Sate. 1966). Toujours g propos du catabolisme du P-450, sous l’effet des dithiocarbamates fongicides. il serait intkressant de determiner I’activitt de l’hime-oxygknase, ce qui, B notre connaissance, n’est pas signal6 dans la IittCrature. En 1978, Yoshida & Neal indiquaient qu’in vitro les dithiocarbamates (plus exactement leur mCtabolite EBIS) rtagissent avec les groupes thiolates de la cysteine du P-450. Albrecht (1979) a propost aussi ce type de rtaction pour le zinkbe lui-mime. D’aprb le Tableau 1, le traitement par les fongicides ne parait pas modifier la quantitt de -SH protCique des microsomes. Cela suggire qu’in vivo, il n’y aurait pas de liaisons dithiocarbamate-cysttine. Cependant. notre mesure de thiolate Porte sur I’ensemble des prottines microsomales et on ne peut exclure l’existence d’une liaison (non dCtectable dans I’exp&rience) pour une esptce particuliire de prottine. Par exemple. ii faudrait pouvoir isoler et purifier le P-450 puis diterminer le nombre de -SH de I’hCmoprotCine chez I’animal.

Activitt (nmol/min/mg prottines) Traitement

et

(nmol/mg protkines)

-SH (nmol/mg protbines)

f 0.0201

0,812 + 0.0282

Traces

46.6 + 3.61

k 0.0146**

0,511 f 0,0265**

0,161 + 0.0266

41.3 k 1.65

f 0.0184 + 0,0184**

0,665 0,557 0,760 0,703

Traces 0,102 f 0.0260 Traces Traces

62.1 67.1 48,l 44.5

f 0,0441 f 0.0171

APDM = ~--L’aminopyrine.-. N-dtmkthylase -___

f + k f

0,035O 0.0221’ 0.0246 0.0231

AH = L’aniline hydroxylase < 0,05 et **P < 0.01 (test F).

Chaque valeur est la moyenne,&art-type sur la moyenne(sixrats/groupe):l P

f 2.47 &- 2.81 k 2.19 k 2.46

Nabame. zintbe et l’activitd des oxygenases ttmoin et chez celui trait6 par les pesticides. Une telle Ctude, rcalisable grice aux acquis techniques de ccs dernibes annCes, dkpasse cependant l’objet du present travail. Cette recherche sera ulterieurement complCtCe par des essais in vitro de manibe B prtciser si I’effet de I’ingestion des dithiocarbamates rtsulte dune dtgradation du P-450 et dune inactivation des sites de type II ou s’il est dO a la persistance dans le foie du fongitide (ou d’un metabolite) agissant comme inhibiteur compCtitif lors des essais enzymatiques. Signalons seulement que nous avons constate (Albrecht, 1979) que I’addition de zinebe a des microsomes de foie de rats non trait& peut directement rtduire I’activitt de I’AH (temoin 7,525 f 0,060O nmol/min/g foie; zintbe (0.01 mM) 7.06 f O,134nmol/min/g foie. P < 0.01; zinebe (0.1 KIM) 5.330 + 0,0645 nmol/min/g foie, P < 901). REFERENCES

Albrecht. R. (1979). Influence des Pesticides, Lindane et Zinebe, sur les Monoxygtnases Microsomiques du Foie chez le Rat. These Doctorat d’Etat es-Science. Universite Paris VII. Albrecht. R.. Pelissier. M. A.. Manchon. Ph. & Rospars, J. P. (1973). Obtention de microsomes par coprecipitation avec Ca+ + et mise en evidence d’induction enzymatique par le phenobarbital. C.r. S&c. Sot. Biol. 167. 1552. Blackwell Smith, R.. Jr. Finnegan, J. K.. Larson, P. S.. Sahyoun. P. F.. Dreyfuss, M. L. & Haag, H. B. (1953). Toxicologic studies on zinc and disodium ethylene bisdithiocarbamates. J. Phurmuc. exp. Ther. 109, 159. Chernov. 0. V. Kc Khitsenko. I. I. (1969). Blastomogenic properties of some derivatives of dithiocarbamic acid. Vop. Onkol.

15, 71.

Chvapil. M., Ludwig, J. C., Sipes, I. G. & Misiorowski. R. L. (1976). Inhibition of NADPH oxidation and related drug oxidation in liver microsomes by zinc. Eiochem. Phurmac. 25, 1787. Dalvi. R. R.. Hunter. A. L. & Neal. R. A. (1975). Toxicological implications of the mixed-function oxidase catalyzed metabolism of carbon disulphide. Chemico-Biol. Interactions

10. 349.

Falk, H. L.. Thompson, S. J. & Kotin. P. (1965). Carcinogenic potential of pesticides. Archs encir. Hlth IO, 847. FAO/OMS (1975). Rtsidus de Pesticides dans les Denrtes Alimentaires: Rapport de la Reunion Conjointe du Groupe de Travail FAO d-Experts des Rtsidus de Pesticides. tenue en 1974. Etudes aaricoles de la FAO, no. 97; OMS serie de rapports techn&es no. 574. Fishbein. L. (1976). Environmental health aspects of fungi-

763

tides I. Dithiocarbamates. J. Toxicol. enuir. Hlth 1, 713. Granick, S. & Urata, G. (1963). Increase in activity of b-aminolevulinic acid synthetase in liver mitochondria induced by feeding of 3.5-dicarbethoxy-l&dihydrocollidine. J. biol. Chem. Us. 821. Hunter, A. L. & Neal, R. A. (1975). Inhibition of hepatic mixed-function oxidase in vitro and in uivo by various thiono-sulfur-containing compounds. Biochem. Pharmac. 24,2199.

Imai, Y. & Sate. R. (1966). Substrate interaction with hydroxylase system in liver microsomes. Biochem. biophys. Res. Commun.

22,620.

Ivanova. L., Sheytanov. M. & Mosheva-Izmirova. N. (1967). Changes in the functional state of thvroid eland upon acute intoxication with certain dithiocarbamates. Zineb and Maneb. C.r. Acad. bulg. Sci. 20, 1011. Kurbat. N. M. (1968). Etfect of ethylenebis-dithiocarbamates on the blood and hematopoietic organs of animals. Z. Dracookhr. Bieloruss. 2, 49. Lowy. R., Albrecht, R.. Ptlissier, M. A. & Manchon, Ph. (1977). Determination of the “no-effect levels” of two pesticides, lindane and zinebe, on the microsomal enzyme activities of rat liver. Toxic. appl. Pharmac. 42, 329.

Marver. H. S.. Collins, A., Tschudy, D. P. & Rechcigl, M., Jr (1966). &Aminolevulinic acid synthetase. II. Induction in rat liver. J. biol. Chem. 241. 4323. Omura, T. & Sato, R. (1967): Isolation of cytochromes P450 and P420. Meth. Enzymol. 10,556. Pelissier. M. A., Faudemay, F.. Manchon, Ph. & Albrecht. R. (1978). Induction par le lindane des monoxygtnases microsomales du foie chez le rat: elfets dun regime hypocalcique. Fd Cosmet. Toxicol. 16, 27. Pelissier, M. A., Faudemay, F., Dooh-Priso. E.. Atttba. S. & Albrecht, R. (1981). Diminution par un dithiocarbamate fongicide, le Zintbe, de l’activitt des oxygenases microsomales du foie chez le rat: effets dun regime a 9% de caseine. Fd Cosmet. Toxicol. 19, 357. Ryasanova. P. H. (1967). Effect of the chemical poisons Ziram and Zinebe on the reproduction function of experimental animals. (En russe). Gig. Sanit. 2. 26. Savolainen, H., Jlrvisalo. J. & Vainio. H. (1977). Specific binding of CSz metabolites to microsomal proteins in rat liver. Acta pharmac. tax. 41. 94. Sedlak, J. & Lindsay, R. H. (1968). Estimation of total. protein-bound and nonprotein sullhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent. Analyt. Eiochem. 25, 192. Yoshida, T. & Neal, R. A. (1978). Effect of ethylenebisdiisothiocyanato sulfide (EBIS) on mouse liver &aminolevulinic acid synthetase. Toxic. appl. Pharmuc. 46, 339. Zemaitis, M. A. & Greene, F. E. (1978). In ciao and in vitro effects of thiuram disulfides and dithiocarbamates on hepatic microsomal drug metabolism in the rat. Toxic. appl.

Pharmac.

48, 343.