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Methodologie simple de separation et de purification de l'antigene de surface de l'hepatite B a partir du serum
59
Ctinica Chimica Acto, 74 (1977) 59-69 0 Elsevier/North-Holland Biomedical Press
CCA 8191
METHODOLOGIE SIMPLE DE SEPARATION L’ANTIGENE DE SURFACE DE L’HEPATITE
G. DESMET
et J.L.
BOITIEUX
Laboratoire de Biochimie Pathologiqu~, 80036 Amiens Cedex (France) (Received
July
lst,
ET DE PURIFICATION DE B A PARTIR DU SERUM
FacultC
de Mkdecine,
rue Frkdkic
Petit,
1976)
Summary A simple method for the separation and purification of the surface antigen of hepatitis B from serum The present report describes a simple, rapid and reproducible procedure for preparation of hepatitis B surface antigen from human positive sera, with a satisfactory yield. After removal of fl- and a-lipoproteins by dextran sulphate precipitation and subsequent removal of IgM and a part of the other serum proteins by dialysis against distilled water, the supernatant obtained presents almost no change in its surface antigen content. After passing this solution through a molecular sieve of Biogel A-5 m, the surface antigen is detected in a well-defined peak. The fraction corresponding to this peak is collected in its totality. After lyophilization, it is passed through a molecular sieve of CPG 10, in phosphate buffer; this allows recovery of a substance which has retained its structural as well as its antigenic properties, and which is intact and practically free of any serum contamination.
Introduction La separation de l’antigene Australia [l] ou antigene de surface du virus de I’hepatite B (HB,Ag) a partir de &rums positifs et sa purification ont don& lieu 1 de multiples publications. La plupart des pro&d& permettant une purification satisfaisante de cet antigene extrait, le plus souvent, h partir de serums de sujets atteints d’hepatite virale B, necessite une ultracentrifugation en gradient de densite [ 2-71 mais le rendement est faible. Les methodes utilisant le tamisage moleculaire avec ou sans precipitations selectives se sont revelkes, jusqu’b present, peu efficaces, et de nombreuses astuces techniques ont 6th
necessaires pour ameliorrr la purification, w, au d&rimcAnt, du wndement 17,8/. Alors que la plupart des techniques chromatographiques sont longues, dklicates et peu rentablrs, la mkthodologie que nous proposons s’av+rc rapid{> et simple, et le rendement satisfaisant. Apres klimination de la totalit des a- et des fl-lipoproteinrs, puis drs 1gM et d’une partie apprkciable d’IgG, IgA et cr,-macroglobulinfa, les &rums sent’ soumis 5 une double chromatographie de gel filtration rkalisk sur Biogel A-5 m et sur billes de verre CPG-10. Notre ktude Porte parall&lement sur drs serums positifs (HBsAg’) et sur des &rums normaux (SHN). Matkriel
et mkthodes
1. Elimination des a- et des /3-lipoprote’ines, et des euglobulines Nous utilisons un pool skrique (P.S.) d’une positivitk en antigene
supkrieure a l/32. Nous prkcipitons les cr- et /3-liprotkines selon la technique de Castaigne et Amselem [ 91, par le sulfate de Dextrane en prksence de chlorure de calcium. Aprk centrifugation, le surnageant est soumis ti une dialyse de douze heures contre de l’eau distillbe, ce qui permet l’klimination des euglobulines et en particulier, des IgM. 2. Filtration
sur gels Chromatographie sur Riogel A-5 m, de 100 i 200 mesh
(Biorad-Richmond, U.S.A.) [lo]. Le gel se prtkente sous forme d’une suspension dense de perles; il est diluk dans un tampon Tris 0.1 M/chlorure de sodium 1 M, pH 8.2, dkgaz6 et versk dans une colonne de 1 m&re de hauteur sur 2.5 cm de diam&re. La colonne est stabilike par passage du tampon pendant 12 h. Le dkbit est de 1.5 ml/min. Nous amkliorons la &solution en remplissant le fond de la colonne de CPG-10,200-400 mesh, sur une hauteur de 2 cm. Chromatographie sur CGP-10, 120-200 mesh, (controlled Pore Glass Electro-Nucleonics Inc., U.S.A.). Elle est &ali&e en colonnes de 50 cm de hauteur sur 1 cm de diam&re, en tampon phosphate 0.2 M, pH 7.0. Le dkbit est de 1 ml/min. 3. Dosage des prote’ines totales Les prothines sont do&es selon la technique classique automatiquement 6 l’aide d’une chaine colorimktrique.
du biuret
[ 11 J rkalisbe
4. Electrophortise en gel de polyacrylamide-agarose Les skparations sont rhaliskes sur plaques de gel de polyacrylamide-agarose (P.A.A.) i 4 pour 100 selon la technique d’Urie1 [ 121. Les khantillons, d’une concentration protkique comprise entre 3 et 6 g/l, sont dkposks dans le gel apres dilution au demi dans de l’agarose fondue. Les protknes sont &v&es par le Bleu Coomassie 2 2.5 pour 1000. Les lipoprotkines sont mises en kvidence apr& coloration par le Noir Soudan [ 13). 5. Ultracentrifugation La puretk de la prkparation
de HB,Ag
est contrGlGe
par ultracentrifugation
61
(U.C.) realisee dans une ultracentrifugeuse Beckman analytique L350 a la vitesse de 50 000 tours/min (160 000 X g), i 15°C. La fraction soumise a l’ultracentrifugation a ete lyophilisee-puis resolubilisee dans un tampon phosphate 0.2 M, pH 7.0,1 une concentration de 15 mg/ml. 6. Microscopic e’lectronique L’etude en microscopic electronique (M.E.) de nos fractions a 4th &ah&e apres “coloration negative” par l’acide phosphotungstique a 5%. Les examens sont realises au microscope electronique Siemens Elmiskop JA. i 80 kV. 7. Techniques immunologiques Analyse immunoe’lectrophorktique (AIE). Elle est realisee selon la technique de Grabar et Williams [14] adapt&e i la micromethode par Scheidegger [15] en gel d’agar (Agar Noble Batco-Difco Laboratories, U.S.A.). Nous utilisons un immunserum anti-serum humain normal de 1’Institut Pasteur (AS. antiSHN) et un immundrum anti-HB,Ag de mouton fourni par les laboratoires BDMerieux (A.S. BD). L’e’lectroimmunodiffusion (EID), selon la technique adaptee par Prince et Burke [ 161 permet la mise en evidence de HB,Ag ainsi que la determination du titre de nos preparations. Rdsultats Pour suivre les diverses &apes de separation et de purification de l’antigene de surface, nous faisons appel a l’electrophorese en gel de P.A.A. a 4 p. 100, permettant la mise en evidence des particules HB,Ag’ dans une zone sit&e entre l’a2-macroglobuline et le lieu de depot, en fonction de leur poids moleculaire. La presence, dans cette zone fortement coloree par le Noir Soudan, de fllipoproteines et d’IgM, nous a conduit a envisager, en un premier temps, une precipitation selective des lipoproteines, puis, des euglobulines. P.S. HB,Ag’ est precipite par le sulfate de Dextrane a haut poids moleculaire en presence de chlorure de calcium, (Tableau I), ce qui permet l’elimination des P-lipoproteines et des a-lipoproteines, mais aussi d’une fraction non negligeable d’oc,-macroglobuline, de serum-albumine et d’immunoglobulines (IgG, IgA, IgM). Le precipite P1 correspond h 12 pour 100 des proteines de P.S. La recherche de l’antigene de surface dans P1 s’avere negative. La dialyse du surnageant S, permet d’eliminer, en plus des IgM, une partie appreciable d’IgG, IgA, de serum albumine, ainsi que de glycoproteides migrant dans la zone haptoglobuline-siderophiline (Fig. l), sans modification appreciable du titre antigenique. L’A.1.E. confirme la purification de l’antigene de surface (Fig. 2). Parmi les immunoglobulines, nous retrouvons dans SZ des IgG et des IgA, les IgM etant pratiquement eliminees. L’cr*-macroglobuline reste le contaminant majeur de S 2. Apres dialyse contre Tampon Tris 0.1 M/NaCl 1 M, pH 8.2, SZ est soumis a une filtration sur Biogel A-5 m. Le tamisage moleculaire permet d’individuali-
62
TABLEAU
I
ELIMINATION
DES
LIPOPROTEINES
ET
DES
EUGLOBULINES
DU
POOL
SERIQUE
POSITIF
(P.S.
HBsAg+)
P.S.
HB,Ag+
ProtGines
“S2
contre
en
Titre
3.4%
‘P2 Dialyse
totales
( ,1/32)
0
H20
_-_________
84.6%
____.__.__
>1,32
ser un pit F, positif, la quasi totalite des proteines dans la fraction Fii Fig. 3). La fraction F, riche en antigene de surface est see et reprise dans un tampon phosphate 0.2 fraction par electrophorese (Fig. 4) et par A.I.E. croglobulines et de traces d’immuno-globulines glycoproteides. En gel de P.A.A. a 4 pour 100, etre individualisees: une zone dtroite, nette, sit&e
seriques
recueillie en totalite, lyophiliM, pH 7.0. L’ktude de cette montre la presence d’a,-ma(IgG et IgA) et d’cu I et cy2deux zones Hb,Ag’ peuvent au-dessus de la source, faible-
SHN Fig.
1. Electrophorbe
en gel de P.A.A.
d 4 pour
100
de P.S.
de S, se retrouvant
HB,Ag’et
f?S
des fractions
S1.
PI,
S2 et P2,
ique
Fig. 4. Electrophoke en gel de P.A.A. E‘I obtenue d park de SIIN.
a 4 pour 100 de S2 et de F1 positifs.
Comparison
aved la fraction
ment positive, et une zone diffuse, large, fortement positive, situ& entre cette derniitrc, et l’a:-macroglohuline. La presence d’antigene de surface dans ces deux zones a pu etre determike apres elution des molecules antigeniques du gel frais soumis au broyage, et a des congelations et deconghlations successives. La M.E. confirme la richessc de la fraction F, en antigene de surface tout en revelant la presence de rares particules de diametre moyen de l’ordre de 43 nm, correspondant aux particules de Dane [17]. HB,Ag apparaft surtout sous forme de spherules dont le diametre est voisin de 25 nm mais on note aussi la presence de formes en Y, en halt&-es, en bdtonnets (Fig. 5). L’antigene de surface se retrouve presque quantitativement dans la fraction F, et, en M.E., les molecules apparaissent tres homogenes et non alterees. La fraction F, positive s’est r&Xe Gtre un excellent materiel pour la preparation d’immunserum anti-antigene de surface chez le lapin*, d’autant que l’obtention de cette fraction est simple, rapide et quantitativement satisfaiSante. La chromatographie de S2 obtenu a partir de SHN selon un protocole strictement calque sur celui decrit pour la preparation de SZ positif suggere que 50
65
Fig.
5.
pphkique
Etude (25
de
FI positif
nm).
en
2, particules
M.E.
(grossissement
de DANE
(43
nm).
160
000).
1. HB,Ag:
(a) forme
en bitonnet,
(b)
forme
pour 100 environ de la fraction F, positive correspond aux souillures s@riqucs dont lc constituant, majeur est l’cuz-macroglobulines. La fraction F, postitive reprise en tampon phosphate pH 7.0 est soumise j unr gel filtration sur CI’G-10. La lecture dcs fractions ~lufks 5 280 nm (Fig. 6) pclrmet d’individualiscr un pit F; exclu pkxxdmcnt, quc nous n’avons pu jusqu’i prksent caractkriser, et qui pourrait correspondre aux rares particules de DANE prkentes dans F, HB,Ag’, un pit F;, qui correspond ri l’antigknc a l’cu,-macroglobuliw et aux de surface, et une fraction F;,,, correspondant autres souillures skiqucs prkentes 2 I’Ptat de traces dans F,. La fraction positive F;, est lyophilis&l apr& dialyse et conservde en dessiccateur & 4” C. En vue de prkiser la puretk de la p&par&ion, nous avow fait appel Li des ~lectrophor~tiq~~es et immu~lo~lectrophor~ticritkes chromatographiques, ques (Fig. 7). La chromatographie de F;, positive sur CPG-10 permet d’individualiser un pit unique, r&gulier. La positivitk en antigke de surface est retrouvke dans tous les tubes 6luk. En klectrophor&e en gel de P.A.A. i 4 pour 100, la fraction F;, se &partit dans une zone comprise entre la source et I’a,-macroglobuline. Unr bande ktroite, faiblement colorke par It Bleu Coomassie, qui correspond $ une fraction HB,Ag’, comme nous l’avons montr6 aprk Alution du gel, est mise en &idence dans certaines fractions F;,. Elle semble correspondre 6 des particules positives de poids mol~cu~aires plus 6lev6, voire, 5 des particules de DANE. La coloration des gels par le Noir Soudan confirme la nature lipoprot~idique des particules.
Fig. 6. Filtration SW CPG 10 de la fraction Ft positive (-----) en tampon phosphate pH 7.0, Comparaison avec le profil chromatographique de la fraction FI obtenu i partir de SHN (- - - - - -1.
67
0.7
I
(0)
0.+
0.5 1 F E c
0.4
x UT 0.3 t
0.2r-
1I.I-I__ 123456789
.I. .1.-l 10 11 12
1 13
I_ 14
i _.1. ..L.liU 15 16 17 18 NO. de5
19
20
21
22
f raCttOnS
(b)
Fig. 7. (a) Chromatographie de F~I positive SW CPG 10 en tampon phosphate, pH 7.0. (b) Electrophorke de Fil positive en gel de P.A.A. ii 4 pour 100. fe) A.I.E. de Fil positive.
L’A.1.E. confirme l’absence de souillures proteiques d’origine serique dans F;, obtenu a partir de P.S. positif, l’immuns6rum specifique de HB,Ag (AS. BD), rev&ml l’antigene de surface sous forme d’un arc unique. L’U.C. confirme l’absence de souillure d’origine serique dans la preparation. Discussion La methodologie que nous utilisons permet une recuperation rapide et satisfaisante d’HB,Ag a partir de serums pritleves, le plus souvent, chez des donneurs de sang apparement sains. L’originalitd de notre methode vient de ce qu’elle fait appel $ des techniques simples en vue d’eliminer les constituants s&-iques souillant la plupart des preparations antigeniques, en particulier, les cu- et /3-lipoproteines, les immunoglobulines, et l’a,-macroglobuline rendant tres delicate les Btapes terminales de purification. Par ailleurs, les techniques employees sont peu cotiteuses, les gels utilids pour le tamisage moleculaire etant parfaitement recuperables. Enfin, en tours de purification, HB,Ag ne subit pas d’alteration notable, comme c’est le cas au tours des techniques utilisant une purification par l’ether [18], ainsi qu’en temoigne l’observation en M.E., et le rendement apparait satisfaisant puisque le titre en HB,Ag, ramene au volume de P.S. initial, est peu modifie. Le rendement en HB,Ag est actuellement en tours de determination. Par ailleurs, la fraction F, tres positive obtenue apres gel filtration de Sz sur A-5 m nous a permis de pr6parer un immuns~rum anti-antig~ne de surface dont le titre en anticorps semble particuli&rement &lev& L’obtention d’HB,Ag en quantitk apprkiable nous permettra de preciser le rapport entre la fraction lipidique et la fraction protidique de l’antig&e et de completer les resultats preliminaires concernant sa composition chimique. R&urn6 Notre publication decrit une mkthode simple, rapide et reproductible pour la preparation de I’antigPne de surface de l’hkpatite B i partir de serums humains positifs, avec un rendement satisfaisant. Apres elimination des cy- et ~-lipoprot~ines par precipitation par le sulfate de dextrane, puis des IgM et, p~iellement, d’autres protCines skiques par dialyse contre de l’eau distill&e, le surnageant obtenu ne prksente pratiquement pas de modification dans le contenu en antigke de surface. Apr& tamisage moleculaire de cette solution sur Biogel A-5 m, l’antig&ne de surface est detect& en un pit bien defini. La fraction correspondant a ce pit est rkup6rke en totalite. Apr& lyophilisation, cette fraction est soumise au tamisage molkulaire sur CPG-10 en tampon phosphate. Ceci permet la r&upCration d’un mat&-iel morphologiquement et antigkniquement intact et pratiquement dCpourvu de contamination serique. Remerciements Nous exprimons nos plus vifs remerciements a Madame Ribeil, directrice du Centre de Transfusion Sanguine d’Amiens, qui a bien voulu nous fournir des
69
&rums HB,Ag’, i Monsieur le Professeur Personne (U.E.R. de Science d’Amiens) pour la microscopic klectronique, ?I Monsieur le Professeur Daniel (Laboratoire de Virologie de la FacultC de MCdecine d’Amiens), pour son aimable collaboration. RCf&ences
2 Gerin, J.L., 3 Gerin, J.L., H 4 Tayot, J.L..
. H.J. et Visnich, S. (1965) J. Am. Med. Assoc. 191, 541 If. R.H., Hoggan, M.D., Holland, P.V. et Chanoek, R.M. (1969) J. Viral. 4, 763 nd, P.V. et F%rcelI. R.H. (1971) J. Virol. 7, 569 on, L.G., Tektoff, J.. Ruel, J.P. et Roumiantzeff. M. (1972) Am. J. Dis. Child 123,
5 Gerin. J.L.
3) dans Australia
(1
6 Cruceanu, A.. 7 Cherchei, G.L 9 10 11 12 13 14 15 16
Castaigne, A. Frenoy, J.P., Gomall, A.G. Uriel, J. (196 McDonald, H. Grabar, P. et Scheidegger, J Prince, A.M. e
Microbial. 20. 18 Kim, C.Y. et T
Antigen
(Prier. J.E. et Friedman,
u&r
H.. eds.). pp. 31-53,
University
R. et Deichter, H. (1973) Med. Microbial. Immunol. 159, 83 J. et Ackerman, H.W. (1974) Now. Rev. Fr. H6matoI.. 14,341 131, 359 Amselem, A. (1959) Ann. Biol. Clin. 17, 336 zafimmahaleo, E. et Bourrillon, R. (1972) Clin. Chim. Acta 42. 51 ardawill, C.J. et David, M.M. (1949) J. Biol. Chem. 177, 751 Bull. Sot. Chim. Biol. 48, 969 Ribiero, L.P. (1959) Clin. Chim. Acta 4, 458 ams, C.A. (1953) Biochim. Biophys. Aeta 10, 193 955) Int. Arch. Aflergy 7,103 rke, K. (1970) Science, 169, 593 Cherchel, G.L., Valet, J.P., Matte, J., Moorjani. S., et Higgins, R. (1974) Can. J.
alet, J.P., Matte, _Infect. Dis.
, J.G.
(1973)
J. Clin. Invest. 62. 1176
Ctinica Chimica Acto, 74 (1977) 59-69 0 Elsevier/North-Holland Biomedical Press
CCA 8191
METHODOLOGIE SIMPLE DE SEPARATION L’ANTIGENE DE SURFACE DE L’HEPATITE
G. DESMET
et J.L.
BOITIEUX
Laboratoire de Biochimie Pathologiqu~, 80036 Amiens Cedex (France) (Received
July
lst,
ET DE PURIFICATION DE B A PARTIR DU SERUM
FacultC
de Mkdecine,
rue Frkdkic
Petit,
1976)
Summary A simple method for the separation and purification of the surface antigen of hepatitis B from serum The present report describes a simple, rapid and reproducible procedure for preparation of hepatitis B surface antigen from human positive sera, with a satisfactory yield. After removal of fl- and a-lipoproteins by dextran sulphate precipitation and subsequent removal of IgM and a part of the other serum proteins by dialysis against distilled water, the supernatant obtained presents almost no change in its surface antigen content. After passing this solution through a molecular sieve of Biogel A-5 m, the surface antigen is detected in a well-defined peak. The fraction corresponding to this peak is collected in its totality. After lyophilization, it is passed through a molecular sieve of CPG 10, in phosphate buffer; this allows recovery of a substance which has retained its structural as well as its antigenic properties, and which is intact and practically free of any serum contamination.
Introduction La separation de l’antigene Australia [l] ou antigene de surface du virus de I’hepatite B (HB,Ag) a partir de &rums positifs et sa purification ont don& lieu 1 de multiples publications. La plupart des pro&d& permettant une purification satisfaisante de cet antigene extrait, le plus souvent, h partir de serums de sujets atteints d’hepatite virale B, necessite une ultracentrifugation en gradient de densite [ 2-71 mais le rendement est faible. Les methodes utilisant le tamisage moleculaire avec ou sans precipitations selectives se sont revelkes, jusqu’b present, peu efficaces, et de nombreuses astuces techniques ont 6th
necessaires pour ameliorrr la purification, w, au d&rimcAnt, du wndement 17,8/. Alors que la plupart des techniques chromatographiques sont longues, dklicates et peu rentablrs, la mkthodologie que nous proposons s’av+rc rapid{> et simple, et le rendement satisfaisant. Apres klimination de la totalit des a- et des fl-lipoproteinrs, puis drs 1gM et d’une partie apprkciable d’IgG, IgA et cr,-macroglobulinfa, les &rums sent’ soumis 5 une double chromatographie de gel filtration rkalisk sur Biogel A-5 m et sur billes de verre CPG-10. Notre ktude Porte parall&lement sur drs serums positifs (HBsAg’) et sur des &rums normaux (SHN). Matkriel
et mkthodes
1. Elimination des a- et des /3-lipoprote’ines, et des euglobulines Nous utilisons un pool skrique (P.S.) d’une positivitk en antigene
supkrieure a l/32. Nous prkcipitons les cr- et /3-liprotkines selon la technique de Castaigne et Amselem [ 91, par le sulfate de Dextrane en prksence de chlorure de calcium. Aprk centrifugation, le surnageant est soumis ti une dialyse de douze heures contre de l’eau distillbe, ce qui permet l’klimination des euglobulines et en particulier, des IgM. 2. Filtration
sur gels Chromatographie sur Riogel A-5 m, de 100 i 200 mesh
(Biorad-Richmond, U.S.A.) [lo]. Le gel se prtkente sous forme d’une suspension dense de perles; il est diluk dans un tampon Tris 0.1 M/chlorure de sodium 1 M, pH 8.2, dkgaz6 et versk dans une colonne de 1 m&re de hauteur sur 2.5 cm de diam&re. La colonne est stabilike par passage du tampon pendant 12 h. Le dkbit est de 1.5 ml/min. Nous amkliorons la &solution en remplissant le fond de la colonne de CPG-10,200-400 mesh, sur une hauteur de 2 cm. Chromatographie sur CGP-10, 120-200 mesh, (controlled Pore Glass Electro-Nucleonics Inc., U.S.A.). Elle est &ali&e en colonnes de 50 cm de hauteur sur 1 cm de diam&re, en tampon phosphate 0.2 M, pH 7.0. Le dkbit est de 1 ml/min. 3. Dosage des prote’ines totales Les prothines sont do&es selon la technique classique automatiquement 6 l’aide d’une chaine colorimktrique.
du biuret
[ 11 J rkalisbe
4. Electrophortise en gel de polyacrylamide-agarose Les skparations sont rhaliskes sur plaques de gel de polyacrylamide-agarose (P.A.A.) i 4 pour 100 selon la technique d’Urie1 [ 121. Les khantillons, d’une concentration protkique comprise entre 3 et 6 g/l, sont dkposks dans le gel apres dilution au demi dans de l’agarose fondue. Les protknes sont &v&es par le Bleu Coomassie 2 2.5 pour 1000. Les lipoprotkines sont mises en kvidence apr& coloration par le Noir Soudan [ 13). 5. Ultracentrifugation La puretk de la prkparation
de HB,Ag
est contrGlGe
par ultracentrifugation
61
(U.C.) realisee dans une ultracentrifugeuse Beckman analytique L350 a la vitesse de 50 000 tours/min (160 000 X g), i 15°C. La fraction soumise a l’ultracentrifugation a ete lyophilisee-puis resolubilisee dans un tampon phosphate 0.2 M, pH 7.0,1 une concentration de 15 mg/ml. 6. Microscopic e’lectronique L’etude en microscopic electronique (M.E.) de nos fractions a 4th &ah&e apres “coloration negative” par l’acide phosphotungstique a 5%. Les examens sont realises au microscope electronique Siemens Elmiskop JA. i 80 kV. 7. Techniques immunologiques Analyse immunoe’lectrophorktique (AIE). Elle est realisee selon la technique de Grabar et Williams [14] adapt&e i la micromethode par Scheidegger [15] en gel d’agar (Agar Noble Batco-Difco Laboratories, U.S.A.). Nous utilisons un immunserum anti-serum humain normal de 1’Institut Pasteur (AS. antiSHN) et un immundrum anti-HB,Ag de mouton fourni par les laboratoires BDMerieux (A.S. BD). L’e’lectroimmunodiffusion (EID), selon la technique adaptee par Prince et Burke [ 161 permet la mise en evidence de HB,Ag ainsi que la determination du titre de nos preparations. Rdsultats Pour suivre les diverses &apes de separation et de purification de l’antigene de surface, nous faisons appel a l’electrophorese en gel de P.A.A. a 4 p. 100, permettant la mise en evidence des particules HB,Ag’ dans une zone sit&e entre l’a2-macroglobuline et le lieu de depot, en fonction de leur poids moleculaire. La presence, dans cette zone fortement coloree par le Noir Soudan, de fllipoproteines et d’IgM, nous a conduit a envisager, en un premier temps, une precipitation selective des lipoproteines, puis, des euglobulines. P.S. HB,Ag’ est precipite par le sulfate de Dextrane a haut poids moleculaire en presence de chlorure de calcium, (Tableau I), ce qui permet l’elimination des P-lipoproteines et des a-lipoproteines, mais aussi d’une fraction non negligeable d’oc,-macroglobuline, de serum-albumine et d’immunoglobulines (IgG, IgA, IgM). Le precipite P1 correspond h 12 pour 100 des proteines de P.S. La recherche de l’antigene de surface dans P1 s’avere negative. La dialyse du surnageant S, permet d’eliminer, en plus des IgM, une partie appreciable d’IgG, IgA, de serum albumine, ainsi que de glycoproteides migrant dans la zone haptoglobuline-siderophiline (Fig. l), sans modification appreciable du titre antigenique. L’A.1.E. confirme la purification de l’antigene de surface (Fig. 2). Parmi les immunoglobulines, nous retrouvons dans SZ des IgG et des IgA, les IgM etant pratiquement eliminees. L’cr*-macroglobuline reste le contaminant majeur de S 2. Apres dialyse contre Tampon Tris 0.1 M/NaCl 1 M, pH 8.2, SZ est soumis a une filtration sur Biogel A-5 m. Le tamisage moleculaire permet d’individuali-
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TABLEAU
I
ELIMINATION
DES
LIPOPROTEINES
ET
DES
EUGLOBULINES
DU
POOL
SERIQUE
POSITIF
(P.S.
HBsAg+)
P.S.
HB,Ag+
ProtGines
“S2
contre
en
Titre
3.4%
‘P2 Dialyse
totales
( ,1/32)
0
H20
_-_________
84.6%
____.__.__
>1,32
ser un pit F, positif, la quasi totalite des proteines dans la fraction Fii Fig. 3). La fraction F, riche en antigene de surface est see et reprise dans un tampon phosphate 0.2 fraction par electrophorese (Fig. 4) et par A.I.E. croglobulines et de traces d’immuno-globulines glycoproteides. En gel de P.A.A. a 4 pour 100, etre individualisees: une zone dtroite, nette, sit&e
seriques
recueillie en totalite, lyophiliM, pH 7.0. L’ktude de cette montre la presence d’a,-ma(IgG et IgA) et d’cu I et cy2deux zones Hb,Ag’ peuvent au-dessus de la source, faible-
SHN Fig.
1. Electrophorbe
en gel de P.A.A.
d 4 pour
100
de P.S.
de S, se retrouvant
HB,Ag’et
f?S
des fractions
S1.
PI,
S2 et P2,
ique
Fig. 4. Electrophoke en gel de P.A.A. E‘I obtenue d park de SIIN.
a 4 pour 100 de S2 et de F1 positifs.
Comparison
aved la fraction
ment positive, et une zone diffuse, large, fortement positive, situ& entre cette derniitrc, et l’a:-macroglohuline. La presence d’antigene de surface dans ces deux zones a pu etre determike apres elution des molecules antigeniques du gel frais soumis au broyage, et a des congelations et deconghlations successives. La M.E. confirme la richessc de la fraction F, en antigene de surface tout en revelant la presence de rares particules de diametre moyen de l’ordre de 43 nm, correspondant aux particules de Dane [17]. HB,Ag apparaft surtout sous forme de spherules dont le diametre est voisin de 25 nm mais on note aussi la presence de formes en Y, en halt&-es, en bdtonnets (Fig. 5). L’antigene de surface se retrouve presque quantitativement dans la fraction F, et, en M.E., les molecules apparaissent tres homogenes et non alterees. La fraction F, positive s’est r&Xe Gtre un excellent materiel pour la preparation d’immunserum anti-antigene de surface chez le lapin*, d’autant que l’obtention de cette fraction est simple, rapide et quantitativement satisfaiSante. La chromatographie de S2 obtenu a partir de SHN selon un protocole strictement calque sur celui decrit pour la preparation de SZ positif suggere que 50
65
Fig.
5.
pphkique
Etude (25
de
FI positif
nm).
en
2, particules
M.E.
(grossissement
de DANE
(43
nm).
160
000).
1. HB,Ag:
(a) forme
en bitonnet,
(b)
forme
pour 100 environ de la fraction F, positive correspond aux souillures s@riqucs dont lc constituant, majeur est l’cuz-macroglobulines. La fraction F, postitive reprise en tampon phosphate pH 7.0 est soumise j unr gel filtration sur CI’G-10. La lecture dcs fractions ~lufks 5 280 nm (Fig. 6) pclrmet d’individualiscr un pit F; exclu pkxxdmcnt, quc nous n’avons pu jusqu’i prksent caractkriser, et qui pourrait correspondre aux rares particules de DANE prkentes dans F, HB,Ag’, un pit F;, qui correspond ri l’antigknc a l’cu,-macroglobuliw et aux de surface, et une fraction F;,,, correspondant autres souillures skiqucs prkentes 2 I’Ptat de traces dans F,. La fraction positive F;, est lyophilis&l apr& dialyse et conservde en dessiccateur & 4” C. En vue de prkiser la puretk de la p&par&ion, nous avow fait appel Li des ~lectrophor~tiq~~es et immu~lo~lectrophor~ticritkes chromatographiques, ques (Fig. 7). La chromatographie de F;, positive sur CPG-10 permet d’individualiser un pit unique, r&gulier. La positivitk en antigke de surface est retrouvke dans tous les tubes 6luk. En klectrophor&e en gel de P.A.A. i 4 pour 100, la fraction F;, se &partit dans une zone comprise entre la source et I’a,-macroglobuline. Unr bande ktroite, faiblement colorke par It Bleu Coomassie, qui correspond $ une fraction HB,Ag’, comme nous l’avons montr6 aprk Alution du gel, est mise en &idence dans certaines fractions F;,. Elle semble correspondre 6 des particules positives de poids mol~cu~aires plus 6lev6, voire, 5 des particules de DANE. La coloration des gels par le Noir Soudan confirme la nature lipoprot~idique des particules.
Fig. 6. Filtration SW CPG 10 de la fraction Ft positive (-----) en tampon phosphate pH 7.0, Comparaison avec le profil chromatographique de la fraction FI obtenu i partir de SHN (- - - - - -1.
67
0.7
I
(0)
0.+
0.5 1 F E c
0.4
x UT 0.3 t
0.2r-
1I.I-I__ 123456789
.I. .1.-l 10 11 12
1 13
I_ 14
i _.1. ..L.liU 15 16 17 18 NO. de5
19
20
21
22
f raCttOnS
(b)
Fig. 7. (a) Chromatographie de F~I positive SW CPG 10 en tampon phosphate, pH 7.0. (b) Electrophorke de Fil positive en gel de P.A.A. ii 4 pour 100. fe) A.I.E. de Fil positive.
L’A.1.E. confirme l’absence de souillures proteiques d’origine serique dans F;, obtenu a partir de P.S. positif, l’immuns6rum specifique de HB,Ag (AS. BD), rev&ml l’antigene de surface sous forme d’un arc unique. L’U.C. confirme l’absence de souillure d’origine serique dans la preparation. Discussion La methodologie que nous utilisons permet une recuperation rapide et satisfaisante d’HB,Ag a partir de serums pritleves, le plus souvent, chez des donneurs de sang apparement sains. L’originalitd de notre methode vient de ce qu’elle fait appel $ des techniques simples en vue d’eliminer les constituants s&-iques souillant la plupart des preparations antigeniques, en particulier, les cu- et /3-lipoproteines, les immunoglobulines, et l’a,-macroglobuline rendant tres delicate les Btapes terminales de purification. Par ailleurs, les techniques employees sont peu cotiteuses, les gels utilids pour le tamisage moleculaire etant parfaitement recuperables. Enfin, en tours de purification, HB,Ag ne subit pas d’alteration notable, comme c’est le cas au tours des techniques utilisant une purification par l’ether [18], ainsi qu’en temoigne l’observation en M.E., et le rendement apparait satisfaisant puisque le titre en HB,Ag, ramene au volume de P.S. initial, est peu modifie. Le rendement en HB,Ag est actuellement en tours de determination. Par ailleurs, la fraction F, tres positive obtenue apres gel filtration de Sz sur A-5 m nous a permis de pr6parer un immuns~rum anti-antig~ne de surface dont le titre en anticorps semble particuli&rement &lev& L’obtention d’HB,Ag en quantitk apprkiable nous permettra de preciser le rapport entre la fraction lipidique et la fraction protidique de l’antig&e et de completer les resultats preliminaires concernant sa composition chimique. R&urn6 Notre publication decrit une mkthode simple, rapide et reproductible pour la preparation de I’antigPne de surface de l’hkpatite B i partir de serums humains positifs, avec un rendement satisfaisant. Apres elimination des cy- et ~-lipoprot~ines par precipitation par le sulfate de dextrane, puis des IgM et, p~iellement, d’autres protCines skiques par dialyse contre de l’eau distill&e, le surnageant obtenu ne prksente pratiquement pas de modification dans le contenu en antigke de surface. Apr& tamisage moleculaire de cette solution sur Biogel A-5 m, l’antig&ne de surface est detect& en un pit bien defini. La fraction correspondant a ce pit est rkup6rke en totalite. Apr& lyophilisation, cette fraction est soumise au tamisage molkulaire sur CPG-10 en tampon phosphate. Ceci permet la r&upCration d’un mat&-iel morphologiquement et antigkniquement intact et pratiquement dCpourvu de contamination serique. Remerciements Nous exprimons nos plus vifs remerciements a Madame Ribeil, directrice du Centre de Transfusion Sanguine d’Amiens, qui a bien voulu nous fournir des
69
&rums HB,Ag’, i Monsieur le Professeur Personne (U.E.R. de Science d’Amiens) pour la microscopic klectronique, ?I Monsieur le Professeur Daniel (Laboratoire de Virologie de la FacultC de MCdecine d’Amiens), pour son aimable collaboration. RCf&ences
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