Mikrobieller abbau von progesteron zu α-ketoglutarsäure und bernsteinsäure

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA

BBA

55416

MIKROBIELLER UND

KURT

401

ACTA

ABBAU

VON PROGESTERON

ZU a-KETOGLUTARSAURE

BERNSTEINSAURE

SCHUBERT,

KARL-HEINZ

BiiHME,

FRANZ

RITTER

UND

CLliRE

Deutsche Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Institut fiir Mikrobiologie Therapie, Abteilung fiir Steroidforschung, Jena (D.D.R.) (Eingegangen am 28. August, 1967) (Revidiertes Manuskript eingegangen am IO. November,

Hi5RHOLD

und expevimentelle

1967)

SUMMARY

Microbial

degradation

of progesterolze

to cc-ketoglzttaric

acid and succinic

acid

The acid produced from microbially digested progesterone containing the remaining rings C and D of the sterane skeleton was labelled with tritium and further degraded by Nocardia opaca. In this way a-ketoglutaric acid and succinic acid could be obtained as degradation products which enter the citric acid cycle. A scheme with the proved and possible steps of the microbial degradation of progesterone is proposed for discussion. In the absence of a side chain at C-17, as in the case of At-androstene3,17-dione, only succinic acid was obtained, which is in accordance with the concepts developed. Investigation of the degradation of steroids by microorganisms is suggested as a basis for the elucidation of the still unknown pathway of degradation in mammalian organisms.

EINLEITUNG

Im Rahmen von Untersuchungen tiber die Umwandlung von Progesteron durch Mycobakterien fanden wir tiber eine Reihe von Zwischenstufen das erste niedermolekulare Abbauproduktl. Es handelt sich hier urn 7a-Methyl-r-acetyl-perhydroindan-5-on-qcr-(3-propionsaure), eine &Ketosaure (VII), die noch die Ringe C und D des Steranskeletts enthalt. Der Abbau der Steroide und das Auftreten neuer Intermediarprodukte eriiffnet einen weiteren Stoffwechselbereich. Die Untersuchung des Steroidabbaues mit Mikroorganismen dient als Model1 fur die Aufklarung des noch unbekannten Abbauweges von Steroidhormonen im Saugetierorganismusl. Ausgehend von der S-Ketosaure wurden IO neue Verbindungen vom Perhydroindantyp isoliert2-4. Obwohl bei Mycobakterien der Abbau bis zu CO, geht, gelang es indessen nicht, weitere Abbaustufen zu fassen. Mit Nocardia opaca konnten durch die Bildung von a-Ketoglutarsaure und Bernsteinsaure aus der &Ketosaure Vorstellungen tiber den Abbau der Ringe C und D des Steranskeletts entwickelt werden. Biochim. Biophys. Acta, 152 (1968) 401-408

K. SCHI'BERT

402

et d.

MATERIAL IJND METHODES Die Schmelzpunkte wurden mit den1 Mikroheiztisch nach Hoetius bestimmt. Fur die Saulenchromatographie fand Kieselgel 0.2--0.4 mm (Merck) nach Zusatz von 10% Wasser Verwendung. Die Dtinnschichtchromatographie wurde mit Kieselgel G (Merck) in dem System Chloroform-Athylacetat-Ameisensaure (5 :4: I, 1./v/v) ausgeftihrt. Die Papierchromatographie erfolgte auf Schleicher und Schiill-Papicr 2043 bm absteigend

in den Systemen

Toluolltert.-Butanol-Eisessig-Wasser

(255 : 245 : 00: 210,

v/v/v/v) (System A), und Benzol-Eisessig-Wassersec.-Butanol (3: I : 2: I, v/v/vi\.) (System B). Als Anionenaustauscher kam Amberlite IRA 410 in der Karbonat-Form zur Anwendung. Ferner wurde Celite 545 von der Acrochemie, Berlin, bcnutzt. Die Sauren wurden auf der Dtinnschicht und auf dem Papier mit einer o.o4”,,igen alkoholischen Liisung von Bromkresolgrtin angefarbt. Die Registrierung der Tnfrarotspektren erfolgte mit einem UR-ro-Spektralphotometer wurden von 20-30 pg der Substanz KBr-Presslinge

(VEB Carl Zeiss Jena). Daftir (I mm x I mm x 4 mm) ange-

fertigt. Die Auswertung der radioaktiven Chromatogramme erfolgte mit Methandurch flusszahlrohren und einem Strahlungsmessgerat FH 49 von Friesecke und Hiipfner. Die Transportvorrichtung fur Papierchromatogramme war gleichfalls von Friesecke und Hdpfner, wahrend die fur Dtinnschichtchromatogramme in eigener WTerkstatt5 hergestellt wurde. Die quantitative Bestimmung der Tritiumaktivitat wurde in der Gasphase nach HASAN~ durchgeftihrt. Standardfehler I %. Reindarstelhag

der tritiummarkierte~z

Die Zahleffectivitat

betragt

und der

h-Ketosiiure

Die aus Progesteron mit X. o$aca erhaltene Abbausaure perhydroindan-5-on+cr(3-propionsaure)7 wurde nach Wilzbach darstellung und Abtrennung Kieselgel chromatographiert.

j2:;,

Ta-Methyl-r-acetylmarkiert. Zur Rein-

der gebildeten Nebenprodukte wie die Triole3, wurde tiber Eluiert wurde mit Chloroform und steigendem Zusatz

eines Gemisches von ~%thylacetattAmeisensaure (100: 25). Die &Ketosaure eluiertc mit Chloroform plus IO 96 :’4thylacetattAmeisensaure. Nach dreimaligem Llmkristallisieren aus Ather erwies sich die Ci-Ketosaure papierchromatographisch als einheitlich. Der Mischschmelzpunkt mit inaktiver Ketosaure ergab keine Depression. Die spezifische

Aktivitat

betrug

18.48 ,&/mg.

Fermentation AT. opaca 7030 wurde z Tage bei 28" in Difco-Nutrient Broth + 29; Glucose angeztichtet. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit 0.0133 M Phosphatpufferliisung (pH 7.2) gewaschen und in der gleichen Pufferlosung suspendiert (z g Nasszellen pro 20 ml). 66.5 mg&Ketosaure (inaktiv bzw. tritiummarkiert; 1.228 mC, gelijst in 0.25 ml I M NaOH, wurden zugesetzt. Der Abbau erfolgte innerhalb von zoo24 Std bei 28” unter Schtitteln. Anschliessend wurden die Zellen bei 4000 x ,q abzentrifugiert. Isolierung der a-Ketoglutarsiiure Ein Viertel des klaren cberstandes wurde mit IO ml einer 0.2 “,$gen 2,4-Dinitrophenylhydrazinlijsung in 2 M HCl 20 Min auf 38” im Wasserbad erwarmt. Nach dem Abkiihlen wurde dreimal mit Ather extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit

MIKROBIELLERABBAU

VON

403

PROGESTERON

z M HCl und mit Wasser gewaschen. Die atherische Phase wurde mit 5 %iger wassriger K&O,-L&sung ausgeschiittelt, die Karbonatlosung mit verdtinnter HCI angesauert und mit Chloroform sowie anschliessend mit lither extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zur Trockene gebracht und diinnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die Zone mit dem kleinsten RF-Wert (RF 0.5) entsprach dem z,4-Dinitrophenylhydrazon der cc-Ketoglutardure. Das Eluat wurde aus Wasser umkristallisiert. Die dariiberliegenden unpolaren Zonen entsprachen den z,4_Dinitrophenylhydrazonen der nichtumgesetzten Q-KetosPure. Nach Elution mit Ather konnte gravimetrisch der Anteil an ni~htumgesetzter d-Ketosaure ermittelt werden. Die Identifizierung der aus tritiummarkierter S-Ketosaure erhaltenen a-Ketoglutarsaure erfolgte gleichfalls iiber das z,4-Dinitrophenylhydrazon mit der Isotopenverdtinnungsmethode unter Zusatz von 9.57 mg inaktivem cr-Ketoglutarsaure-z,4dinitrophenylhydrazon (Tabelle I).

Drei Viertel des ffberstandes wurden durch eine Austauschersaule (IO mm x 120 mm, IRA 410 in der Karbonat-Form) geschickt und mit IOO ml Wasser nachgespiilt. Die Elution der Sauren erfolgte mit IOO ml 0.5 M (NH&CO,-Losung. Das Eluat wurde im Vakuum bei 60” zur Trockene gebracht. Der Riickstand wurde in 5 ml Wasser gel&t, mit HCI angesauert und von IO g Celite gleichmassig aufgenommen. Das Celite wurde in einer Fritte mit I 1 Ather eluiert. Der zur Trockene gebrachte Atherextrakt wurde einer abgestuften Saulenchromatographie an Kieselgel unterzogen. Es wurden hierbei 3 Fraktionen zu je zoo ml erhalten. Fraktion I : Chloroform pltis IO o/o Athylacetat-Ameisensauregemisch (IOO :zg) ; Fraktion z : Chloroform plus 15 y. Athylacetat-Ameisens&uregemisch (100: 25) ; Fraktion 3: Chloroform pl?~ 40 % ~thylacetat-Ameisens~uregemisch (x00: 25). Die Fraktion 2 wurde papierchromatograph&h in den Systemen A und B getrennt. Bernsteinsaure hat im System A einen RF-Wert von 0.10 und in dem System B einen RF-Wert von 0.33. Die weitere Reinigung der Bernsteinsaure erfolgte dtinnschichtchromatographisch. Die Identifizierung der aus tritiummarkierter S-Ketosaure erhaltenen BernsteinsSure erfolgte mit der Isotopenverd~nnungsmethode unter Zusatz von 11.90 mg inaktiver Bernsteinsaure. Die K~stallisationen wurden in Dioxan durchgef~hrt (Tabelle I). Herstellung der 7a-Methyl-r-acetyl-per~ydroindan-rcr-ol-5-on-4-a(3-pyopion.s~uye) (VIII)

aus r7a-Hydroxyprogesteron

Unter Anwendung der schon frtiher bei der Herstellung der cS-Ketosaure des Progesterons beschriebenen Fermentationsund Isolierungsbe~ngungen7 wurde durch ~inwirkung von N. ojaca SG 7030 auf 17~-Hydroxyprogesteron 7a-Methyl-racetyl-perhydroindan-Icw-ol-5-on-qa-(3-propions~ure) mit dem Schmelzpunkt F. 149151’ erhalten. 3, ,“f; 2.87; 3.69; 3.84; 5.80-5.92; 7.35; 8.13 und 10.75 ,u, Molekulargewicht : 282 (Molekiilmassenspektrum). Berechnet fur C,, H,, 0, : C, 63.81; H, 7.85 ; gefunden: C, 63.57; H, 7.66%. Heyste~~~n~ von ~a-~~ethyE-S,ti,7,7a-tetrah~ldroindaIlz-r,5-ckion-413-(3-propionsli~rei (XV)

Bei der Einwirkung von Nocardia rhodochrous 7022 auf Progesteron unter den bereits zitierten Fermentationsbedingungen konnte die von VELLUZ* im Rahmen der Biochim. Biophys. Acta, 152 (rg68) 413-408

K. SCHUBEKT

404 TABELLE

et al.

I

ERGEBNISSE DER ISOTOPENVERD~NNUSG Das 2,4_Dinitrophenylhydrazon umkristallisieit-

tier a-Ketoglutarsaure

wurdc: aus \Vasser und

die Bernstcinsaure

aus Dioxan

Subs/am

Eingesetzte Mengc I. Kristallisation

a-Ketoglutarsaure-z,4-dinitrophenyh ydrazon

Kristalle Mutterlaugc Kristalle Mutterlaugc Kristalle Muttcrlauge Kristallc >Iutterlauge

2. Kristallisation 3. Kristallisation 4. Kristallisation

Bernsteinsaurc

Eingesctzte Mengc r Kristallisation

Kristalle Mutterlauge Kristalle Mutterlauge Kristalle 1Iutterlauge Iiristalle Rlutterlauge

2. Kristallisation 3. Kristallisation 4, Kristallisation

TABELLE

I1

BEEINFLUSSUNG

DES

ABBAUES

DBR

10 mg &Ketosaurc (VII) in ciner 48 Std bei 28” geschiittelt.

a-I
Zellsuspcnsion

van ,Y. opacn

7030 (0.5 g Sasszellen

pro

IO ml),

zusiitze

Ohne Zusatz Na,AsO,

H&l, S-Hydroxychinolin EDTh KCN Bernsteinsaurc

TABELLE

I1 1

*~BAIJ oi3n VERSCH*EDRNEN

&KET0SkURi3N

(\‘II-XI)

mM&Ketosaure in eincr Zellsuspension van N. opaca 7030 (I g Nasszcllcn pro IO ml 0.01.~ >I Phosphatpufferlosung), pH 7.2, 20 Std bei 28” geschiittelt. Die quantitative Bestimmung der nichtumgesetzten KetosHure erfolgte gravimetrisch als 2,4-Dinitrophenylhydrazon(siehe MATERIAL 12.5

UND

METHODEN).

&Ketosiiure

VII IX VIII X XI

(aus (aus (aus (aus (aus

Biochim.

Progesteron) r7a-Acetoxyprogestcron) 17x-Hydroxyprogesteron) rr-Desoxycorticosteron) d4-i\ndrosten-3,r7-dion)

Bioph?,s.

Acta,

15~ (1968)

3; Nichtumgesetzte &Ketos&we nach 20 Std

Rzldung van CI-Ketoglutarsiiure

‘9.9 r7.0

;

14.9 9.9 0 401-408

I

BiZdung WM Aevnsteinsii iwp

/

MIKROBIELLER

ABBAU

VON

PROGESTERON

45

Steroid-Totalsynthese hergestellte 7a-Methyl-5,6,7,7a-tetrahydroidan-r,5-dion-4,8(3-propionsaure) vom Schmelzpunkt 143-144.5~ erhalten werden. Der Mischschmelzpunkt mit der totalsynthetisch hergestellten Ketosaure zeigte keine Depression. Das Infrarotspektrum stimmte mit dem des Vergleichspraparates iiberein. ERGEBNISSE

Zur Untersuchung des weiteren Abbaues der b-Ketosaure (VII) des Progesterons wurde diese als alleinige Kohlenstoffquelle in einer Zellsuspension von N. opaca in Phosphatpufferlijsung inkubiert. Uber das z,4_Dinitrophenylhydrazon gelanges, eine neue Ketosaure abzutrennen. Das z,4-Dinitrophenylhydrazon zeigte einen Schmelzpunkt von 213’ (Zers.) und entsprach such in seinem chromatographischen Verhalten dem z,4-Dinitrophenylhydrazon der a-Ketoglutarsaure. Desgleichen konnte nach der Abtrennung der Sauren an der Austauschersaule IRA 410 a-Ketoglutarsaure an Kieselgel mit Chloroform plus 50 o/o Athylacetat-Ameisensaure (100 :25) eluiert werden. Der Schmelzpunkt lag bei 115-116’ und der Mischschmelzpunkt mit einer Vergleichssubstanz zeigte keine Depression. Das Ultrarotspektrum war mit dem der a-Ketoglutarsaure identisch. Desweiteren konnte nach der gleichen Austauscher-Behandlung in Fraktion 2 der Kieselgel-Chromatographie Bernsteinsaure erhalten werden. Das papier- und der Schmelzpunkt und der Mischdiinnschichtchromatographische Verhalten, schmelzpunkt sowie das Ultrarotspektrum stimmten mit Bernsteinsaure tiberein. Bei insgesamt 12 Inkubationen lagen die Ausbeuten an a-Ketoglutarsaure zwischen I und 3%. Bei Blindansatzen, zwischen 8 und 25% und an Bernsteinsaure d.h. ohne Zugabe der S-Ketosaure betrug die Menge nachweisbarer cr-Ketoglutarsaure etwa nur 1125. Fiir einen quantitativen Vergleich war die Menge der Bernsteinsaure zu gering. Zur weiteren Identifizierung und fur den Beweis einer Bildung von cc-Ketoglutarsaure und Bernsteinsaure aus der &Ketosaure wurde diese nach Wilzbach mit Tritium markiert und in analoger Weise mit N. opaca inkubiert, isoliert und identifiziert. Die Ergebnisse der Isotopenverdtinnung in Tabelle I zeigen die erforderliche Konstanz der spez. Aktivitat bei den Kristallisationen von cr-Ketoglutarsaure-z,4dinitrophenylhydrazon und Bernsteinsaure. Zusatze von EDTA, Na,AsO,, HgCl, und S-Hydroxychinolin bewirkten bei den in Tabelle II angegebenen Konzentrationen eine Hemmung des Abbaues der &Ketosaure. KCN zeigte unter den genannten Bedingungen keinen Hemmeffekt. Bernsteinsaure bewirkte bei einer Konzentration von 10-2 M eine Fijrderung des Abbaues. Vergleichend wurden die entsprechenden &Ketosauren von r7cr-Hydroxyprogesteron (II), ITa-Acetoxyprogesteron (III), II-Desoxycorticosteron (IV), IIDesoxycorticosteron-acetat (V) und d4-Androsten-3,17-dion (VI) auf die Abbauprodukte cr-Ketoglutarsaure (XII) und Bernsteinsaure (XIII) sowie auf die unterschiedlichen Abbaugeschwindigkeiten untersucht (Abb. I). Die &Ketosauren von At-Androsten-3,r7-dion (XI) und Desoxycorticosteron sowie dessen Acetat (X) wurden am schnellsten abgebaut und bildeten keine cr-Ketoglutarsaure, sondern nur Bernsteinsaure. Beim Abbau der S-Ketosaure aus Desoxycorticosteron tritt die&Ketosaure desA4-Androsten-3,r7-dionsalsIntermediarprodukt Biochim.

Biophys.

Acta,

152 (1968)

401-408

K. SCHuIIEIIT d at.

400

auf. Langsamer als die c%Ketosaure des Desoxycorticosterons, aber schneller als die des Progesterons wurde die 8-Ketosaure des r7”-Hydroxyprogesterons (VIII) abgcbaut. In beiden Fallen kam es zur Bildung von a-Ketoglutarsaure und Bernstein saure.

i

‘4

+

HOOC-CO

0

\

THZ HOOC-CH,

t HOOC-CH2 HOOC&

J

m

Abb. I. Mikrobielle Bildung der &I
uncl wcitewr

DISKUSSION Der mikrobielle

Abbau des Steranskeletts

verlauft

bei C,,-, C,,- und C,,-Steroi-

den einheitlich iiber d-Ketosauren. Weitere Abbauprodukte dieser Perhydroindankorper konnten bisher nicht gefasst werden. Die Bildung von a-Ketoglutarsaure und Bernsteinsaure ftihrte nun zur Aufstellung eines Abbauschemas”. Dabei wird angenommen, dass der Abbau der Ringe C und D in prinzipiell gleichartiger Weise wie der der Ringe A und B verlauft (Abb. 2). Unsere Vorstellungen tiber die p-Oxydation des Propionsaurerestes erhielten inzwischen eine Sttitze durch die Untersuchungen von LEE UND SIH’~ mit analogen synthetisch hergestellten Perhydroindanpropionsaurederivaten. Die Moglichkeit der Einfiihrung einer Doppelbindung vor der P-Oxydation konnten wir 7a-Meth~l-~,6,7,7a-tetrahydroindan-r,~-dion-4~~-(3-prol~,vldurch Isolierung von und 7a-Methyl-5,6,7,7a-tetrallydroindan-r,5-dion-4B-(3-propionalkohol) (XIV)I satire) (XV) bei der Einwirkung von Mycobacteriwn smegntatis bzw. iv. vhodochrous auf die d-Ketosaure des Progesterons (VII) nachweisen. Die Ketogruppe am 6-Ring kijnnte hierbei die gleiche Rolle fiir die Einftihrung von z-Doppelbindungen und die nachfolgende Aromatisierung unter Dienon-PhenolUmlagerung, wie die Sauerstoff-Funktion in 3-Stellung bei Steroiden, spielen13. Nach Abspaltung eines C,-Fragmentes, wie bei Ring A wtirde aus dem Fragment des 5Ringes von Progesteron und r7E-Hydroxyprogesteron nach Abspaltung der Methylgruppe in der Seitenkette cr-Ketoglutarsaure und daraus Bernsteinsaure entstehen. Biochim. Bio@~~s. Acta,

152

(1968) 401-408

407

,

C, -Fragment Abb. 2. Nachgewiesene

und mdgliche Stufen des mikrobiellen

Abbaues

von Progesteron.

Entsprechend dieser Vorstellung wurde nun aus Progesteron und r7a-HydroxyProgesteron a-Ketoglutarsaure erhalten. Der tiber die &Ketosaure ohne Seitenkette (XI) verlaufende Abbau von IV, V und VI lieferte wie zu erwarten nur Bernsteinsaure. Die Bildung von a-Ketoglutarsaure und Bemsteinsaure aus der &Ketosaure VII konnte durch Tritiummarkierung verfolgt werden. In ijbereinstimmung mit dem skizzierten Abbauweg wurde stets mehr cr-Ketoglutarsaure als Bernsteinsaure gefunden. Desweiteren wurde Bernstein&ire nur aus cr-Ketoglutarsaure erhalten und nicht umgekehrt. Die Ergebnisse zeigen, dass auf mikrobiellem Wege der Abbau der Ringe C und D des Steranskeletts in den Zitronensaurezyklus einmiindet. DANK

Wir danken Herrn Ing.-Chem. K. WEHRBERGER fur die Infrarotspektren und Herrn K. K~~~~~(Isotopenlabor,LeiterDr.S.B~~~~~~~)fiirdieDurchfiihrungder Aktivitgtsmessungen. ZUSAMMENFASSUNG

Die auf mikrobiellem

Wege aus Progesteron

erhaltene

Biochim. Biophys.

Abbausaure Acta, 152 (1968)

mit den ~OI-408

verbliebenen Ringen (‘ und II des Steranskeletts \vurde mit Tritium Socaytlia opaca weiter abgebaut. Dabei konnten x-Ketoglutars~ure saure

als Abbauproduktc,

die in den Zitronensaurezvklus

markicrt und mit und Hemstein-

einmtinden,

den. Ein Schema mit den nachgewiesenen und mii&chen Stufen Xbbaues van Progesteron wird zur Diskussic\n gestcllt. Entsprechend ten Vorstellungen

wurde

,4ndrosten-3,17-dions, abbaues

bei Fehlen

nur

mit Mikroorganismen

ten Abbauweges

I I<. SCHUBERT,

2 I<. SCHUBERT,

Seitenkrttc erhalten.

am C-17, \vic im Fallc Die Cntersuchung

sol1 als Model1 ftir die Aufklgrung

im %ugetierorganismus

K-H. K-H.

einer

BernsteinCure

I~~~HME UND HBHME UND

erhaltrn

\ver-

des mikrobicllen den entwickeldes

des not-lr unbekann-

dienen.

(‘.H~RHOLD, Z. Plzj,sio/. Clzew., ,?rj (1yO1) C. HBRHOLL),

I’-

des Steroid-

LOO