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Morphologische und cytochemische Beobachtungen an Tabakmosaikvirus-infizierten Protoplasten von Nicotiana tabacum
Experimental
560
Cell Research,
6, 560-562
(1954)
MORPHOLOGISCHE UND CYTOCHEMISCHE BEOBACHTUNGEN AN TABAKMOSAIKVIRUS-INFIZIERTEN PROTOPLASTEN VON NICWZ’IANA TABACUM H. ZECH Institut
.fiir
Zellforschung
und
V ERFOLGT
Genetik, Medizinisches Nobelinstitut, Stockholm, Schweden
Karolinska
Institutet,
man die intraplasmatischen Veranderungen in individuell mit Tabakmosaikvirus (TMV) infizierten Haarzellen von Nicotiana tabacum (13) oder in Zellen von Blattern, die nach mechanischer Inokulierung mit TMV unter weitgehend konstanten Bedingungen gehalten wurden (25’ C, 8000 Lux, komplette Nahrliisung), so lassen sich leicht vier Stadien verschiedener Infektivitatsqualitaten abgrenzen (N. glutinosa-Test, 7). 1. Wahrend der Periode verstarkter Zellaktivitat (Cyclosis) bis zu beginnender X-K&per-Bildung sind keine infektiven Substanzen zu isolieren. 2. Mit dem Auftreten von einem oder mehreren amorphen X-KGrpern erreicht die Infektivitat der Isolate ihren Hohepunkt, urn dann 3. nach Abbau der X-bodies und mit dem Erscheinen intraplasmatischer Kristalle progressiv abzusinken. 4. Im Spatstadium der Infektion, wenn die Kristalle aufgeliist oder von kristallinen Fibrillen ersetzt werden, ist nur noch schwache Infektivitat nachweisbar. Der durch diese bekannten Stadien grob markierte Gesamtverlauf der Zellinfektion zeigt nun im einzelnen an lebendem und gefriergetrocknetem (9) Material auffallende morphologische Veranderungen, die zum Teil such von cytochemisch fassbaren (3, 4) substantiellen Konzentrationsschwankungen im Protoplasten begleitet sind. Wahrend der ekliptischen Periode der Virusvermehrung wandeln Zellkern und Nukleolus in bestimmtern Rhythmus Grosse und Gestalt. Friihestens 4, spatestens20 h nach Inokulierung zeigt sich der Zellkern von einer zunachst scharf umgrenzten und spater diffuser erscheinenden Zone U. V.-absorbierender Substanz (2600-2900 A) umgeben. Mit dem Auftreten zahlreicher, im gleichen Wellenbereich stark absorbierender Partikel, die vom striimenden Plasma mitgefuhrt werden, verschwindet dieser Absorptionsmantel wieder. In diesem, fur die frtihe Virusinfektion typischen Infektionsstadium, das oft tagelang andauern kann, ist eine auffallende Reduktion des Kernvolumens bemerkbar, die sich such U.V.-spektrographisch in der Abnahme der Gesamtabsorption des Zellkerns ausdrtickt. Mit beginnender X-K&per-Bildung nimmt das Kernvolumen wieder langsam zu und bleibt wahrend der X-body-Periode relativ konstant, aber immer unter den Proportionen vergleichbarer gesunder Kerne. Mit dem Auftreten von Kristallen innerhalb der zerfallenden X-Korper oder in bestimmten Zonen des Cytoplasmas lndern sich die Kernverhlltnisse von neuem. Kern und Nukleolus kiinnen bis zum Vierfachen ihres urspriinglichen Volumens anschwellen. Die U. V.Extinctionswerte zeigen such hier eine Massenzunahme an. Im Spatstadium der Infektion werden die Kristalle wieder aufgeliist, die Plasmastrange verlaufen dann in eigenartig geraden und starren Bahnen. Meist fallen in ihnen flexible kristalline Experimental
Cell Research
6
Tabakmosaikvirusinfizierte
Protoplasten
von Nicotiana
561
tabacum
Fibrillen aus, die sich zu Strangen vereinigen konnen und mit der Zeit wieder verschwinden. Die Phanomene der Kristallbildung und des Kristallabbaues konnen sich in der gleichen Zelle mehrfach wiederholen. Bei der Beobachtung der Kristallbildung in lebenden Zellen (Phasenkontrast 1500 X) wurde folgender morphologische Befund gemacht: In Grtlich begrenzten, fein vernetzten Zonen des stromenden Plasmas entstehen dichtere blbchenformige Gebilde von wenigen p 0. Diese treten fast stets in spiegelbildsymmetrischen und zuntichst zusammenhangenden Zwillingsformen auf. Durch Anlagerung weiterer Schichten vergrossern sie sich zusehends zu rundlichen Kristalloiden. Der Kristallisationsprozess schreitet von aussen nach innen fort. Schliesslich entstehen regelmassige hexagonale Platten und schollenformige unregelmassige Prismen. Auffallend ist die anomale Ansammlung fadenformiger Mitochondrien in diesen Plasmabezirken. Die Beobachtung solcher Doppelformen liefert vielleicht einen Beitrag zu den Vorstellungen iiber die Anlagerung von Substratmolekiilen im Kraftfeld eines Matrizensystems bei der Bildung von Proteinkristallen (5, 8, 10). In Tabelle I sind die mittleren Extinctionswerte (2650 und 2800 A) von mindestensje 10 vergleichbaren Zellen der beschriebenenStadien nach Korrektur fur Lichtstreuung und unspezifische Absorption in Beziehung zur relativen Infektivitat entsprechender Gewebeteile gesetzt. Auf Grund der beschriebenen wechselnden Infektivitatsverhaltnisse der Zellen im Laufe der Viruserkrankung erschien eswichtig, die Virussubstanzen der einzelnen Stadien durch differentiale Ultrazentrifugierung zu isolieren. Unter konstanten Bedingungen gehaltene, moglichst gleichmassiginfizierte Blattgewebe wurden zum gewiinschten Zeitpunkt geerntet, extrahiert (la), die Extrakte zentrifugiert und elektronenoptisch untersucht. Bisherige Ergebnisse: Es gelang such bei Variierung der Extraktionsmethoden und Zentrifugierungszeiten nicht, eine anomale makromolekulare Proteinkomponente von Geweben, die bis zu 20 h inokuliert waren, zu isolieren. Das Stadium beginnender X-body-Bildung ergab geringe Mengen anomaler TABELLE
I
E 2650 E 2800
Anzahl Lokall. N. gZut.
000
1
000
1
oo+
j +++t-
1
o+l-
1
oot
000
= keine Llsionen auf Nicotiana glutinosa. oo+ = nicht tiber 5 Llsionen auf je 10 Blatthslften = nicht iiber 30 S) i) o 10 1, o+ + + + + + = iiber 100 i, 1, I> 10 r>
van N. glu!. ‘> 3) ,, 1, Experimental
Cell Research
6
562
H. Zech
Nukleoproteide, die elektronenmikroskopisch als Stsbchen von vorwiegend normaler LBnge identifiziert wurden. X-K&per-haltige Gewebe enthielten grosse Mengen hochinfektiver Virussubstanz, die im frischen Zustand vorwiegend normale Partikellgngen zeigte. Sedimente von Material im Kristallstadium ergaben bedeutende Zunahme an Virussubstanz im Verhsltnis zum Frischgewicht der Ausgangsblstter. Die PrHparate enthielten aber einen auffallend hohen Anteil von Partikeln kurzer Ltingen (etwa l/3). Die Anzahl kurzer Teilchen nahm in Prgparaten aus Isinger infiziertem Ausgangsmaterial noch zu. Eine fast isodiametrische Fraktion liess sich durch differentiales Ultrazentrifugieren abtrennen. Bei pH 34 aggregierten diese Partikel zu den gewiihnlichen Taktoiden (11). PCilimintire Bestimmung des RNSGehaltes dieser Fraktion nach iiblicher Hydrolysierung ergab im Beckman-Spektrometer in der 2600 A-Bande nur ein unbedeutendes Maximum im Vergleich zu dem der ,,X-body-Fraktion“. Wenn die hier gefundenen nukleinsgurearmen Komponenten mit den von anderen Autoren (6,12) beschriebenen RNS-freien Antigenen identisch sind, kannen sie keine friihen Aufbaustufen des TMV darstellen. Sie scheinen vielmehr in sptiten Stadien der TMV-Erkrankung gebildet zu werden und mijgen eine Voraussetzung fiir die demonstrierbare Abnahme der Infektivitgt bei gleichzeitiger Zunahme von isolierbarer Virussubstanz sein. Die Bedeutung der Nukleinssuren fiir die biologische Aktivitgt des Tabakmosaikvirus wird erneut unterstrichen. Andererseits lassen diese Beobachtungen darauf schliessen, dass die Synthese anomaler Proteine such dann weiterzugehen scheint, wenn die komplement~re Rolle der RNS im proklamierten Matrizensystem der Virusreduplikation (2) nicht mehr gesichert erscheint. Ich bin Herrn Professor Dr. T. Caspersson und der Deutschen Forschungsgemeinschaft fiir die ErmBglichung dieser Arbeit zu grossem Dank verpflichtet. REFERENCES
1.
BAWDEN, F. C., und PIRIE, N. W., .Brit. J. Exptl. Pathol., 26, 294 (1945). CALDWELL, P. C., und HINSHELWOOD, C. N., J. Chem. Sot., IV, 3156 (1950). CASPERSSON, T., J. Roy. Microscop. Sot., 608, 8 (1940). --, Cell Growth and Cell Funtion, 1950. FRIEDRICH-FREI(SA, Naturwissenschhften, 28, 376 (1940). JEENER, R., und LEMOINE, P., Nature (London), 171, 935 (1953). 7. KLECZK~W&KI, A., Ann. appZ..Biol., 36; 139 (1949). 8. KUHN, R., Chemie, 55, 1 (1942). 9. MOBERGER, G., LINDSTRBM, B., und ANDERSSON, L., Expil. Cell Research, 6, 228 (1954). 162, 963 (1948). 10. OGSTON, A. G., Nature (London), 11. SCHRAMM, G., Z. Naturforsch., 2b, 112 (1947). 12. TAKAHASHI, W. N., und ISHII, M., Am. J. Bot., 40, 85 (1953). 13. ZECH, H., Ptanfa, 40, 461 (1952).
2. 3. 4. 5. 6.
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(1954)
MORPHOLOGISCHE UND CYTOCHEMISCHE BEOBACHTUNGEN AN TABAKMOSAIKVIRUS-INFIZIERTEN PROTOPLASTEN VON NICWZ’IANA TABACUM H. ZECH Institut
.fiir
Zellforschung
und
V ERFOLGT
Genetik, Medizinisches Nobelinstitut, Stockholm, Schweden
Karolinska
Institutet,
man die intraplasmatischen Veranderungen in individuell mit Tabakmosaikvirus (TMV) infizierten Haarzellen von Nicotiana tabacum (13) oder in Zellen von Blattern, die nach mechanischer Inokulierung mit TMV unter weitgehend konstanten Bedingungen gehalten wurden (25’ C, 8000 Lux, komplette Nahrliisung), so lassen sich leicht vier Stadien verschiedener Infektivitatsqualitaten abgrenzen (N. glutinosa-Test, 7). 1. Wahrend der Periode verstarkter Zellaktivitat (Cyclosis) bis zu beginnender X-K&per-Bildung sind keine infektiven Substanzen zu isolieren. 2. Mit dem Auftreten von einem oder mehreren amorphen X-KGrpern erreicht die Infektivitat der Isolate ihren Hohepunkt, urn dann 3. nach Abbau der X-bodies und mit dem Erscheinen intraplasmatischer Kristalle progressiv abzusinken. 4. Im Spatstadium der Infektion, wenn die Kristalle aufgeliist oder von kristallinen Fibrillen ersetzt werden, ist nur noch schwache Infektivitat nachweisbar. Der durch diese bekannten Stadien grob markierte Gesamtverlauf der Zellinfektion zeigt nun im einzelnen an lebendem und gefriergetrocknetem (9) Material auffallende morphologische Veranderungen, die zum Teil such von cytochemisch fassbaren (3, 4) substantiellen Konzentrationsschwankungen im Protoplasten begleitet sind. Wahrend der ekliptischen Periode der Virusvermehrung wandeln Zellkern und Nukleolus in bestimmtern Rhythmus Grosse und Gestalt. Friihestens 4, spatestens20 h nach Inokulierung zeigt sich der Zellkern von einer zunachst scharf umgrenzten und spater diffuser erscheinenden Zone U. V.-absorbierender Substanz (2600-2900 A) umgeben. Mit dem Auftreten zahlreicher, im gleichen Wellenbereich stark absorbierender Partikel, die vom striimenden Plasma mitgefuhrt werden, verschwindet dieser Absorptionsmantel wieder. In diesem, fur die frtihe Virusinfektion typischen Infektionsstadium, das oft tagelang andauern kann, ist eine auffallende Reduktion des Kernvolumens bemerkbar, die sich such U.V.-spektrographisch in der Abnahme der Gesamtabsorption des Zellkerns ausdrtickt. Mit beginnender X-K&per-Bildung nimmt das Kernvolumen wieder langsam zu und bleibt wahrend der X-body-Periode relativ konstant, aber immer unter den Proportionen vergleichbarer gesunder Kerne. Mit dem Auftreten von Kristallen innerhalb der zerfallenden X-Korper oder in bestimmten Zonen des Cytoplasmas lndern sich die Kernverhlltnisse von neuem. Kern und Nukleolus kiinnen bis zum Vierfachen ihres urspriinglichen Volumens anschwellen. Die U. V.Extinctionswerte zeigen such hier eine Massenzunahme an. Im Spatstadium der Infektion werden die Kristalle wieder aufgeliist, die Plasmastrange verlaufen dann in eigenartig geraden und starren Bahnen. Meist fallen in ihnen flexible kristalline Experimental
Cell Research
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Tabakmosaikvirusinfizierte
Protoplasten
von Nicotiana
561
tabacum
Fibrillen aus, die sich zu Strangen vereinigen konnen und mit der Zeit wieder verschwinden. Die Phanomene der Kristallbildung und des Kristallabbaues konnen sich in der gleichen Zelle mehrfach wiederholen. Bei der Beobachtung der Kristallbildung in lebenden Zellen (Phasenkontrast 1500 X) wurde folgender morphologische Befund gemacht: In Grtlich begrenzten, fein vernetzten Zonen des stromenden Plasmas entstehen dichtere blbchenformige Gebilde von wenigen p 0. Diese treten fast stets in spiegelbildsymmetrischen und zuntichst zusammenhangenden Zwillingsformen auf. Durch Anlagerung weiterer Schichten vergrossern sie sich zusehends zu rundlichen Kristalloiden. Der Kristallisationsprozess schreitet von aussen nach innen fort. Schliesslich entstehen regelmassige hexagonale Platten und schollenformige unregelmassige Prismen. Auffallend ist die anomale Ansammlung fadenformiger Mitochondrien in diesen Plasmabezirken. Die Beobachtung solcher Doppelformen liefert vielleicht einen Beitrag zu den Vorstellungen iiber die Anlagerung von Substratmolekiilen im Kraftfeld eines Matrizensystems bei der Bildung von Proteinkristallen (5, 8, 10). In Tabelle I sind die mittleren Extinctionswerte (2650 und 2800 A) von mindestensje 10 vergleichbaren Zellen der beschriebenenStadien nach Korrektur fur Lichtstreuung und unspezifische Absorption in Beziehung zur relativen Infektivitat entsprechender Gewebeteile gesetzt. Auf Grund der beschriebenen wechselnden Infektivitatsverhaltnisse der Zellen im Laufe der Viruserkrankung erschien eswichtig, die Virussubstanzen der einzelnen Stadien durch differentiale Ultrazentrifugierung zu isolieren. Unter konstanten Bedingungen gehaltene, moglichst gleichmassiginfizierte Blattgewebe wurden zum gewiinschten Zeitpunkt geerntet, extrahiert (la), die Extrakte zentrifugiert und elektronenoptisch untersucht. Bisherige Ergebnisse: Es gelang such bei Variierung der Extraktionsmethoden und Zentrifugierungszeiten nicht, eine anomale makromolekulare Proteinkomponente von Geweben, die bis zu 20 h inokuliert waren, zu isolieren. Das Stadium beginnender X-body-Bildung ergab geringe Mengen anomaler TABELLE
I
E 2650 E 2800
Anzahl Lokall. N. gZut.
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j +++t-
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o+l-
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= keine Llsionen auf Nicotiana glutinosa. oo+ = nicht tiber 5 Llsionen auf je 10 Blatthslften = nicht iiber 30 S) i) o 10 1, o+ + + + + + = iiber 100 i, 1, I> 10 r>
van N. glu!. ‘> 3) ,, 1, Experimental
Cell Research
6
562
H. Zech
Nukleoproteide, die elektronenmikroskopisch als Stsbchen von vorwiegend normaler LBnge identifiziert wurden. X-K&per-haltige Gewebe enthielten grosse Mengen hochinfektiver Virussubstanz, die im frischen Zustand vorwiegend normale Partikellgngen zeigte. Sedimente von Material im Kristallstadium ergaben bedeutende Zunahme an Virussubstanz im Verhsltnis zum Frischgewicht der Ausgangsblstter. Die PrHparate enthielten aber einen auffallend hohen Anteil von Partikeln kurzer Ltingen (etwa l/3). Die Anzahl kurzer Teilchen nahm in Prgparaten aus Isinger infiziertem Ausgangsmaterial noch zu. Eine fast isodiametrische Fraktion liess sich durch differentiales Ultrazentrifugieren abtrennen. Bei pH 34 aggregierten diese Partikel zu den gewiihnlichen Taktoiden (11). PCilimintire Bestimmung des RNSGehaltes dieser Fraktion nach iiblicher Hydrolysierung ergab im Beckman-Spektrometer in der 2600 A-Bande nur ein unbedeutendes Maximum im Vergleich zu dem der ,,X-body-Fraktion“. Wenn die hier gefundenen nukleinsgurearmen Komponenten mit den von anderen Autoren (6,12) beschriebenen RNS-freien Antigenen identisch sind, kannen sie keine friihen Aufbaustufen des TMV darstellen. Sie scheinen vielmehr in sptiten Stadien der TMV-Erkrankung gebildet zu werden und mijgen eine Voraussetzung fiir die demonstrierbare Abnahme der Infektivitgt bei gleichzeitiger Zunahme von isolierbarer Virussubstanz sein. Die Bedeutung der Nukleinssuren fiir die biologische Aktivitgt des Tabakmosaikvirus wird erneut unterstrichen. Andererseits lassen diese Beobachtungen darauf schliessen, dass die Synthese anomaler Proteine such dann weiterzugehen scheint, wenn die komplement~re Rolle der RNS im proklamierten Matrizensystem der Virusreduplikation (2) nicht mehr gesichert erscheint. Ich bin Herrn Professor Dr. T. Caspersson und der Deutschen Forschungsgemeinschaft fiir die ErmBglichung dieser Arbeit zu grossem Dank verpflichtet. REFERENCES
1.
BAWDEN, F. C., und PIRIE, N. W., .Brit. J. Exptl. Pathol., 26, 294 (1945). CALDWELL, P. C., und HINSHELWOOD, C. N., J. Chem. Sot., IV, 3156 (1950). CASPERSSON, T., J. Roy. Microscop. Sot., 608, 8 (1940). --, Cell Growth and Cell Funtion, 1950. FRIEDRICH-FREI(SA, Naturwissenschhften, 28, 376 (1940). JEENER, R., und LEMOINE, P., Nature (London), 171, 935 (1953). 7. KLECZK~W&KI, A., Ann. appZ..Biol., 36; 139 (1949). 8. KUHN, R., Chemie, 55, 1 (1942). 9. MOBERGER, G., LINDSTRBM, B., und ANDERSSON, L., Expil. Cell Research, 6, 228 (1954). 162, 963 (1948). 10. OGSTON, A. G., Nature (London), 11. SCHRAMM, G., Z. Naturforsch., 2b, 112 (1947). 12. TAKAHASHI, W. N., und ISHII, M., Am. J. Bot., 40, 85 (1953). 13. ZECH, H., Ptanfa, 40, 461 (1952).
2. 3. 4. 5. 6.
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Celt Research
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