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Nouvelle détermination des acides aminés basiques du lysozyme
588
VOL. 8
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA
(1952)
Short Communications and Preliminary Notes NOUVELLE
DI~TERMINATION
D E S A C I D E S AMINI~S B A S I Q U E S D U L Y S O Z Y M E par
ROGER MONIER, YVES GENDRON, M A R I A N J U T I S Z ET C L A U D E F R O M A G E O T Laboratoire de Chimie biologique de la Facultd des Sciences, Paris (France)
L a c o n s t i t u t i o n globale en acides a m i n e s du l y s o z y m e est a c t u e l l e m e n t ~ p e u pros c o m p l ~ t e m e n t ~lucid6e 1. Q u e l q u e s i n c e r t i t u d e s s u b s i s t e n t toutefois, n o t a m m e n t en ce qui c o n c e r n e la t e n e u r en lysine 1. I1 ~tait donc utile de r e p r e n d r e le dosage des trois acides a m i n 6 s b a s i q u e s d u l y s o z y m e , histidine, lysine et arginine, p a r u n proc6d~ f o n d a m e n t a l e m e n t diff6rent de c e u x utilis~s jusqu'ici. D a n s ce b u t , n o u s a v o n s utilis~ la m ~ t h o d e de MOORE ~T STEIN ~, en m e t t a n t e n o e u v r e u n e colonne de D o w e x 5o et les t a m p o n s pr~conis6s p a r ces a u t e u r s , et en e m p l o y a n t u n appareil collecteur de fractions* a n a l o g u e & celui d6crit p a r JAMES, MARTIN ET RANDALL3. U n e premiere sdrie d'exp6riences, faites en u t i l i s a n t des m61anges c o n n u s des trois bases, s o i g n e u s e m e n t purifi6es, et d a n s des p r o p o r t i o n s voisines de celles off elles e x i s t e n t d a n s le lysozyme, n o u s a m o n t r 6 q u e leur s 6 p a r a t i o n et leur r6cup6ration 6 t a i e n t q u a n t i t a t i v e s (~ 2 % pros) p o u r la lysine et l'arginine, et m o i n s rdguli~res p o u r l'histidine; cette irr6gularit6, q u e l'on r e t r o u v e d a n s les chiffres d u T a b l e a u I, est d u e ~ la q u a n t i t 6 de cette derni~re base, faible ici p a r r a p p o r t & celle des d e u x autres. Le l y s o z y m e cristallis~, h o m o g ~ n e , est h y d r o l y s 6 p a r HC1 6 N ~ IIO °, p e n d a n t 2 4 heures, en t u b e scelld, sous vide. L ' h y d r o l y s a t , traitd de la m a n i ~ r e habituelle, est repris p a r le t a m p o n (citrate o.I M) ~ p H 5.o, de fa$on q u ' u n e prise de I m l c o r r e s p o n d e ~ e n v i r o n 6 m g de l y s o z y m e iso~lectrique. Cette prise, plac6e s u r la colonne, est suivie de la s6rie de t a m p o n s d6crits p a r MOOR~ E~ STEIN ~. Le p r e m i e r t a m p o n 5. p H 5 p e r m e t d'61iminer les acides a m i n 6 s a u t r e s que le t r y p t o p h a n e et les trois acides a m i n 6 s b a s i q u e s ; ceux-ci, de m 6 m e q u e l ' a m m o n i a c , s o r t e n t e n t r e les t u b e s 3 ° et 25o (Fig. z). Amm~tc¢
1
Ly~ne
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Tr;vpfophc~e
Hl~tCne
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#~ 6.9 (p~sphate~.
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1~p~ 6.5 (cffrato) _ _
~0
Fig. I. Courbe c o r r e s p o n d a n t & l'exp~rience 4; l y s o z y m e iso~lectrique 5.68 m g L e s r d s u l t a t s o b t e n u s s o n t donnds p a r les courbes de la Fig. x et les ehiffres du t a b l e a u ci-dessous. E x p r i m 6 s en rdsidus p a r mol6cule de l y s o z y m e (N = I8.6 % ; P.M. = I4,7oo), les chiffres du T a b l e a u i c o r r e s p o n d e n t &: H i s t i d i n e I, L y s i n e 6, Arginine i I . Ces v a l e u r s c o n f i r m e n t d ' u n e fa~on p a r f a i t e celles que L E w i s et al. 4 a v a i e n t o b t e n u e s p a r voie microbiologique. E n ce qui coneerne le t r y p t o * Cet appareil a p u ~tre c o n s t r u i t grace A l'aide de la F o n d a t i o n Rockefeller, q u e n o u s s o m m e s h e u r e u x de remercier ici.
VOL. B (1952)
SHORT COMMUNICATIONS, PRELIMINARY NOTES
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p h a n e , on r e t r o u v e de 5 ° h 6o % de la q u a n t i t 6 i n i t i a l e m e n t c o n t e n u e d a n s la prot6ine. Q u a n t ~t l ' a m m o n i a c , sa r6cup6ration est irr6guli~re; en t r o u v e des v a l e u r s oscillant e n t r e 1. 7 et 2.o, avec u n e m o y e n n e de 1.8 % de l y s o z y m e . TABLEAU I R]~CUP]~RATION DES ACIDES AMINES BASIQUES, EN ~o DU LYSOZYME
Expdrience i
Histidine -
2 3 4 Moyenne : Rdsidus:
-
Lysine -
0.83 1.54 1.12 i. 16 i. i
A rginine
-
5.94 6.oo 6.16 6.o 3 6. i
13.4 12.8 13.1 12. 9 13- i i i .o
BIBLIOGRAPHIE i H. L. FEVOLD, Adv. in Protein Chemistry, 6 (1951) 188. s S. MOORE ET W. STEIN, J. Biol. Chem., 192 (1951) 663. a A. T. JAMES, A. J. P. MARTIN ET S. S. RANDALL, Biochem. J., 49 (1951) 293. 4 j . C. L E w i s , N. S. SNELL, D. J. HIRSCHMANN ET H. FRA•NKEL-CONRAT, J. Biol. Chem., 186 (195 o) 23. ReQu le 6 m a r s 1952
COs-FIXATION IN PIGEON
BREAST MUSCLE
by C. H. M O N F O O R T
Laboratory [or Physiological Chemistry, The University, Utrecht (Netherlands)
GRUBER AND M E I J E R 1 f o u n d indications of a COs-fixation reaction, influenced b y t h e a d d i t i o n of t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t e (TPP) in vitro, occurring u n d e r anaerobic c o n d i t i o n s in L a t a p i e m i n c e of t h e m u s c l e of t h e left ventricle of t h e pig heart. I succeeded in finding m o r e d i s t i n c t clues for t h e occurrence of s u c h .~ reaction in h o m o g e n a t e s of pigeon b r e a s t m u s c l e (m. pectoralis major) in o.i M p h o s p h a t e buffer, p H 6.2. W o r k i n g w i t h pigeons offers t h e g r e a t a d v a n t a g e as c o m p a r e d w i t h pig h e a r t t h a t t h e a c t i v i t y of certain e n z y m e s , capable of m e t a b o l i z i n g p y r u v i c acid u n d e r a n a e r o b i c conditions, c a n be s t u d i e d in several stages of v i t a m i n - B t deficiency, so t h a t t h e role of t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t e in c o n n e c t i o n w i t h t h e s e r e a c t i o n s c a n be e s t a b l i s h e d m o r e conclusively• T h e a m o u n t s of acetoin f o r m e d f r o m N a p y r u v a t e were c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t s of CO s p r o d u c e d s i m u l t a n e o u s l y . I n M n ++ s u p p l e m e n t e d h o m o g e n a t e s of b r e a s t m u s c l e of n o r m a l l y fed pigeons, t h e a m o u n t of CO s p r o d u c e d a l w a y s s h o w e d a deficit as c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t calculated according to t h e reaction: z p y r u v i c acid ----+ i acetoin + 2 CO s T h e deficit is increased b y a d d i n g T P P in vitro. T h i s effect is p r o b a b l y d u e to d a m a g e of t h e tissue b y h o m o g e n i z i n g B r e a s t m u s c l e h o m o g e n a t e s f r o m pigeons, w h i c h h a d c o n s u m e d a carboh y d r a t e - r i c h , t h i a m i n e - t r e e diet s a d m i n i s t e r e d b y forced feeding for twelve days, s h o w e d n o or only a v e r y slight CO s deficit, u n d e r t h e s a m e conditions, w h i c h w a s a g a i n increased to t h e v a l u e s f o u n d for h o m o g e n a t e s f r o m n o r m a l pigeons b y a d d i t i o n of T P P in vitro (Table I). T h i s CO s deficit c a n in m y opinion o n l y be i n t e r p r e t e d b y a s s u m i n g a reaction c o n s u m i n g CO s, viz. COs-fixation. T h e presence of Mn++ h a s b e e n s h o w n to be essential in all cases of COs-fixation s t u d i e d b y o t h e r a u t h o r s (see OcrlOa3). H e n c e m y observation, t h a t t h e described CO s deficit is a b s e n t w h e n Mn++ is o m i t t e d or replaced b y ME++, provides f u r t h e r evidence for t h e p r e s u m e d T P P - c a t a l y z e d CO2-fixation in pigeon b r e a s t m u s c l e h o m o g e n a t e . I n h o m o g e n a t e s of t h e muscle of t h e left ventricle of t h e pigeon h e a r t t h e CO z p r o d u c t i o n
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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA
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Short Communications and Preliminary Notes NOUVELLE
DI~TERMINATION
D E S A C I D E S AMINI~S B A S I Q U E S D U L Y S O Z Y M E par
ROGER MONIER, YVES GENDRON, M A R I A N J U T I S Z ET C L A U D E F R O M A G E O T Laboratoire de Chimie biologique de la Facultd des Sciences, Paris (France)
L a c o n s t i t u t i o n globale en acides a m i n e s du l y s o z y m e est a c t u e l l e m e n t ~ p e u pros c o m p l ~ t e m e n t ~lucid6e 1. Q u e l q u e s i n c e r t i t u d e s s u b s i s t e n t toutefois, n o t a m m e n t en ce qui c o n c e r n e la t e n e u r en lysine 1. I1 ~tait donc utile de r e p r e n d r e le dosage des trois acides a m i n 6 s b a s i q u e s d u l y s o z y m e , histidine, lysine et arginine, p a r u n proc6d~ f o n d a m e n t a l e m e n t diff6rent de c e u x utilis~s jusqu'ici. D a n s ce b u t , n o u s a v o n s utilis~ la m ~ t h o d e de MOORE ~T STEIN ~, en m e t t a n t e n o e u v r e u n e colonne de D o w e x 5o et les t a m p o n s pr~conis6s p a r ces a u t e u r s , et en e m p l o y a n t u n appareil collecteur de fractions* a n a l o g u e & celui d6crit p a r JAMES, MARTIN ET RANDALL3. U n e premiere sdrie d'exp6riences, faites en u t i l i s a n t des m61anges c o n n u s des trois bases, s o i g n e u s e m e n t purifi6es, et d a n s des p r o p o r t i o n s voisines de celles off elles e x i s t e n t d a n s le lysozyme, n o u s a m o n t r 6 q u e leur s 6 p a r a t i o n et leur r6cup6ration 6 t a i e n t q u a n t i t a t i v e s (~ 2 % pros) p o u r la lysine et l'arginine, et m o i n s rdguli~res p o u r l'histidine; cette irr6gularit6, q u e l'on r e t r o u v e d a n s les chiffres d u T a b l e a u I, est d u e ~ la q u a n t i t 6 de cette derni~re base, faible ici p a r r a p p o r t & celle des d e u x autres. Le l y s o z y m e cristallis~, h o m o g ~ n e , est h y d r o l y s 6 p a r HC1 6 N ~ IIO °, p e n d a n t 2 4 heures, en t u b e scelld, sous vide. L ' h y d r o l y s a t , traitd de la m a n i ~ r e habituelle, est repris p a r le t a m p o n (citrate o.I M) ~ p H 5.o, de fa$on q u ' u n e prise de I m l c o r r e s p o n d e ~ e n v i r o n 6 m g de l y s o z y m e iso~lectrique. Cette prise, plac6e s u r la colonne, est suivie de la s6rie de t a m p o n s d6crits p a r MOOR~ E~ STEIN ~. Le p r e m i e r t a m p o n 5. p H 5 p e r m e t d'61iminer les acides a m i n 6 s a u t r e s que le t r y p t o p h a n e et les trois acides a m i n 6 s b a s i q u e s ; ceux-ci, de m 6 m e q u e l ' a m m o n i a c , s o r t e n t e n t r e les t u b e s 3 ° et 25o (Fig. z). Amm~tc¢
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p h a n e , on r e t r o u v e de 5 ° h 6o % de la q u a n t i t 6 i n i t i a l e m e n t c o n t e n u e d a n s la prot6ine. Q u a n t ~t l ' a m m o n i a c , sa r6cup6ration est irr6guli~re; en t r o u v e des v a l e u r s oscillant e n t r e 1. 7 et 2.o, avec u n e m o y e n n e de 1.8 % de l y s o z y m e . TABLEAU I R]~CUP]~RATION DES ACIDES AMINES BASIQUES, EN ~o DU LYSOZYME
Expdrience i
Histidine -
2 3 4 Moyenne : Rdsidus:
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Lysine -
0.83 1.54 1.12 i. 16 i. i
A rginine
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5.94 6.oo 6.16 6.o 3 6. i
13.4 12.8 13.1 12. 9 13- i i i .o
BIBLIOGRAPHIE i H. L. FEVOLD, Adv. in Protein Chemistry, 6 (1951) 188. s S. MOORE ET W. STEIN, J. Biol. Chem., 192 (1951) 663. a A. T. JAMES, A. J. P. MARTIN ET S. S. RANDALL, Biochem. J., 49 (1951) 293. 4 j . C. L E w i s , N. S. SNELL, D. J. HIRSCHMANN ET H. FRA•NKEL-CONRAT, J. Biol. Chem., 186 (195 o) 23. ReQu le 6 m a r s 1952
COs-FIXATION IN PIGEON
BREAST MUSCLE
by C. H. M O N F O O R T
Laboratory [or Physiological Chemistry, The University, Utrecht (Netherlands)
GRUBER AND M E I J E R 1 f o u n d indications of a COs-fixation reaction, influenced b y t h e a d d i t i o n of t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t e (TPP) in vitro, occurring u n d e r anaerobic c o n d i t i o n s in L a t a p i e m i n c e of t h e m u s c l e of t h e left ventricle of t h e pig heart. I succeeded in finding m o r e d i s t i n c t clues for t h e occurrence of s u c h .~ reaction in h o m o g e n a t e s of pigeon b r e a s t m u s c l e (m. pectoralis major) in o.i M p h o s p h a t e buffer, p H 6.2. W o r k i n g w i t h pigeons offers t h e g r e a t a d v a n t a g e as c o m p a r e d w i t h pig h e a r t t h a t t h e a c t i v i t y of certain e n z y m e s , capable of m e t a b o l i z i n g p y r u v i c acid u n d e r a n a e r o b i c conditions, c a n be s t u d i e d in several stages of v i t a m i n - B t deficiency, so t h a t t h e role of t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t e in c o n n e c t i o n w i t h t h e s e r e a c t i o n s c a n be e s t a b l i s h e d m o r e conclusively• T h e a m o u n t s of acetoin f o r m e d f r o m N a p y r u v a t e were c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t s of CO s p r o d u c e d s i m u l t a n e o u s l y . I n M n ++ s u p p l e m e n t e d h o m o g e n a t e s of b r e a s t m u s c l e of n o r m a l l y fed pigeons, t h e a m o u n t of CO s p r o d u c e d a l w a y s s h o w e d a deficit as c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t calculated according to t h e reaction: z p y r u v i c acid ----+ i acetoin + 2 CO s T h e deficit is increased b y a d d i n g T P P in vitro. T h i s effect is p r o b a b l y d u e to d a m a g e of t h e tissue b y h o m o g e n i z i n g B r e a s t m u s c l e h o m o g e n a t e s f r o m pigeons, w h i c h h a d c o n s u m e d a carboh y d r a t e - r i c h , t h i a m i n e - t r e e diet s a d m i n i s t e r e d b y forced feeding for twelve days, s h o w e d n o or only a v e r y slight CO s deficit, u n d e r t h e s a m e conditions, w h i c h w a s a g a i n increased to t h e v a l u e s f o u n d for h o m o g e n a t e s f r o m n o r m a l pigeons b y a d d i t i o n of T P P in vitro (Table I). T h i s CO s deficit c a n in m y opinion o n l y be i n t e r p r e t e d b y a s s u m i n g a reaction c o n s u m i n g CO s, viz. COs-fixation. T h e presence of Mn++ h a s b e e n s h o w n to be essential in all cases of COs-fixation s t u d i e d b y o t h e r a u t h o r s (see OcrlOa3). H e n c e m y observation, t h a t t h e described CO s deficit is a b s e n t w h e n Mn++ is o m i t t e d or replaced b y ME++, provides f u r t h e r evidence for t h e p r e s u m e d T P P - c a t a l y z e d CO2-fixation in pigeon b r e a s t m u s c l e h o m o g e n a t e . I n h o m o g e n a t e s of t h e muscle of t h e left ventricle of t h e pigeon h e a r t t h e CO z p r o d u c t i o n