- Email: [email protected]
P153 Le cytosquelette et l’appareil de Golgi sont requis pour le trafic de la Cx36 dans les cellules Min6
Diabète – Genève 2011
pour le trafic de la Cx36 dans les cellules Min6 A. Gustavo Fort, P. Meda Université de Genève, Genève, Suisse.
Introduction : La connexine 36 (Cx36) permet la communication directe entre cellules. Dans la cellule des îlots de Langerhans, la Cx36 joue un rôle important en tant que régulateur de la sécrétion d’insuline. Toutefois, la régulation et le transport intracellulaire de la Cx36 dans les cellules sont peu connus. Matériels et méthodes : Afin de déterminer si la Cx36 suit la voie du transport normal des protéines à la membrane plasmique, nous avons évalué l’effet d’inhibiteur des microtubules (nocodazole), des microfilaments (cytochalasin D) et de l’appareil de Golgi (brefeldin A) sur la distribution et fonction de la Cx36 dans une lignée murine des cellules (MIN6). Résultats : Nous avons montré par imagerie sur cellules vivantes, marquage immunologique et quantification des membranes que le trafic de la Cx36 vers la membrane plasmique et son expression, sont grandement affectés par la perturbation de l’appareil de Golgi et des microtubules, mais pas par celle des microfilaments. Cependant, des expériences de transfert intercellulaire des traceurs fluorescents et l’analyse des oscillations de calcium, qui dans les îlots pancréatiques sont synchronisées par la Cx36, démontrent que la fonction de la Cx36 est affectée dans tous les cas. Conclusion : Nous démontrons que la machinerie de transport protéique est nécessaire au fonctionnement de la Cx36. Les microtubules et l’appareil de Golgi permettent le transport de la Cx36 vers la périphérie de la cellule, tandis que les microfilaments seraient impliqués dans son incorporation membranaire. Toute condition affectant la fonction de l’appareil de Golgi, la structure des microtubules et/ou des microfilaments dans la cellule, peut donc affecter la Cx36, et par là, la sécrétion d’insuline.
P154 E2F1, sécrétion d’insuline et production de glucose hépatique : cible thérapeutique dans le traitement du diabète ? J.-S. Annicotte1, E. Blanchet1, P.-D. Dénéchaud1, S. Dalle2, L. Fajas1 1
IGMM, Montpellier ; IGF, Montpellier.
2
Introduction : Les cellules bêta pancréatiques, considérées comme le capteur des niveaux de glucose circulants, contrôlent la sécrétion d’insuline par un processus finement régulé. Des dysfonctionnements de ce type cellulaire sont à l’origine de pathologies comme le Diabète Mellitus ou le cancer. Par conséquent, une compréhension complète des facteurs et des mécanismes responsables du maintien du pool de cellules bêta ou au cours de la régénération est de haute importance et pourrait conduire à de nouvelles thérapies pour le traitement de diabète. Nous avons démontré que certains régulateurs du cycle cellulaire, comme E2F1, CDK4 et pRb, régulateurs clé de la progression dans le cycle cellulaire, sont impliqués dans l’homéostasie du glucose et des lipides via leurs fonctions dans l’adipogenèse, le métabolisme énergétique, la croissance post-natale bêta pancréatique et la sécrétion d’insuline, fournissant la preuve pour d’un double rôle de ces protéines dans les tissus produisant et/ou cibles de l’insuline. Matériels et méthodes : Des souris invalidées pour E2F1 seront utilisées comme modèle d’étude. Une caractérisation métabolique de ces souris sera réalisée in vivo. Des expérimentations in vitro permettant l’identification des gènes cibles de E2F1 seront effectuées par les techniques d’immunoprecipitation de la chromatine et d’expression génique. Résultats : Dans cette étude, nous allons démontrer le rôle joué par E2f1 sur le métabolisme du glucose, et ses conséquences bénéfiques contre le diabète. Une attention particulière sera portée sur le rôle joué par E2F1 dans la cellule bêta pancréatique dans le contrôle transcriptionnel en réponse à l’insuline, ainsi que sur la production de glucose hépatique, deux mécanismes fortement altérés au cours du diabète. Conclusion : L’identification de E2F1 comme facteur prépondérant dans le contrôle de la sécrétion d’insuline et la production de glucose hépatique permettra de cibler cette voie dans le traitement de maladies métaboliques, telles que le diabète ou l’obésité.
P155 Différences de sécrétion d’insuline dans une cohorte 2
3
1
P156 Identification de cibles moléculaires mitochondriales communes à différents stresses dans le dysfonctionnement des cellules bêta T. Brun1, P. Scarcia2, F. Palmieri2, P. Maechler1 1
Département de Physiologie Cellulaire et Métabolisme, Université de Genève, Centre Médical Universitaire, Genève, Suisse ; 2 Département de Pharmaco-Biologie, Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Université de Bari, Bari, Italie.
Introduction : Une exposition chronique des cellules pancréatiques bêta à des stresses aussi variés qu’une concentration élevée de glucose, d’acides gras ou d’oxydants induit un dysfonctionnement du couplage entre le métabolisme du glucose et la sécrétion d’insuline, généralement lié au métabolisme mitochondrial et entraîne l’apoptose. Afin de déterminer les mécanismes moléculaires respectifs de ces différents stresses associés au diabète, nous avons voulu identifier de nouvelles cibles en combinant une analyse sélective de l’expression de gènes impliqués dans la fonction mitochondriale avec des outils bio-informatiques récemment développés. Un intérêt particulier a été porté sur l’expression des transporteurs mitochondriaux de la famille Slc25a. Matériels et méthodes : Les cellules INS-1E ont été cultivées pendant trois jours en présence de stresses variés : concentrations de glucose basse (5,5 mM), intermédiaire (11,6 mM) et élevée (25 mM), de 0,4 mM palmitate ou d’oléate ou à un stress oxydatif (200microM H2O2) transitoire de 10 minutes. Après isolation de l’ARN total et synthèse de l’ADNc, le profil d’expression des 57 gènes d’intérêt sélectionnés a été obtenu par RT-PCR au moyen d’une carte micro-fluide (Mito-array). Les résultats ont été intégrés dans le programme bio-informatique Cytoscape, afin d’établir un réseau compréhensible des interactions géniques et de visualiser les changements complexes d’expression d’ARNm suite aux différents stresses. Résultats : Parmi les 49 gènes détectés dans les cellules INS-1E, nous avons identifié l’expression de 22 transporteurs mitochondriaux de la famille Slc25a. Une concentration élevée de glucose induit l’expression de plusieurs transporteurs (Slc25a1, Slc25a10, Slc25a13) ; résultats compatibles avec une activité anaplérotique/cataplérotique élevée. Le degré d’insaturation des acides gras modifie l’expression des nombreux gènes de manière opposée, suggérant des effets spécifiques sur la cellule bêta tels que toxicité versus dysfonctionnement. Conclusion : Une meilleure compréhension des réseaux métaboliques altérés dans le dysfonctionnement des cellules bêta suite à différentes stresses sera utile dans l’approche thérapeutique du diabète.
P157 L’inflammation et le dysfonctionnement de la cellule bêta-pancréatique Compréhension des mécanismes d’action de l’IL1-bêta, par l’analyse de la dynamique membranaire et des radeaux lipidiques de cellules INS-1 M. Chentouf, C. Jahannault, F. Séjalon, R. Gross, S. Peraldi-Roux
de patients adultes atteints de mucoviscidose 1
pour la mutation 'F508 ont un plus grand risque de développer le CFRD. Cependant, très peu d’études ont examiné l’effet du genre et du génotype sur la sécrétion d’insuline. Le but principal de cette étude était donc de comparer la sécrétion d’insuline entre les hommes et les femmes avec des génotypes différents. Patients et méthodes : 196 sujets adultes non diabétiques ont été recrutés dans la clinique de MV du CHUM. Leurs génotypes ont été extraits de leurs dossiers médicaux. Tous les sujets ont subi une hyperglycémie provoquée oralement (HGPO) afin de déterminer leur tolérance au glucose : tolérance normale (NGT), intolérance (IGT) ou diabète. Des échantillons de sang ont été prélevés toutes les 30 min pendant 2 h pour mesurer les niveaux d’insuline. La sécrétion d’insuline et la sensibilité ont été évaluées à l’aide d’indices connus tels que le Stumvoll. Résultats : À excursion glycémique comparable, les valeurs d’insuline varie entre les génotypes et entre les genres : les hétérozygotes et les femmes ont une sécrétion d’insuline plus élevée que les homozygotes et les hommes. Le suivi prospectif sur 2 ans indique que cette insulinémie élevée semble protéger de la dégradation de l’état glycémique des patients. Discussion : Dans un groupe important de patients MV, sans diagnostic antérieur de diabète, on observe une association entre une sécrétion d’insuline plus élevée et l’état hétérozygote pour la mutation F508 et/ou le genre.
SFD
P153 Le cytosquelette et l’appareil de Golgi sont requis
CPID CNRS UMR 5232, Montpellier. 4
L. Belson , S. Ziai , Y. Berthiaume , L. Coderre , R. Rabasa-Lhoret 1
Institut de Recherches Cliniques de Montréal, Montréal, Canada ; Université de Montréal, Montréal, Canada ; Centre Hospitalier de l’Université de Montréal, Montréal, Canada ; 4 Centre de Recherche sur le Diabète de Montréal, Montréal, Canada. 2 3
Introduction : La mucoviscidose (MV) est la plus fréquente maladie létale autosomique récessive chez les Caucasiens et est due à une mutation du gène CFTR. La mutation principale est une délétion d’un acide aminé en position 508 (F508). L’espérance de vie des patients MV s’est beaucoup améliorée et conséquememment de nouvelles complications telles que le diabète lié à la MV ont vu le jour (CFRD). Des études ont montré que les femmes et les sujets homozygotes
Objectif : Les effets de l’IL1-bêta ont été décrits précédemment, il est avéré que cette interleukine participe à la prolifération, la différenciation et l’apoptose, mais par quels mécanismes cellulaires opère t’elle, et a-t-elle un effet propre sur la sécrétion d’insuline de cellules bêta-pancréatiques. Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes d’action de l’IL1-bêta et plus particulièrement au rôle des plates-formes de signalisation que sont les radeaux lipidiques. Matériels et méthodes : Les cellules INS-1 sont stimulées par l’IL1-bêta, l’état général des cellules est alors évalué (sécrétion, prolifération, apoptose). D’autre part les radeaux lipidiques sont isolés par gradient de sucrose/ultra-centrifugation, et leur composition protéique est analysée par Antibody Array et Western Blot. Diabetes Metab 2011, 37, A36-A108
A71
pour le trafic de la Cx36 dans les cellules Min6 A. Gustavo Fort, P. Meda Université de Genève, Genève, Suisse.
Introduction : La connexine 36 (Cx36) permet la communication directe entre cellules. Dans la cellule des îlots de Langerhans, la Cx36 joue un rôle important en tant que régulateur de la sécrétion d’insuline. Toutefois, la régulation et le transport intracellulaire de la Cx36 dans les cellules sont peu connus. Matériels et méthodes : Afin de déterminer si la Cx36 suit la voie du transport normal des protéines à la membrane plasmique, nous avons évalué l’effet d’inhibiteur des microtubules (nocodazole), des microfilaments (cytochalasin D) et de l’appareil de Golgi (brefeldin A) sur la distribution et fonction de la Cx36 dans une lignée murine des cellules (MIN6). Résultats : Nous avons montré par imagerie sur cellules vivantes, marquage immunologique et quantification des membranes que le trafic de la Cx36 vers la membrane plasmique et son expression, sont grandement affectés par la perturbation de l’appareil de Golgi et des microtubules, mais pas par celle des microfilaments. Cependant, des expériences de transfert intercellulaire des traceurs fluorescents et l’analyse des oscillations de calcium, qui dans les îlots pancréatiques sont synchronisées par la Cx36, démontrent que la fonction de la Cx36 est affectée dans tous les cas. Conclusion : Nous démontrons que la machinerie de transport protéique est nécessaire au fonctionnement de la Cx36. Les microtubules et l’appareil de Golgi permettent le transport de la Cx36 vers la périphérie de la cellule, tandis que les microfilaments seraient impliqués dans son incorporation membranaire. Toute condition affectant la fonction de l’appareil de Golgi, la structure des microtubules et/ou des microfilaments dans la cellule, peut donc affecter la Cx36, et par là, la sécrétion d’insuline.
P154 E2F1, sécrétion d’insuline et production de glucose hépatique : cible thérapeutique dans le traitement du diabète ? J.-S. Annicotte1, E. Blanchet1, P.-D. Dénéchaud1, S. Dalle2, L. Fajas1 1
IGMM, Montpellier ; IGF, Montpellier.
2
Introduction : Les cellules bêta pancréatiques, considérées comme le capteur des niveaux de glucose circulants, contrôlent la sécrétion d’insuline par un processus finement régulé. Des dysfonctionnements de ce type cellulaire sont à l’origine de pathologies comme le Diabète Mellitus ou le cancer. Par conséquent, une compréhension complète des facteurs et des mécanismes responsables du maintien du pool de cellules bêta ou au cours de la régénération est de haute importance et pourrait conduire à de nouvelles thérapies pour le traitement de diabète. Nous avons démontré que certains régulateurs du cycle cellulaire, comme E2F1, CDK4 et pRb, régulateurs clé de la progression dans le cycle cellulaire, sont impliqués dans l’homéostasie du glucose et des lipides via leurs fonctions dans l’adipogenèse, le métabolisme énergétique, la croissance post-natale bêta pancréatique et la sécrétion d’insuline, fournissant la preuve pour d’un double rôle de ces protéines dans les tissus produisant et/ou cibles de l’insuline. Matériels et méthodes : Des souris invalidées pour E2F1 seront utilisées comme modèle d’étude. Une caractérisation métabolique de ces souris sera réalisée in vivo. Des expérimentations in vitro permettant l’identification des gènes cibles de E2F1 seront effectuées par les techniques d’immunoprecipitation de la chromatine et d’expression génique. Résultats : Dans cette étude, nous allons démontrer le rôle joué par E2f1 sur le métabolisme du glucose, et ses conséquences bénéfiques contre le diabète. Une attention particulière sera portée sur le rôle joué par E2F1 dans la cellule bêta pancréatique dans le contrôle transcriptionnel en réponse à l’insuline, ainsi que sur la production de glucose hépatique, deux mécanismes fortement altérés au cours du diabète. Conclusion : L’identification de E2F1 comme facteur prépondérant dans le contrôle de la sécrétion d’insuline et la production de glucose hépatique permettra de cibler cette voie dans le traitement de maladies métaboliques, telles que le diabète ou l’obésité.
P155 Différences de sécrétion d’insuline dans une cohorte 2
3
1
P156 Identification de cibles moléculaires mitochondriales communes à différents stresses dans le dysfonctionnement des cellules bêta T. Brun1, P. Scarcia2, F. Palmieri2, P. Maechler1 1
Département de Physiologie Cellulaire et Métabolisme, Université de Genève, Centre Médical Universitaire, Genève, Suisse ; 2 Département de Pharmaco-Biologie, Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Université de Bari, Bari, Italie.
Introduction : Une exposition chronique des cellules pancréatiques bêta à des stresses aussi variés qu’une concentration élevée de glucose, d’acides gras ou d’oxydants induit un dysfonctionnement du couplage entre le métabolisme du glucose et la sécrétion d’insuline, généralement lié au métabolisme mitochondrial et entraîne l’apoptose. Afin de déterminer les mécanismes moléculaires respectifs de ces différents stresses associés au diabète, nous avons voulu identifier de nouvelles cibles en combinant une analyse sélective de l’expression de gènes impliqués dans la fonction mitochondriale avec des outils bio-informatiques récemment développés. Un intérêt particulier a été porté sur l’expression des transporteurs mitochondriaux de la famille Slc25a. Matériels et méthodes : Les cellules INS-1E ont été cultivées pendant trois jours en présence de stresses variés : concentrations de glucose basse (5,5 mM), intermédiaire (11,6 mM) et élevée (25 mM), de 0,4 mM palmitate ou d’oléate ou à un stress oxydatif (200microM H2O2) transitoire de 10 minutes. Après isolation de l’ARN total et synthèse de l’ADNc, le profil d’expression des 57 gènes d’intérêt sélectionnés a été obtenu par RT-PCR au moyen d’une carte micro-fluide (Mito-array). Les résultats ont été intégrés dans le programme bio-informatique Cytoscape, afin d’établir un réseau compréhensible des interactions géniques et de visualiser les changements complexes d’expression d’ARNm suite aux différents stresses. Résultats : Parmi les 49 gènes détectés dans les cellules INS-1E, nous avons identifié l’expression de 22 transporteurs mitochondriaux de la famille Slc25a. Une concentration élevée de glucose induit l’expression de plusieurs transporteurs (Slc25a1, Slc25a10, Slc25a13) ; résultats compatibles avec une activité anaplérotique/cataplérotique élevée. Le degré d’insaturation des acides gras modifie l’expression des nombreux gènes de manière opposée, suggérant des effets spécifiques sur la cellule bêta tels que toxicité versus dysfonctionnement. Conclusion : Une meilleure compréhension des réseaux métaboliques altérés dans le dysfonctionnement des cellules bêta suite à différentes stresses sera utile dans l’approche thérapeutique du diabète.
P157 L’inflammation et le dysfonctionnement de la cellule bêta-pancréatique Compréhension des mécanismes d’action de l’IL1-bêta, par l’analyse de la dynamique membranaire et des radeaux lipidiques de cellules INS-1 M. Chentouf, C. Jahannault, F. Séjalon, R. Gross, S. Peraldi-Roux
de patients adultes atteints de mucoviscidose 1
pour la mutation 'F508 ont un plus grand risque de développer le CFRD. Cependant, très peu d’études ont examiné l’effet du genre et du génotype sur la sécrétion d’insuline. Le but principal de cette étude était donc de comparer la sécrétion d’insuline entre les hommes et les femmes avec des génotypes différents. Patients et méthodes : 196 sujets adultes non diabétiques ont été recrutés dans la clinique de MV du CHUM. Leurs génotypes ont été extraits de leurs dossiers médicaux. Tous les sujets ont subi une hyperglycémie provoquée oralement (HGPO) afin de déterminer leur tolérance au glucose : tolérance normale (NGT), intolérance (IGT) ou diabète. Des échantillons de sang ont été prélevés toutes les 30 min pendant 2 h pour mesurer les niveaux d’insuline. La sécrétion d’insuline et la sensibilité ont été évaluées à l’aide d’indices connus tels que le Stumvoll. Résultats : À excursion glycémique comparable, les valeurs d’insuline varie entre les génotypes et entre les genres : les hétérozygotes et les femmes ont une sécrétion d’insuline plus élevée que les homozygotes et les hommes. Le suivi prospectif sur 2 ans indique que cette insulinémie élevée semble protéger de la dégradation de l’état glycémique des patients. Discussion : Dans un groupe important de patients MV, sans diagnostic antérieur de diabète, on observe une association entre une sécrétion d’insuline plus élevée et l’état hétérozygote pour la mutation F508 et/ou le genre.
SFD
P153 Le cytosquelette et l’appareil de Golgi sont requis
CPID CNRS UMR 5232, Montpellier. 4
L. Belson , S. Ziai , Y. Berthiaume , L. Coderre , R. Rabasa-Lhoret 1
Institut de Recherches Cliniques de Montréal, Montréal, Canada ; Université de Montréal, Montréal, Canada ; Centre Hospitalier de l’Université de Montréal, Montréal, Canada ; 4 Centre de Recherche sur le Diabète de Montréal, Montréal, Canada. 2 3
Introduction : La mucoviscidose (MV) est la plus fréquente maladie létale autosomique récessive chez les Caucasiens et est due à une mutation du gène CFTR. La mutation principale est une délétion d’un acide aminé en position 508 (F508). L’espérance de vie des patients MV s’est beaucoup améliorée et conséquememment de nouvelles complications telles que le diabète lié à la MV ont vu le jour (CFRD). Des études ont montré que les femmes et les sujets homozygotes
Objectif : Les effets de l’IL1-bêta ont été décrits précédemment, il est avéré que cette interleukine participe à la prolifération, la différenciation et l’apoptose, mais par quels mécanismes cellulaires opère t’elle, et a-t-elle un effet propre sur la sécrétion d’insuline de cellules bêta-pancréatiques. Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes d’action de l’IL1-bêta et plus particulièrement au rôle des plates-formes de signalisation que sont les radeaux lipidiques. Matériels et méthodes : Les cellules INS-1 sont stimulées par l’IL1-bêta, l’état général des cellules est alors évalué (sécrétion, prolifération, apoptose). D’autre part les radeaux lipidiques sont isolés par gradient de sucrose/ultra-centrifugation, et leur composition protéique est analysée par Antibody Array et Western Blot. Diabetes Metab 2011, 37, A36-A108
A71