P17-3 Utilisation de la cytométrie en flux pour le contrôle de qualité de la leucodéplétion des PSL

Session 17 - D61eucocytation des produits sanguins : bases scientifiques et m6thodologiques P17-1

Numdration des leucocytes rdsiduels des concentrds plaquettaires d'aphdr~se par cytomdtrie en flux ~ l"aide de billes calibrdes E Hardy, D Parlab6ne, I D u p o n t , N Boulic, F Q u i v o r o n , M C Leroy, C F6rec ETS Bretagne-Occidentale, 46, rue Fdlix-Le-Dantec, BP 454, 29275 Brest cedex Du fait de la g6n6ralisation de l'utilisation des produits sanguins d61eucocyt6s, les 6tablissements de transfusion sanguine devront disposer de techniques fiables, sensibles et standardisables pour la num6ration des leucocytes r6siduels afin d'assurer le contr61e qualit6 de ces pr6parations. Par cytom6trie en flux (CMF), il est possible de compter les globules blancs (GB) apr6s coloration des noyaux par l'iodure de propidium. Nous avons effectu6 des comptages de leucocytes sur des concentr6s plaquettaires d'aph6rbse avant et apr~s d61eucocytation par filtre int6gr~ (PALL LRF 6) (51 6chantillons). Le comptage des GB par CMF a 6t6 compar6 a celui obtenu par la technique de la Nageotte dilu6e (au 1/10). La technique de CMF que nous avons utilis6e est celle pr6conis6e par la soci6t6 Coulter a l'aide d e s r6actifs ADN Prep. Elle se d6roule en trois 6tapes : apr6s perm6abilisation des leucocytes par le LPR, les noyaux sont color6s par l'iodure de propidium (r6actif STAIN), puis des billes calibr6es, fluorescentes, de concentration connue (Flow-Count Coulter ®) sont ajout6es/i la pr6paration avant passage au cytombtre (FACScan Becton Dickinson'S). Les r6sultats obtenus par CMF sont bien corr616s ~ ceux de la Nageotte (r 2 =0,93). La num6ration des leucocytes a l'aide des r6actifs ADN Prep et billes Flow-Count est rapide, simple/t mettre en eeuvre et r6alisable par tout technicien d'un laboratoire de cytom6trie. Elle est adaptable ~ tout type de cytom6tre. Sensible et fiable, elle est parfaitement adapt6e au comptage des leucocytes a de trbs faibles concentrations. P17-2

Ddleucocytation pour les transfusions autologues differdes ~ l'aide des filtres intdgr~s Maco Pharma P M Fornasari, A Bassi, A Cenacchi Centro immunoematologia e Trasfusionale, IRCCS, Rizzoli hospital, Bologna, Italie Dans notre institut orthop6dique, le sang autologue est souvent utilis6 a une date proche de la p6remption sous

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forme de sang total ou concentr6 de globules rouges (CGR), non d61eucocyt6. Les transfusions autologues diff6r6es (TAD) couvrent 50 % de nos besoins, aussi nous avons men6 un protocole de recherche pour analyser les effets de la d61eucocytation sur la conservation du sang et sur les patients transfus6s. Quatre-vingts pr61bvements pour TAD ont 6t6 r6alis6s chez quatre groupes de patients en chirurgie orthop6dique majeure. Dans chaque groupe, 20 poches MacoPharma ont 6t6 pr61ev6es. Dix contr61es (ni appauvris ni d61eucocyt6s), et dix poches d61eucocyt6es (groupe 1,2,3) ou appauvries (groupe 4) selon le protocole suivant : - pr616vement sur CPD, s6paration, stockage une nuit 4 °C, filtration en ligne du CGR, stockage 42 jours ; - pr~l~vement sur CPD, stockage 4 h ~ 4 °C, filtration en ligne du sang total, s6paration, stockage 42 jours ; - pr616vement sur CPDA1, stockage 4h h 4 °C, filtration en ligne du sang total, stockage 35 jours ; - pr61bvement sur CPD, stockage 4h a 4 °C, s6paration avec 61imination du buffy coat, stockage 42 jours. Cinq 6chantillons ont 6t6 pr61ev6s dans chaque poche (apr6s le pr616vement, aprbs filtration, h J7, a J21, et ~ p6remption). Les contrhles suivants ont 6t6 r6alis6s : K, Na, C1, LDH, ATP, pH, Hb plasma, IL6, TNF, 61astase, chymotrypsine, c~2-M, c~I-AT, num6ration cellulaire et fragilit6 osmotique. Comptage Nageotte aprbs filtration. Pour le groupe 3, les FVII, fibrinog6ne et FDP ont 6t6 dos6s. Un examen des 6rythrocytes au microscope 61ectronique a 6t6 effectu6 sur des poches au cours du stockage. Les r6sultats seront pr6sent6s en d6tail. Ils nous am6nent a conclure que la d61eucocytation am61iore la qualit6 du sang pour les protocoles de transfusion autologue diff6r6e.

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Utilisation de la cytomdtrie en flux pour le contr6le de qualitd de la leucoddpldtion des PSL P Sedillo, A M G r i v e a u , E Lebrun, A Girard, A Batho, B Pelletier, A Rideau ETS Basse-Normandie, site de Caen, 1, rue du Professeur J-Rousselot, 14000 Caen La m6thode de r6f6rence en mati6re de quantification des leucocytes r6siduels des produits sanguins labiles deleucocyt6s (CGR et CPA) est le comptage en cellule de Nageotte, technique simple mais de r6alisation longue et fastidieuse. La cytom6trie en flux (CMF) est une alternative, nous rap-

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Session 17 - D61eucocytation des produits sanguins : bases scientifiques et m6thodologiques

portons ici les r6sultats obtenus lors de la validation de cette technique. Matdriel et mdthode : l'appareil utilis6 est un Facscan (Becton Dickinson), qui permet de compter les leucocytes r6siduels apr6s marquage de I'ADN nucl6aire par du bromure d'6thidium. L'emploi de billes calibr6es (Fluorospher Coulter) p e r m e t de m e s u r e r le v o l u m e des 6chantillons pass6s. L'6tude a port6 sur des concentr6s de globules rouges (CGR) et des concentr6s de plaquettes d'aph6r6se (CPA). Aprbs optimisation des conditions op6ratoires et v6rification de la pertinence de l'identification des noyaux leucocytaires marqu6s, une analyse de r6p~tabilit6 (30 6chant i l l o n s c a l i b r 6 s p o u r c h a q u e t y p e d e PSL) et d e reproductibilit6 (30 passages des m6mes 6chantillons pour les deux types de PSL). Soixante CGR et 30 CPA ont ensuite fair l'objet d ' u n comptage en cellule de Nageotte et en CMF.

protocole 1 : 20 unit6s pr61evdes le matin et s6par6es dans les 6 heures. Les CGR sont stock6s ~ 4 °C pour une filtration 4 °C dans les 24 heures. protocole 2 : 20 unit6s pr61ev6es l'apr6s-midi et s6par6es le lendemain dans les 18 heures. Les CGR sont filtr6s a 20 °C juste apr6s s6paration. Les param6tres contr616s sur les CGR DL sont : leucocytes r6siduels en Nageotte concentr6e /t J2 et ATP, Na + et K ÷ extracellulaires, pH, pO2, pCO2 et h6moglobine surnageante au 2L 35 ~ et 42 ~ jour de conservation. Rdsultats : l'utilisation et la manipulation du dispositif par les 6quipes de pr616vement sont satisfaisantes. En production, un soin particulier doit 8tre apport6 au pliage pour centrifugation. Apr6s s6paration, la solution de SAG-M est transf6r6e dans le CGR travers le filtre int6gr6, permettant ainsi un r6tro-amoNage. -

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Les rdsultats observds sont : Leucocytes r&iduels/gL

1,5 1,2 0,9 0,7 0.5 0,3 NF : non fait

Coefficients de variation (%) rdpdtabilitd reproductibilitd CGR

CPA

CGR

CPA

8,5 10,5 7 8,6 24 25,2

7 6,5 11,7 8,4 25,4 22,6

NF NF NF 8,5 NF 7,8

NF NF NF 12 NF 9,2

Les coefficients de corr61ation entre les deux m6thodes sont respectivement de 0,997 et 0,995 pour les CGR et les CPA. Conclusion : la CMF est une technique fiable, rapide et adapt6e aux num6rations de leucocytes r6siduels des produits sanguins.

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Evaluation d'un dispositif de prdl~vement et de filtration intdgrd des CGR Pall Leukotrap RC S B6gu6, F Robert, F Bertholey E T S Lyon, I-3, rue du Vercors, 69008 Lyon Objet : le dispositif de pr616vement et filtration int6gr6e du CGR Leukotrap RC a 6t6 ~valu6 sur les aspects pratiques d'utilisation au pr616vement eta la production ainsi que sur ses performances de d61eucocytation. Les r6sultats obtenus permettent de dOfinir les conditions d'utilisation et les proc6dures a mettre en place pour une utilisation en routine. Mdthode : 40 unit6s de 450 mL de sang total sont pr61ev6es puis trait6es selon deux protocoles :

GB x 10 6

Log ddpldtion

Hb (g)

Perte Hb (g)

Durde filtration

0,007 0,004 0,005

5,1 0,3 5,2

54,4 5,7 54,7

6,1 1,0 6,1

2 h 18' 57' 2 h 10'

0,124 0,121 0,084

4,0 0,7 3,9

52,9 5,6 52,5

4,9 0,7 5,0

29' 10' 28'

Protocole 1

Moyenne l~cart-type M4diane Protocole 2

Moyenne l~cart-type M4diane

Pour les deux protocoles, t o u s l e s CGR DL obtenus sont conformes aux caract6ristiques. La filtration a 4 °C donne un taux de leucocytes r6siduel plus faible, avec une perte 16g6rement sup6rieure en h6moglobine. Les dur6es de filtration sont d6pendantes de la temp6rature. A p6remption, les CGR DL sont conformes, avec un pourcentage d'h6molyse inferieur ~ 0,6 % (Norme europ6enne/t 0,8 %). La concentration en K ÷ est inf6rieure gl 60 mEq/L. Le suivi des param6tres de conservation montre qu'il n'y a pas de diff6rences significatives entre les deux temp6ratures de filtration. Conclusion : l'6valuation du dispositif Leukotrap RC montre qu'une maltrise parfaite de l'6tape de centrifugation est n6cessaire. Les concentr6s de globules rouges d61eucocyt6s obtenus sont conformes aux caract6ristiques, tant en sortie de production qu'& p6remption. Les r6sultats de la d61eucocytation r6alis6e a 20 °C dans les 24 heures suivant le pr616vement sont satisfaisants et montrent que cette m6rhode peut 6tre une alternative a la filtration ~ 4 °C.

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