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Phénotypes de résistance aux β-lactamines dans le genre Aeromonas
Pathologie Biologie 51 (2003) 290–296 www.elsevier.com/locate/patbio
Article original
Phénotypes de résistance aux b-lactamines dans le genre Aeromonas b-lactam-resistance phenotypes in the genus Aeromonas T. Fosse *, C. Giraud-Morin, I. Madinier Laboratoire de bactériologie, hôpital l’Archet 2, Centre Hospitalier Universitaire, BP 3079, 06202 Nice cedex 3, France Reçu le 24 septembre 2002 ; accepté le 20 décembre 2002
Résumé Ce travail a pour objectif d’étudier la distribution des phénotypes de résistance aux b-lactamines en corrélation avec la production de b-lactamases dans le genre Aeromonas. Sur 417 souches sauvages, l’identification biochimique corrélée à l’antibiogramme (11 b-lactamines testées) a révélé 5 phénotypes de base : • complexe Aeromonas hydrophila / b-lactamases de classe B, C et D ; • complexe Aeromonas caviae / b-lactamases de classe C et D ; • complexe Aeromonas veronii / b-lactamases de classe B et D ; • espèce Aeromonas schubertii / b-lactamase de classe D ; • espèce Aeromonas trota / b-lactamase de classe C. Sur 64 souches représentatives, nous avons déterminé les CMI de 8 b-lactamines associées à 3 inhibiteurs (acide clavulanique, tazobactam et BRL 42715). Pour ces 64 souches, le nombre de b-lactamases produites et leurs points iso-électriques ont été recherchés par isofocalisation analytique à partir d’extraits bruts. Les différentes espèces d’Aeromonas produisent 1 à 3 enzymes inductibles : une imipénémase produite à bas niveau dont le phénotype est difficile à détecter sur l’antibiogramme (classe B, pI 8, CMI imipénème > 2 µg/ml), une céphalosporinase (classe C, pI > 7 ± 0,5, CMI céfalotine > 256 µg/ml), et une oxacillinase largement répandue dans le genre Aeromonas (classe D, pI > 8,5, CMI ticarcilline > 256 µg/ml). Chez les Aeromonas les profils de résistance aux b-lactamines sont corrélés avec des phénotypes naturels de production de b-lactamases. En conclusion, la caractérisation de ces enzymes a des applications thérapeutiques et taxonomiques pour les Aeromonas d’identification délicate. © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract This work aimed to investigate resistance profiles towards b-lactam antibiotics in correlation with b-lactamases production in the genus Aeromonas. In a series of 417 wild-type strains, biochemical identification and testing with 11 b-lactams by the disk-diffusion method revealed 5 predominant phenotypes: • A. hydrophila complex / class B, C and D b-lactamases; • A. caviae complex / class C and D b-lactamases; • A. veronii complex / class B and D b-lactamases; • A. schubertii spp. / class D b-lactamase; • A. trota spp. / class C b-lactamase. A subgroup of 64 representative strains was submitted to MIC determination with 8 b-lactam compounds alone and in combination with 3 b-lactamase inhibitors (clavulanic acid, tazobactam and BRL 42715). Visualisation of b-lactamases and pI determination were performed in all these 64 isolates by isoelectric focusing from crude extracts. The different Aeromonas species produced 1 to 3 of the following inducible enzymes: an imipenemase with low expression, which is difficult to detect with routine phenotype studies (class B, pI 8, imipenem MIC >2 µg/ml), a cephalosporinase (class C, pI >7 ± 0.5, cephalothin MIC >256 µg/ml), and an oxacillinase widely produced in the genus Aeromonas (class D, pI >8.5, ticarcillin MIC >256 µg/ml). In Aeromonas spp. resistance profile to b-lactam antibiotics is correlated with naturally
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (T. Fosse). © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. DOI: 10.1016/S0369-8114(03)00027-0
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occurring phenotypes of b-lactamases production. As a conclusion, the characterisation of these different enzymes is of therapeutic and taxonomic interest, in species notoriously difficult to identify. © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Aeromonas ; Céphalosporinase ; Identification ; Imipénémase ; Oxacillinase Keywords: Aeromona; Cephalosporinase; Identification; Imipenemase; Oxacillinase
1. Introduction La famille des Aeromonadaceae, récemment séparée des Vibrionaceae, ne contient qu’un seul genre Aeromonas. Les Aeromonas peuvent être isolés à partir de l’eau, des aliments (crudités, crustacés), ainsi qu’à partir de prélèvements pathologiques chez l’homme et les animaux. Ils possèdent des facteurs de virulence dont le rôle n’est pas formellement démontré dans les infections humaines (entérotoxines, aérolysines et hémolysines). Le genre Aeromonas comporte actuellement 14 espèces ou groupes d’hybridation (HG1 à HG14) : Aeromonas hydrophila : HG1, Aeromonas bestiarum : HG2, Aeromonas salmonicida : HG3, Aeromonas caviae : HG 4 et 5B, Aeromonas media : HG4, HG5A et HG5B, Aeromonas eucrenophila : HG6, Aeromonas sobria : HG7, Aeromonas veronii biogroupe sobria : HG8, Aeromonas jandaei : HG9, Aeromonas veronii biogroupe veronii : HG10, Aeromonas encheleia : HG6 et HG11, Aeromonas schubertii : HG12, Aeromonas trota : HG13, Aeromonas allosaccharophila : HG8 et HG10, Aeromonas popoffıi : HG 14 [1–7]. Cette classification est appelée à de nouvelles évolutions taxonomiques. Cinq espèces seulement peuvent être fréquemment isolées chez l’homme : A. hydrophila, A. caviae, A. veronii biogroupe sobria, A. jandaei et A. schubertii. Pour cette raison, il est important d’identifier les Aeromonas au rang d’espèce [8,9]. Leur résistance naturelle aux b-lactamines est fréquemment associée à la production d’une à trois b-lactamases appartenant aux classes B, C ou D d’Ambler [17–21]. Cette production de b-lactamases complique le traitement des infections à Aeromonas, puisque les inhibiteurs classiques des b-lactamases prescrits en clinique (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam) sont surtout efficaces contre les enzymes de classe A [22]. Le BRL 42715 est un autre inhibiteur du groupe des pénèmes capable d’inhiber in vitro des enzymes de classe C et D, mais il n’est pas disponible en clinique [23,24]. Chez les bacilles Gram négatif, les oxacillinases (classe D) hydrolysent aussi l’amoxicilline et la ticarcilline, et elles sont très mal inhibées par les inhibiteurs classiques [14–16]. Enfin, pour les Aeromonas, la relation entre espèce, phénotype de résistance aux b-lactamines et identification des b-lactamases a été peu étudiée. Ce travail a pour objectif d’étudier la distribution des phénotypes de résistance aux b-lactamines en corrélation avec la production de b-lactamases dans le genre Aeromonas.
2. Matériel et méthodes 2.1. Souches bactériennes Nous avons étudié une série de 417 souches sauvages d’Aeromonas provenant de plusieurs laboratoires (Bordeaux, Clermont-Ferrand, Lyon, Nice et Strasbourg) et ayant été isolées de 1986–1998. Toutes ces souches répondaient aux critères d’identification du genre Aeromonas [13]. Les tests d’identification ont été réalisés selon les critères décrits par Altwegg et al. (1990), Carnahan et al. (1991), Abbott et al. (1992), et contrôlés sur les 19 souches de référence (collection Institut Pasteur, Paris) [1,10,11]. Les souches de référence testées sont les suivantes : A. hydrophila : ATCC 7966, A. bestiarum : ATCC 51108, A. salmonicida : ATCC 27013, ATCC 33658, ATCC 14174 ; A. caviae : ATCC 15468, A. media : ATCC 33907, A. eucrenophila : ATCC 23309, A. encheleia : CIP 104608T, A. trota : ATCC 49657, ATCC 49660, ATCC 49803 ; A. sobria : ATCC 9071, ATCC 43979 ; A. veronii : ATCC 35624, ATCC 49904 ; A. jandaei : ATCC 49568 ; A. schubertii : ATCC 43700 ; A. allosaccharophila : ATCC 51208. La majorité des cultures a été réalisée en aérobiose à 30 °C. Les souches ont été identifiées à l’aide de galeries commercialisées (Api 20E, Api 20NE, Api 32 GN et Api 20C Aux, BioMérieux, Marcy l’Étoile, France) et de tests unitaires (hémolysine, esculine, salicine, production d’H2S et gaz en glucose) [11]. L’utilisation de l’acide urocanique a permis de différencier A. hydrophila stricto sensu des autres espèces du complexe A. hydrophila [12]. 2.2. Détermination des profils de résistance aux b-lactamines Le profil de résistance aux b-lactamines des 417 souches sauvages d’Aeromonas a été déterminé par la méthode de diffusion en disques sur gélose selon les recommandations de la Société Française de Microbiologie [25]. Les antibiotiques suivant ont été testés : amoxicilline, amoxicilline-acide clavulanique, ticarcilline, ticarcilline-acide clavulanique, pipéracilline, imipénème, céfalotine, céfuroxime, céfoxitine, céfotaxime, céfopérazone, ceftazidime et cefsulodine (BioRad, Marnes-la-Coquette, France) [25]. Dans un second temps, nous avons déterminé les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de 8 b-lactamines visà-vis de 64 souches représentatives des 3 phénogroupes d’Aeromonas, par la technique de microdilution en milieu liquide. Chaque antibiotique a été testé seul et en association
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avec l’acide clavulanique, le tazobactam et le BRL 42715 (SmithKline Beecham, Brentford, U.K.). Les points critiques retenus par le Comité de l’antibiogramme sont les suivants : amoxicilline > 4 µg/ml, amoxicilline-acide clavulanique > 4/2 µg/ml, ticarcilline > 16 µg/ml, ticarcilline-acide clavulanique > 16/2 µg/ml, pipéracilline > 8 µg/ml, pipéracillinetazobactam > 8/2 µg/ml, imipénème > 4 µg/ml, céfalotine > 8 µg/ml, céfuroxime > 8 µg/ml, céfopérazone > 4 µg/ml et céfotaxime > 4 µg/ml [25]. 2.3. Identification des b-lactamases par isofocalisation analytique Les b-lactamases ont ensuite été étudiées par isofocalisation analytique pour ces 64 souches représentatives des phénotypes de base [14]. Cette technique permet de déterminer si une souche d’Aeromonas produit une ou plusieurs enzymes hydrolysant différents substrats, et de caractériser chaque enzyme par son point isoélectrique (pI) et le substrat préférentiel présent dans le gel de révélation. Brièvement, les bactéries ont été cultivées avec différents types d’inducteurs (imipénème 1 µg/ml, céfoxitine 10 µg/ml ou amoxicilline 25 µg/ml), lysées par ultrasons et ultracentrifugées, le surnageant correspondant à l’extrait enzymatique brut. Les points iso-électriques des différentes b-lactamases ont été déterminés à partir de ces extraits bruts sur gel de polyacrylamide selon les techniques usuelles [16]. Nous avons utilisé comme témoins 3 souches du laboratoire d’Escherichia coli recombinantes exprimant les 3 types de b-lactamases : une imipénémase de classe B / A. veronii biogroupe sobria, de pI 8 (gène cephA, GenBank no AY112998), une céphalosporinase de classe C / A. caviae, de pI 6,8 (gène ampC, GenBank no AF462690), et une oxacillinase de classe D / A. schubertii, de pI 8,5 (gène oxa, GenBank no AY112999). L’activité enzymatique et les points iso-électriques ont ensuite été révélés par un gel à l’iode contenant du méropénème (imipénémase), de la céfazoline (céphalosporinase) ou de l’oxacilline (oxacillinase) à 1 mg/ml [16]. La notion d’induction a été mise en évidence soit par un antagonisme à la lecture de l’antibiogramme, soit par la visualisation d’une bande supplémentaire sur les gels d’isofocalisation analytique. En raison du profil de substrat très spécifique de chaque type de b-lactamases [13,14], nous avons recherché dans cette étude la production d’imipénémases (classe B), de céphalosporinases (classe C) et d’oxacillinases (classe D), respectivement, chez les souches présentant une CMI > 2 µg/ml pour l’imipénème, > 256 µg/ml pour la céfalotine, et > 256 µg/ml pour la ticarcilline. 3. Résultats 3.1. Souches bactériennes et détermination des profils de résistance aux b-lactamines L’identification des 417 souches sauvages d’Aeromonas, ainsi que le résultat des antibiogrammes vis-à-vis de 11
b-lactamines sont donnés dans le Tableau 1. Toutes les espèces d’Aeromonas sont résistantes à l’amoxicilline, à la ticarcilline et à un moindre niveau à l’imipénème, excepté le complexe A. caviae qui reste globalement sensible à l’imipénème. La pipéracilline est relativement active avec 72 à 100 % de souches sensibles, et son activité est peu dépendante des espèces. Toutes les espèces présentent également une faible synergie amoxicilline-acide clavulanique et ticarcilline-acide clavulanique : l’acide clavulanique est donc peu actif chez les Aeromonas. Toutes espèces confondues, les céphalosporines les plus actives sont le céfuroxime (céphalosporine de deuxième génération), ainsi que le céfotaxime, la céfopérazone et la ceftazidime (céphalosporines de troisième génération). Les espèces des complexes A. hydrophila et A. caviae sont presque toutes résistantes à la céfalotine (céphalosporine de première génération). Contrairement aux souches du complexe A. hydrophila, les espèces du complexe A. caviae peuvent présenter un antagonisme entre la céfoxitine ou l’imipénème (inducteurs) et le céfuroxime ou le céfotaxime (substrats pour visualiser l’induction), qui est dû aux céphalosporinases inductibles. Environ 70 % des espèces du complexe A. hydrophila et 85 % des espèces du complexe A. veronii présentent une résistance de bas niveau à l’imipénème (Tableau 1). Cette résistance est mieux visualisée en augmentant la densité de l’inoculum. La synthèse des résultats des identifications et des antibiogrammes révèle 5 phénotypes de base en fonction du ou des types de b-lactamases produites (Tableau 2). La détermination des CMI confirme ces résultats (Tableau 3). 3.2. Identification des b-lactamases par isofocalisation analytique L’isofocalisation analytique permet d’identifier chez les Aeromonas trois b-lactamases appartenant aux groupes B, C ou D d’Ambler (Tableau 2). Une imipénémase de classe B confère la résistance à l’imipénème avec une CMI > 2 µg/ml et un pI autour de 8 avec peu de variations. Cette enzyme est produite à bas niveau à l’état basal par la majorité des souches appartenant aux complexes A. hydrophila et A. veronii, mais elle devient visible après induction ou augmentation de l’inoculum. Elle est mal inhibée par l’acide clavulanique et le tazobactam. La lecture seule des diamètres d’inhibition sans isofocalisation analytique ne permet pas toujours de différencier les souches qui ont une imipénémase de celles qui n’en ont pas [25]. Une céphalosporinase de classe C confère la résistance à la céfalotine avec une CMI > 256 µg/ml et un pI égal à 7 ± 0,5. Cette deuxième enzyme est produite par plus de 80 % des souches du complexe A. hydrophila. C’est une céphalosporinase qui peut présenter un caractère inductible visualisé par l’antagonisme entre différents inducteurs (imipénème, céfoxitine) et différents substrats, en particulier le céfuroxime qui présente un caractère classant pour ce caractère. Ce caractère inductible est retrouvé chez de nombreuses
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Tableau 1 Activité des b-lactamines déterminée par antibiogramme sur 417 souches sauvages d’Aeromonas Souches d’Aeromonas (Total)
• Complexe A. hydrophila (107) A. hydrophila (66) A. bestiarum (37) A. salmonicida (4) • Complexe A. caviae (203) A. caviae (196) A. media (7) • Complexe A. veronii (107) A. sobria (5) A. veronii biogroupe sobria (87) A. veronii biogroupe veronii (4) A. jandaei(11) Souches d’Aeromonas (Total) • Complexe A. hydrophila (107) A. hydrophila (66) A. bestiarum (37) A. salmonicida (4) • Complexe A. caviae (203) A. caviae (196) A. media (7) • Complexe A. veronii (107) A. sobria (5) A. veronii biogroupe sobria (87) A. veronii biogroupe veronii (4) A. jandaei (11)
Amoxicilline
Amoxicilline Acide clavulanique
Nombre de souches sensibles (%) Ticarcilline Ticarcilline Pipéracilline Acide Clavulanique
25 µg (%)
20/10 µg (%)
75 µg (%)
75/10 µg (%)
75 µg (%)
10 µg (%)
0 (0) 1 (2,7) 1 (25,0)
5 (7,6) 11 (29,7) 1 (25,0)
0 (0) 2 (5,4) 1 (25,0)
27 (40,9) 25 (67,6) 3 (75,0)
59 (89,4) 32 (86,5) 4 (100)
15 (22,7) 16 (43,2) 2 (50,0)
12 (6,1) 0 (0)
60 (30,6) 3 (42,9)
28 (14,3) 1 (14,3)
106 (54,1) 4 (57,1)
182 (92,9) 7 (100)
193 (98,5) 6 (85,7)
0 (0) 1,1 (1) 0 (0) 0 (0) C1G Céfalotine 30 µg (%)
2 (40,0) 15 (17,2) 0 (0) 0 (0)
1 (20,0) 4 (4,6) 1 (25,0) 1 (9,1) C2G Céfuroxime Céfoxitine 30 µg (%) 30 µg (%)
4 (80,0) 49 (56,3) 2 (50,0) 5 (45,4)
5 (100) 86 (98,8) 4 (100) 8 (72,7)
1 (20,0) 12 (13,8) 1 (25,0) 2 (18,2) C3G Céfopérazone Céfotaxime Céftazidime 30 µg (%) 30 µg (%) 30 µg (%)
Cefsulodine 30 µg (%)
1 (1,5) 7 (18,9) 0 (0)
63 (95,5) 37 (100) 4 (100)
42 (63,6) 27 (73,0) 2 (50,0)
62 (93,9) 37 (100) 4 (100)
64 (97,0) 37 (100) 4 (100)
65 (98,5) 37 (100) 4 (100)
39 (59,1) 25 (67,6) 2 (50,0)
6 (3,1) 0 (0)
183(93,4) 6 (85,7)
55 (28,1) 4 (57,1)
181 (92,3) 7 (100)
191(97,4) 7 (100)
191 (97,4) 7 (100)
99 (50,1) 7 (100)
3 (60,0) 64 (73,6) 3 (75,0) 9 (81,8)
5 (100) 87 (100) 4 (100) 11 (100)
5 (100) 82 (94,3) 3 (75,0) 11 (100)
5 (100) 86 (98,8) 4 (100) 11 (100)
5 (100) 87 (100) 4 (100) 11 (100)
5 (100) 87 (100) 4 (100) 11 (100)
3 (60,0) 68 (78,2) 1 (25,0) 5 (45,5)
espèces du complexe A. caviae, ainsi que chez les 3 souches de références de l’espèce A. trota, mais il est moins marqué dans le complexe A. hydrophila. Cette céphalosporinase, peu active contre la céfoxitine et le céfotaxime en l’absence d’induction, est mal inhibée par l’acide clavulanique et le tazobactam mais très sensible à l’action du BRL 42715. Une oxacillinase de classe D confère la résistance à la ticarcilline à plus de 75 % des souches testées (CMI > 256 µg/ml, pI > 8,5), ainsi que la résistance à l’amoxicilline à presque 100 % des souches testées, à l’exception de l’espèce A. trota qui ne la produit pas. Elle est faiblement ou non inhibée par l’acide clavulanique et le tazobactam, contrairement au BRL 42715 qui est très actif sur cette enzyme. Cette
Imipénème
troisième enzyme est habituellement très bien exprimée, mais elle n’est pas toujours facile à différencier de l’imipénémase car les 2 bandes sont proches sur les gels d’isofocalisation. 3.3. Action des inhibiteurs des b-lactamases sur les b-lactamases des Aeromonas Ce travail confirme que l’acide clavulanique, qui inhibe mal les pénicillinases de classe D, est inefficace pour restaurer l’activité de l’amoxicilline et de la ticarcilline chez les Aeromonas qui produisent essentiellement des pénicillinases de classe D. Le tazobactam n’offre aucune supériorité sur
Tableau 2 Profils de résistance aux b-lactamines dans le genre Aeromonas : mise en évidence de 5 phénotypes de base chez les souches productrices de b-lactamases
Complexe A. hydrophila Complexe A. caviae Complexe A. veronii Espèce A. schubertii Espèce A. trota 1
Type de b-lactamases (point iso-électrique) Céphalosporinase2 Imipénémase1 (pI 8) (pI 7 ± 0,5) + + – + + – – – – +
Oxacillinase3 (pI > 8,5) + + + + –
Imipénémase : CMI imipenème > 2 µg/ml ; 2 céphalosporinase : CMI céfalotine > 256 µg/ml ; 3 oxacillinase : CMI ticarcilline > 256 µg/ml.
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Tableau 3 Activité de 8 b-lactamines et de 3 inhibiteurs des b-lactamases vis-à-vis de 64 souches représentatives des 3 principaux phénotypes d’Aeromonas spp. (Points critiques : amoxicilline > 4 µg/ml, amoxicilline–acide clavulanique > 4/2 µg/ml, ticarcilline > 16 µg/ml, ticarcilline–acide clavulanique > 16/2 µg/ml, pipéracilline > 8 µg/ml, pipéracilline–tazobactam > 8/2 µg/ml, imipénème > 4 µg/ml, céfalotine et céfuroxime > 8 µg/ml, céfopérazone et céfotaxime > 4 µg/ml).
Amoxicilline BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Ticarcilline BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Pipéracilline BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Imipénème BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfalotine BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfuroxime BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfopérazone BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfotaxime BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam
Phénotypes (nbre de souches) Complexe A. hydrophila (38) CI90 Min CI50 1024 1024 1 0,5 0,5 0,008 512 512 1 512 512 1 128 128 16 0,25 0,25 0,008 64 64 2 64 64 2 4 4 0,25 0,25 0,25 0,008 2 2 0,25 4 4 0,25 1 1 0,125 0,5 0,5 0,125 0,75 0,75 0,125 0,5 0,5 0,06 256 256 2 4 4 0,5 512 512 2 128 128 2 1 1 0,125 1 1 0,06 1 1 0,125 1 1 0,125 0,5 0,5 0,03 0,25 0,25 0,08 0,5 0,5 0,03 0,5 0,5 0,03 0,06 0,06 0,008 0,06 0,06 0,008 0,06 0,06 0,008 0,06 0,06 0,008
Max 4096 1 4096 4096 2048 8 2048 2048 1024 1 256 256 32 16 16 16 2048 16 2048 2048 16 8 16 64 32 8 32 32 8 0,25 8 8
Complexe A. caviae (27) CI50 CI90 Min 512 2048 4 0,5 8 0,125 256 1024 8 256 2048 2 64 256 0,5 0,25 8 0,125 32 256 2 0,5 512 0,5 4 16 0,25 0,5 2 0,03 2 16 0,25 2 32 0,25 0,25 0,5 0,06 0,125 0,25 0,06 0,125 0,5 0,06 0,125 0,25 0,06 512 2048 8 8 256 0,5 512 2048 16 8 2048 32 4 128 0,125 2 32 0,03 4 128 0,5 2 128 0,125 2 16 0,06 0,5 8 0,03 2 16 0,06 0,5 8 0,06 0,25 8 0,03 0,125 2 0,016 0,25 16 0,03 0,25 8 0,03
l’acide clavulanique chez les Aeromonas. Contrairement aux inhibiteurs classiques, le BRL 42715 restaure l’activité de l’amoxicilline et de la ticarcilline par inhibition de l’oxacillinase (classe D), ainsi que l’activité de la céfalotine en inhibant la céphalosporinase (classe C) (Tableau 3). 4. Discussion Cette étude de la distribution des b-lactamases sur une grande série de souches identifiées au rang d’espèce montre que les Aeromonas synthétisent une à trois b-lactamases suivant les phénogroupes ou les espèces. La détermination des CMI en milieu liquide et l’utilisation du BRL 42715 sont plus sensibles que l’antibiogramme de routine pour caractériser les souches produisant plusieurs b-lactamases [24]. Walsh et al. (1995) et Hayes et al. (1996) ont décrit les premiers la synthèse d’imipénémases produites à bas niveau [14,26], et plusieurs auteurs ont décrit la large distribution d’oxacillinases ayant des propriétés de pénicillinases dans
Max 4096 4096 2048 4096 2048 2048 1024 2048 1024 64 32 256 0,5 0,5 0,5 0,5 2048 2048 2048 2048 128 128 256 128 128 128 128 128 16 8 64 16
Complexe A. veronii (19) CI50 CI90 Min 1024 4096 32 0,25 1 0,125 512 2048 8 256 2048 1 256 1024 4 0,125 0,5 0,06 128 512 2 128 512 0,5 4 32 0,25 0,25 0,5 0,125 4 64 0,25 2 256 0,25 2 16 0,25 2 16 0,25 2 8 0,125 2 8 0,125 16 512 0,5 2 16 1 16 512 1 8 256 1 0,25 2 0,125 0,5 2 0.125 0,25 2 0,125 0,25 2 0,125 0,25 1 0,03 0,25 1 0,06 0,25 0,5 0,06 0,25 1 0,06 0,016 0,125 0,008 0,016 0,06 0,008 0,016 0,25 0,008 0,016 0,25 0,008
Max 4096 1 4096 4096 2048 0,5 1024 > 4096 64 0,5 256 512 64 64 64 64 512 32 1024 512 4 4 4 4 2 1 2 4 0,25 0,25 0,5 0,25
toutes les espèces du genre Aeromonas, excepté A. trota [14–16]. Au total, lorsqu’une souche d’ Aeromonas est isolée en clinique le traitement s’oriente généralement vers les aminosides ou les fluoroquinolones au détriment des b-lactamines. Les céphalosporines de troisième génération sont à proscrire en monothérapie dans les infections à Aeromonas du phénogroupe A. hydrophila qui produisent une céphalosporinase non inductible. Elles sont également à éviter contre les espèces du phénogroupe A. caviae et A. trota, en raison du phénomène d’induction de céphalosporinases et du risque de sélection de mutants résistants en cours de traitement. Il faut cependant noter que certaines souches d’ Aeromonas sont naturellement résistantes à la céfoxitine, surtout dans l’espèce A. caviae, ce qui pourrait impliquer un autre mécanisme de résistance. Ce travail montre que l’identification des Aeromonas au rang de phénogroupe permet de mieux moduler l’approche thérapeutique, grâce à une meilleure connaissance de la distribution des b-lactamases. Ainsi, bien que les espèces du
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complexe A. hydrophila synthétisent en général une imipénémase produite à bas niveau, une céphalosporinase et une oxacillinase, il reste possible de prescrire de l’aztréonam qui reste actif [17–19]. De même, chez les espèces du complexe A. caviae qui ne produisent pas de métallo-enzymes de classe B, l’imipénème peut être prescrit en première intention. Enfin, les espèces du phénogroupe A. veronii produisent souvent une imipénémase et une oxacillinase mais rarement des céphalosporinases, ce qui autorise le recours aux céphalosphorines de 3e génération [14]. En effet, les enzymes de classe B sont des métallo-b-lactamases qui hydrolysent essentiellement les carbapénèmes chez les Aeromonas, et sont faiblement inhibées par les inhibiteurs classiques. La métallo-enzyme des Aeromonas est celle qui a le spectre le plus étroit. Les enzymes de classe C sont des b-lactamases à sérine qui hydrolysent les céphalosporines mais sont peu sensibles aux inhibiteurs classiques. Enfin, les enzymes de classe D sont des b-lactamases à sérine qui hydrolysent l’oxacilline, et présentent de faibles homologies de séquences avec les autres b-lactamases à sérine [22]. Ce travail confirme que l’acide clavulanique et le tazobactam sont peu actifs contre la céphalosporinase de classe C et la pénicillinase de classe D produites par les Aeromonas (Tableau 3). En revanche, le BRL 42715 qui est un inhibiteur à large spectre serait beaucoup plus efficace contre ces 2 types d’enzymes, mais il n’est pas commercialisé actuellement. En dehors des applications thérapeutiques, la caractérisation des phénotypes naturels de production des b-lactamases peut être une aide à l’identification. En effet, dans la classification actuelle il existe des divergences entre l’identification phénotypique réalisée en routine, et l’identification génotypique réalisée dans les laboratoires spécialisés [10]. L’identification biochimique permet d’attribuer environ 80 % des souches à 3 phénogroupes principaux : le complexe A. hydrophila (HG1, 2, 3 et 14), le complexe A. caviae (HG4, 5, 6, 11 et 13), le complexe A. veronii (HG7, 8, 9, 10 et 12) [1,10–12]. Le profil de résistance peut aussi aider à l’identification des espèces. Ainsi, les Aeromonas sont sensibles à la colistine sauf A. jandaei (résistant) et A. hydrophila (résistance variable) [5,13]. Ils sont aussi résistants aux aminopénicillines sauf A. trota, et aux céphalosporines de première génération sauf les espèces du complexe A. veronii [14–16]. Le clonage de ces différentes enzymes devrait permettre de mettre au point des techniques de PCR pour aider à l’identification des souches atypiques grâce à leur contenu enzymatique [15,16,18–21,27,28]. Ainsi, l’identification des b-lactamases permet une différenciation nette de l’espèce A. schubertii qui synthétise uniquement une oxacillinase, ou de l’espèce A. trota qui ne produit qu’une céphalosporinase inductible. Les techniques de biologie moléculaire, quand elles seront disponibles en routine, seront particulièrement indiquées pour identifier les b-lactamases produites à bas niveau [26] ou inductibles [28,29]. En conclusion, chez les Aeromonas les profils de résistance aux b-lactamines sont corrélés avec la production de
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b-lactamases. La caractérisation de ces enzymes a des applications non seulement thérapeutiques mais aussi taxonomiques pour ces espèces dont l’identification est notoirement délicate. Remerciements Nous remercions F. Mégraud (Bordeaux), B. Joly (Clermont-Ferrand), J. Frenay (Lyon) et H. Monteil (Strasbourg), qui nous ont adressé des souches d’Aeromonas. Nous remercions également Christiane Luciano et Maryse Cassar pour leur assistance technique. Références [1]
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Article original
Phénotypes de résistance aux b-lactamines dans le genre Aeromonas b-lactam-resistance phenotypes in the genus Aeromonas T. Fosse *, C. Giraud-Morin, I. Madinier Laboratoire de bactériologie, hôpital l’Archet 2, Centre Hospitalier Universitaire, BP 3079, 06202 Nice cedex 3, France Reçu le 24 septembre 2002 ; accepté le 20 décembre 2002
Résumé Ce travail a pour objectif d’étudier la distribution des phénotypes de résistance aux b-lactamines en corrélation avec la production de b-lactamases dans le genre Aeromonas. Sur 417 souches sauvages, l’identification biochimique corrélée à l’antibiogramme (11 b-lactamines testées) a révélé 5 phénotypes de base : • complexe Aeromonas hydrophila / b-lactamases de classe B, C et D ; • complexe Aeromonas caviae / b-lactamases de classe C et D ; • complexe Aeromonas veronii / b-lactamases de classe B et D ; • espèce Aeromonas schubertii / b-lactamase de classe D ; • espèce Aeromonas trota / b-lactamase de classe C. Sur 64 souches représentatives, nous avons déterminé les CMI de 8 b-lactamines associées à 3 inhibiteurs (acide clavulanique, tazobactam et BRL 42715). Pour ces 64 souches, le nombre de b-lactamases produites et leurs points iso-électriques ont été recherchés par isofocalisation analytique à partir d’extraits bruts. Les différentes espèces d’Aeromonas produisent 1 à 3 enzymes inductibles : une imipénémase produite à bas niveau dont le phénotype est difficile à détecter sur l’antibiogramme (classe B, pI 8, CMI imipénème > 2 µg/ml), une céphalosporinase (classe C, pI > 7 ± 0,5, CMI céfalotine > 256 µg/ml), et une oxacillinase largement répandue dans le genre Aeromonas (classe D, pI > 8,5, CMI ticarcilline > 256 µg/ml). Chez les Aeromonas les profils de résistance aux b-lactamines sont corrélés avec des phénotypes naturels de production de b-lactamases. En conclusion, la caractérisation de ces enzymes a des applications thérapeutiques et taxonomiques pour les Aeromonas d’identification délicate. © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract This work aimed to investigate resistance profiles towards b-lactam antibiotics in correlation with b-lactamases production in the genus Aeromonas. In a series of 417 wild-type strains, biochemical identification and testing with 11 b-lactams by the disk-diffusion method revealed 5 predominant phenotypes: • A. hydrophila complex / class B, C and D b-lactamases; • A. caviae complex / class C and D b-lactamases; • A. veronii complex / class B and D b-lactamases; • A. schubertii spp. / class D b-lactamase; • A. trota spp. / class C b-lactamase. A subgroup of 64 representative strains was submitted to MIC determination with 8 b-lactam compounds alone and in combination with 3 b-lactamase inhibitors (clavulanic acid, tazobactam and BRL 42715). Visualisation of b-lactamases and pI determination were performed in all these 64 isolates by isoelectric focusing from crude extracts. The different Aeromonas species produced 1 to 3 of the following inducible enzymes: an imipenemase with low expression, which is difficult to detect with routine phenotype studies (class B, pI 8, imipenem MIC >2 µg/ml), a cephalosporinase (class C, pI >7 ± 0.5, cephalothin MIC >256 µg/ml), and an oxacillinase widely produced in the genus Aeromonas (class D, pI >8.5, ticarcillin MIC >256 µg/ml). In Aeromonas spp. resistance profile to b-lactam antibiotics is correlated with naturally
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (T. Fosse). © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. DOI: 10.1016/S0369-8114(03)00027-0
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occurring phenotypes of b-lactamases production. As a conclusion, the characterisation of these different enzymes is of therapeutic and taxonomic interest, in species notoriously difficult to identify. © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Aeromonas ; Céphalosporinase ; Identification ; Imipénémase ; Oxacillinase Keywords: Aeromona; Cephalosporinase; Identification; Imipenemase; Oxacillinase
1. Introduction La famille des Aeromonadaceae, récemment séparée des Vibrionaceae, ne contient qu’un seul genre Aeromonas. Les Aeromonas peuvent être isolés à partir de l’eau, des aliments (crudités, crustacés), ainsi qu’à partir de prélèvements pathologiques chez l’homme et les animaux. Ils possèdent des facteurs de virulence dont le rôle n’est pas formellement démontré dans les infections humaines (entérotoxines, aérolysines et hémolysines). Le genre Aeromonas comporte actuellement 14 espèces ou groupes d’hybridation (HG1 à HG14) : Aeromonas hydrophila : HG1, Aeromonas bestiarum : HG2, Aeromonas salmonicida : HG3, Aeromonas caviae : HG 4 et 5B, Aeromonas media : HG4, HG5A et HG5B, Aeromonas eucrenophila : HG6, Aeromonas sobria : HG7, Aeromonas veronii biogroupe sobria : HG8, Aeromonas jandaei : HG9, Aeromonas veronii biogroupe veronii : HG10, Aeromonas encheleia : HG6 et HG11, Aeromonas schubertii : HG12, Aeromonas trota : HG13, Aeromonas allosaccharophila : HG8 et HG10, Aeromonas popoffıi : HG 14 [1–7]. Cette classification est appelée à de nouvelles évolutions taxonomiques. Cinq espèces seulement peuvent être fréquemment isolées chez l’homme : A. hydrophila, A. caviae, A. veronii biogroupe sobria, A. jandaei et A. schubertii. Pour cette raison, il est important d’identifier les Aeromonas au rang d’espèce [8,9]. Leur résistance naturelle aux b-lactamines est fréquemment associée à la production d’une à trois b-lactamases appartenant aux classes B, C ou D d’Ambler [17–21]. Cette production de b-lactamases complique le traitement des infections à Aeromonas, puisque les inhibiteurs classiques des b-lactamases prescrits en clinique (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam) sont surtout efficaces contre les enzymes de classe A [22]. Le BRL 42715 est un autre inhibiteur du groupe des pénèmes capable d’inhiber in vitro des enzymes de classe C et D, mais il n’est pas disponible en clinique [23,24]. Chez les bacilles Gram négatif, les oxacillinases (classe D) hydrolysent aussi l’amoxicilline et la ticarcilline, et elles sont très mal inhibées par les inhibiteurs classiques [14–16]. Enfin, pour les Aeromonas, la relation entre espèce, phénotype de résistance aux b-lactamines et identification des b-lactamases a été peu étudiée. Ce travail a pour objectif d’étudier la distribution des phénotypes de résistance aux b-lactamines en corrélation avec la production de b-lactamases dans le genre Aeromonas.
2. Matériel et méthodes 2.1. Souches bactériennes Nous avons étudié une série de 417 souches sauvages d’Aeromonas provenant de plusieurs laboratoires (Bordeaux, Clermont-Ferrand, Lyon, Nice et Strasbourg) et ayant été isolées de 1986–1998. Toutes ces souches répondaient aux critères d’identification du genre Aeromonas [13]. Les tests d’identification ont été réalisés selon les critères décrits par Altwegg et al. (1990), Carnahan et al. (1991), Abbott et al. (1992), et contrôlés sur les 19 souches de référence (collection Institut Pasteur, Paris) [1,10,11]. Les souches de référence testées sont les suivantes : A. hydrophila : ATCC 7966, A. bestiarum : ATCC 51108, A. salmonicida : ATCC 27013, ATCC 33658, ATCC 14174 ; A. caviae : ATCC 15468, A. media : ATCC 33907, A. eucrenophila : ATCC 23309, A. encheleia : CIP 104608T, A. trota : ATCC 49657, ATCC 49660, ATCC 49803 ; A. sobria : ATCC 9071, ATCC 43979 ; A. veronii : ATCC 35624, ATCC 49904 ; A. jandaei : ATCC 49568 ; A. schubertii : ATCC 43700 ; A. allosaccharophila : ATCC 51208. La majorité des cultures a été réalisée en aérobiose à 30 °C. Les souches ont été identifiées à l’aide de galeries commercialisées (Api 20E, Api 20NE, Api 32 GN et Api 20C Aux, BioMérieux, Marcy l’Étoile, France) et de tests unitaires (hémolysine, esculine, salicine, production d’H2S et gaz en glucose) [11]. L’utilisation de l’acide urocanique a permis de différencier A. hydrophila stricto sensu des autres espèces du complexe A. hydrophila [12]. 2.2. Détermination des profils de résistance aux b-lactamines Le profil de résistance aux b-lactamines des 417 souches sauvages d’Aeromonas a été déterminé par la méthode de diffusion en disques sur gélose selon les recommandations de la Société Française de Microbiologie [25]. Les antibiotiques suivant ont été testés : amoxicilline, amoxicilline-acide clavulanique, ticarcilline, ticarcilline-acide clavulanique, pipéracilline, imipénème, céfalotine, céfuroxime, céfoxitine, céfotaxime, céfopérazone, ceftazidime et cefsulodine (BioRad, Marnes-la-Coquette, France) [25]. Dans un second temps, nous avons déterminé les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de 8 b-lactamines visà-vis de 64 souches représentatives des 3 phénogroupes d’Aeromonas, par la technique de microdilution en milieu liquide. Chaque antibiotique a été testé seul et en association
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avec l’acide clavulanique, le tazobactam et le BRL 42715 (SmithKline Beecham, Brentford, U.K.). Les points critiques retenus par le Comité de l’antibiogramme sont les suivants : amoxicilline > 4 µg/ml, amoxicilline-acide clavulanique > 4/2 µg/ml, ticarcilline > 16 µg/ml, ticarcilline-acide clavulanique > 16/2 µg/ml, pipéracilline > 8 µg/ml, pipéracillinetazobactam > 8/2 µg/ml, imipénème > 4 µg/ml, céfalotine > 8 µg/ml, céfuroxime > 8 µg/ml, céfopérazone > 4 µg/ml et céfotaxime > 4 µg/ml [25]. 2.3. Identification des b-lactamases par isofocalisation analytique Les b-lactamases ont ensuite été étudiées par isofocalisation analytique pour ces 64 souches représentatives des phénotypes de base [14]. Cette technique permet de déterminer si une souche d’Aeromonas produit une ou plusieurs enzymes hydrolysant différents substrats, et de caractériser chaque enzyme par son point isoélectrique (pI) et le substrat préférentiel présent dans le gel de révélation. Brièvement, les bactéries ont été cultivées avec différents types d’inducteurs (imipénème 1 µg/ml, céfoxitine 10 µg/ml ou amoxicilline 25 µg/ml), lysées par ultrasons et ultracentrifugées, le surnageant correspondant à l’extrait enzymatique brut. Les points iso-électriques des différentes b-lactamases ont été déterminés à partir de ces extraits bruts sur gel de polyacrylamide selon les techniques usuelles [16]. Nous avons utilisé comme témoins 3 souches du laboratoire d’Escherichia coli recombinantes exprimant les 3 types de b-lactamases : une imipénémase de classe B / A. veronii biogroupe sobria, de pI 8 (gène cephA, GenBank no AY112998), une céphalosporinase de classe C / A. caviae, de pI 6,8 (gène ampC, GenBank no AF462690), et une oxacillinase de classe D / A. schubertii, de pI 8,5 (gène oxa, GenBank no AY112999). L’activité enzymatique et les points iso-électriques ont ensuite été révélés par un gel à l’iode contenant du méropénème (imipénémase), de la céfazoline (céphalosporinase) ou de l’oxacilline (oxacillinase) à 1 mg/ml [16]. La notion d’induction a été mise en évidence soit par un antagonisme à la lecture de l’antibiogramme, soit par la visualisation d’une bande supplémentaire sur les gels d’isofocalisation analytique. En raison du profil de substrat très spécifique de chaque type de b-lactamases [13,14], nous avons recherché dans cette étude la production d’imipénémases (classe B), de céphalosporinases (classe C) et d’oxacillinases (classe D), respectivement, chez les souches présentant une CMI > 2 µg/ml pour l’imipénème, > 256 µg/ml pour la céfalotine, et > 256 µg/ml pour la ticarcilline. 3. Résultats 3.1. Souches bactériennes et détermination des profils de résistance aux b-lactamines L’identification des 417 souches sauvages d’Aeromonas, ainsi que le résultat des antibiogrammes vis-à-vis de 11
b-lactamines sont donnés dans le Tableau 1. Toutes les espèces d’Aeromonas sont résistantes à l’amoxicilline, à la ticarcilline et à un moindre niveau à l’imipénème, excepté le complexe A. caviae qui reste globalement sensible à l’imipénème. La pipéracilline est relativement active avec 72 à 100 % de souches sensibles, et son activité est peu dépendante des espèces. Toutes les espèces présentent également une faible synergie amoxicilline-acide clavulanique et ticarcilline-acide clavulanique : l’acide clavulanique est donc peu actif chez les Aeromonas. Toutes espèces confondues, les céphalosporines les plus actives sont le céfuroxime (céphalosporine de deuxième génération), ainsi que le céfotaxime, la céfopérazone et la ceftazidime (céphalosporines de troisième génération). Les espèces des complexes A. hydrophila et A. caviae sont presque toutes résistantes à la céfalotine (céphalosporine de première génération). Contrairement aux souches du complexe A. hydrophila, les espèces du complexe A. caviae peuvent présenter un antagonisme entre la céfoxitine ou l’imipénème (inducteurs) et le céfuroxime ou le céfotaxime (substrats pour visualiser l’induction), qui est dû aux céphalosporinases inductibles. Environ 70 % des espèces du complexe A. hydrophila et 85 % des espèces du complexe A. veronii présentent une résistance de bas niveau à l’imipénème (Tableau 1). Cette résistance est mieux visualisée en augmentant la densité de l’inoculum. La synthèse des résultats des identifications et des antibiogrammes révèle 5 phénotypes de base en fonction du ou des types de b-lactamases produites (Tableau 2). La détermination des CMI confirme ces résultats (Tableau 3). 3.2. Identification des b-lactamases par isofocalisation analytique L’isofocalisation analytique permet d’identifier chez les Aeromonas trois b-lactamases appartenant aux groupes B, C ou D d’Ambler (Tableau 2). Une imipénémase de classe B confère la résistance à l’imipénème avec une CMI > 2 µg/ml et un pI autour de 8 avec peu de variations. Cette enzyme est produite à bas niveau à l’état basal par la majorité des souches appartenant aux complexes A. hydrophila et A. veronii, mais elle devient visible après induction ou augmentation de l’inoculum. Elle est mal inhibée par l’acide clavulanique et le tazobactam. La lecture seule des diamètres d’inhibition sans isofocalisation analytique ne permet pas toujours de différencier les souches qui ont une imipénémase de celles qui n’en ont pas [25]. Une céphalosporinase de classe C confère la résistance à la céfalotine avec une CMI > 256 µg/ml et un pI égal à 7 ± 0,5. Cette deuxième enzyme est produite par plus de 80 % des souches du complexe A. hydrophila. C’est une céphalosporinase qui peut présenter un caractère inductible visualisé par l’antagonisme entre différents inducteurs (imipénème, céfoxitine) et différents substrats, en particulier le céfuroxime qui présente un caractère classant pour ce caractère. Ce caractère inductible est retrouvé chez de nombreuses
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Tableau 1 Activité des b-lactamines déterminée par antibiogramme sur 417 souches sauvages d’Aeromonas Souches d’Aeromonas (Total)
• Complexe A. hydrophila (107) A. hydrophila (66) A. bestiarum (37) A. salmonicida (4) • Complexe A. caviae (203) A. caviae (196) A. media (7) • Complexe A. veronii (107) A. sobria (5) A. veronii biogroupe sobria (87) A. veronii biogroupe veronii (4) A. jandaei(11) Souches d’Aeromonas (Total) • Complexe A. hydrophila (107) A. hydrophila (66) A. bestiarum (37) A. salmonicida (4) • Complexe A. caviae (203) A. caviae (196) A. media (7) • Complexe A. veronii (107) A. sobria (5) A. veronii biogroupe sobria (87) A. veronii biogroupe veronii (4) A. jandaei (11)
Amoxicilline
Amoxicilline Acide clavulanique
Nombre de souches sensibles (%) Ticarcilline Ticarcilline Pipéracilline Acide Clavulanique
25 µg (%)
20/10 µg (%)
75 µg (%)
75/10 µg (%)
75 µg (%)
10 µg (%)
0 (0) 1 (2,7) 1 (25,0)
5 (7,6) 11 (29,7) 1 (25,0)
0 (0) 2 (5,4) 1 (25,0)
27 (40,9) 25 (67,6) 3 (75,0)
59 (89,4) 32 (86,5) 4 (100)
15 (22,7) 16 (43,2) 2 (50,0)
12 (6,1) 0 (0)
60 (30,6) 3 (42,9)
28 (14,3) 1 (14,3)
106 (54,1) 4 (57,1)
182 (92,9) 7 (100)
193 (98,5) 6 (85,7)
0 (0) 1,1 (1) 0 (0) 0 (0) C1G Céfalotine 30 µg (%)
2 (40,0) 15 (17,2) 0 (0) 0 (0)
1 (20,0) 4 (4,6) 1 (25,0) 1 (9,1) C2G Céfuroxime Céfoxitine 30 µg (%) 30 µg (%)
4 (80,0) 49 (56,3) 2 (50,0) 5 (45,4)
5 (100) 86 (98,8) 4 (100) 8 (72,7)
1 (20,0) 12 (13,8) 1 (25,0) 2 (18,2) C3G Céfopérazone Céfotaxime Céftazidime 30 µg (%) 30 µg (%) 30 µg (%)
Cefsulodine 30 µg (%)
1 (1,5) 7 (18,9) 0 (0)
63 (95,5) 37 (100) 4 (100)
42 (63,6) 27 (73,0) 2 (50,0)
62 (93,9) 37 (100) 4 (100)
64 (97,0) 37 (100) 4 (100)
65 (98,5) 37 (100) 4 (100)
39 (59,1) 25 (67,6) 2 (50,0)
6 (3,1) 0 (0)
183(93,4) 6 (85,7)
55 (28,1) 4 (57,1)
181 (92,3) 7 (100)
191(97,4) 7 (100)
191 (97,4) 7 (100)
99 (50,1) 7 (100)
3 (60,0) 64 (73,6) 3 (75,0) 9 (81,8)
5 (100) 87 (100) 4 (100) 11 (100)
5 (100) 82 (94,3) 3 (75,0) 11 (100)
5 (100) 86 (98,8) 4 (100) 11 (100)
5 (100) 87 (100) 4 (100) 11 (100)
5 (100) 87 (100) 4 (100) 11 (100)
3 (60,0) 68 (78,2) 1 (25,0) 5 (45,5)
espèces du complexe A. caviae, ainsi que chez les 3 souches de références de l’espèce A. trota, mais il est moins marqué dans le complexe A. hydrophila. Cette céphalosporinase, peu active contre la céfoxitine et le céfotaxime en l’absence d’induction, est mal inhibée par l’acide clavulanique et le tazobactam mais très sensible à l’action du BRL 42715. Une oxacillinase de classe D confère la résistance à la ticarcilline à plus de 75 % des souches testées (CMI > 256 µg/ml, pI > 8,5), ainsi que la résistance à l’amoxicilline à presque 100 % des souches testées, à l’exception de l’espèce A. trota qui ne la produit pas. Elle est faiblement ou non inhibée par l’acide clavulanique et le tazobactam, contrairement au BRL 42715 qui est très actif sur cette enzyme. Cette
Imipénème
troisième enzyme est habituellement très bien exprimée, mais elle n’est pas toujours facile à différencier de l’imipénémase car les 2 bandes sont proches sur les gels d’isofocalisation. 3.3. Action des inhibiteurs des b-lactamases sur les b-lactamases des Aeromonas Ce travail confirme que l’acide clavulanique, qui inhibe mal les pénicillinases de classe D, est inefficace pour restaurer l’activité de l’amoxicilline et de la ticarcilline chez les Aeromonas qui produisent essentiellement des pénicillinases de classe D. Le tazobactam n’offre aucune supériorité sur
Tableau 2 Profils de résistance aux b-lactamines dans le genre Aeromonas : mise en évidence de 5 phénotypes de base chez les souches productrices de b-lactamases
Complexe A. hydrophila Complexe A. caviae Complexe A. veronii Espèce A. schubertii Espèce A. trota 1
Type de b-lactamases (point iso-électrique) Céphalosporinase2 Imipénémase1 (pI 8) (pI 7 ± 0,5) + + – + + – – – – +
Oxacillinase3 (pI > 8,5) + + + + –
Imipénémase : CMI imipenème > 2 µg/ml ; 2 céphalosporinase : CMI céfalotine > 256 µg/ml ; 3 oxacillinase : CMI ticarcilline > 256 µg/ml.
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Tableau 3 Activité de 8 b-lactamines et de 3 inhibiteurs des b-lactamases vis-à-vis de 64 souches représentatives des 3 principaux phénotypes d’Aeromonas spp. (Points critiques : amoxicilline > 4 µg/ml, amoxicilline–acide clavulanique > 4/2 µg/ml, ticarcilline > 16 µg/ml, ticarcilline–acide clavulanique > 16/2 µg/ml, pipéracilline > 8 µg/ml, pipéracilline–tazobactam > 8/2 µg/ml, imipénème > 4 µg/ml, céfalotine et céfuroxime > 8 µg/ml, céfopérazone et céfotaxime > 4 µg/ml).
Amoxicilline BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Ticarcilline BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Pipéracilline BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Imipénème BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfalotine BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfuroxime BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfopérazone BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam Céfotaxime BRL 42715 Acide clavulanique Tazobactam
Phénotypes (nbre de souches) Complexe A. hydrophila (38) CI90 Min CI50 1024 1024 1 0,5 0,5 0,008 512 512 1 512 512 1 128 128 16 0,25 0,25 0,008 64 64 2 64 64 2 4 4 0,25 0,25 0,25 0,008 2 2 0,25 4 4 0,25 1 1 0,125 0,5 0,5 0,125 0,75 0,75 0,125 0,5 0,5 0,06 256 256 2 4 4 0,5 512 512 2 128 128 2 1 1 0,125 1 1 0,06 1 1 0,125 1 1 0,125 0,5 0,5 0,03 0,25 0,25 0,08 0,5 0,5 0,03 0,5 0,5 0,03 0,06 0,06 0,008 0,06 0,06 0,008 0,06 0,06 0,008 0,06 0,06 0,008
Max 4096 1 4096 4096 2048 8 2048 2048 1024 1 256 256 32 16 16 16 2048 16 2048 2048 16 8 16 64 32 8 32 32 8 0,25 8 8
Complexe A. caviae (27) CI50 CI90 Min 512 2048 4 0,5 8 0,125 256 1024 8 256 2048 2 64 256 0,5 0,25 8 0,125 32 256 2 0,5 512 0,5 4 16 0,25 0,5 2 0,03 2 16 0,25 2 32 0,25 0,25 0,5 0,06 0,125 0,25 0,06 0,125 0,5 0,06 0,125 0,25 0,06 512 2048 8 8 256 0,5 512 2048 16 8 2048 32 4 128 0,125 2 32 0,03 4 128 0,5 2 128 0,125 2 16 0,06 0,5 8 0,03 2 16 0,06 0,5 8 0,06 0,25 8 0,03 0,125 2 0,016 0,25 16 0,03 0,25 8 0,03
l’acide clavulanique chez les Aeromonas. Contrairement aux inhibiteurs classiques, le BRL 42715 restaure l’activité de l’amoxicilline et de la ticarcilline par inhibition de l’oxacillinase (classe D), ainsi que l’activité de la céfalotine en inhibant la céphalosporinase (classe C) (Tableau 3). 4. Discussion Cette étude de la distribution des b-lactamases sur une grande série de souches identifiées au rang d’espèce montre que les Aeromonas synthétisent une à trois b-lactamases suivant les phénogroupes ou les espèces. La détermination des CMI en milieu liquide et l’utilisation du BRL 42715 sont plus sensibles que l’antibiogramme de routine pour caractériser les souches produisant plusieurs b-lactamases [24]. Walsh et al. (1995) et Hayes et al. (1996) ont décrit les premiers la synthèse d’imipénémases produites à bas niveau [14,26], et plusieurs auteurs ont décrit la large distribution d’oxacillinases ayant des propriétés de pénicillinases dans
Max 4096 4096 2048 4096 2048 2048 1024 2048 1024 64 32 256 0,5 0,5 0,5 0,5 2048 2048 2048 2048 128 128 256 128 128 128 128 128 16 8 64 16
Complexe A. veronii (19) CI50 CI90 Min 1024 4096 32 0,25 1 0,125 512 2048 8 256 2048 1 256 1024 4 0,125 0,5 0,06 128 512 2 128 512 0,5 4 32 0,25 0,25 0,5 0,125 4 64 0,25 2 256 0,25 2 16 0,25 2 16 0,25 2 8 0,125 2 8 0,125 16 512 0,5 2 16 1 16 512 1 8 256 1 0,25 2 0,125 0,5 2 0.125 0,25 2 0,125 0,25 2 0,125 0,25 1 0,03 0,25 1 0,06 0,25 0,5 0,06 0,25 1 0,06 0,016 0,125 0,008 0,016 0,06 0,008 0,016 0,25 0,008 0,016 0,25 0,008
Max 4096 1 4096 4096 2048 0,5 1024 > 4096 64 0,5 256 512 64 64 64 64 512 32 1024 512 4 4 4 4 2 1 2 4 0,25 0,25 0,5 0,25
toutes les espèces du genre Aeromonas, excepté A. trota [14–16]. Au total, lorsqu’une souche d’ Aeromonas est isolée en clinique le traitement s’oriente généralement vers les aminosides ou les fluoroquinolones au détriment des b-lactamines. Les céphalosporines de troisième génération sont à proscrire en monothérapie dans les infections à Aeromonas du phénogroupe A. hydrophila qui produisent une céphalosporinase non inductible. Elles sont également à éviter contre les espèces du phénogroupe A. caviae et A. trota, en raison du phénomène d’induction de céphalosporinases et du risque de sélection de mutants résistants en cours de traitement. Il faut cependant noter que certaines souches d’ Aeromonas sont naturellement résistantes à la céfoxitine, surtout dans l’espèce A. caviae, ce qui pourrait impliquer un autre mécanisme de résistance. Ce travail montre que l’identification des Aeromonas au rang de phénogroupe permet de mieux moduler l’approche thérapeutique, grâce à une meilleure connaissance de la distribution des b-lactamases. Ainsi, bien que les espèces du
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complexe A. hydrophila synthétisent en général une imipénémase produite à bas niveau, une céphalosporinase et une oxacillinase, il reste possible de prescrire de l’aztréonam qui reste actif [17–19]. De même, chez les espèces du complexe A. caviae qui ne produisent pas de métallo-enzymes de classe B, l’imipénème peut être prescrit en première intention. Enfin, les espèces du phénogroupe A. veronii produisent souvent une imipénémase et une oxacillinase mais rarement des céphalosporinases, ce qui autorise le recours aux céphalosphorines de 3e génération [14]. En effet, les enzymes de classe B sont des métallo-b-lactamases qui hydrolysent essentiellement les carbapénèmes chez les Aeromonas, et sont faiblement inhibées par les inhibiteurs classiques. La métallo-enzyme des Aeromonas est celle qui a le spectre le plus étroit. Les enzymes de classe C sont des b-lactamases à sérine qui hydrolysent les céphalosporines mais sont peu sensibles aux inhibiteurs classiques. Enfin, les enzymes de classe D sont des b-lactamases à sérine qui hydrolysent l’oxacilline, et présentent de faibles homologies de séquences avec les autres b-lactamases à sérine [22]. Ce travail confirme que l’acide clavulanique et le tazobactam sont peu actifs contre la céphalosporinase de classe C et la pénicillinase de classe D produites par les Aeromonas (Tableau 3). En revanche, le BRL 42715 qui est un inhibiteur à large spectre serait beaucoup plus efficace contre ces 2 types d’enzymes, mais il n’est pas commercialisé actuellement. En dehors des applications thérapeutiques, la caractérisation des phénotypes naturels de production des b-lactamases peut être une aide à l’identification. En effet, dans la classification actuelle il existe des divergences entre l’identification phénotypique réalisée en routine, et l’identification génotypique réalisée dans les laboratoires spécialisés [10]. L’identification biochimique permet d’attribuer environ 80 % des souches à 3 phénogroupes principaux : le complexe A. hydrophila (HG1, 2, 3 et 14), le complexe A. caviae (HG4, 5, 6, 11 et 13), le complexe A. veronii (HG7, 8, 9, 10 et 12) [1,10–12]. Le profil de résistance peut aussi aider à l’identification des espèces. Ainsi, les Aeromonas sont sensibles à la colistine sauf A. jandaei (résistant) et A. hydrophila (résistance variable) [5,13]. Ils sont aussi résistants aux aminopénicillines sauf A. trota, et aux céphalosporines de première génération sauf les espèces du complexe A. veronii [14–16]. Le clonage de ces différentes enzymes devrait permettre de mettre au point des techniques de PCR pour aider à l’identification des souches atypiques grâce à leur contenu enzymatique [15,16,18–21,27,28]. Ainsi, l’identification des b-lactamases permet une différenciation nette de l’espèce A. schubertii qui synthétise uniquement une oxacillinase, ou de l’espèce A. trota qui ne produit qu’une céphalosporinase inductible. Les techniques de biologie moléculaire, quand elles seront disponibles en routine, seront particulièrement indiquées pour identifier les b-lactamases produites à bas niveau [26] ou inductibles [28,29]. En conclusion, chez les Aeromonas les profils de résistance aux b-lactamines sont corrélés avec la production de
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b-lactamases. La caractérisation de ces enzymes a des applications non seulement thérapeutiques mais aussi taxonomiques pour ces espèces dont l’identification est notoirement délicate. Remerciements Nous remercions F. Mégraud (Bordeaux), B. Joly (Clermont-Ferrand), J. Frenay (Lyon) et H. Monteil (Strasbourg), qui nous ont adressé des souches d’Aeromonas. Nous remercions également Christiane Luciano et Maryse Cassar pour leur assistance technique. Références [1]
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