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Polymorphisme de l'ADN et exclusions de paternité : analyse de 543 cas de recherche de filiation
TCB 1996
5:273-278
P o l y m o r p h i s m e de I'ADN et exclusions de paternit analyse de 543 cas de recherche de filiation
:
Ph. ROUGER*, V. VAN HUFFEL* * Institut National de la Transfusion Sanguine, Paris, France
R~sum~ L'6tude du polymorphisme des marqueurs g6n6tiques a largement 6volu4 depuis ces dix derni6res ann6es du fait du d6veloppement de la biologie mol6culaire et de la d4couverte de zones r6p6t4es d'ADN. Au travers de l'4tude de 543 cas d'analyse de filiation, les auteurs analysent les performances des diff6rentes sondes, Ieurs limites d'utilisation, les programmes et strat6gies afin d'aboutir h des probabilit6s d'exclusion 61ev6es. : Amplification gdnique, probabilit4 d'exclusion, recherche de paternit6, sondes moldculaires, VNTR-RFLP.
Mots-cl~s
Summary D N A p o l y m o r p h i s m a n d p a t e r n i t y exclusions: analysis of 543 cases of p a t e r n i t y testing The study of the genetic markers of polymorphism has known a very large evolution during these last ten years in relation to the development of the molecular biology and the discovery and analysis of some DNA repeated loci. In a study of 543 of paternity testing, the authors analyse the performance of some probes, the limits of their using, the program and strategy of testing to establish a high probability of exclusion. DNA probes, paternity testing, Polymerase Chain Reaction, probability of exclusion, VNTR-RFLP.
Keywords:
Introduction Les 4tudes biologiques de filiation sont bas4es sur le polymorphisme des individus et la transmission menddlienne des marqueurs de ce polymorphisme. Avant 1980, le polymorphisme 6tait analys6 grace l'6tude immunogdndtique des antighnes du globule Correspondance : Ph. Rouger, Institut National de la Transfusion
Sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 Paris, France.
rouge, des enzymes 4rythrocytaires, des prot6ines sdriques et du syst6me HLA. Ainsi, l'utilisation de 10 syst6mes de groupes sanguins, de 17 syst6mes d'enzymes et de protdines et du syst6me HLA classe I induisait une probabilit6 d'exclusion de 0.999, estimation de la capacit6 a exclure la paternit6 d'un sujet faussement accus6 de filiation [1-3]. Dans les ann6es 1980, l'6volution vint de l'identification de zones d'ADN d6nomm6es minisattelites. 273
274
Ph. ROUGER & V. VAN HUFFEL
La premi6re de ces r6gions fut dfcouverte par Wyman et White [4]. Ces r6gions sont form6es d'une courte s6quence d'ADN (quelques dizaines de paires de bases) qui se r6p6tent en tandem d'ofl leur d6nomination Variable Number of Tandem Repeat [VNTRI. Le nombre de ces r6p6titions est variable d'un individu fi l'autre, constituant ainsi une s6rie d'all61es se transmettant selon un mode mend61ien. Plusieurs centaines de zones de ce type ont ainsi 6t6 identifi6es par l'6tude du g6nome humain [5-8]. Plus r6cemment, des zones dites , microsattelites, [Short Tandem Repeat - STR) compos6es de zones r6p6tfes inf6rieures fi 10 paires de bases ont 6t6 d6crites. Les r6p6titions peuvent ~tre dftermin6es par un seul locus [Single Locus System - SLS} ou par plusieurs loci .[Multiple Locus System - MLS) [9, 10]. Ce polymorphisme a 6t6 tout d'abord analys6 par la technique des RFLP [Restriction Fragment Length Polymorphism). Ces syst6mes de polymorphisme nucl6ique ont un fort degr6 d'hft6rog6n6it6 de telle sorte que les plus performants d'entre eux ont un pouvoir d'exclusion identique gt celui du syst6me HLA classe 1 6tudi6 par la s6rologie. En utilisant 4 <
M a t 6 r i e l et m 6 t h o d e s
Echantillons et pr61~vernents Entre le Ier janvier 1992 et le 31 d6cembre 1995, 543 analyses de filiation ont 6t6 r6alis6es : 108 en 1992, 137 en 1993, 141 en 1994 et 157 en 1995. Lc
tableau 1 rapporte les circonstances d'6tudes : duo [p~re-enfant), trio [p~re-m~re-enfant), quatuor et autres.., trois recherches de maternit6 ont 6t6 r~alis6es pendant cette p6riode. Tousles tests ont 6t6 r6alis6s sur des pr6l~vements fraichement effectu6s dans notre laboratoire. Toutes ces expertises ont ~t6 pratiqu~es fi la demande des autorit6s de Justice. Toutes les analyses rapport6es concernent des sujets caucasiens. Tableau 1 R6capitulatif des cas 6tudifs sur 4 ans ; entre parentheses figurent le n o m b r e d'exclusions
Ann6e
Trio simple
1992
81 (32)
1993
1994
1995
99 139} 106 {281 116 1281
Quatuor g 2 p6res
10 (9)
12 110)
17 (17}
20 {181
Duo p~re-enfant
5 (21
6 {21
5 (2)
8 i4)
Autres cas
8 (3)
19 (2)
13 (2)
11 (5)
0
1 (1)
0
2 (2}
Recherche de maternit~ (avec 2 m~res putafives I
108 (46) 137 (54} 141 (49) 157 {58)
Total
Examens Chaque annie, en fonction de l'6volution scientifique, le nombre et le type de systhmes analys4s ont 6t6 red4finis, la probabilit6 d'exclusion globale 6tant toujours sup6rieure/t 0.9999. Le tableau 2 montre le nombre de syst6mes utilis6s selon le type de marqueurs. Tableau 2 N o m b r e de syst~mes 6tudiOs selon les types de m a r q u e u r s du polymorphisme entre 1992 et 1995
~
A
n
n
6
e
1992
1993
1994
1995
Syst~mes 6rythrocytaire~,
7 fi 9
7 fi 9
7
7
Syst~mes d'enzymes du globule rouge
7 ~ 9
7 ~9
3
3
Syst~mes de prot~ines s6riques
5 fi 7
5 fi 7
2
2
HLA A HLA B
HLA A HLA B
0
0
4fi8
4~8
4fi9
4~9
Syst6me
HLA classe I (ph6notypage) VNTR
POLYMORPHISME DE L'ADN ET EXCLUSIONS DE PATERNITt~
Probabilit~ d"exclusion La probabilit6 d'exclusion repr6sente la capacit6 de 1'ensemble des systames 6tudi6s h exclure un sujet pris au hasard d'une filiation pare ou mare-enfant. L'indice calcul6 est la probabilit6 d'exclusion d'un sujet au hasard vis-a-vis d'un enfant au hasard, il correspond en fait ~ la capacit6 du programme d'6tude proc6der ~ une exclusion de paternit6 (ou de maternit6 I.
Tableau
275
3
Capacit6 constat6e des diff6rents syst6mes du polymorphisme exclure une filiation
nn6e
Syst6mes classiques
1992
2,8/23 (1) 2,7/22 Ill 4,8/6
VNTR
1993
4,4/5,6
1994
1995
1,5/12
1,6/12
5,4/7
5,6/7
(1) dont 90 % HLA AB
R6sultats
Les exclusions Parmi les 543 cas 4tudi6s, 207 exclusions ont 6t6 d6montr6es {38,1%1. Parmi les trios simples, le pourcentage moyen d'exclusion est de 31,6 %. Dans les cas de quatuor ~t deux pares, l'un des deux pares est au moins exclu dans 91,5 % des expertises, ce qui signifie que dans 8,5 % des cas un autre sujet est en cause. Dans les cas de duo pare-enfant, le pourcentage d'exclusion est de 41,7 %. Dans les recherches de maternit6, l'une des deux mares putatives a 4t6 exclue dans les 3 cas analys6s. Tous ces r6sultats sont r6sum4s dans le tableau 1. Darts notre laboratoire, toute exclusion implique que quatre sondes d6montrent le r6sultat.
VNTR utilis6s. Ainsi les sondes MS 1, PH 30, G 3, MS 205 paraissent les plus discriminantes dans cette 6tude (Figure 1). La quantification des bandes a 6t6 r6alis6e d'une part selon un mode visuel et d'autre part en consid6rant comme diff6rente toute bande ayant un difffrentiel de 3 ~ 7 % selon les zones de migration.
Performances des diff~rents types de syst~mes L'objet de ce travail a 4t6 de comparer l'efficacit6 des systames classiques par rapport ~ l'analyse du polymorphisme de I'ADN. Les systames classiques incluent les systames 6rythrocytaires, les systames d'enzymes du globule rouge, les systames de prot6ines s6riques et le ph6notypage HLA classe I. Le tableau 3 rapporte l'efficacit6 des systames classiques et des VNTR. En ne raisonnant que systame par systhme, l'efficacit6 moyenne pond6r4e est de 12,7 % pour les systames classiques~Idont 90 % pour les marqueurs HLA] et de 79 % pour les VNTR.
1
2
3
4
Figure 1 Profil de migration 61ectrophor6tique de RFLP (Hmf : r6v616 par la sonde MS 31). ]~chantillon (1) 4chelle de poids mol6culaire, (2) m~re, (3) enfant, (4) p6re pr6sum4 : le p6re pr6sum4 n'est pas exclu.
Les minisattelites amplifies Fr~quences d'exclusion des VNTR Le tableau 4 rapporte les fr6quences observ6es d'exclusion en fonction des ann6es et des types de
Les r6sultats portant sur l'ann6e 1995 montrent que l'6tude de la r6gion DIS80 permet une fr6quence d'exclusion de 0.70 ; elle est de 0.73 pour la r6gion D17S5 {Figure 2).
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Ph. ROUGER & V. VAN HUFFEL
Tableau 4 Performances des diff4rentes sondes et rdgions gdnomiques test~es (NT : non test6)
1992
1993
1994
1995
Cumul
Performance optimale rapportfe dans la litt4rature
PH 30 (D45139)
0.87
0.89
0.95
NT
0.91
0.79
0.08
MS 1 (D1S7)
0.90
0.92
0.92
0.92
0.92
0.98
5
G3 (D7S22)
0.80
0.85
0.90
0.90
0.87
0.92
0.3
MS 205 (D165309)
NT
NT
0.90
0.90
0.90
0.94
0.4
MS 31 (D7S21)
0.68
0.72
0.84
0.84
0.79
0.94
0.5
MS 43 (D12Sll)
0.70
0.79
0.72
0.76
0.76
0.92
> 0.3
Y N H 24 (D2S43)
0.77
0.83
0.71
0.73
0.75
0.90
0.03
MS 8 (D5844)
0.54
0.61
0.69
0.69
0.64
0.74
> 0.3
TB Q7 (D10S28)
0.70
NT
NT
NT
0.70
0.88
0.06
C M M 101 (D14S131
NT
NT
0.70
0.71
0.70
0.79
0.04
D1S80
0.70
0.70
0.64
D17S5
0.73
0.73
0.70
Ann4e Sonde
Syst6me
VNTR
Fr6quence (%) de mutations observ4es rapport6e par la litt4rature
Amp VNTR
Les
~ mutations
,, e t , h o m o z y g o t i e s
,
Toute sonde consid6r6e pour un cas donn6 comme r6v61ant un profil d'homozygotie n'est pas consid4r4e au nombre des sondes n6cessaires pour conclure une exclusion. De m~me, le choix d'un minimum de quatre sondes est dfi aux fr6quences de mutations rapport6es (tableau 4).
Discussion Les poureentages d'exclusion observ6s sont en fait fonction de l'objet des demandes formul6es par les tribunaux : ils varient peu (34,8 ~ 42,6 %) pendant les quatre ann4es de l'6tude. Au fur et ~ mesure des ann4es, les syst~mes biologiques 6tudi4s ont profon-
d6ment 6volu6, or la probabilit6 d'exclusion doit ~tre considfrde comme le param6tre pertinent qui qualifie la capaeit6 d'un ensemble d'examens/t parvenir un r6sultat fiable [14-16]. La probabilit6 d'exclusion repose sur des analyses g6nftiques, syst6me par syst6me, des diffdrents marqueurs et de leur polymorphisme : le syst6me Kell est repr6sent6 par deux all61es, eertaines sondes VNTR s'expriment au travers de plus de cent all61es. Au plan quantitatif, 10 systhmes de groupes sanguins induisaient une probabilit6 d'exelusion de 0.80, l'6tude s6rologique du eomplexe majeur d'histocompatibilit4 (HLA A,B) permettait d'obtenir une probabilit6 d'exclusion de 0.93. Ainsi, l'ensemble de ces syst6mes ineluant l'4tude des enzymes de
P O L Y M O R P H I S M E DE L ' A D N ET E X C L U S I O N S DE PATERNITI~
globule rouge et des prot4ines s4riques g6n6rait une probabilit6 d'exclusion de 0.999. N o t r e 6tude m o n tre que la p e r f o r m a n c e r6elle de chaque sonde utilis6e se situe entre 0.64 et 0.92, en p r e n a n t p o u r c h a q u e analyse de migration u n diff6rentiel de discrimination entre 3 et 7 %. Ainsi, l'utilisation de quatre sondes a y a n t un p o u v o i r d i s c r i m i n a n t m o y e n de 0.80 induit u n e probabilit6 d ' e x c l u s i o n de 0.999. Tester, par des t e c h n i q u e s de biologic mol6culaire, 7 zones du g6nome, g6n~re une probabilit6 d'exclusion de l'ordre de 0.999999 ; c'est dire que l ' a n a l y s e du p o l y m o r p h i s m e de I ' A D N a chang4 le n i v e a u de p e r f o r m a n c e des analyses de filiation.
1
2
3
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277
l'introduction de n o u v e a u x syst6mes d ' a n a l y s e du p o l y m o r p h i s m e . Les variations de fr6quence li6es a l'origine des individus affectent essentiellement les calctfls de probabilit6 de paternit4. Les strat6gies utilis6es sont en fait trhs variables selon les p a y s et les laboratoires. Certains laboratoires ne font encore a p p e l q u ' a u x a p p r o c h e s i m m u nologiques et biochimiques, alors que la majorit6 utilise d6sormais les t e c h n i q u e s de biologic mol6culaire ; certains laboratoires ont par ailleurs pr6f6r6 c o n s e r v e r u n m i n i m u m de syst6mes i m m u n o g 6 n 6 tiques c o m m e 616ments de s6curit6 visant ~ maitriser les risques dus ~ des d6faillances de logistique [11]. L'utilisation des V N T R amplifi6es pr6sente de n o m b r e u x a v a n t a g e s : u n e lecture plus pr6cise, u n n o m b r e d'all6les inf6rieur, une interpr4tation p a r r4f6rence ~ un pool d'all61es d6terminds, une analyse statistique simplifi6e, tous 616ments qui font que cette m6thodologie est a m e n 6 e ~ s'6tendre, ce d ' a u t a n t qu'il est possible de co-amplifier plusieurs syst6mes [18-20]. L'6volution des connaissances scientifiques conduit ~ utiliser des m6thodologies et technologies de plus en plus sophistiqu6es et innovantes. N6anm o i n s ces i n n o v a t i o n s n e sont pas sans soutever des difficult6s de r6alisation et d'interpr6tation. C ' e s t p o u r q u o i il est n6cessaire d'6tablir des r6gles pr6cises d'utilisation et des proc6dures adapt6es de contr61e de qualit6 des e x a m e n s [21, 22]. -
6
Figure 2 Profil d'amplification de la r6gion DIS80 dans le cas d'un quatuor ~ deux p6res putatifs, t~chantillon (1) et (6) 6chelle all61ique, (2) m6re, (3) enfant, {4) phre putatif P1, (5) phre putatif P2 : P1 est exclu de paternit6, alors que P2 n'est pas exclu.
L'6tude du g6nome n ' e s t pas d6nu6e de difficult6s, tant en t e r m e s de t e c h n i q u e que d ' a n a l y s e , de telle sorte qu'il est essentiel de fixer des r6gles pr6cises d'interpr6tation des r6sultats bruts des e x a m e n s de laboratoire [11]. Ainsi, c h a q u e p r o g r a m m e d ' a n a l y s e de filiation doit reposer sur une analyse objective des m o y e n s de d6tection utilis6s. N o t r e strat6gie est de se f o n d e r sur trois crit6res : - la probabilit6 d'exclusion, la r6actualisation annuelle des p e r f o r m a n c e s de c h a q u e sonde,
R6f6rences [1] Salmon Ch., Cartron J.P., Rouger Ph. (1991) Paternit6. Les groupes-sanguins ehez l'homme. Masson, Paris, 487-508. [2] MorrisJ.W. (1983) Relationships between power of exclusion and probability of paternity in Inclusion probabilities in parentage testing. AABB, Arlington VA, 267-276. [3] Nijenhuis L.E. (1983) A critical evaluation of various methods of approaching probability of paternity in inclusion probabilities in parentage of paternity in inclusion probabilities in parentage testing. AABB, Arlington VA, 103-114. [4] Wyman A., White R. (1980) A highly polymorphic locus in human DNA. Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), 77, 6754-6758. [5] Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. (1985}Hypervariable minisattelite regions in human DNA. Nature, 314, 67-73. [6] Jeffreys A.J., Wilson V.; Thein S.L. (1985) Individual genetic **fingerprints of human DNA ~. Nature, 316, 76-79. [7] Nakumura Y., Leppert M., O'Connell P., Wolff R., Holm T., Culver M., Martin C., Fujimoto E., Hoff M., Kumlin E., White R. (1987) Variable number of tandem repeats (VNTR) markers for human gene mapping. Science, 235, 1616-1622.
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Ph. ROUGER
& V. V A N H U F F E L
[8] Wong Z., Wilson V., Patel I. , Povey S., Jeffreys AJ. (1987) Characterisation of a panel of highly variable minisatellites cloned from human DNA. Ann. Human Genet., 51, 269-288. [9] Weber J.L., May P.E. (1989) Abondant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet., 44, 388-396. [10] Edwards A., Civittels A., Hammond H.A., Caskey C.T. (1991) DNA typing and genetic mapping with trimeric and tretrameric tandem repeats. Am. J. Human Genet., 49, 746-756. [11] Masson J.M., Maha G.C., Stuhlmillex G.M., Hein U., Eisenberg M. (1995) Application of DNA analysis to human identification in molecular genetics in diagnosis and research. AABB, Arlington, VA, 25-40. [12] Rouger Ph. (1992) L'empreinte humaine : de l'4thique ~ la g6n4tique. Mereure de France, Paris. [13] Lander E.S., Budowle B. (1994) DNA finderprinting dispute laid to rest. Nature, 371, 35-38. [14] Salmon Ch., CartronJ.P., Rouger Ph. (1985) Paternity in the human blood groups. Masson, New York, 397-412. [1"5] Salmon D., Salmon C. (1979) Blood groups and genetic markers, polymorphism and probability of paternity. Transfusion, 20, 684-694. [16] Salmon D., Seger J., Salmon Ch. (1980) Expected and observed proportion of subjects excluded from paternity by blood
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]
[22]
phenotypes of a child and its mother in a sample of 171 families. Am. jr. Hum. Genet., 32, 432-444. Salmon C., Salmon D., Muller J.Y., Seger J. (1980) Groupes sanguins, groupes de prot6ines et groupes tissulaires dans la recherche de paternit4. M~decine l~gale, L. Derobert, 751-791. Eisenberg M., Sharma S., Carden E. (1994) PCR for identity testing: proceeding from de fifth International Symposium and Human Identification. Madison, WI, Promega Corp. Hammard H.A., Jin L., Zhong Y., Caskey C.T., Chakraborty R. (1994) Evaluation of 13 short repeat tandem repeat loci for use in personnal identification application. Am. J. Hum. Genet., 55, 175-189. WayeJ.S. (1993) Forensic identify testing using highly polymorphic DNA markers: current status and emerging technologies. Transfusion Med. Rev., 7, 193-205. Syndercombe Court D., Lindcoln P. (1996) A review of the 1991-1994 paternity testing workshops of the english speaking working group. In advances in Forensic Haemogenefics, Ed. Carracedo A., Brinkmann B., Bar W., Springer, 6, 683-687. Harrison C., Allen C., Endean D., Morris J., Polesky H., Roby R., Walker R. (1996) Comparability of RFLP results between laboratories: AABB/CAP survey data. In advances in Forensic Haemogenetics, Carracedo A., Brinkmann B., Bar W., Springer, 6, 699-701.
5:273-278
P o l y m o r p h i s m e de I'ADN et exclusions de paternit analyse de 543 cas de recherche de filiation
:
Ph. ROUGER*, V. VAN HUFFEL* * Institut National de la Transfusion Sanguine, Paris, France
R~sum~ L'6tude du polymorphisme des marqueurs g6n6tiques a largement 6volu4 depuis ces dix derni6res ann6es du fait du d6veloppement de la biologie mol6culaire et de la d4couverte de zones r6p6t4es d'ADN. Au travers de l'4tude de 543 cas d'analyse de filiation, les auteurs analysent les performances des diff6rentes sondes, Ieurs limites d'utilisation, les programmes et strat6gies afin d'aboutir h des probabilit6s d'exclusion 61ev6es. : Amplification gdnique, probabilit4 d'exclusion, recherche de paternit6, sondes moldculaires, VNTR-RFLP.
Mots-cl~s
Summary D N A p o l y m o r p h i s m a n d p a t e r n i t y exclusions: analysis of 543 cases of p a t e r n i t y testing The study of the genetic markers of polymorphism has known a very large evolution during these last ten years in relation to the development of the molecular biology and the discovery and analysis of some DNA repeated loci. In a study of 543 of paternity testing, the authors analyse the performance of some probes, the limits of their using, the program and strategy of testing to establish a high probability of exclusion. DNA probes, paternity testing, Polymerase Chain Reaction, probability of exclusion, VNTR-RFLP.
Keywords:
Introduction Les 4tudes biologiques de filiation sont bas4es sur le polymorphisme des individus et la transmission menddlienne des marqueurs de ce polymorphisme. Avant 1980, le polymorphisme 6tait analys6 grace l'6tude immunogdndtique des antighnes du globule Correspondance : Ph. Rouger, Institut National de la Transfusion
Sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 Paris, France.
rouge, des enzymes 4rythrocytaires, des prot6ines sdriques et du syst6me HLA. Ainsi, l'utilisation de 10 syst6mes de groupes sanguins, de 17 syst6mes d'enzymes et de protdines et du syst6me HLA classe I induisait une probabilit6 d'exclusion de 0.999, estimation de la capacit6 a exclure la paternit6 d'un sujet faussement accus6 de filiation [1-3]. Dans les ann6es 1980, l'6volution vint de l'identification de zones d'ADN d6nomm6es minisattelites. 273
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Ph. ROUGER & V. VAN HUFFEL
La premi6re de ces r6gions fut dfcouverte par Wyman et White [4]. Ces r6gions sont form6es d'une courte s6quence d'ADN (quelques dizaines de paires de bases) qui se r6p6tent en tandem d'ofl leur d6nomination Variable Number of Tandem Repeat [VNTRI. Le nombre de ces r6p6titions est variable d'un individu fi l'autre, constituant ainsi une s6rie d'all61es se transmettant selon un mode mend61ien. Plusieurs centaines de zones de ce type ont ainsi 6t6 identifi6es par l'6tude du g6nome humain [5-8]. Plus r6cemment, des zones dites , microsattelites, [Short Tandem Repeat - STR) compos6es de zones r6p6tfes inf6rieures fi 10 paires de bases ont 6t6 d6crites. Les r6p6titions peuvent ~tre dftermin6es par un seul locus [Single Locus System - SLS} ou par plusieurs loci .[Multiple Locus System - MLS) [9, 10]. Ce polymorphisme a 6t6 tout d'abord analys6 par la technique des RFLP [Restriction Fragment Length Polymorphism). Ces syst6mes de polymorphisme nucl6ique ont un fort degr6 d'hft6rog6n6it6 de telle sorte que les plus performants d'entre eux ont un pouvoir d'exclusion identique gt celui du syst6me HLA classe 1 6tudi6 par la s6rologie. En utilisant 4 <
M a t 6 r i e l et m 6 t h o d e s
Echantillons et pr61~vernents Entre le Ier janvier 1992 et le 31 d6cembre 1995, 543 analyses de filiation ont 6t6 r6alis6es : 108 en 1992, 137 en 1993, 141 en 1994 et 157 en 1995. Lc
tableau 1 rapporte les circonstances d'6tudes : duo [p~re-enfant), trio [p~re-m~re-enfant), quatuor et autres.., trois recherches de maternit6 ont 6t6 r~alis6es pendant cette p6riode. Tousles tests ont 6t6 r6alis6s sur des pr6l~vements fraichement effectu6s dans notre laboratoire. Toutes ces expertises ont ~t6 pratiqu~es fi la demande des autorit6s de Justice. Toutes les analyses rapport6es concernent des sujets caucasiens. Tableau 1 R6capitulatif des cas 6tudifs sur 4 ans ; entre parentheses figurent le n o m b r e d'exclusions
Ann6e
Trio simple
1992
81 (32)
1993
1994
1995
99 139} 106 {281 116 1281
Quatuor g 2 p6res
10 (9)
12 110)
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Duo p~re-enfant
5 (21
6 {21
5 (2)
8 i4)
Autres cas
8 (3)
19 (2)
13 (2)
11 (5)
0
1 (1)
0
2 (2}
Recherche de maternit~ (avec 2 m~res putafives I
108 (46) 137 (54} 141 (49) 157 {58)
Total
Examens Chaque annie, en fonction de l'6volution scientifique, le nombre et le type de systhmes analys4s ont 6t6 red4finis, la probabilit6 d'exclusion globale 6tant toujours sup6rieure/t 0.9999. Le tableau 2 montre le nombre de syst6mes utilis6s selon le type de marqueurs. Tableau 2 N o m b r e de syst~mes 6tudiOs selon les types de m a r q u e u r s du polymorphisme entre 1992 et 1995
~
A
n
n
6
e
1992
1993
1994
1995
Syst~mes 6rythrocytaire~,
7 fi 9
7 fi 9
7
7
Syst~mes d'enzymes du globule rouge
7 ~ 9
7 ~9
3
3
Syst~mes de prot~ines s6riques
5 fi 7
5 fi 7
2
2
HLA A HLA B
HLA A HLA B
0
0
4fi8
4~8
4fi9
4~9
Syst6me
HLA classe I (ph6notypage) VNTR
POLYMORPHISME DE L'ADN ET EXCLUSIONS DE PATERNITt~
Probabilit~ d"exclusion La probabilit6 d'exclusion repr6sente la capacit6 de 1'ensemble des systames 6tudi6s h exclure un sujet pris au hasard d'une filiation pare ou mare-enfant. L'indice calcul6 est la probabilit6 d'exclusion d'un sujet au hasard vis-a-vis d'un enfant au hasard, il correspond en fait ~ la capacit6 du programme d'6tude proc6der ~ une exclusion de paternit6 (ou de maternit6 I.
Tableau
275
3
Capacit6 constat6e des diff6rents syst6mes du polymorphisme exclure une filiation
nn6e
Syst6mes classiques
1992
2,8/23 (1) 2,7/22 Ill 4,8/6
VNTR
1993
4,4/5,6
1994
1995
1,5/12
1,6/12
5,4/7
5,6/7
(1) dont 90 % HLA AB
R6sultats
Les exclusions Parmi les 543 cas 4tudi6s, 207 exclusions ont 6t6 d6montr6es {38,1%1. Parmi les trios simples, le pourcentage moyen d'exclusion est de 31,6 %. Dans les cas de quatuor ~t deux pares, l'un des deux pares est au moins exclu dans 91,5 % des expertises, ce qui signifie que dans 8,5 % des cas un autre sujet est en cause. Dans les cas de duo pare-enfant, le pourcentage d'exclusion est de 41,7 %. Dans les recherches de maternit6, l'une des deux mares putatives a 4t6 exclue dans les 3 cas analys6s. Tous ces r6sultats sont r6sum4s dans le tableau 1. Darts notre laboratoire, toute exclusion implique que quatre sondes d6montrent le r6sultat.
VNTR utilis6s. Ainsi les sondes MS 1, PH 30, G 3, MS 205 paraissent les plus discriminantes dans cette 6tude (Figure 1). La quantification des bandes a 6t6 r6alis6e d'une part selon un mode visuel et d'autre part en consid6rant comme diff6rente toute bande ayant un difffrentiel de 3 ~ 7 % selon les zones de migration.
Performances des diff~rents types de syst~mes L'objet de ce travail a 4t6 de comparer l'efficacit6 des systames classiques par rapport ~ l'analyse du polymorphisme de I'ADN. Les systames classiques incluent les systames 6rythrocytaires, les systames d'enzymes du globule rouge, les systames de prot6ines s6riques et le ph6notypage HLA classe I. Le tableau 3 rapporte l'efficacit6 des systames classiques et des VNTR. En ne raisonnant que systame par systhme, l'efficacit6 moyenne pond6r4e est de 12,7 % pour les systames classiques~Idont 90 % pour les marqueurs HLA] et de 79 % pour les VNTR.
1
2
3
4
Figure 1 Profil de migration 61ectrophor6tique de RFLP (Hmf : r6v616 par la sonde MS 31). ]~chantillon (1) 4chelle de poids mol6culaire, (2) m~re, (3) enfant, (4) p6re pr6sum4 : le p6re pr6sum4 n'est pas exclu.
Les minisattelites amplifies Fr~quences d'exclusion des VNTR Le tableau 4 rapporte les fr6quences observ6es d'exclusion en fonction des ann6es et des types de
Les r6sultats portant sur l'ann6e 1995 montrent que l'6tude de la r6gion DIS80 permet une fr6quence d'exclusion de 0.70 ; elle est de 0.73 pour la r6gion D17S5 {Figure 2).
276
Ph. ROUGER & V. VAN HUFFEL
Tableau 4 Performances des diff4rentes sondes et rdgions gdnomiques test~es (NT : non test6)
1992
1993
1994
1995
Cumul
Performance optimale rapportfe dans la litt4rature
PH 30 (D45139)
0.87
0.89
0.95
NT
0.91
0.79
0.08
MS 1 (D1S7)
0.90
0.92
0.92
0.92
0.92
0.98
5
G3 (D7S22)
0.80
0.85
0.90
0.90
0.87
0.92
0.3
MS 205 (D165309)
NT
NT
0.90
0.90
0.90
0.94
0.4
MS 31 (D7S21)
0.68
0.72
0.84
0.84
0.79
0.94
0.5
MS 43 (D12Sll)
0.70
0.79
0.72
0.76
0.76
0.92
> 0.3
Y N H 24 (D2S43)
0.77
0.83
0.71
0.73
0.75
0.90
0.03
MS 8 (D5844)
0.54
0.61
0.69
0.69
0.64
0.74
> 0.3
TB Q7 (D10S28)
0.70
NT
NT
NT
0.70
0.88
0.06
C M M 101 (D14S131
NT
NT
0.70
0.71
0.70
0.79
0.04
D1S80
0.70
0.70
0.64
D17S5
0.73
0.73
0.70
Ann4e Sonde
Syst6me
VNTR
Fr6quence (%) de mutations observ4es rapport6e par la litt4rature
Amp VNTR
Les
~ mutations
,, e t , h o m o z y g o t i e s
,
Toute sonde consid6r6e pour un cas donn6 comme r6v61ant un profil d'homozygotie n'est pas consid4r4e au nombre des sondes n6cessaires pour conclure une exclusion. De m~me, le choix d'un minimum de quatre sondes est dfi aux fr6quences de mutations rapport6es (tableau 4).
Discussion Les poureentages d'exclusion observ6s sont en fait fonction de l'objet des demandes formul6es par les tribunaux : ils varient peu (34,8 ~ 42,6 %) pendant les quatre ann4es de l'6tude. Au fur et ~ mesure des ann4es, les syst~mes biologiques 6tudi4s ont profon-
d6ment 6volu6, or la probabilit6 d'exclusion doit ~tre considfrde comme le param6tre pertinent qui qualifie la capaeit6 d'un ensemble d'examens/t parvenir un r6sultat fiable [14-16]. La probabilit6 d'exclusion repose sur des analyses g6nftiques, syst6me par syst6me, des diffdrents marqueurs et de leur polymorphisme : le syst6me Kell est repr6sent6 par deux all61es, eertaines sondes VNTR s'expriment au travers de plus de cent all61es. Au plan quantitatif, 10 systhmes de groupes sanguins induisaient une probabilit6 d'exelusion de 0.80, l'6tude s6rologique du eomplexe majeur d'histocompatibilit4 (HLA A,B) permettait d'obtenir une probabilit6 d'exclusion de 0.93. Ainsi, l'ensemble de ces syst6mes ineluant l'4tude des enzymes de
P O L Y M O R P H I S M E DE L ' A D N ET E X C L U S I O N S DE PATERNITI~
globule rouge et des prot4ines s4riques g6n6rait une probabilit6 d'exclusion de 0.999. N o t r e 6tude m o n tre que la p e r f o r m a n c e r6elle de chaque sonde utilis6e se situe entre 0.64 et 0.92, en p r e n a n t p o u r c h a q u e analyse de migration u n diff6rentiel de discrimination entre 3 et 7 %. Ainsi, l'utilisation de quatre sondes a y a n t un p o u v o i r d i s c r i m i n a n t m o y e n de 0.80 induit u n e probabilit6 d ' e x c l u s i o n de 0.999. Tester, par des t e c h n i q u e s de biologic mol6culaire, 7 zones du g6nome, g6n~re une probabilit6 d'exclusion de l'ordre de 0.999999 ; c'est dire que l ' a n a l y s e du p o l y m o r p h i s m e de I ' A D N a chang4 le n i v e a u de p e r f o r m a n c e des analyses de filiation.
1
2
3
4
5
277
l'introduction de n o u v e a u x syst6mes d ' a n a l y s e du p o l y m o r p h i s m e . Les variations de fr6quence li6es a l'origine des individus affectent essentiellement les calctfls de probabilit6 de paternit4. Les strat6gies utilis6es sont en fait trhs variables selon les p a y s et les laboratoires. Certains laboratoires ne font encore a p p e l q u ' a u x a p p r o c h e s i m m u nologiques et biochimiques, alors que la majorit6 utilise d6sormais les t e c h n i q u e s de biologic mol6culaire ; certains laboratoires ont par ailleurs pr6f6r6 c o n s e r v e r u n m i n i m u m de syst6mes i m m u n o g 6 n 6 tiques c o m m e 616ments de s6curit6 visant ~ maitriser les risques dus ~ des d6faillances de logistique [11]. L'utilisation des V N T R amplifi6es pr6sente de n o m b r e u x a v a n t a g e s : u n e lecture plus pr6cise, u n n o m b r e d'all6les inf6rieur, une interpr4tation p a r r4f6rence ~ un pool d'all61es d6terminds, une analyse statistique simplifi6e, tous 616ments qui font que cette m6thodologie est a m e n 6 e ~ s'6tendre, ce d ' a u t a n t qu'il est possible de co-amplifier plusieurs syst6mes [18-20]. L'6volution des connaissances scientifiques conduit ~ utiliser des m6thodologies et technologies de plus en plus sophistiqu6es et innovantes. N6anm o i n s ces i n n o v a t i o n s n e sont pas sans soutever des difficult6s de r6alisation et d'interpr6tation. C ' e s t p o u r q u o i il est n6cessaire d'6tablir des r6gles pr6cises d'utilisation et des proc6dures adapt6es de contr61e de qualit6 des e x a m e n s [21, 22]. -
6
Figure 2 Profil d'amplification de la r6gion DIS80 dans le cas d'un quatuor ~ deux p6res putatifs, t~chantillon (1) et (6) 6chelle all61ique, (2) m6re, (3) enfant, {4) phre putatif P1, (5) phre putatif P2 : P1 est exclu de paternit6, alors que P2 n'est pas exclu.
L'6tude du g6nome n ' e s t pas d6nu6e de difficult6s, tant en t e r m e s de t e c h n i q u e que d ' a n a l y s e , de telle sorte qu'il est essentiel de fixer des r6gles pr6cises d'interpr6tation des r6sultats bruts des e x a m e n s de laboratoire [11]. Ainsi, c h a q u e p r o g r a m m e d ' a n a l y s e de filiation doit reposer sur une analyse objective des m o y e n s de d6tection utilis6s. N o t r e strat6gie est de se f o n d e r sur trois crit6res : - la probabilit6 d'exclusion, la r6actualisation annuelle des p e r f o r m a n c e s de c h a q u e sonde,
R6f6rences [1] Salmon Ch., Cartron J.P., Rouger Ph. (1991) Paternit6. Les groupes-sanguins ehez l'homme. Masson, Paris, 487-508. [2] MorrisJ.W. (1983) Relationships between power of exclusion and probability of paternity in Inclusion probabilities in parentage testing. AABB, Arlington VA, 267-276. [3] Nijenhuis L.E. (1983) A critical evaluation of various methods of approaching probability of paternity in inclusion probabilities in parentage of paternity in inclusion probabilities in parentage testing. AABB, Arlington VA, 103-114. [4] Wyman A., White R. (1980) A highly polymorphic locus in human DNA. Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), 77, 6754-6758. [5] Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. (1985}Hypervariable minisattelite regions in human DNA. Nature, 314, 67-73. [6] Jeffreys A.J., Wilson V.; Thein S.L. (1985) Individual genetic **fingerprints of human DNA ~. Nature, 316, 76-79. [7] Nakumura Y., Leppert M., O'Connell P., Wolff R., Holm T., Culver M., Martin C., Fujimoto E., Hoff M., Kumlin E., White R. (1987) Variable number of tandem repeats (VNTR) markers for human gene mapping. Science, 235, 1616-1622.
278
Ph. ROUGER
& V. V A N H U F F E L
[8] Wong Z., Wilson V., Patel I. , Povey S., Jeffreys AJ. (1987) Characterisation of a panel of highly variable minisatellites cloned from human DNA. Ann. Human Genet., 51, 269-288. [9] Weber J.L., May P.E. (1989) Abondant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet., 44, 388-396. [10] Edwards A., Civittels A., Hammond H.A., Caskey C.T. (1991) DNA typing and genetic mapping with trimeric and tretrameric tandem repeats. Am. J. Human Genet., 49, 746-756. [11] Masson J.M., Maha G.C., Stuhlmillex G.M., Hein U., Eisenberg M. (1995) Application of DNA analysis to human identification in molecular genetics in diagnosis and research. AABB, Arlington, VA, 25-40. [12] Rouger Ph. (1992) L'empreinte humaine : de l'4thique ~ la g6n4tique. Mereure de France, Paris. [13] Lander E.S., Budowle B. (1994) DNA finderprinting dispute laid to rest. Nature, 371, 35-38. [14] Salmon Ch., CartronJ.P., Rouger Ph. (1985) Paternity in the human blood groups. Masson, New York, 397-412. [1"5] Salmon D., Salmon C. (1979) Blood groups and genetic markers, polymorphism and probability of paternity. Transfusion, 20, 684-694. [16] Salmon D., Seger J., Salmon Ch. (1980) Expected and observed proportion of subjects excluded from paternity by blood
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]
[22]
phenotypes of a child and its mother in a sample of 171 families. Am. jr. Hum. Genet., 32, 432-444. Salmon C., Salmon D., Muller J.Y., Seger J. (1980) Groupes sanguins, groupes de prot6ines et groupes tissulaires dans la recherche de paternit4. M~decine l~gale, L. Derobert, 751-791. Eisenberg M., Sharma S., Carden E. (1994) PCR for identity testing: proceeding from de fifth International Symposium and Human Identification. Madison, WI, Promega Corp. Hammard H.A., Jin L., Zhong Y., Caskey C.T., Chakraborty R. (1994) Evaluation of 13 short repeat tandem repeat loci for use in personnal identification application. Am. J. Hum. Genet., 55, 175-189. WayeJ.S. (1993) Forensic identify testing using highly polymorphic DNA markers: current status and emerging technologies. Transfusion Med. Rev., 7, 193-205. Syndercombe Court D., Lindcoln P. (1996) A review of the 1991-1994 paternity testing workshops of the english speaking working group. In advances in Forensic Haemogenefics, Ed. Carracedo A., Brinkmann B., Bar W., Springer, 6, 683-687. Harrison C., Allen C., Endean D., Morris J., Polesky H., Roby R., Walker R. (1996) Comparability of RFLP results between laboratories: AABB/CAP survey data. In advances in Forensic Haemogenetics, Carracedo A., Brinkmann B., Bar W., Springer, 6, 699-701.