Problème du dosage du cuivre et du zinc par absorption atomique

CLINICA

CHIMICA

PROBL&ME

ACTA

DI_J DOSAGE

243

DU CUIVKE

ET DU ZINC PAR

ABSORPTION

ATOMIQUE’

XAURICE

LOUIS

GIRARD*’

Ciiaire de Biachimie a&%@e, Faculte’ de Pharvmacie, et Laboratoire CentmE de Riochimie, Hdpital LariboisiBre, Paris (France) (Iiec;u le 30 septembre

1967; cornpI&

le IZ fCvrier 1968)

SUMMARY

Determinatiolz

of CO&!W and Z&c by Atomic Absor;htion

Ease and accuracy in the determination of copper and zinc concentrations in biological media is now possible through the use of atomic absorption spe~trophotometry. Until now, only calorimetric technics have been used to determine low concentrations in the order of I ,ug/ml of copper and zinc generally found in biological media. However, the complexity of these media and the small quantities readily available for analysis require long and delicate manipulation of equipment. These two factors make calorimetric technics unsuitable for the determination of concentrations in serial samples. In striking contrast, atomic absorption offers an elegant solution to this problem. The ease and accuracy of atomic absorption spectrophotometry is due to the improved equipment now used while earlier devices had insufficient sensitivity for the determination of concentrations in the order of I pgjml. In biology, atomic absorption spectrophotometry is appropriate for the analysis of blood sera with copper and zinc concentrations in this order, where the viscosity and protein content of the medium prohibit direct nebulization. With lamps made in our laboratory having cooled burner heads, it was possible to establish standards in which the highest concentration is o.4,ug/ml. For example, by simply diluting serum to rjro, rather than extracting the dithiocarbamic product from the organic phase, as is normally done for this analysis, concentrations of copper and zinc could be determined directly. In the case of organs and tissues, it is no longer necessary to have a complete mineralisation. HNO,-HCl extraction for zinc and HNO,-HClO, extraction for copper (which is bound to proteins) is sufficient for the preparation of samples for analysis.

* Atomic Absorption Symposium, Prague, August a+-September I, rg67. ** Professeur de Biochimie appliquee B la Faculte’ de Pharmacie, 4, Avenue de I’Observatoire, F’aris Vie. Clin. Chiw

75,

Acta, 20 (1968) 243~zG0

244

GIRARD

D&j&lies par des propri&& biologit~ues communes ~‘olig~~-~l~n~ents d~~~nlique~ intervenant par leurs combinaisons proteiques ou enzymatiques, le cuivre et le zinc presentent, en outre, certaines analogies analytiques permettant de grouper les problgmes qui se pose& pour leur determination quantitative dans les milieux biologiques. Normalement presents dans Ie serum ;It la mtme et faible concentration, de l’ordre de I ,~g/ml, le cuivre et le zinc subissent des variations ~athol~~giques, se traduisant le plus souvent par une diminution dcs taux normaux sanguins (maladie de Wilson porn le cuivre, baisse de i’anhydrase rarbonique Crythrocytaire pour le zinc, par exemple). htm difficult& anslytiques qui en resultmt, s’ajoute le fait que la p&e d’essai, surtout chez I’enfant, se trouve g~~n&alement limitee B quelques dizaines de microlitres et que certains prelevements, tel l’humeur aqueuse de l’ceil, s’offrent sous un volume plus recluit encore. Par ailieurs, les liquides biologiques B analvser ont une composition tres complexe: lc serum contient environ 75 g par like de proteines, i’urine 20 A 30 g d’uree. Ces imperatifs conditionnent les mod&t& de l’analyse bioclrimique qui doit allier une grande sensibilit& B une extr&me s13&iiicitC &ins fe cas d’tS5memts aussi facilement dissimules que le zinc et surtout le cuivre. Face h ces problPmesr, les methodes de dosage du cuivre et du zinc par V&Z chiw~&e se heurtent B une double difficult&: faible teneur de l’klement metallique h mesurer, manque de sp&ificite des r&.&ifs que la complexit& des milienx biolo~iqu~s interdit d”utiliscr directement, Aussi devient-il Ie plus souvent indispensable de pratiquer une minQalisation prealabie & la reaction coloree nu, & la rigueur, une d&proteinisation. Par suite, les t~cllniq~~s preconisees se montre~t toujours ~‘applicati~i~ longue et delicate, surtout pour les grandes skies. Elles exigent en outre I’emploi de r&~tifs complexants dent la specificitt? est fimit6e et dont la puretd doit Ctre soigneusement contrblee. En dehors de scs Lminentes qualites de sensibilitb, la methode d’acttijation ?~e~,~t~o~z~~~~e presente, pour la pratique courante un certain nombre d’inconvenients, en particulier la complexit de preparation de ~~chantillo~ et de manipulation de l’~ppareill~~e, jointe B la duree non n+$igeable des operations analytiques La spectroph.otome%ie par &zissimz a et6 parfois proposeea. Toutefois, les teneurs en cuivre IlabitueIl~m~~t rencolltr~es en biologic sent trop faibles en regard de la sensibilite de La technique qui exige, par suite, la concentration du liquide de minPralisation, sans apparter cependant une pr$cision suffisante. Quant au zinc, il repr&cnte l’un des metaux pour lesquels le rapport du nombre d’rrtomes excites au nombre d’atomes A l’etat fondamental est Ie plus faible dans les flammes usuelles. En effet, aucune raie du zinc n’apparait dans la Aamme air/adtyl≠ il faut atteindre la tempkrature de Aammes ox~~~~e~cya~o~~ne pour pouwir observer une faible Cmissittn de la raie de rhnance. Connaissant par expkriences 1+4la pussibilik! de la ~~~C~~Qp~o~~~~~~~ie par ahsor$tim ~~o~~~i~~~e d’offrir A I’analyste un ensemble de qualit& r4putPes incom~~t~b~es, nous awns peas@, grhe B elk, pouvoir &carter les principales difficult6s inhC*entes aux mPthodes pr&itdentes et ajouter aux avantages pr~u~~rdiaux de sensibiliti: et de

CU ET &I DANS

MILIEUX

BIOLOCIQUES

24.5

specificit qu’elle fournit celui de la simplicite de mise en ceuvre qui associe, dans une m&me phase operatoire, minQalisation et dosage, et qui peut reduire a la seule dilution de l’echantillon les manipulations preliminaires a I’analyse. Toutefois, la facilite ainsi offerte implique que la concentration finale de I’element a doser se trouve dans la zone de sensibilite optimale de la methode pour le cation consider& C’est cette condition qui tree la difficult6 majeure de la determination du cuivre et du zinc dans les milieux biologiques, a l’exemple du serum sanguin dont la faible teneur en ces elements interdit, a priori, toute dilution prealable. Dans le present rapport c’est cette “interdiction” que nous nous sommes efforces de lever en nous attaquant plus precisement ici au probleme instrumental. CONDITIONS

D'APPLICATION

DE

L'ABSORPTION

ATOMIQUE

AU

DOSAGE

DU

CUIVRE

ET

DU ZINC

Le probleme des inter$bences Cventuelles, minerales ou organiques, s’avere ici assez different de celui pose en analyse industrielle oti les concentrations finales (entre IO-@ et IO-~ g/ml) restent dans des limites compatibles avec la precision analytique. Dans ce dernier domaine, les interferences rencontrees sont relativement peu importantes, en dehors de l’influence des silicates. 11 semble, d’ailleurs, que c’est surtout l’accroissement de viscosite du milieu qui est responsable de la diminution d’absorption du zinc en presence de quantites importantes de cuivre et d’aluminium, par exemple. En biologie, seuls les ions mineraux importants seraient susceptibles de modifier l’absorption du cuivre et du zinc. Nous avons v&it% qu’il n’en Ctait rien par l’experience suivante. Ces deux elements ont CtC dissous a la dose de I ,ug/ml dans un solute artificiel compose de : Ca2+ 0.100 g/l Naf 3.20 g/l Cl5.30 g/l Mg2+ 0.020 g/l 0.200 g/l K+ PO,3- 0.030 g/l L’analyse de ce melange ne montre pas d’interference notable pour le cuivre, comme pour le zinc, puisque les resultats ne different pas de plus de 2?/, de ceux fournis par les memes metaux en solution aqueuse simple. Les m&mes constatations ont CtC faites en ce qui concerne l’incidence eventuelle du pH; en particulier les solutions acides (HCI 0.1 N; I N-HNO, IO N...), ne modifient pas l’absorption atomique, contrairement aux observations precedentes de Gidley et Jones6 qui utilisaient, il est vrai, un bruleur en laiton et non en acier inoxydable comme celui dont nous disposons. Ainsi done, en milieu neutre comme en milieu acide, il ne semble pas exister d’interference du cuivre et du zinc avec les constituants mineraux habituels des liquides biologiquesa. C’est la meme observation, d’ailleurs, qui a et6 faite ulterieurement en milieu nitrique concentre au tours d’un travail sur le dosage des traces de cuivre dans les beurres7. Pour juger d’une Cventuelle interference des proteines, importants constituants organiques normaux des milieux vivants, sur I’absorption atomique de ces metaux, nous avons surcharge respectivement de I*IO-~ g/ml de cuivre et de zinc des dilutions de proteines humaines correspondant a des serums dilues au I /2oe, au I /Ioe, au I /5e. Le pourcentage de la surcharge retrouvee a et6 respectivement pour le cuivre de 9S, Clin. Chim. Ada,

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GIRARD

246

97,93 et pour le zinc de 99.5, 97, gay;. Les memes experiences realisees avec des proteines privees d’ions mineraux par dialyse, puis par passage SW &sines echangeuses d’ions, ont fourni des result&s voisins. En comparant les pourcentages precedents avec les debits correspondants du pulverisateur, on constate un parallelisme satisfaisant. I1 semble done logique de rapporter, ici encore, a la seule variation de la viscosite les differences observees entre des solutions plus ou moins char&es en proteines. Les dilutions au I /5e, et B plus forte raison au I/Z comme l’ont souligne Sprague et Slavi+, conduisent done a des resultats errones et, de plus, se trouvent responsables des depots de mat&es solides qui obstruent rapidement la fente du brdleur. I1 apparait ainsi que le taux de dilution I /IO represente le minimum 2 utiliser ici. Or cette dilution du serum, techniquement necessaire, entraine une diminution correspondante de la teneur en cuivre et en zinc, qui passe ainsi environ de IO@ ?L IO--~ g/ml. On se trouve alors en dehors de la zone habituelle oh la methode fournit la precision recherchee en pathologie, sauf si, la viscosite et la tension superficielle restant peu differentes de celles de l’eau, les liquides biologiques examines peuvent etre nebulises directement. C’est, par exemple, le cas pour l’urine, lors de l’evaluation de la cuprurie dont la valeur est d’ordinaire t&s basse, inferieure a 0.1 mg par litre. Deux possibilites s’offrent alors au biologiste pour effectuer les mesures dans les conditions requises : - proceder B une concentration prealable des elements a doser; - accroitre la sensibilite de la methode. Comentration

pre’alable

au dosage des dime&

Jusqu’ici, c’est surtout a la premiere possibilite que les analystes ont fait appel pour le dosage du cuivre et du zinc. Pour adapter les caracteristiques physiques et la concentration de la prise d’essai aux exigcnces de l’appar~illage utilise, les auteurs ont recours traditionnellelnent aux trois principaux procedes suivants: mineralisation, deproteinisation, extraction quantitative en phase organique de complexes metalliques. Minhalisation. (I) Cal&nation stkhe. La technique a et6 souvent adopt&e par les auteurs americains qui preconisent gen&alement une calcination se&e, au four, &500 ou 700~ C,. Ce pro&de s’avere en fait d&at, surtout dans le cas du zinc ou la VolatiIisation partielle du metal peut entrainer des pertes par defaut. Au contraire, des pollutions par les poussihes atmospheriques entacheraient les resultats d’erreurs par exces. II reste evident cependant, qu’une prise d’essai liquide (ou solide) riche en mat&-es proteiques pourra se trouver fortement concentree apres la reprise du residu de mineralisation par un volume reduit d’un solvant approprie. Dans le cas des organes, ccrtains auteurs n’utilisant que les qualit& de sensibilit6 de l’absorption atomique ont recours & une mineralisation totale pour obtenir une dissolution assuree des cations. Ainsi la methode proposee par Parker8 pour doser le zinc comporte une calcination s&he a 550”. C’est aussi apres destruction par voie seehe (450’) que Cheek et ~011.~0dosent le cuivre et le zinc dans le muscle du rat et les cellules hepatiques et au tours d’insuffisances thyroidiennes et pituitaires. De meme Berman’1 calcine les fragments d’autopsie en presence des acides sulfurique et nitrique pour d&erminer la concentration en cuivre. (2) Extraction acide sin@le. Par la suite, des biochimistes tels que Parker et

CU ET &l

DAN.5 MILIEUX

~011.~’ ont cherche particulier

BIOLOGIQUES

a reduire les inconvenients

de la calcination

s&he,

247 des manipulations

preliminaires,

en operant une simple dissolution

extractive

et en grace

& une digestion des tissus par HNO,, a l’ebullition, suivie d’une evaporation SOUS vi& pour chasser l’acide. Dans le cas de tissus riches en lipides, le residu de la digestion est repris par l’eau, puis delipide par un solvant organique; on peut alors doser le cuivre et le zinc directement dans la phase aqueuse, sans meme &parer la phase organique. Nous pensons personnellement que, pour profiter pleinement des qualites exceptionnelles de sensibilite et de rapidite de la methode d’absorption atomique, il convient de reduire, dans la mesure du possible, les operations de preparation de la prise d’essai et, par suite, de s’attacher a rechercher des pro&d& simples de mise en solution, d’execution facile et rapide, ne necessitant que l’emploi de reactifs volatilsr3. 11 parait en tout cas souhaitable que l’extraction ne fasse pas appel a des sels mineraux comme le sulfate acide ou le permanganate de potassium, classiquement utilises en toxicologic dans les methodes de mineralisation sulfo-nitrique de Pouchet-Meilliere et Deniges. 11 y aura avantage a diviser finement les tissus conjonctifs, les scleroproteines, pour permettre une meilleure attaque organes frais ou mieux encore a en provoquer

du parenchyme cellulaire, a broyer les la dessiccation pour faciliter la pulveri-

sation. Quant au choix de l’acide a utiliser, il n’est pas sans inter&t. A l’acide sulfurique, parfois g&rant lors des mesures par absorption atomique, nous preferons HNOS et HCl que nous utilisons de la man&e suivante: 500 mg de poudre d’organe, en suspension dans IO ml de HNO, (redistille) dilue au r/5e, sont soumis a une agitation Clectromagnetique continue, puis chauffes pendant IO min jusqu’a ebullition. Apres centrifugation, le culot subit a nouveau une agitation de 5 min en presence de IO ml de HCl dilue au r/roe. Un nouvel epuisement, dans les memes conditions, fournit un second extracturn chlorhydrique. Nous avons eu l’occasion d’effectuer de nombreuses experiences sur des organes d’espece et de nature variables et les resultats ont toujours ete comparablesr”. Dans le cas de l’analyse

d’une poudre de foie de lapin lyophilise,

nous avons remarque

que

si les quantites de zinc extraites (et aussi de magnesium) sont de l’ordre de 95%, les resultats obtenus pour le cuivre sont plus irreguliers, n’atteignant parfois que 6276,. 11 reste ici la ressource de pratiquer par simple calcination la mirkralisation du residu de l’extraction nitro-chlorhydrique. Cette operation s’effectue en quelques minutes, beaucoup plus rapidement que si la mat&e organique n’a pas ete prealablement trait&e. En ajoutant le produit de la dissolution des cendres aux liqueurs extractives precedentes, on dispose done en solution de la totalite des cations. Ainsi, lamethodeque nous suivons comporte une extraction nitrique et deux extractions chlorhydriques, suivies eventuellement pour le cuivre d’une calcination rapide du residu. Les cendres sont reprises par le deuxieme extrait chlorhydrique, puis les trois solutions melangees. La duree des manipulations ne d&passe pas une demi-heure. (3) Digestion n&o-perchlorique. Lorsqu’il n’est pas possible de s’adresser a des organes desseches et pulverises, mais directement a des organes frais, il devient necessaire de proceder a une digestion nitro-perchlorique que nous pratiquons commodement de la facon suivante: I g de tissu est trait6 a chaud par z ml, etendus par 8 ml d’eau, d’un melange a parties &gales de HNO, et de HClO, concentres. La digestion s’opere en 2 & 3 min et sans danger si on kite la dessiccation. Clin. Chivn. Acta, 20 (1968) 243-260

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248

C’est aussi la solution adopt&e par Kahnke15 pour doser le zinc dans des tissus

humaim formolb,

sans risquer

cendres & haute tempkrature. tester la valeur de l’absorption

les pertes en n&al

entrainkes

par la formation

des

La m&ode des ajouts doses permet B cet auteur de atomique et de trouver pour le zinc des chiffres voisins

de 95)n. C’est par un pro&d& assez comparable que Chang et ~011.‘~ ont do& le zinc (et le magnQium) dans le tissu cCr6bra1, particuli&rement riche en lipides. Toutefois, l’attaque

acide est pratiquCe en deux temps successifs : attaque

et chaud, suivie d’attaque

par HClO, & 707~; (I /5 volume),

de denses fumCes blanches de HCIO,. Le produit de la digestion nitro-chlorhydrique diluC avec de l’eau distill&e A un volume convenable,

par HNO, concentri

B chnud, iusqu'& apparition

ou nitro-percll~ori~~ue est alors dCtermind par l’importance

de la

prise d’essai. Nous pro&dons g&&alement A_une centrifugation pour Climiner les mat&es insolubles (lipides, perchlorate de potassium, etc.). Nous d&onseilions l’extraction lipidique par agitation avec un solvant organique, car les sels de l’acide perchlorique passent facilement en phase organique. Cette technique d’extraction semble, de ce fait,, moins recommandable IM$wotkinisatio?z. L’action

que la pr&Cdente pour les organes riches en graisses. prkcipitante de l’acide trichlorsc&ique a &A souvent

mise B profit par les auteurs an&o-Saxons pour &miner Ies protCines dont Ia prPsence provoque des interfkrences, ici surtout d’ordre physique par aug]~lentatioI~ de viscosit& C’est en parti~ulier la te~l~nique adopt&e par Berman17 qui d~prot~inise le &rum par cinq volumes d’acide triclrloracCtique & 500 avant de complexer le cuivre et de l’extraire en phase organique. Comparant les effets respectifs de la dilution simple et de la d+rot&nisation par l’acide trichloradtique sur la pr&ision du dosage du cuivre s&ique et de la r&up&ation des ajouts do&s introduits comme tClmoins, Parker et ~011.~~constatent 1’Cquivalence des deux techniques, 21leurs yeux kgalement satisfaisantes. C’est la d6protGnisation trichlorac&ique, et B chaud, que rkalisent Prasad et c01l.~~ sur le s&urn et les globules, au fours d’une etude sur la &partition du zinc chez les sujets normaux et les cirrllotiques. Pour remkdier aux inconv~nients de la dilution, an I 12 au x~iinimunl, n~cessairement introduite par l’addition du r&a&f prkcipitant, res auteurs recherchent l’intCr?t d’une concentration priralable des iichantillons par lyophiiisation, technique assez longue qui prksente pourtant l’avantage d’Pliminer les risques de contamination atmosphbrique. La d6protGnisation des Cchantillons biolo-

giques est susceptible, dans certains cas, d’entrainer une r&partition non homog&ne des Wnents minCraux B doser entre les phases solide et liquide ainsi cr&Aes. C’est la constatation que nous avons faitelg & propos du magn&ium 6rythrocytaire qui s’extrait facilement, en milieu acide, du prPcipiti! des prothines dbnaturkes (cation faiblement fix@ sur les protkines). Les erreurs ainsi commises pourraient n’etre pas limitkes au dosage du nlagn~siuIl1. ~~t~~c~io~ ~~a~z.t~tat~u~de conz~lexes #r~a~~~l~~s. Comme l’on sait, la m&hode consiste & mettre en prCsence deux phases non miscibles: une solution aqueuse de l’&Aantillon et un solvant organique non miscible. Pour faire passer I’ion mCtallique en phase organique, on utilise la prop&t6 d’agents ch&lateurs de convertir le mCta1 en une forme non ioniquement chargke, repr&.enGe par un complexe stable, neutre et extractible. Souvent recommand6e et frCquemment utilisPe pour l’analyse des mCtaux lourds, particulierement en toxicologic (mercure, plomb.. .) cette excellente technique de concentration a, de plus, l’avantage de permettre un recul appr&iable

CU ET &l

DANS

MILIEUX

BIOLOGIQUES

249

des limites de sensibilite de la spectropho~om~trie d’absorption atomique. En effet, la phase fmale se trouve constituee par un solvant organique voiatil (isobutylmethyl&one, par exemple) qui augmente l’absorption specifique d’une part en am& liorant la nebulisation, d’autre part en Clevant la temperature de combustion, exothermique dans le cas du solvant contrairement B I’effet endothermique de 1’Cvaporation de l’eau des solutions aqueuses analysees. 11 n’est pas inopportun de rappeler, en outre, les possibilites de dosages indirects offertes par la methode d’extraction organique. C’est ainsi qu’est mise B profit la propriete du cuivre de fournir des combinaisons specifiques avec certaines substances organiques telles les acides gras dont les savons de cuivre sont susceptibles de s’extraire quantitativement par les solvants organiques comme le chloroforme20. Le dosage du cuivre dans la phase organique s’opere alors directement et traduit la teneur en acides gras de la prise d’essai, le serum sanguin par exemple. {r] Choix d&s r&clijs. - Cas du cuivre: Le reactif complexant le phrs cfassique est sans doute le reactif de Del&pine (acide diethyldithiocarbamique), utihse seui, selon par exemple la technique de Fleury et CourtoiP ou en presence d’ethylenediamine tCtracCtate de sodium pour Cviter les interferences, comme l’a pr&onis& recemment Bermanr7 lors d’une etude sur les modifications du cuivre en pathologie cardiaque, hepatique et ca.nc&euse. Les auteurs angle-Saxons substituent souvent au r&&if precedent le pyrro~idine dithiocarbamate d’ammonium, produit encore rare en Europe, mais facilement prCpare, suivant une technique d&iv&e de la m&bode de Malissa et Schoeffmann22. Lakanen23 decrit m&me une methode rapide d’extraction chloroformique du cuivre et du zinc par l’acide pyrrolidine dithiocarbamique for-me extemporanement par synthese directe dans une solution de chloroforme. En dehors des dithiocarbamates, la dithizone a les faveurs de Hermann et Lang 24 tout comme l’hvdroxy-8 quinoI~ine, _I egalement utilisee par Takenchi et ~011.~~qui s’adressent encore a la sahcylafdoxime pour extraire le cuivre serique. La cupro’ine prCconisCe par Jerome et Schmitt 2B,la bis-cyclohexanone adopt&e du cuivre. par Bohuon27, ont CtC aussi proposBes comme rbactifs complexants - Cas du zinc: En dehors des d&rives de l’acide dithiocarbamique, de la dithizonez8, Pgalement applicables au dosage du zinc, on a preconise des chelateurs comme le zinconz9 ou encore l’indo-oxime. (2) Choix des solvants. Ce choix est orient6 par la recherche des principales qualites exigees pour le solvant qui doit : - pouvoir entierement dissoudre le metal ch6latC et former une solution non miscible avec la solution aqueuse qui renferme I’echantillon. - brfiler avec une flamme Claire et reguliere. L’emploi, au tours de la phase extractive, de sofvants chlorPs du mCthane (CHCI,, Ccl,) pouvant eteindre ou diminuer la flamme doit &tre suivi d’une evaporation complete precedant le dosage par absorption atomique. - augmenter l’absorption en amkliorant la nebulisation et en klevant la temperature de combustion, qualite secondaire, mais interessante, deja soulignee. Ce sont en general, les esters et les cCtones30 qui rkpondent le mieux aux caracteristiques recherch&s et plus particu~i~rement dans le dernier groupe organique les homologues de I’acetone : isopentyl-, isopropyl- et surtout isobutylcetone. L’extraction en phase organique du cuivre ou du zinc par I’intermediaire d’agents complexants, CEi+z.Chim. Acta, zo (1968) 243-260

GIRAKD

25()

tels les d&iv& de l’acide dithiocarbamique, ne p&e&e comme inconvhients qu’une manipulation longue et d&licate et jamais sans doute, du moins dans le cas des liquides biologiques, int6gralement quantitative,

Jusqu’ici, c’est surtout A la concentration prkalable des Mnents A doser que les analystes ant fait appel en proddant, comme nous l’avons vu, soit B une min&alisation par la chaleur &he ou humide, soit B une d~pro~~i~~satioll, soit rl une extraction quantitative de &Clates par un solvant organique non miscible A l’eau. Pour &tre j meme de rkduire au ~~a~irnurn de telles operations pr~liminaires, tout en rPservant la possibilit4 d’analyserdes traces comprisesentre oeto.j pgjml, ilconvient alors de prockder 2 la seule manipulation virtuellement souhaitable, la d~~~~ti5~z, opCration simple Cventuellement nhessaire pour amener la teneur de l’&ment & (loser dans la zone de meileure sensibilitC. Cette condition se trouve respect&e dans le cas des alca~ino-terr~ux, calcium et magnesium, prCsents dans tes milieux biologiyues Li une concentration relativement hlevth. C’est ainsi qu’en utilisant des techniques d&ides des travaux de David 81et de Willisa”, nous sommes a m6me de closer ces mCtaux, apr&s une simple dilution au I j$oe ou au ~/rooe, B des concentrations finales de l’ordre de z-10-6 g/ml dans le cas du calcium et de 0.2 1I@ g]ml dans celui du ~~agn~siurns~. Mais Ie problAme se pose tout diff~re~lment en ce qui concerne le cuivre et fe zinc, dont la IaibIe concentration habituelle, dans le s&urn sanguin par exemple, n’atteint pas la limite infbrieure de sensibilitti: de la m&hode et interdit par suite toute nouvelle dilution exp~rimentale. 11 devient alors indispensable d’avoir recours B la seconde des deux possibilit~s envisag&s : aug~~enter la sensibility de ia tec~~ni~~ue, c’est Q dire am6liorer le rapport signal/bruit du systhe. Avec l’appareil Perkin-Elmer 303 dont nous disposions, notre probhne personnel consistait done A am6liorer la sensibilite de ce dernier sans en modifier la conception. Ce probl&me a Ct6 r&olu gr&ce $ I’appor~ dans nos recberches des ~{)nsid~ratio~s t~l~oriques et te~~lll~~~ues suivantes, ayant trait plus particuli~rement : .- B la ri?alisation de brDleurs assurant le rnax~rnu~ll ~a~sorption dans la traversCe des flammes; -- B la fabrication de lampes particulihes & cathode crease assurant la stabiIit6 de la source lumineuse; -.- & l’adopt~on d’un systhe d’enreg~strement destin4 2 am~~iorer la quality des mesures et la pr&ision des r&ultats. Pvobldme des hr4lews et dzl rn~~~~~,~rn d’~b~~y~t~~~dnrzs lesftammes. En premibre approximation, l’absorption atomique, comme l’on sait, suit la loi de Beer-Lambert. On peut done, toutes pro~ortio~s garddes, augmenter I’absorption en allongeant la Asmme ou plus pr&SCment la longueur de l’atmosph&e o& les atomes sont susceptibles d’absorber les radiations de rfisonance. (I) C’est la solution adopt&e par Fuwa et Vallee3” qui utilisent des bnileurs particuliers ri “Aamme souffiCe”, dans lesquels la Aamme se trouve renferm&e dans un man&on r6fractaire en cCramique ou en quartz, tandis qu’un ventilateur, dirig4 perpendi~u~a~rement & I’estrCmitb de celui-ci, &carte les gaz chards du systhne optique. Ici, le faisccau ~ull~ineux traverse la Bamme selon une oblique presque parallgle B l’axe de cette dernikre. Les mCmes auteurs, avec Pulido et NcKay35 ont employ6 le [email protected]

Ah,

20 (rga?!

243~rGo

CU ET .&I DANS MILIEUX

dent dispositif

BIOLOGIQUES

pour la determination

2s

du zinc en biologie,

directement

en flamme

hydrogene/air, sans autre operation preliminaire que la dilution de l’echantillon avec de l’eau. Les sensibilites ainsi obtenues sont elevees: le zinc peut &tre en effet analyse a des concentrations comprises entre 0.05 et 0.5 pg/ml, approchant celles du marquage isotopique. Pourtant, ce systeme relativement encombrant (le tube peut atteindre 90 cm) se revele de plus instable, car le pouvoir reflecteur des parois du tube joue un role important dans la transmission de la lumiere. En outre, malgre l’avantage de la dilution

qui Ccarte d’eventuelles

assez riches en sels ou en matieres accumules progressivement dans les mesures.

interferences, organiques

lorsque les solutions (cas frequent

sur le tube peuvent entrainer

analysees

en biologie),

des irregularites

sont

les depots importantes

Avec un dispositif assez peu different, par contre, Thilliez36937 a obtenu de remarquables resultats

lors du dosage d’atomes

a longue duree de vie (Pb, Hg) dans l’air

atmospherique qui joue alors le role de comburant, sans apporter tion des parois du tube en l’absence de solution a nebuliser. (2) 11 est encore possible,

pour obtenir

une absorption

le facteur

maximale,

de pollu-

d’utiliser

un

montage de plusieurs brtileurs en ligne ou mieux encore un montage a traverdes multiples, grace a un jeu de miroirs convenablement orient& et disposes de part et d’autre de la flamme. peut effectuer

C’est le cas de l’appareil Jarrel-Ash dans lequel le faisceau lumineux cinq passages successifs a travers les flammes de trois bruleurs oxy-

acetyleniques. En fait, l’elevation du taux d’absorption produite par un tel systeme apparait beaucoup moins importante que le laisse prevoir le calcul theorique, m&me si les meilleures conditions de parallelisme du faisceau lumineux sont observeesZ4. (3) Les bruleurs a flamme laminaire, dans lesquels le melange des gaz s’effectue dans une enceinte preddant le bet, se pretent mieux que les brtileurs a flamme turbulente aux exigences de la spectrophotometrie par absorption atomique, aussi bien par les possibilites qu’ils offrent de realiser la nebulisation suffisamment loin des flammes, pour rendre parfaitement homogene le melange du brouillard et des gaz, que de donner aux flammes une forme permettant a la population des atomes a l’etat fondamental de rester group&e sur le trajet necessairement etroit du faisceau lumineux. Cependant, malgre la dilution, les solutions de cuivre et de zinc que nous avons a analyser en biologie renferment encore de 8 a 20 $/,,,, de matihes organiques ou minerales qui, par suite de l’evaporation intense de la phase liquide de nebulisation au contact

des parois des bruleurs, obstruent irregulierement la fente de ces derniers. (4) L’augmentation de largeur de la flamme, grace a un systeme de brfileur a trois fentes paralleles comme celui de Bolings, en permettant une meilleure interception du faisceau lumineux convergent de l’appareil P.E. 303, retarde le phenomene precedent et en limite les inconvenients. (5) Nous avons pen& que l’un des meilleurs moyens de remedier a l’instabilite de la flamme consistait a refroidir energiquement les parois des bruleurs a l’aide d’une circulation d’ea@. A cet Cgard, deux modeles de brblews refroidis ont et6 realis&@. La Fig. I represente le modirle a fente (r2o x 0.4 mm) type air/acetylene, I’autre modele destine aux flammes “froides” type air/butane ou air/propane ne differ-ant du precedent que par le remplacement de la fente par une shie d’orifices circulaires de 3.5 mm de diametre (modele depose). Le caractere souvent corrosif des solutions a doser interdit necessairement l’usage d’un alliage de cuivre (laiton, bronze, etc...) pour la fabrication de l’appareil. L’acier ordinaire peut convenir, mais nous lui preClin. Chim.

Acta,

zo (1968)

243-260

GIRARD

252 Fente

/\

t Chemise

Fig, I. Briileur refroidi air-ac&yl&ne. fCrons un aliiage inoxydable,

du type IS/~ molybdene,

qui nous a dorm4 toute satis-

faction. Avec de tels bruleurs et un debit d’eau convenable, les parois restent maintenues a la temperature ambiante, m&me apres plusieurs heures de fonctionnement et sans necessiter de nettoyage. On sait que lors du dosage de certains

6lCments commc le cuivre ou le zinc, con-

trairement au cas du calcium et du magnesium produisant dans les flammes des oxydes refractaires, il est preferable d’utiliser une flamme de temperature moderee comme celle fournie par le butane (1895’), plut& que la flamme classique du mClange air/acetylene (2325”). Dans le cas du cuivre en effet, l’absorption atomique provoquee par une solution renfermant I ,ug/ml de cuivre, toutes chases &gales par ailleurs, atteint respectivement

:

927’, pour une flamme air/acCtyl&ne de 12 cm de longueur, 17.9~1; pour une flamme air/butane de meme longueur, soit un gain en sensibilite voisin de IOO~/~en faveur de la flamme “refroidie”. Dans le cas du zinc egalement, le melange air/butane autorise des sensibilites presque deux fois supkieures a celles des flammes chaudes. A la longueur d’onde utilisee (2 = 213.8 run), c’est j dire dans l’ultra-violet iointain, l’absorption propre d’une flamme de IO cm, dans nos conditions operatoires, est de l’ordre de 25%, soit une valeur 17 fois superieure a celle fournie par la pulverisation d’une solution contenant I sIO-’ mg/ml de zinc. Par suite, la stabilite de la flamme pose pour le dosage de ce metal une condition imperative, en partie realis& grace B nos bruleurs refroidis. L’absorption propre de la flamme varie, d’ailleurs, avec la richesse du melange gazeux qui doit rester legerement oxydant pour que la valeur de l’absorption non specifique reste sensiblement constante. P~o~~~rnedes ~~~~~e~d ~~t~l‘~a~ cwl-fse etde Ea s~~~i~~~~ ids la SO~CB ~~t,rn~~~~~se. Nous nous sommes efford d’ameliorer le rapport signal/bruit pour rendre plus significatives les plus minimes variations de l’absorption atomique en construisant au laboratoire un nouveau modele de lampes B cathode creuse, a brillance maximale pour un courant au& faible que possible. la cathode creuse a fait l’objet de nombreuses recherches destinees a augmenter son rendement lumineux. Si la valeur des gaz rares qui, SOUS faible pression, remplissent la cavite des lampes n’a pas d’inffuence notable sur la qualite spectrale, il n’en est pas de m&me des caracteristiques des lampes B cathode creuse dont l’emission doit offrir les trois principales garanties suivantes: (I] I&ens& et jkessc: des radiatiorzs. Ces deux qualites de la hnni6re emise paraissent difficiles B concilier. En effet, pour augmenter f’energie lumineuse, on est tent4 d’augmenter l’intensitd du courant electrique, comme c’est le cas avec les lampes commerciales actuelles. Dans ces conditions, on observe un diargissement de la raie c&Z. Chim. A&, 20 (1968)

2.+ZhO

CU ET .h

spectrale

DANS

MILIEUX

BIOLOGIQUES

dont seule la partie centrale,

253 comme l’on sait, correspond

a la raie de r&so-

nance, et provoquant de ce fait une baisse de sensibilite. C’est ainsi que nous avons pu observer, dans les memes conditions ophatoires, qu’une solution contenant 0.2 ,ug/ml de cuivre provoquait une absorption de 2% avec une alimentation en courant de 2 mA, et de ~“/bseulement si l’intensite atteignait 25 mA. C’est done d’un faisceau de “rendement

lumineux”

pour une raie de resonance

choisie que depend essentielle-

ment la qualite dune lampe. Quant aux lampes commerciales a cathode de zinc habituelles, elles se revelent souvent de qualite mediocre et d’emission faible et instable. On se trouve, par suite, contraint d’augmenter le courant d’excitation de la lampe et de reduire ainsi considerablement la duree de vie de cette derniere. Les nouvelles

lampes zinc/calcium

Pour

ameliorer

Cmise, Sullivan

semblent

les deux

cependant

qualites

de meilleur rendement.

si difficilement

et Walsh40 ont eu l’idee d’exciter

compatibles

de la lumiere

les atomes metalliques,

arraches

par

le bombardement gazeux, par une decharge entre deux electrodes auxiliaires electriquement independantes du circuit principal et canalisees par un dispositif en verre. Sans subir d’elargissement,

la raie de resonance

superieure aux valeurs habituelles.

peut alors atteindre

une inter&C

IOO fois

Par ailleurs, le spectre emis est beaucoup plus simple.

(2) Stab&e &&mission. Cette propriete est fonction des variations de l’intensite lumineuse provenant essentiellement de l’echauffement progressif de la cathode

et de phenomenes derniere. Quand

d’ionisation

les variations

transitoires

sont

brusques

autour

de I’armature

et irregulibes,

qui supporte

elles rendent

cette

impossible

toute evaluation m&me approximative. Elles s’observent generalement sur des lampes de fabrication industrielle, m&me a l’etat de neuf dans lesquelles la surface exterieure de la cathode et son armature ne sont pas electriquement isolees. Rousselet3g a m&me eu a essayer certaines lampes commerciales dont l’interieur de la cathode, malgre une heure de prechauffage avec une intensite pourtant superieure a la limite utilisable, refusait obstinement de s’allumer. (3) Absence de fond continu

d’hnission.

Le phenomene

d’absorption

atomique

interessant essentiellement la zone centrale de la raie de resonance, il importe que celle-ci soit parfaitement isolee. L’existence d’un fond continu, provenant generalement d’impuretes des gaz rares (oxygene, azote.. .) diminue I’intensite de raies spectrales et limite la specificit des mesures. La sensibilite imposee en biologie par le dosage du cuivre et du zinc, la qua&C souvent insuffisante des lampes commerciales a l’epoque oh ont debut6 nos recherches, le prix eleve de celles-ci, nous ont incite a construire nos propres lampes dans le double dessein d’ameliorer leur qualite tout en simplifiant leurs construction. L’originalite du nouveau modele de lampes, dites a “cathode externe”, depose par mon collaborateur Rousselet et dont on trouvera la description par ailleur+’ a consist6 a utiliser comme cathode un bloc metallique scelle a l’exterieur de l’enveloppe de la lampe et ne communiquant avec I’intbieur que par la cavite menagee dans le metal (Fig. 2). L’interet de ce type de lampes est triple: regularit de fonctionnement, car les phenomenes d’ionisation propres a I’armature de la cathode creuse interne se trouvent ici &art&; facilite de fabrication ne necessitant en particulier qu’une seule soudure verre/metal

correspondant

a l’anode; Clin. Chim. Acta,

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GIRARD

254

jFenitre

(Cathode

1Anode

creuse

de quartz

l?g. 2. Lampe & cathode creu~e externe (Coupe longitudinalc) -

possibilite

B un dispositif

d’emission

(radiateur

intense,

a ailettes,

sans Clargissement

circulation

des raies spectrales,

d’eau, effet Peltier...)

refroidissement de la cathode externe. Les lampes de cuivre massif sont girneralement

assez Cmissives et supportent

intensites

de limiter l’intensite

de l’ordre de

20

mA. Mais il est preferable

grace

permettant

le des

en fonction

de la sensibilite du systeme de detection, puisque la valeur absolue de l’absorption atomique decroit nettement avec l’augmentation du courant alimentant la lampe41. Pour notre part, nous preferons utiliser des lampes a cathode de laito+ qui ont l’avantage de permettre les dosages successifs du cuivre et du zinc par un simple changement de longueur d’onde (Fig. 3). L’emission des raies du cuivre, m&me apres plusieurs centaines d’heures de fonctionnement, n’est pas affectee par le phenomene de migration du zinc a la surface de la cathode a qui ce metal communique l’aspect blanchatre observe. La presence des raies reversibles du cuivre a 215, 217 et 218 nm, done assez proches de la raie du zinc a 213.8 nm, n’a pas d’inconvenient pour le dosage de ce dernier si on prend soin d’adopter une definition suffisante du monochromateur, 0.65 nm par exemple, avec une fente de I mm, qui permet ference spectrale. Des lampes a cathode de laiton ainsi fabriquees

d’eviter

tout risque d’inter-

se sont revelees

excellentes

puisqu’elles ont conserve leur qualite apres plus de IOOO heures de fonctionnement. E+ressioFtzgraphique des mesures. L’enregistrement des valeurs d’absorption permet d’objectiverlaqualite des mesures et d’ameliorer sensiblement laprecisiondes resultats. En effet, le signal utile reste toujours entache d’un bruit de fond imputable soit aux variations d’energie fournie par la source, soit B l’irregularite de la nebulisation ou de la combustion, soit enfin au systeme de detection lui-meme. Par suite, l’aiguille de l’appareil de mesure oscille irregulierement autour d’une valeur moyenne, d’autant plus difficile a preciser que la sensibilite recherchee et par consequence l’amplification se trouvent plus poussees. En pratique, seul l’enregistrement graphique des mesures per-met d’obtenir une precision satisfaisante lorsque les phenomenes d’absorption mesures n’atteignent pas 5%. Dans le cas particulier de l’analyse du cuivre et du zinc en chimie pathologique, nous utilisons un systeme d’enregistrement precede d’un filtre amortissant considerablement les variations erratiques dues principalement au photomultiplicateur. Le Clin. Chim.Acta,

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243-~60

CU ET .%l DANS MILIEUX BIOLOGIQUES

1 Cu!324.

255

7) I

3

2

0.2

Sl .1

1 0.1

2

t340

300f

j230 nvr\.

1

11

Fig. 3. Spectre d’une lampe & cathode de laiton (Fragments de spectre de r9o & 230 nm et de 300 & 340 nm). Fig. 4, Exemples de dosage direct du cuivre dans le s&urn sanguin diluk au 1 /ro&me (Lampe laiton 2 cathode externe, 6 m4, 1 = 324.7 nm). Gamme d’Ctalonnage o.1-0.2-0.3-0.4~1o-~ g/ml. S I S&urn normal; S 2 S&urn de maladie de Wilson; S 3 SCrum de grossesse (6eme mois) ; S 4 S&urn de grossesse (S&me mois).

filtre utilise comporte un jeu de condensateurs interchangeables dont les valeurs s’etagent entre 0.5 et 16 ,uF, mantes en parallele sur l’entree de I’adaptateur d’impk dance. En outre, l’introduction en s&e et entre les condensateurs soit de resistances, soit de selfs de forte valeur, permet, en fonction de l’importance du bruit, de choisir la combinaison la plus favorable. En apparence comparables, les problemes analytiques du cuivre et du zinc prksentent cependant des difficult& de r&solution sensiblement differentes. Le cuivre est en effet, toutes proportions gardees, quatre fois moins absorbant que le zinc. 11 exige done une amplification du signal accrue pour que le dosage conserve la m&me precision. Deux avantages viennent heureusement compenser cette inferiorit+: un taux Clew2 d’amplification est rendu possible par la position de la raie de resonance du cuivre (A = 324.7 nm) dans une region du spectre techniquement favorable oh les absorptions propres a l’atmosphere et B la Aamme se trouvent relativement mod&es. la raie Cmise par la cathode se r6vele assez intense et assez stable. Dans le cas du zinc, les differences proviennent des deux facteurs suivants: la position de la raie deresonance dans 1’U.V. lointain (213.8 nm). Dans cette C&n. C/aim. Acta,

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256

GIRARD

zone l’absorption par l’atmosphere, tout en restant encore inferieure mes utilisees (air/acetylene et air/butane), n’est plus negligeable;

a celle des flam-

la relative instabilite de l’emission des lampes au zinc. Les fluctuations spontanees observees avec certains modeles commerciaux se traduisent par des deplacements de la ligne de base cornparables a ceux que produirait En outre, la volatilisation assez rapide du zinc impose l’usage

IO-' g/ml de zinc. d’intensites faibles

pour eviter la destruction rapide de la cathode et reduire l’auto-absorption. 11 est vrai que nos lampes a cathode de laiton apparaissent plus rohustes, plus stables et plus Cmissives que les lampes a cathode

de zinc pur”Z.

Aussi, grace aux ameliorations proposer, il devient possible d’obtenir l’absorption

atomique

d’une solution

que les etudes effecttrees nous ont permis de des enregistrements a ce point favorables que contenant

IO-’ g/ml de zinc se traduit

graphi-

quement par une elongation de 50 mm, appreciable et reproductible a I mm p&s. Dans le cas du cuivre pour une mitme concentration, l’incertitude est de I’ordre de 40/1,. MdTHODES

PROPOSriES

Solutions -

dalom Les solutions

tournure

de cuivre ou de zinc pur en aiguilles dans la quantite

stock

Ctalons sont p&par&es

par dissolution minimale

de

IOO

mg de

d’acide chlor-

hydrique, le volume ainsi obtenu &ant complete a I litre par de l’eau distillee. Les solutions d’etalonnage sont tit&es respectivement a 0.1-0.2-0.3 et 0.4 /(g/ml. I1 convient de remarquer qu’il s’avere impossible de conserver en flacons de verre,

comme

en recipients

plastiques,

des solutions

de concentration

inferieure

a

5 &ml. Dosages dam le s&urn sang&n Le serum est simplement dilue au I /Ioe par de l’eau distillee contenant ~'$b de HCl. La m&me dilution permet, grace a I’emploi de lampes en laiton, le dosage des deux elements a partir seulement de 0.3 ml de serum. Les resultats trouves concordent tout a fait avec ceux des methodes colorimetriques. La moyenne normale, dans le cas du cuivre, oscille autour de 135,ugpour IOO ml et, dans celui du zinc, elle est de I’ordre de 116 pug pour IOO ml et par suite identique a la valeur fournie par la technique de BohuonZ7 choisie pour comparaison. Voice, a titre d’exemples, quelques enregistrements de dosages directs du c&we dans le serum sanguin normal ou pathologique, apres simple dilution au I /roe (Pig. 4). La Fig. 5 reproduit des exemples de dosage du zinc dans un serum normal, un serum pathologique (dilution au 1/1oe) et dans les erythrocytes (dilution au I jrooe) (A), ainsi que dans une preparation d’insuline (B). La modicite de la prise d’essai necessaire nous a permis de doser le cuivre dans l’humeur aqueuse (0.2 ml) d’un bless6 atteint d’un eclat metallique dans la cornee (42 pg/~oo ml) (Fig. 6) et de suivre l’effet du traitement par la penicillamine. Dosages dam les tkythrocytes L’anhydrase carbonique, constituant des globules rouges, contient un atome de zinc par molecule. La determination du zinc erythrocytaire permet done un dosage indirect de l’enzyme, qui s’effectue aprits une simple dilution au 111ooe dans l’eau Clin.

Chim.

Acta,

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CU ET ZIl DANS MILIEUX

BIOLOGIQUES

2.57

e

A

Fig. 5. Exemples de dosage du zinc (Lampe laiton & cathode creuse externe. 6 mA, 3, = 213.8 nm). A, Dosage dans le sang: I, S&m normal (dilu6 au r/lo&me); 2, S&urn hdpatique (dilu6 an ~/rokme) 3, Erytbrocytes (diiution au r/rookme). d’&alonnage 0.1-0.2-0.3-0.4~ 10-G g/ml. Fig. 6. Dosage

distjil&

du cuivre

dans

une humeur

B, Dosage aqueuse

(Fig, 5) et conduit a des r&&tats

dans

nne pre’paration

d’insuline

(I). Gamme

(H.A.) (Dilution au r/Iokme). dont la moyenne

osciIIe autour de 14 mg

par litre de cellules.

duns les urines Le dosage du cuivre urinaire s’effectue directement sur les urines acidifiCes. Les taux trouvCs sont le plus souvent inf&ieurs & 0.1 ,fg/mf et peuvent s’apprkier avec la m&me p&&ion que ceux des pr&l&vementssanguins.

Dosages

Dosages duns les organes

l3ne simple extraction nitro-chlorhydrique sunlit le plus souvent et permet de r&U-e la prise d’essai B 50 mg environ. La Fig. 7, reprksente un exemple d’enregistrement obtenu lors de 1’Ctude de la richesse en zinc de reins de lapins (Fig. 7, II). Dans le cas du cuivre, plus kergiquement 12 aux protkines, I’extraction nitroperchlorique s’impose et doit &tre pow&e jusqu’au stade de la dissolution (Fig. 7, I). CONCLUSION

C’est apr&s une Ctude approfondie des paramittres physiques in~uen~ant la qualit des dosages, que nous avons r4ussi P &carter les difficult& soulevCes par I’analyse du cuivre et du zinc en biologie, en remkdiant surtout aux dkfauts des brGleurs, B l’insuffisance des lampes, au manque de sensibilitk du syst6me de mesure. En ameliorant ainsi Ie rapport Signallbr~Iit, nous avons pu lever l’hypoth&que Clin.

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GIRARD

25s CU

?v=3247n~ T lcm

:,nc

0.4 DP-T

,I=213 8

n

3Pm

3

02 C

:! 01

B

A

LJJ I

:

II

Fig. 7. I. Dosage du cuivre dans des foies de rat (A et B). II. Dosage du zinc dam des extraits de reins de lapin.

de la concentration des elements preddant le dosage et determiner la valeur deux cations sans autre manipulation preliminaire qu’une simple dilution.

des

Aux qualites de sensibilite et de specificite de l’absorption atomique viennent alors s’ajouter des qualites de simplicite et de rapidite non moins precieuses, aussi bien pour le laboratoire d’analyses de routine que le laboratoire de recherches biologiques. La methode met ainsi a la disposition de la clinique des documents aussi frequents et aussi nombreux sion de flamme.

que l’autorisait

seule jusqu’ici

la spectrophotometrie

d’emis-

Les facilites supplementaires recemment apportees par le developpement de l’automatisation, avec Gaumer et al.43 en particulier, comme par l’echantillonnage direct des substances solides selon Venghiattis?” pour Cviter la dissolution elle-meme, laissent entrevoir des possibilites nouvelles non seulement dans le domaine analytique propre, mais encore dans la recherche d’une meilleure connaissance des mecanismes biologiques auxquels participent des oligo-elements dynamiques tels le cuivre45 et le zinc.

La spectrophotometrie par absorption atomique apporte au dosage du cuivre et du zinc dans les milieux biologiques des perspectives nouvelles, dues a la facilite de mise en ceuvre de la methode autorisant des determinations a la fois repetees et precises. Jusqu’alors, seules les techniques colorimetriques permettaient d’apprecier les taux tres faibles de Cu et de Zn generalement rencontres (de l’ordre de 10-6 g/ml). Or la complexite des milieux et la limitation le plus souvent de l’importance des preleveClan. Chim.

Acta,

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CU

ET .&

DANS

MILIEUX

l!%IOLOCIQUES

259

ments necessitaient des manipulations longues et delicates, rendant Ia coforimetrie difficifement applicable aux dosages en Grie. L’absorption atomique, par un contraste frappant, offre une solution elegante au probleme pose, grace toutefois aus perfectionnements de I’appareillage habitue1 sensibilite s’avere insuffisante pour doser avec precision des concentrations de I’ordre de IO-” g/ml. En biologic, c’est le cas pour le serum sanguin dont Ia teneur en Cu et 211 est voisine de cette valeur, mais dont la nitbulisation directe est emp&chPe par la viscosite du milieu et la richesse en proteines. Avec des lampes fabriquees au laboratoire et des brilleurs refroidis, il devient possible d’etabhr des gammes d’etalonnage dont la concentration la pIus &levee correspond a 0.4.x0-~ g/ml et, par suite, de pratiquer un dosage direct, aprb simple dilution du &rum au I /roeme, Cvitant ainsi I’extraction du derive dithio-carbamique en phase organique, generalement pratiquee avant le dosage. Dans ie cas des organes et tissus, ii n’est pas &cessaire de recourir h une mink+ lisation cornpEte: une extraction nitro-c~lIorh~driq~Ie pour Zn et nitro-perchlorique pour Cu, dnergiquement Ii6 aux protkines, suffisent B la prdparation des kchantillons destinCs B l’analyse.

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