- Email: [email protected]
Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów
OTPOL-133; No. of Pages 8 otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Dostępne online www.sciencedirect.com
ScienceDirect journal homepage: www.elsevier.com/locate/otpol
Artykuł oryginalny/Original research article
Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów The healing process of tympanic membrane perforations in rats Hanna Zajączkiewicz 1,*, Elżbieta Hassmann-Poznańska 1, Bożena Skotnicka 1, Lech Chyczewski 2, Joanna Reszeć 2, Maria Małgorzata Winnicka 3 1
Klinika Otolaryngologii Dziecięcej UM w Białymstoku, Kierownik: prof. dr hab. Elżbieta Hassmann-Poznańska, Białystok, Polska 2 Zakład Patomorfologii Lekarskiej UM w Białymstoku, Kierownik: prof. dr hab. Lech Chyczewski, Białystok, Polska 3 Zakład Patologii Ogólnej i Doświadczalnej UM w Białymstoku, Kierownik: prof. dr hab. Maria Małgorzata Winnicka, Białystok, Polska
informacje o artykule
abstract
Historia artykułu:
Introduction: Tympanic membrane (TM) perforations are commonly seen in clinical
Otrzymano: 02.12.2013
practice as a result of trauma or in the course of otitis media. The TM is a unique
Zaakceptowano: 07.01.2014
structure suspended in air which makes its healing processes different than in the skin
Dostępne online: xxx
wounds.
Słowa kluczowe: perforacje błon bębenkowych proces gojenia
healing process. Material and methods: 56 male Wistar rats were used for the study.
myringotomia laserowa ocena histologiczna
of healing was assessed otoscopicaly, subsequently TM were dissected and processed for
The aim of the study was otoscopical and histological evaluation of the rat's TM Fifty of them had TMs perforated bilaterally using CO2 laser, additional 6 served as a controls. The animals were sacrificed on either day 1, 2, 3, 6 and 10 post injury. Process histological evaluation. Results: At day 6 after perforation half and on day 10 all of TM were healed. On the first day, in histological evaluation, focal thickening of the epithelial Keywords: Tympanic membrane perforation Healing process Laser myringotomy Histological evaluation
layer was observed at some distance from the edge of perforation, on the side of annulus. On the following day proliferation of epithelium covering outer surface of TM on the side of the malleus handle and annulus was clearly visible. An eosinophilic mass containing macrophages and granulocytes was seen in front of the migrating epithelium. On day 3–6 migrating epithelium reached the edge of perforation. Proliferation of the connective tissue layer followed the epithelium. Conclusions: The present results indicate that the squamous epithelium covering the outer surface of TM constitutes the first layer which restores continuity of TM. The proliferation of the connective tissue occurs in the direct vicinity of the proliferating and migrating epithelium. © 2014 Polish Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.
* Autor do korespondencji: Klinika Otolaryngologii Dziecięcej UM, ul. Waszyngtona 17, 15-274 Białystok, Polska. Tel./Fax: +48 85 7-450-832. Adres email: [email protected] (H. Zajączkiewicz). 0030-6657/$ – see front matter © 2014 Polish Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001 Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8
2
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Wstęp Do perforacji błony bębenkowej dochodzi często w przebiegu ostrego zapalenia ucha lub w wyniku urazu. Wysiękowe zapalenie ucha jest leczone poprzez jej nacięcie i założenie drenażu. Większość z tych perforacji zamyka się spontanicznie, co dowodzi dużej zdolności błony do regeneracji. Jednakże w części przypadków, z nieznanych przyczyn, proces ten zostaje zatrzymany, co pozostawia trwały ubytek. Ponieważ błona bębenkowa jest strukturą rozciągniętą pomiędzy dwiema przestrzeniami powietrznymi, proces gojenia przebiega inaczej niż w ranach skóry. Przeważa pogląd, że w początkowych fazach gojenia ubytek pokrywany jest przez nasuwającą się w jego kierunku warstwę keratyny, która stanowi rusztowanie dla migrujących komórek nabłonka warstwy zewnętrznej. Natomiast komórki tkanki łącznej migrują później, podążając za nabłonkiem. Zgodnie z tą koncepcją, kluczowa rola w procesie gojenia przypisywana jest zdolnościom do proliferacji i migracji nabłonka wielowarstwowego płaskiego pokrywającego błonę [1–7]. Ze względu na oczywiste trudności w uzyskaniu materiału do badań od ludzi, jak również techniczne problemy w prowadzeniu badań eksperymentalnych na zwierzętach, mechanizmy gojenia się błon bębenkowych nie zostały w pełni wyjaśnione. Dlatego też podjęto badania, których celem była ocena procesu gojenia błon bębenkowych u szczurów poprzez obserwacje w mikroskopie operacyjnym, jak również w ocenie histologicznej.
Materiał i metody Doświadczenia przeprowadzono na 56 samcach szczurów szczepu Wistar, o masie 250–300 g. U pięćdziesięciu szczurów stanowiących grupę doświadczalną wykonano obustronne perforacje błon bębenkowych. Po dootrzewnowym podaniu znieczulenia ogólnego (1 mg xylazyny i 5 mg ketaminy/100 g wagi ciała zwierzęcia) w mikroskopie operacyjnym oceniano błonę bębenkową pod kątem ewentualnych zmian patologicznych. U żadnego ze zwierząt nie stwierdzono objawów wskazujących na toczący się w uchu środkowym proces zapalny. W celu uzyskania perforacji o jednakowej średnicy 1 mm wykonywano je za pomocą lasera CO2 (SurgiTouch Flashscan, ESC/Sharplan, Tel Aviv, Israel). W prawym uchu perforację wykonywano w przednio-górnym, a w uchu lewym w tylno-górnym kwadrancie części napiętej błony bębenkowej (Ryc. 1). Zwierzęta podzielono na 5 grup doświadczalnych po 10 zwierząt w każdej, w zależności od długości prowadzenia obserwacji i czasu uśmiercenia zwierzęcia – 1, 2, 3, 6, 10 dni po wykonaniu perforacji. Sześć szczurów, u których nie wykonano perforacji, stanowiło grupę kontrolną. W dniu zakończenia obserwacji w warunkach pełnej narkozy oceniano przebieg gojenia się błony w mikroskopie operacyjnym. Szczury uśmiercano poprzez skrwawienie aortalne, a następnie dokonywano dekapitacji i wypreparowywano kości skroniowe. Po otwarciu puszki słuchowej sporządzano dokumentację fotograficzną procesu gojenia, rejestrującą obraz mikroskopowy wewnętrznej powierzchni błony.
Ryc. 1 – Obraz wideootoskopowy błony bębenkowej ucha prawego szczura – perforacja w przednio-górnym kwadrancie części napiętej (strzałka) Fig. 1 – Video-otoscopic image of rat's right tympanic membrane – perforation in the anterior–superior quadrant of pars tensa (arrow)
Wypreparowaną kość utrwalano w 10-procentowym roztworze buforowanej formaliny przez 48 godzin. Z utrwalonych kości skroniowych wypreparowywano błony bębenkowe z zachowaniem ich kostnego obramowania i odwapniano w płynie oxfordzkim. Po odwapnieniu i odwodnieniu preparaty zatapiano w bloczkach parafinowych, ustawiając je tak, aby przekroje przebiegały prostopadle do powierzchni błony. Następnie sporządzano skrawki o grubości 5 mm. Preparaty barwiono hematoksyliną i eozyną (H + E) oraz metodą Picrosirius Red (PSR).
Wyniki Bezpośrednio po wykonaniu laserem CO2 perforacje miały okrągły kształt z wyraźnie zaznaczonym białawym brzegiem i obejmowały około 30–50% powierzchni kwadrantu przednio-górnego lub tylno-górnego części napiętej błony (Ryc. 1). W następnej dobie wygląd perforacji nie różnił się znacząco, natomiast w części napiętej błony w okolicy przyczepu rękojeści młoteczka i jej górnych częściach na granicy z częścią wiotką i pierścieniem włóknisto-chrząstkowym widoczne były bardzo delikatne białawe zmiany przypominające myringosklerozę, które utrzymywały się przez cały okres obserwacji. W dwa dni po wykonaniu perforacja była mniejsza o około 1/2–1/3 wyjściowej średnicy. Wokół ubytku obserwowano cienkie, białawe zgrubienie znajdujące się na zewnątrz, w pewnym oddaleniu od jego brzegu. Błona pomiędzy perforacją a linijnym zgrubieniem była cieńsza niż w miejscach nieuszkodzonych. W trzeciej dobie obserwowano dalsze zmniejszanie się średnicy perforacji. Była ona otoczona wyraźnie widocznym, wypukłym zgrubieniem
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8 otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
3
Ryc. 2 – Widok gojących się błon bębenkowych od strony jamy bębenkowej. A. Dzień 1. – okrągła perforacja z nierównymi brzegami bez wyraźnego odczynu zapalnego. Wzdłuż rękojeści młoteczka i wokół pierścienia włóknisto-chrząstkowego poszerzone naczynia krwionośne (strzałki); B. Dzień 2. – wokół ubytku widoczne cienkie, białawe zgrubienie, które w okolicy rękojeści młoteczka dochodzi do brzegu perforacji, w pozostałych miejscach oddzielone jest on niej cienką błoną; C i D. Dzień 3. – perforacja otoczona wałowatym zgrubieniem pokrytym zaschniętą wydzieliną; E. Dzień 6. – widoczna niewielka, resztkowa perforacja, otoczona ze wszystkich stron bliznowatą, pogrubiałą błoną pokrytą od strony przewodu słuchowego zaschniętą wydzieliną; F. Dzień 10. – ubytek błony zamknięty, miejsce perforacji pokryte w całości cienką, żółtawą, półprzeźroczystą blizną i odklejającą się zaschniętą wydzieliną od strony przewodu słuchowego Fig. 2 – Images of healing tympanic membranes viewed from middle ear. A. Day 1st – round perforation with jagged edges without any signs of inflammatory reaction. Along the malleus handle and around the annulus congested blood vessels (arrows); B. Day 2nd – around the perforation faint, whitish rim which at the malleus handle is close to defect, in other places it is separated from it by thin membrane; C and D. Day 3rd – perforation surrounded by thick rough ridge covered with crust; E. Day 6th – small residual perforation with edges surrounded by thickened rim of scary tissue, covered on the side of external acoustic meatus by dried secretions; F. Day 10th – perforation closed, on its place a thin, yellowish, semitranslucent scar covered by crust
znajdującym się w pobliżu jej brzegu. W szóstej dobie w połowie uszu ubytek był zamknięty, pokryty nierównym zgrubieniem żółtawej barwy, a w połowie utrzymywał się nadal śladowy otwór otoczony wałowatym zgrubieniem. W dobie dziesiątej we wszystkich uszach perforacje były zamknięte, a w miejscu perforacji widoczny był oddzielający się żółtawy strup lub biaława, pogrubiała błona (Ryc. 2). W preparatach histologicznych prawidłowych błon bębenkowych szczurów warstwę zewnętrzną części napiętej stanowiła pojedyncza warstwa znacznie spłaszczonych komórek nabłonkowych. W pobliżu rękojeści młoteczka i pierścienia włóknisto-chrząstkowego była ona nieco grubsza, składała się z dwu do trzech warstw, bez widocznych złogów keratynowych na powierzchni. W części wiotkiej zewnętrzna
powierzchnia błony była pokryta nabłonkiem wielowarstwowym płaskim składającym się z kilku warstw komórek, z widoczną cienką warstwą keratynową. Warstwa włóknista w części napiętej stanowiła pojedyncze pasmo tkanki łącznej, prawie zupełnie pozbawione komórek. Fibroblasty były widoczne jedynie w jej grubszych częściach, w pobliżu rękojeści młoteczka i pierścienia włóknisto-chrząstkowego. W części wiotkiej warstwa środkowa zbudowana była z luźnej tkanki łącznej z licznymi fibroblastami i naczyniami włosowatymi. Od strony wewnętrznej pokrycie błony śluzowej stanowiła pojedyncza warstwa komórek nabłonkowych, znacznie spłaszczonych w części napiętej błony (Ryc. 3). W obrazie histologicznym błon pobranych w pierwszej dobie po wykonaniu perforacji nie obserwowano wyraźnych
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8
4
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Ryc. 3 – Prawidłowa błona bębenkowa (grupa kontrolna). Przekrój równoległy do rękojeści młoteczka przez część napiętą (1), przyczep młoteczka (2) oraz część wiotką (3). PSZ – przewód słuchowy zewnętrzny. JB – jama bębenkowa. H + E, powiększenie 200T Fig. 3 – Normal tympanic membrane (control group). Section parallel to handle of the malleus through pars tensa (1), handle of the malleus (2), and pars flaccida (3). PSZ-external auditory meatus, JB-middle ear. H + E, magnification 200T
oznak gojenia na brzegu ubytku ani odczynu zapalnego, zarówno po stronie pierścienia włóknisto-chrząstkowego, jak i rękojeści młoteczka. W bezpośrednim sąsiedztwie perforacji błona pozbawiona była zewnętrznej i wewnętrznej warstwy nabłonkowej, a jej warstwa włóknista była pogrubiała. W pewnym oddaleniu od brzegu perforacji, po stronie pierścienia włóknisto-chrząstkowego obserwowano miejscowe pogrubienie zewnętrznej warstwy nabłonkowej. Pogrubienie to utworzone było przez dwie, trzy warstwy owalnych, luźno ułożonych komórek. Na brzegu tego zgrubienia skierowanym ku perforacji znajdowała się niewielka ilość bezpostaciowej, kwasochłonnej substancji zawierającej granulocyty (Ryc. 4).
W drugiej dobie obserwowano wyraźną proliferację nabłonka zewnętrznej powierzchni błony. Zmiany te były najwyraźniej widoczne w pewnym oddaleniu od ubytku i nie obejmowały jego brzegu. Były one bardziej nasilone od strony rękojeści młoteczka, gdzie komórki nabłonka tworzyły zgrubienie uwypuklające się nad pojedynczą warstwą komórek pokrywających błonę bliżej ubytku. Również od strony pierścienia widoczny był fałd pogrubiałego nabłonka składającego się z kilku warstw luźno ułożonych komórek o kształcie zbliżonym do okrągłego lub owalnego w pobliżu błony podstawnej i nieco spłaszczonych na powierzchni (Ryc. 5). Na powierzchni tego nabłonka nie obserwowano cech rogowacenia. Natomiast na brzegu proliferującego nabłonka, od strony perforacji, występowały skupiska bezpostaciowej substancji zawierającej liczne komórki zapalne, głównie granulocyty. Błona bębenkowa po drugiej stronie młoteczka, w której nie wykonywano perforacji, nie wykazywała zwykle istotnych zmian poza przypadkami, gdy brzeg perforacji przechodził na powierzchnię rękojeści młoteczka. Warstwa włóknista poniżej proliferującego nabłonka była pogrubiała, z cechami zmian obrzękowych. W trzecim dniu obserwacji zmiany proliferacyjne w obrębie nabłonka pokrywającego zewnętrzną powierzchnię błony bębenkowej były bardziej nasilone i zbliżały się do brzegu ubytku. O ile w drugiej dobie nie obserwowano cech rogowacenia, o tyle w dobie trzeciej nabłonek przybierał architekturę nabłonka wielowarstwowego płaskiego z warstwą ziarnistą i cienką warstwą keratyny na powierzchni (Ryc. 6). W dobie szóstej w błonach bębenkowych, w których perforacja nie była zamknięta, pasmo składające się z proliferujących komórek nabłonkowych dochodziło do brzegu ubytku i otaczało go, znacznie zmniejszając wielkość perforacji. Otaczający brzeg perforacji nabłonek tworzył na przekroju poprzecznym obraz porównywany do ,,głowy węża’’. W warstwach położonych głębiej składał się on z licznych warstw komórek o luźnym ułożeniu. Bliżej powierzchni przybierały
Ryc. 4 – A i B. Dzień 1. Przekrój przez część napiętą błony bębenkowej w pobliżu perforacji. Od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego widoczne niewielkie pogrubienie zewnętrznej warstwy nabłonkowej. H + E, powiększenie A 200T, B 600T Fig. 4 – A and B. Day 1. Section through the pars tensa of the tympanic membrane, in the vicinity of perforation, on the side of the annulus, slight thickening of the external epithelial layer. H + E, magnification A 200T, B 600T Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8 otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Ryc. 5 – Dzień 2. A. Przekrój poprzeczny błony bębenkowej po stronie perforacji. Na powierzchni rękojeści młoteczka widoczne skupisko proliferujących komórek nabłonka pokrywającego zewnętrzną powierzchnię błony (strzałka). Od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego podobne zmiany, ale o mniejszym nasileniu (strzałka przerywana); B. Przekrój poprzeczny błony bębenkowej tuż poniżej dolnego brzegu perforacji. Na brzegu perforacji błona bez zmian proliferacyjnych. Skupisko proliferującego nabłonka od strony rękojeści młoteczka, mniejsze pogrubienie nabłonka od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego, skupisko komórek zapalnych otoczonych bezpostaciową substancją kwasochłonną (strzałka). PSZ – przewód słuchowy zewnętrzny, JB – jama bębenkowa. H + E, powiększenie 100T Fig. 5 – Day 2. A. The cross-section through the perforation of the tympanic membrane. On the surface of the malleus handle cluster of proliferating epithelial cells (arrow). Similar, but of a lesser grade, changes on the side of perforation close to annulus (dashed arrow). B. Cross section of the tympanic membrane just beneath the perforation. The edge of perforation without signs of proliferation. Growth of proliferating keratinocytes emerging on the external surface of the tympanic membrane close to the malleus handle, lesser thickening of the epithelium on the side of annulus, an eosinophilic mass containing macrophages and granulocytes in front of the migrating epithelium (arrow). PSZ – external auditory meatus, JB – tympanic cavity. H + E, magnification 100T
Ryc. 6 – A. Dzień 3. Skupisko komórek nabłonkowych migrujących od strony rękojeści młoteczka przybierające wygląd ,,głowy węża’’. Proliferujący nabłonek składa się z kilku warstw komórek typowych dla nabłonka wielowarstwowego płaskiego, z cienką warstwą keratyny na powierzchni. B. Dzień 6. Brzeg perforacji błony od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego. Przerośnięty nabłonek zagina się na brzegu perforacji, na jego powierzchni widoczna warstwa keratynowa i bezpostaciowa substancja kwasochłonna z komórkami zapalnymi. H + E, powiększenie A 400T, B 200T Fig. 6 – A. Day 3. The wave-like cluster of proliferating epithelial cells migrating from the area of malleus handle assuming the ‘‘snake's head’’ appearance. The proliferating epithelium consists of several layers of cells typical for squamous epithelium with delicate keratin layer on its surface. B. Day 6. The edge of perforation on the side of annulus. The keratinocyte wave on the edge of the perforation bending around it, a prominent keratin layer on its surface mixed with eosinophilic mass containing inflammatory cells. H + E, magnification A 400T, B 200T Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
5
OTPOL-133; No. of Pages 8
6
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Ryc. 7 – A i B. Dzień 6. Resztkowy ubytek błony bębenkowej wypełniony bezpostaciową kwasochłonną substancją wymieszaną z warstwą keratyny, zawierającej granulocyty i makrofagi. Proliferacja fibroblastów poniżej proliferującego nabłonka w warstwie właściwej błony. H + E, powiększenie A 100T, B 200T Fig. 7 – A and B. Day 6. The residual perforation closed by provisional cap between the edges of proliferating and migrating epithelium. The cap consists of eosinophilic mass with inflammatory infiltrate, mixed with keratin. Proliferating fibroblasts visible underneath the epithelium. H + E, magnification A 100T, B 200T
one bardziej spłaszczony kształt, a warstwa powierzchowna wykazywała cechy rogowacenia, przez co nabłonek wykazywał cechy proliferującego nabłonka wielowarstwowego płaskiego rogowaciejącego. Obecna na powierzchni nabłonka cienka warstwa keratyny była z nim luźno związana. Nie obserwowano tendencji do tworzenia przez nią pomostu pokrywającego ubytek. Przestrzeń pozostająca pomiędzy zbliżającymi się brzegami perforacji była wypełniona kwasochłonną bezpostaciową masą, w obrębie której znajdowały się liczne komórki zapalne, głównie granulocyty, ale również makrofagi i nieliczne limfocyty. Na brzegach ubytku obserwowano rozplem tkanki łącznej, w której obecne były liczne fibroblasty (Ryc. 7). W szóstej dobie w połowie przypadków ubytek był zamknięty, w części centralnej pokryty prawie wyłącznie warstwami nabłonka wielowarstwowego płaskiego, wykazującego cechy prawidłowego dojrzewania z rogowaceniem na powierzchni. Na obwodzie zamkniętego ubytku warstwa nabłonkowa była cieńsza, a pod nią znajdowała się gruba warstwa luźnej, bogatokomórkowej tkanki łącznej, w której obecne były pojedyncze lub występujące w skupiskach granulocyty. W dobie dziesiątej nabłonek pokrywający miejsce perforacji był cieńszy, ale nadal zbudowany z licznych warstw komórek typowych dla nabłonka wielowarstwowego płaskiego z warstwą keratynową na powierzchni. Warstwa włóknista błony była w tym miejscu znacznie pogrubiała, a liczne fibroblasty miały dość zwarte ułożenie (Ryc. 8). W preparatach barwionych PSR włókna kolagenowe w miejscu zamkniętej perforacji były nieliczne. W częściach obwodowych układały się w wyraźne wiązki, które jednakże nie tworzyły zbitej warstwy występującej w nieuszkodzonej błonie.
Ryc. 8 – Dzień 10. Przekrój poprzeczny przez błonę bębenkową, w części napiętej. Po stronie perforacji gruba warstwa nabłonka zewnętrznego wykazuje typowe cechy nabłonka wielowarstwowego płaskiego rogowaciejącego, widoczna pogrubiała warstwa włóknista z licznymi fibroblastami. Błona bębenkowa po drugiej stronie rękojeści młoteczka niezmieniona. H + E, powiększenie 100T Fig. 8 – Day 10. Transverse section trough the pars tensa of tympanic membrane, on the side of previous perforation a thick layer of epithelium covering external surface of tympanic membrane shows all features typical for squamous keratinizing epithelium, fibrous layer with numerous fibroblasts. The other side of the eardrum across the malleus handle is unchanged. H + E, magnification 100T
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8 otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Na żadnym z etapów gojenia nie zaobserwowano zmian proliferacyjnych w obrębie nabłonka wyścielającego wewnętrzną warstwę błony bębenkowej.
Omówienie W przeprowadzonych badaniach wszystkie perforacje zamknęły się pomiędzy 6. a 10. dniem obserwacji. Podobny czas gojenia się perforacji został opisany również w innych badaniach wykonanych na szczurach, niezależnie od sposobu wykonania perforacji i ich wielkości [7–11]. Wyniki tych badań potwierdzają obserwowaną również u ludzi dużą zdolność błon bębenkowych do szybkiego gojenia się. W wykonanych badaniach histologicznych pierwsze oznaki procesu reparacyjnego obserwowano w obrębie nabłonka pokrywającego zewnętrzną powierzchnię błony bębenkowej, jednakże były one najbardziej nasilone w pewnym oddaleniu od brzegu perforacji. Wałowate zgrubienie złożone z proliferujących komórek nabłonkowych obserwowano w okolicy rękojeści młoteczka, jak również w nieco mniejszym nasileniu od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego. Silniejszą reakcję proliferacyjną po stronie rękojeści młoteczka opisywali również inni autorzy [4, 5], a niektórzy obserwowali ją wyłącznie po tej stronie [11]. Miejsce, w którym rozpoczynają się zmiany proliferacyjne, może wskazywać na istnienie w tej okolicy ośrodków rozrodczych nabłonka pokrywającego błonę bębenkową. Regeneracja nabłonka wielowarstwowego płaskiego skóry następuje poprzez podziały komórek macierzystych znajdujących się w mieszkach włosowych i gruczołach łojowych oraz rozproszonych w warstwie podstawnej nabłonka [12–14]. Ponieważ skóra części kostnej przewodu słuchowego zewnętrznego i błony bębenkowej jest pozbawiona mieszków włosowych i gruczołów, nie mogą być one źródłem komórek progenitorowych. Wiele pośrednich dowodów wskazuje na to, że ośrodki rozrodcze nabłonka są zlokalizowane w okolicy pierścienia włóknistego i rękojeści młoteczka oraz są rozproszone w części wiotkiej błony bębenkowej [8, 15–17]. Badania immunohistochemiczne wykonane na ludzkich i szczurzych błonach bębenkowych wykazały obecność w okolicy pierścienia i wzdłuż rękojeści młoteczka komórek nabłonkowych o cechach komórek macierzystych wykazujących ekspresję a6-integryny, b1-integryny i cytokeratyny 19 [9, 18]. Obserwowana w naszych badaniach proliferacja nabłonka postępująca zarówno od strony rękojeści młoteczka, jak i pierścienia, wydaje się potwierdzać te obserwacje. Pierwsze publikacje McMinna [19] opisywały proces gojenia błon bębenkowych jako podobny do gojenia ran skóry, przebiegający poprzez zamknięcie ubytku tkanką ziarninową pokrywaną następnie przez migrujący nabłonek. W kolejnych badaniach wykazano jednak, że proces gojenia przebiega poprzez pierwotne zamknięcie ubytku przez tkankę nabłonkową, za którą podążają komórki tkanki łącznej [1, 3, 4, 7]. Stenfors i wsp. [7] wysunęli hipotezę, że warstwa keratynowa tworząca się na powierzchni nabłonka i przesuwająca się po powierzchni błony bębenkowej pokrywa wstępnie perforację i stanowi rusztowanie dla podążających za nią komórek nabłonkowych. Hipoteza ta początkowo została zaakceptowana przez innych badaczy, bardziej na podstawie obserwacji
7
otoskopowych niż badań histologicznych [2, 3, 16]. W naszych badaniach na czole pogrubiałego nabłonka od strony perforacji obserwowano skupisko bezpostaciowej substancji zwierającej liczne komórki zapalne, głównie granulocyty i makrofagi. Warstwa keratynowa, jeżeli występowała, była cienka, rozwarstwiona, luźno związana z leżącym pod nią nabłonkiem. Podobne obserwacje przedstawili Santa Maria i wsp. [11]. Wydaje się mało prawdopodobne, aby tak cienka i rozfragmentowana warstwa keratynowa miała istotne znaczenie jako szkielet dla rekonstrukcji błony bębenkowej. Pozostaje do wyjaśnienia rola stale obecnej na czole migrującego nabłonka zasychającej warstwy wydzieliny z komórkami zapalnymi, która w obrazie wziernikowym jest widoczna jako rodzaj strupa otaczającego i zmniejszającego perforację, aż do całkowitego jej zamknięcia. Tahar Aissa i Hultcrantz [20] w badaniach immunohistochemicznych stwierdzili na powierzchni proliferującego nabłonka perforowanej błony bębenkowej obecność licznych makrofagów i limfocytów. Badania przeprowadzone przez Li i wsp. [21] oraz Prestwich i wsp. [22] wykazały, że gojenie błon bębenkowych jest całkowicie zahamowane u myszy pozbawionych możliwości wytwarzania plazminogenu, prekursora plazminy – enzymu, którego działanie polega na rozkładaniu włóknika będącego głównym składnikiem skrzepu. Wykazano również wzrost aktywności genów kodujących aktywatory plazminogenu w przebiegu gojenia się błon bębenkowych [23]. Wydaje się zatem, że obserwowany na czole rozrastającego się nabłonka strup oraz możliwość jego rozkładania stanowią bardziej istotne elementy w gojeniu perforacji błon bębenkowych niż warstwa keratyny. Przeprowadzone badania wskazują, że procesy odtwórcze w obrębie warstwy włóknistej błony bębenkowej następują nieco później niż zmiany proliferacyjne i migracja nabłonka zewnętrznego. W okresie 3.–6. doby gojenia warstwa ta była pogrubiała, z luźnym ułożeniem włókien i licznymi fibroblastami. Dotychczasowe obserwacje dotyczące zmian w obrębie warstwy włóknistej błony w przebiegu jej gojenia są bardzo nieliczne [6, 24]. Uzyskane obserwacje wskazują, że: Nabłonek wielowarstwowy płaski pokrywający zewnętrzną powierzchnię błony bębenkowej jest pierwszą warstwą, która odtwarza jej ciągłość w procesie gojenia ubytku. W procesie zamykania perforacji przez migrujący nabłonek większą rolę niż warstwa keratynowa wydaje się odgrywać obserwowany na brzegu ubytku zasychający wysięk tworzący strup. Rozplem tkanki łącznej w przebiegu gojenia ubytku błony bębenkowej następuje w późniejszych etapach gojenia, w bezpośrednim sąsiedztwie proliferującego i migrującego nabłonka.
Wkład autorów/Authors' contributions EH-P – koncepcja pracy, interpretacja danych, przygotowanie literatury, pozyskanie środków (finansowania). HZ – zebranie i interpretacja danych, analiza statystyczna, przygotowanie literatury, pozyskanie środków (finansowania). MMW, JR – interpretacja danych, akceptacja ostatecznej wersji. BS – zebranie danych, akceptacja ostatecznej wersji. LC – akceptacja ostatecznej wersji.
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8
8
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Konflikt interesu/Conflict of interest Nie występuje.
Finansowanie/Financial support Praca była finansowana ze środków statutowych Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.
Etyka/Ethics Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymi wymaganiami dla czasopism biomedycznych.
pi smiennictwo/references
[1] Reijnen CJ, Kuijpers W. The healing pattern of the drum membrane. Acta Otolaryngol Suppl 1971;287:1–74. [2] Johnson A, Hanke M. The function of migratory epidermis in the healing of tympanic membrane perforations in guinea-pig. A photographic study. Acta Otolaryngol (Stockh) 1987;103:81–86. [3] Johnson AP, Lesley A, Smallman A, Kent SE. The mechanism of healing of tympanic membrane perforations. A two-dimensional histological study in guinea pigs. Acta Otolaryngol 1990;109:406–415. [4] Boedts D, Ars B. Histopathological research on eardrum perforations. Arch Otorhinolaryngol 1977;215:55–59. [5] Boedts D. Tympanie membrane perforations. Acta otorhinolaryngol belg 1995;49:149–158. [6] Govaerts PJ, Jacob WA, Marquet J. Histological study of the thin replacement membrane of human tympanic membrane perforations. Acta Otolaryngol 1988;105:297–302. [7] Stenfors L-E, Carlosöö B, Salén B, Winbland B. Repair of experimental tympanic membrane perforations. Acta Otolaryngol 1980;90:332–341. [8] Koba R. Epidermal cell migration and healing of the tympanic membrane: an immunohistochemical study of cell proliferation using bromodeoxyuridine labelling. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995;104:218–225. [9] Wang W-Q, Wang Z-M, Chi F-L. Spontaneous healing of various tympanic membrane perforations in the rat. Acta Otolaryngol 2004;124:1141–1144.
[10] Castagno LA, Lavinksy L. Tympanic membrane healing in myringotomies performed with argon laser or microknife: an experimental study in rats. Braz J Otorhinolaryngol 2006;72:794–799. [11] Santa Maria PL, Redmond SL, Atlas MD, Ghassemifar R. Histology of the healing tympanic membrane following perforation in rats. Laryngoscope 2010;120:2061–2070. [12] Kaur P. Interfollicular epidermal stem cells: identification, challenges, potential. J Invest Dermatol 2006;126:1450–1458. [13] Watt FM, Lo Celso C, Silva-Vargas V. Epidermal stem cells: an update. Curr Op Genet Dev 2006;16:518–524. [14] Braun KM, Prowse DM. Distinct epidermal stem cell compartments are maintained by independent niche microenvironments. Stemp Cell Rev 2006;2:221–232. [15] Reeve DRE. The mitotic response of the stratified squamous epithelium at the edge of large perforations of the tympanic membrane in guinea-pigs. J Anat 1977;124:731–740. [16] Makino K, Amastu M, Kinishi M, Mohri M. Epithelial migration in the haling process of tympanic membrane perforations. Eur Arch Otorhinolaryngol 1990;247: 352–355. [17] Kakoi H, Anniko M, Kinnefors A, Rask-Andersen H. Auditory epidermal cell migration. VII. Antigen expression of proliferating cell nuclear antigens, PCNA and Ki-67 in human tympanic membrane and external auditory canal. Acta Otolaryngol (Stockh) 1997;117:100–108. [18] Knutsson J, von Unge M, Rask-Andersen H. Localization of progenitor/stem cells in the human tympanic membrane. Audiol Neurotol 2011;16:263–269. [19] McMinn RMH. Cellular aspects of tissue repair. Ann R Coll Surg Engl 1978;60:215–218. [20] Tahar Aissa J, Hultcrantz M. Acute tympanic membrane perforations and the early immunological response in rats. Acta Otolaryngol 2009;129:1192–1197. [21] Li J, Eriksson P-O, Hansson A, Hellström S, Ny T. Plasmin/ plasminogen is essential for the healing of tympanic membrane perforations. Tromb Haemost 2006;96:512–519. [22] Prestwich A, Li J, Eriksson P-O, Ny T, Berggren D, Hellström S. Lack of plasminogen does not alter the early inflammatory response following a tympanic membrane perforation; a study in plasminogen-deficient mice. Acta Otolaryngol 2008;128:1294–1302. [23] Hassmann-Poznańska E, Taranta A, Bialuk I, Poznańska M, Zajączkiewicz H, Winnicka MM. Analysis of gene expression profiles in tympanic membrane following perforation using PCR Array in rats – preliminary investigation. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2013;77: 1753–1759. [24] Laurent C, Hellström S. Extracellular matrix components reflect the dynamics of a healing tympanic membrane perforation – a histochemical study. Int J Biochem Cell Biol 1997;29:221–229.
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
Dostępne online www.sciencedirect.com
ScienceDirect journal homepage: www.elsevier.com/locate/otpol
Artykuł oryginalny/Original research article
Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów The healing process of tympanic membrane perforations in rats Hanna Zajączkiewicz 1,*, Elżbieta Hassmann-Poznańska 1, Bożena Skotnicka 1, Lech Chyczewski 2, Joanna Reszeć 2, Maria Małgorzata Winnicka 3 1
Klinika Otolaryngologii Dziecięcej UM w Białymstoku, Kierownik: prof. dr hab. Elżbieta Hassmann-Poznańska, Białystok, Polska 2 Zakład Patomorfologii Lekarskiej UM w Białymstoku, Kierownik: prof. dr hab. Lech Chyczewski, Białystok, Polska 3 Zakład Patologii Ogólnej i Doświadczalnej UM w Białymstoku, Kierownik: prof. dr hab. Maria Małgorzata Winnicka, Białystok, Polska
informacje o artykule
abstract
Historia artykułu:
Introduction: Tympanic membrane (TM) perforations are commonly seen in clinical
Otrzymano: 02.12.2013
practice as a result of trauma or in the course of otitis media. The TM is a unique
Zaakceptowano: 07.01.2014
structure suspended in air which makes its healing processes different than in the skin
Dostępne online: xxx
wounds.
Słowa kluczowe: perforacje błon bębenkowych proces gojenia
healing process. Material and methods: 56 male Wistar rats were used for the study.
myringotomia laserowa ocena histologiczna
of healing was assessed otoscopicaly, subsequently TM were dissected and processed for
The aim of the study was otoscopical and histological evaluation of the rat's TM Fifty of them had TMs perforated bilaterally using CO2 laser, additional 6 served as a controls. The animals were sacrificed on either day 1, 2, 3, 6 and 10 post injury. Process histological evaluation. Results: At day 6 after perforation half and on day 10 all of TM were healed. On the first day, in histological evaluation, focal thickening of the epithelial Keywords: Tympanic membrane perforation Healing process Laser myringotomy Histological evaluation
layer was observed at some distance from the edge of perforation, on the side of annulus. On the following day proliferation of epithelium covering outer surface of TM on the side of the malleus handle and annulus was clearly visible. An eosinophilic mass containing macrophages and granulocytes was seen in front of the migrating epithelium. On day 3–6 migrating epithelium reached the edge of perforation. Proliferation of the connective tissue layer followed the epithelium. Conclusions: The present results indicate that the squamous epithelium covering the outer surface of TM constitutes the first layer which restores continuity of TM. The proliferation of the connective tissue occurs in the direct vicinity of the proliferating and migrating epithelium. © 2014 Polish Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.
* Autor do korespondencji: Klinika Otolaryngologii Dziecięcej UM, ul. Waszyngtona 17, 15-274 Białystok, Polska. Tel./Fax: +48 85 7-450-832. Adres email: [email protected] (H. Zajączkiewicz). 0030-6657/$ – see front matter © 2014 Polish Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001 Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8
2
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Wstęp Do perforacji błony bębenkowej dochodzi często w przebiegu ostrego zapalenia ucha lub w wyniku urazu. Wysiękowe zapalenie ucha jest leczone poprzez jej nacięcie i założenie drenażu. Większość z tych perforacji zamyka się spontanicznie, co dowodzi dużej zdolności błony do regeneracji. Jednakże w części przypadków, z nieznanych przyczyn, proces ten zostaje zatrzymany, co pozostawia trwały ubytek. Ponieważ błona bębenkowa jest strukturą rozciągniętą pomiędzy dwiema przestrzeniami powietrznymi, proces gojenia przebiega inaczej niż w ranach skóry. Przeważa pogląd, że w początkowych fazach gojenia ubytek pokrywany jest przez nasuwającą się w jego kierunku warstwę keratyny, która stanowi rusztowanie dla migrujących komórek nabłonka warstwy zewnętrznej. Natomiast komórki tkanki łącznej migrują później, podążając za nabłonkiem. Zgodnie z tą koncepcją, kluczowa rola w procesie gojenia przypisywana jest zdolnościom do proliferacji i migracji nabłonka wielowarstwowego płaskiego pokrywającego błonę [1–7]. Ze względu na oczywiste trudności w uzyskaniu materiału do badań od ludzi, jak również techniczne problemy w prowadzeniu badań eksperymentalnych na zwierzętach, mechanizmy gojenia się błon bębenkowych nie zostały w pełni wyjaśnione. Dlatego też podjęto badania, których celem była ocena procesu gojenia błon bębenkowych u szczurów poprzez obserwacje w mikroskopie operacyjnym, jak również w ocenie histologicznej.
Materiał i metody Doświadczenia przeprowadzono na 56 samcach szczurów szczepu Wistar, o masie 250–300 g. U pięćdziesięciu szczurów stanowiących grupę doświadczalną wykonano obustronne perforacje błon bębenkowych. Po dootrzewnowym podaniu znieczulenia ogólnego (1 mg xylazyny i 5 mg ketaminy/100 g wagi ciała zwierzęcia) w mikroskopie operacyjnym oceniano błonę bębenkową pod kątem ewentualnych zmian patologicznych. U żadnego ze zwierząt nie stwierdzono objawów wskazujących na toczący się w uchu środkowym proces zapalny. W celu uzyskania perforacji o jednakowej średnicy 1 mm wykonywano je za pomocą lasera CO2 (SurgiTouch Flashscan, ESC/Sharplan, Tel Aviv, Israel). W prawym uchu perforację wykonywano w przednio-górnym, a w uchu lewym w tylno-górnym kwadrancie części napiętej błony bębenkowej (Ryc. 1). Zwierzęta podzielono na 5 grup doświadczalnych po 10 zwierząt w każdej, w zależności od długości prowadzenia obserwacji i czasu uśmiercenia zwierzęcia – 1, 2, 3, 6, 10 dni po wykonaniu perforacji. Sześć szczurów, u których nie wykonano perforacji, stanowiło grupę kontrolną. W dniu zakończenia obserwacji w warunkach pełnej narkozy oceniano przebieg gojenia się błony w mikroskopie operacyjnym. Szczury uśmiercano poprzez skrwawienie aortalne, a następnie dokonywano dekapitacji i wypreparowywano kości skroniowe. Po otwarciu puszki słuchowej sporządzano dokumentację fotograficzną procesu gojenia, rejestrującą obraz mikroskopowy wewnętrznej powierzchni błony.
Ryc. 1 – Obraz wideootoskopowy błony bębenkowej ucha prawego szczura – perforacja w przednio-górnym kwadrancie części napiętej (strzałka) Fig. 1 – Video-otoscopic image of rat's right tympanic membrane – perforation in the anterior–superior quadrant of pars tensa (arrow)
Wypreparowaną kość utrwalano w 10-procentowym roztworze buforowanej formaliny przez 48 godzin. Z utrwalonych kości skroniowych wypreparowywano błony bębenkowe z zachowaniem ich kostnego obramowania i odwapniano w płynie oxfordzkim. Po odwapnieniu i odwodnieniu preparaty zatapiano w bloczkach parafinowych, ustawiając je tak, aby przekroje przebiegały prostopadle do powierzchni błony. Następnie sporządzano skrawki o grubości 5 mm. Preparaty barwiono hematoksyliną i eozyną (H + E) oraz metodą Picrosirius Red (PSR).
Wyniki Bezpośrednio po wykonaniu laserem CO2 perforacje miały okrągły kształt z wyraźnie zaznaczonym białawym brzegiem i obejmowały około 30–50% powierzchni kwadrantu przednio-górnego lub tylno-górnego części napiętej błony (Ryc. 1). W następnej dobie wygląd perforacji nie różnił się znacząco, natomiast w części napiętej błony w okolicy przyczepu rękojeści młoteczka i jej górnych częściach na granicy z częścią wiotką i pierścieniem włóknisto-chrząstkowym widoczne były bardzo delikatne białawe zmiany przypominające myringosklerozę, które utrzymywały się przez cały okres obserwacji. W dwa dni po wykonaniu perforacja była mniejsza o około 1/2–1/3 wyjściowej średnicy. Wokół ubytku obserwowano cienkie, białawe zgrubienie znajdujące się na zewnątrz, w pewnym oddaleniu od jego brzegu. Błona pomiędzy perforacją a linijnym zgrubieniem była cieńsza niż w miejscach nieuszkodzonych. W trzeciej dobie obserwowano dalsze zmniejszanie się średnicy perforacji. Była ona otoczona wyraźnie widocznym, wypukłym zgrubieniem
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8 otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
3
Ryc. 2 – Widok gojących się błon bębenkowych od strony jamy bębenkowej. A. Dzień 1. – okrągła perforacja z nierównymi brzegami bez wyraźnego odczynu zapalnego. Wzdłuż rękojeści młoteczka i wokół pierścienia włóknisto-chrząstkowego poszerzone naczynia krwionośne (strzałki); B. Dzień 2. – wokół ubytku widoczne cienkie, białawe zgrubienie, które w okolicy rękojeści młoteczka dochodzi do brzegu perforacji, w pozostałych miejscach oddzielone jest on niej cienką błoną; C i D. Dzień 3. – perforacja otoczona wałowatym zgrubieniem pokrytym zaschniętą wydzieliną; E. Dzień 6. – widoczna niewielka, resztkowa perforacja, otoczona ze wszystkich stron bliznowatą, pogrubiałą błoną pokrytą od strony przewodu słuchowego zaschniętą wydzieliną; F. Dzień 10. – ubytek błony zamknięty, miejsce perforacji pokryte w całości cienką, żółtawą, półprzeźroczystą blizną i odklejającą się zaschniętą wydzieliną od strony przewodu słuchowego Fig. 2 – Images of healing tympanic membranes viewed from middle ear. A. Day 1st – round perforation with jagged edges without any signs of inflammatory reaction. Along the malleus handle and around the annulus congested blood vessels (arrows); B. Day 2nd – around the perforation faint, whitish rim which at the malleus handle is close to defect, in other places it is separated from it by thin membrane; C and D. Day 3rd – perforation surrounded by thick rough ridge covered with crust; E. Day 6th – small residual perforation with edges surrounded by thickened rim of scary tissue, covered on the side of external acoustic meatus by dried secretions; F. Day 10th – perforation closed, on its place a thin, yellowish, semitranslucent scar covered by crust
znajdującym się w pobliżu jej brzegu. W szóstej dobie w połowie uszu ubytek był zamknięty, pokryty nierównym zgrubieniem żółtawej barwy, a w połowie utrzymywał się nadal śladowy otwór otoczony wałowatym zgrubieniem. W dobie dziesiątej we wszystkich uszach perforacje były zamknięte, a w miejscu perforacji widoczny był oddzielający się żółtawy strup lub biaława, pogrubiała błona (Ryc. 2). W preparatach histologicznych prawidłowych błon bębenkowych szczurów warstwę zewnętrzną części napiętej stanowiła pojedyncza warstwa znacznie spłaszczonych komórek nabłonkowych. W pobliżu rękojeści młoteczka i pierścienia włóknisto-chrząstkowego była ona nieco grubsza, składała się z dwu do trzech warstw, bez widocznych złogów keratynowych na powierzchni. W części wiotkiej zewnętrzna
powierzchnia błony była pokryta nabłonkiem wielowarstwowym płaskim składającym się z kilku warstw komórek, z widoczną cienką warstwą keratynową. Warstwa włóknista w części napiętej stanowiła pojedyncze pasmo tkanki łącznej, prawie zupełnie pozbawione komórek. Fibroblasty były widoczne jedynie w jej grubszych częściach, w pobliżu rękojeści młoteczka i pierścienia włóknisto-chrząstkowego. W części wiotkiej warstwa środkowa zbudowana była z luźnej tkanki łącznej z licznymi fibroblastami i naczyniami włosowatymi. Od strony wewnętrznej pokrycie błony śluzowej stanowiła pojedyncza warstwa komórek nabłonkowych, znacznie spłaszczonych w części napiętej błony (Ryc. 3). W obrazie histologicznym błon pobranych w pierwszej dobie po wykonaniu perforacji nie obserwowano wyraźnych
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8
4
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Ryc. 3 – Prawidłowa błona bębenkowa (grupa kontrolna). Przekrój równoległy do rękojeści młoteczka przez część napiętą (1), przyczep młoteczka (2) oraz część wiotką (3). PSZ – przewód słuchowy zewnętrzny. JB – jama bębenkowa. H + E, powiększenie 200T Fig. 3 – Normal tympanic membrane (control group). Section parallel to handle of the malleus through pars tensa (1), handle of the malleus (2), and pars flaccida (3). PSZ-external auditory meatus, JB-middle ear. H + E, magnification 200T
oznak gojenia na brzegu ubytku ani odczynu zapalnego, zarówno po stronie pierścienia włóknisto-chrząstkowego, jak i rękojeści młoteczka. W bezpośrednim sąsiedztwie perforacji błona pozbawiona była zewnętrznej i wewnętrznej warstwy nabłonkowej, a jej warstwa włóknista była pogrubiała. W pewnym oddaleniu od brzegu perforacji, po stronie pierścienia włóknisto-chrząstkowego obserwowano miejscowe pogrubienie zewnętrznej warstwy nabłonkowej. Pogrubienie to utworzone było przez dwie, trzy warstwy owalnych, luźno ułożonych komórek. Na brzegu tego zgrubienia skierowanym ku perforacji znajdowała się niewielka ilość bezpostaciowej, kwasochłonnej substancji zawierającej granulocyty (Ryc. 4).
W drugiej dobie obserwowano wyraźną proliferację nabłonka zewnętrznej powierzchni błony. Zmiany te były najwyraźniej widoczne w pewnym oddaleniu od ubytku i nie obejmowały jego brzegu. Były one bardziej nasilone od strony rękojeści młoteczka, gdzie komórki nabłonka tworzyły zgrubienie uwypuklające się nad pojedynczą warstwą komórek pokrywających błonę bliżej ubytku. Również od strony pierścienia widoczny był fałd pogrubiałego nabłonka składającego się z kilku warstw luźno ułożonych komórek o kształcie zbliżonym do okrągłego lub owalnego w pobliżu błony podstawnej i nieco spłaszczonych na powierzchni (Ryc. 5). Na powierzchni tego nabłonka nie obserwowano cech rogowacenia. Natomiast na brzegu proliferującego nabłonka, od strony perforacji, występowały skupiska bezpostaciowej substancji zawierającej liczne komórki zapalne, głównie granulocyty. Błona bębenkowa po drugiej stronie młoteczka, w której nie wykonywano perforacji, nie wykazywała zwykle istotnych zmian poza przypadkami, gdy brzeg perforacji przechodził na powierzchnię rękojeści młoteczka. Warstwa włóknista poniżej proliferującego nabłonka była pogrubiała, z cechami zmian obrzękowych. W trzecim dniu obserwacji zmiany proliferacyjne w obrębie nabłonka pokrywającego zewnętrzną powierzchnię błony bębenkowej były bardziej nasilone i zbliżały się do brzegu ubytku. O ile w drugiej dobie nie obserwowano cech rogowacenia, o tyle w dobie trzeciej nabłonek przybierał architekturę nabłonka wielowarstwowego płaskiego z warstwą ziarnistą i cienką warstwą keratyny na powierzchni (Ryc. 6). W dobie szóstej w błonach bębenkowych, w których perforacja nie była zamknięta, pasmo składające się z proliferujących komórek nabłonkowych dochodziło do brzegu ubytku i otaczało go, znacznie zmniejszając wielkość perforacji. Otaczający brzeg perforacji nabłonek tworzył na przekroju poprzecznym obraz porównywany do ,,głowy węża’’. W warstwach położonych głębiej składał się on z licznych warstw komórek o luźnym ułożeniu. Bliżej powierzchni przybierały
Ryc. 4 – A i B. Dzień 1. Przekrój przez część napiętą błony bębenkowej w pobliżu perforacji. Od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego widoczne niewielkie pogrubienie zewnętrznej warstwy nabłonkowej. H + E, powiększenie A 200T, B 600T Fig. 4 – A and B. Day 1. Section through the pars tensa of the tympanic membrane, in the vicinity of perforation, on the side of the annulus, slight thickening of the external epithelial layer. H + E, magnification A 200T, B 600T Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8 otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Ryc. 5 – Dzień 2. A. Przekrój poprzeczny błony bębenkowej po stronie perforacji. Na powierzchni rękojeści młoteczka widoczne skupisko proliferujących komórek nabłonka pokrywającego zewnętrzną powierzchnię błony (strzałka). Od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego podobne zmiany, ale o mniejszym nasileniu (strzałka przerywana); B. Przekrój poprzeczny błony bębenkowej tuż poniżej dolnego brzegu perforacji. Na brzegu perforacji błona bez zmian proliferacyjnych. Skupisko proliferującego nabłonka od strony rękojeści młoteczka, mniejsze pogrubienie nabłonka od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego, skupisko komórek zapalnych otoczonych bezpostaciową substancją kwasochłonną (strzałka). PSZ – przewód słuchowy zewnętrzny, JB – jama bębenkowa. H + E, powiększenie 100T Fig. 5 – Day 2. A. The cross-section through the perforation of the tympanic membrane. On the surface of the malleus handle cluster of proliferating epithelial cells (arrow). Similar, but of a lesser grade, changes on the side of perforation close to annulus (dashed arrow). B. Cross section of the tympanic membrane just beneath the perforation. The edge of perforation without signs of proliferation. Growth of proliferating keratinocytes emerging on the external surface of the tympanic membrane close to the malleus handle, lesser thickening of the epithelium on the side of annulus, an eosinophilic mass containing macrophages and granulocytes in front of the migrating epithelium (arrow). PSZ – external auditory meatus, JB – tympanic cavity. H + E, magnification 100T
Ryc. 6 – A. Dzień 3. Skupisko komórek nabłonkowych migrujących od strony rękojeści młoteczka przybierające wygląd ,,głowy węża’’. Proliferujący nabłonek składa się z kilku warstw komórek typowych dla nabłonka wielowarstwowego płaskiego, z cienką warstwą keratyny na powierzchni. B. Dzień 6. Brzeg perforacji błony od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego. Przerośnięty nabłonek zagina się na brzegu perforacji, na jego powierzchni widoczna warstwa keratynowa i bezpostaciowa substancja kwasochłonna z komórkami zapalnymi. H + E, powiększenie A 400T, B 200T Fig. 6 – A. Day 3. The wave-like cluster of proliferating epithelial cells migrating from the area of malleus handle assuming the ‘‘snake's head’’ appearance. The proliferating epithelium consists of several layers of cells typical for squamous epithelium with delicate keratin layer on its surface. B. Day 6. The edge of perforation on the side of annulus. The keratinocyte wave on the edge of the perforation bending around it, a prominent keratin layer on its surface mixed with eosinophilic mass containing inflammatory cells. H + E, magnification A 400T, B 200T Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
5
OTPOL-133; No. of Pages 8
6
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Ryc. 7 – A i B. Dzień 6. Resztkowy ubytek błony bębenkowej wypełniony bezpostaciową kwasochłonną substancją wymieszaną z warstwą keratyny, zawierającej granulocyty i makrofagi. Proliferacja fibroblastów poniżej proliferującego nabłonka w warstwie właściwej błony. H + E, powiększenie A 100T, B 200T Fig. 7 – A and B. Day 6. The residual perforation closed by provisional cap between the edges of proliferating and migrating epithelium. The cap consists of eosinophilic mass with inflammatory infiltrate, mixed with keratin. Proliferating fibroblasts visible underneath the epithelium. H + E, magnification A 100T, B 200T
one bardziej spłaszczony kształt, a warstwa powierzchowna wykazywała cechy rogowacenia, przez co nabłonek wykazywał cechy proliferującego nabłonka wielowarstwowego płaskiego rogowaciejącego. Obecna na powierzchni nabłonka cienka warstwa keratyny była z nim luźno związana. Nie obserwowano tendencji do tworzenia przez nią pomostu pokrywającego ubytek. Przestrzeń pozostająca pomiędzy zbliżającymi się brzegami perforacji była wypełniona kwasochłonną bezpostaciową masą, w obrębie której znajdowały się liczne komórki zapalne, głównie granulocyty, ale również makrofagi i nieliczne limfocyty. Na brzegach ubytku obserwowano rozplem tkanki łącznej, w której obecne były liczne fibroblasty (Ryc. 7). W szóstej dobie w połowie przypadków ubytek był zamknięty, w części centralnej pokryty prawie wyłącznie warstwami nabłonka wielowarstwowego płaskiego, wykazującego cechy prawidłowego dojrzewania z rogowaceniem na powierzchni. Na obwodzie zamkniętego ubytku warstwa nabłonkowa była cieńsza, a pod nią znajdowała się gruba warstwa luźnej, bogatokomórkowej tkanki łącznej, w której obecne były pojedyncze lub występujące w skupiskach granulocyty. W dobie dziesiątej nabłonek pokrywający miejsce perforacji był cieńszy, ale nadal zbudowany z licznych warstw komórek typowych dla nabłonka wielowarstwowego płaskiego z warstwą keratynową na powierzchni. Warstwa włóknista błony była w tym miejscu znacznie pogrubiała, a liczne fibroblasty miały dość zwarte ułożenie (Ryc. 8). W preparatach barwionych PSR włókna kolagenowe w miejscu zamkniętej perforacji były nieliczne. W częściach obwodowych układały się w wyraźne wiązki, które jednakże nie tworzyły zbitej warstwy występującej w nieuszkodzonej błonie.
Ryc. 8 – Dzień 10. Przekrój poprzeczny przez błonę bębenkową, w części napiętej. Po stronie perforacji gruba warstwa nabłonka zewnętrznego wykazuje typowe cechy nabłonka wielowarstwowego płaskiego rogowaciejącego, widoczna pogrubiała warstwa włóknista z licznymi fibroblastami. Błona bębenkowa po drugiej stronie rękojeści młoteczka niezmieniona. H + E, powiększenie 100T Fig. 8 – Day 10. Transverse section trough the pars tensa of tympanic membrane, on the side of previous perforation a thick layer of epithelium covering external surface of tympanic membrane shows all features typical for squamous keratinizing epithelium, fibrous layer with numerous fibroblasts. The other side of the eardrum across the malleus handle is unchanged. H + E, magnification 100T
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8 otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Na żadnym z etapów gojenia nie zaobserwowano zmian proliferacyjnych w obrębie nabłonka wyścielającego wewnętrzną warstwę błony bębenkowej.
Omówienie W przeprowadzonych badaniach wszystkie perforacje zamknęły się pomiędzy 6. a 10. dniem obserwacji. Podobny czas gojenia się perforacji został opisany również w innych badaniach wykonanych na szczurach, niezależnie od sposobu wykonania perforacji i ich wielkości [7–11]. Wyniki tych badań potwierdzają obserwowaną również u ludzi dużą zdolność błon bębenkowych do szybkiego gojenia się. W wykonanych badaniach histologicznych pierwsze oznaki procesu reparacyjnego obserwowano w obrębie nabłonka pokrywającego zewnętrzną powierzchnię błony bębenkowej, jednakże były one najbardziej nasilone w pewnym oddaleniu od brzegu perforacji. Wałowate zgrubienie złożone z proliferujących komórek nabłonkowych obserwowano w okolicy rękojeści młoteczka, jak również w nieco mniejszym nasileniu od strony pierścienia włóknisto-chrząstkowego. Silniejszą reakcję proliferacyjną po stronie rękojeści młoteczka opisywali również inni autorzy [4, 5], a niektórzy obserwowali ją wyłącznie po tej stronie [11]. Miejsce, w którym rozpoczynają się zmiany proliferacyjne, może wskazywać na istnienie w tej okolicy ośrodków rozrodczych nabłonka pokrywającego błonę bębenkową. Regeneracja nabłonka wielowarstwowego płaskiego skóry następuje poprzez podziały komórek macierzystych znajdujących się w mieszkach włosowych i gruczołach łojowych oraz rozproszonych w warstwie podstawnej nabłonka [12–14]. Ponieważ skóra części kostnej przewodu słuchowego zewnętrznego i błony bębenkowej jest pozbawiona mieszków włosowych i gruczołów, nie mogą być one źródłem komórek progenitorowych. Wiele pośrednich dowodów wskazuje na to, że ośrodki rozrodcze nabłonka są zlokalizowane w okolicy pierścienia włóknistego i rękojeści młoteczka oraz są rozproszone w części wiotkiej błony bębenkowej [8, 15–17]. Badania immunohistochemiczne wykonane na ludzkich i szczurzych błonach bębenkowych wykazały obecność w okolicy pierścienia i wzdłuż rękojeści młoteczka komórek nabłonkowych o cechach komórek macierzystych wykazujących ekspresję a6-integryny, b1-integryny i cytokeratyny 19 [9, 18]. Obserwowana w naszych badaniach proliferacja nabłonka postępująca zarówno od strony rękojeści młoteczka, jak i pierścienia, wydaje się potwierdzać te obserwacje. Pierwsze publikacje McMinna [19] opisywały proces gojenia błon bębenkowych jako podobny do gojenia ran skóry, przebiegający poprzez zamknięcie ubytku tkanką ziarninową pokrywaną następnie przez migrujący nabłonek. W kolejnych badaniach wykazano jednak, że proces gojenia przebiega poprzez pierwotne zamknięcie ubytku przez tkankę nabłonkową, za którą podążają komórki tkanki łącznej [1, 3, 4, 7]. Stenfors i wsp. [7] wysunęli hipotezę, że warstwa keratynowa tworząca się na powierzchni nabłonka i przesuwająca się po powierzchni błony bębenkowej pokrywa wstępnie perforację i stanowi rusztowanie dla podążających za nią komórek nabłonkowych. Hipoteza ta początkowo została zaakceptowana przez innych badaczy, bardziej na podstawie obserwacji
7
otoskopowych niż badań histologicznych [2, 3, 16]. W naszych badaniach na czole pogrubiałego nabłonka od strony perforacji obserwowano skupisko bezpostaciowej substancji zwierającej liczne komórki zapalne, głównie granulocyty i makrofagi. Warstwa keratynowa, jeżeli występowała, była cienka, rozwarstwiona, luźno związana z leżącym pod nią nabłonkiem. Podobne obserwacje przedstawili Santa Maria i wsp. [11]. Wydaje się mało prawdopodobne, aby tak cienka i rozfragmentowana warstwa keratynowa miała istotne znaczenie jako szkielet dla rekonstrukcji błony bębenkowej. Pozostaje do wyjaśnienia rola stale obecnej na czole migrującego nabłonka zasychającej warstwy wydzieliny z komórkami zapalnymi, która w obrazie wziernikowym jest widoczna jako rodzaj strupa otaczającego i zmniejszającego perforację, aż do całkowitego jej zamknięcia. Tahar Aissa i Hultcrantz [20] w badaniach immunohistochemicznych stwierdzili na powierzchni proliferującego nabłonka perforowanej błony bębenkowej obecność licznych makrofagów i limfocytów. Badania przeprowadzone przez Li i wsp. [21] oraz Prestwich i wsp. [22] wykazały, że gojenie błon bębenkowych jest całkowicie zahamowane u myszy pozbawionych możliwości wytwarzania plazminogenu, prekursora plazminy – enzymu, którego działanie polega na rozkładaniu włóknika będącego głównym składnikiem skrzepu. Wykazano również wzrost aktywności genów kodujących aktywatory plazminogenu w przebiegu gojenia się błon bębenkowych [23]. Wydaje się zatem, że obserwowany na czole rozrastającego się nabłonka strup oraz możliwość jego rozkładania stanowią bardziej istotne elementy w gojeniu perforacji błon bębenkowych niż warstwa keratyny. Przeprowadzone badania wskazują, że procesy odtwórcze w obrębie warstwy włóknistej błony bębenkowej następują nieco później niż zmiany proliferacyjne i migracja nabłonka zewnętrznego. W okresie 3.–6. doby gojenia warstwa ta była pogrubiała, z luźnym ułożeniem włókien i licznymi fibroblastami. Dotychczasowe obserwacje dotyczące zmian w obrębie warstwy włóknistej błony w przebiegu jej gojenia są bardzo nieliczne [6, 24]. Uzyskane obserwacje wskazują, że: Nabłonek wielowarstwowy płaski pokrywający zewnętrzną powierzchnię błony bębenkowej jest pierwszą warstwą, która odtwarza jej ciągłość w procesie gojenia ubytku. W procesie zamykania perforacji przez migrujący nabłonek większą rolę niż warstwa keratynowa wydaje się odgrywać obserwowany na brzegu ubytku zasychający wysięk tworzący strup. Rozplem tkanki łącznej w przebiegu gojenia ubytku błony bębenkowej następuje w późniejszych etapach gojenia, w bezpośrednim sąsiedztwie proliferującego i migrującego nabłonka.
Wkład autorów/Authors' contributions EH-P – koncepcja pracy, interpretacja danych, przygotowanie literatury, pozyskanie środków (finansowania). HZ – zebranie i interpretacja danych, analiza statystyczna, przygotowanie literatury, pozyskanie środków (finansowania). MMW, JR – interpretacja danych, akceptacja ostatecznej wersji. BS – zebranie danych, akceptacja ostatecznej wersji. LC – akceptacja ostatecznej wersji.
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001
OTPOL-133; No. of Pages 8
8
otolaryngologia polska xxx (2014) xxx–xxx
Konflikt interesu/Conflict of interest Nie występuje.
Finansowanie/Financial support Praca była finansowana ze środków statutowych Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.
Etyka/Ethics Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymi wymaganiami dla czasopism biomedycznych.
pi smiennictwo/references
[1] Reijnen CJ, Kuijpers W. The healing pattern of the drum membrane. Acta Otolaryngol Suppl 1971;287:1–74. [2] Johnson A, Hanke M. The function of migratory epidermis in the healing of tympanic membrane perforations in guinea-pig. A photographic study. Acta Otolaryngol (Stockh) 1987;103:81–86. [3] Johnson AP, Lesley A, Smallman A, Kent SE. The mechanism of healing of tympanic membrane perforations. A two-dimensional histological study in guinea pigs. Acta Otolaryngol 1990;109:406–415. [4] Boedts D, Ars B. Histopathological research on eardrum perforations. Arch Otorhinolaryngol 1977;215:55–59. [5] Boedts D. Tympanie membrane perforations. Acta otorhinolaryngol belg 1995;49:149–158. [6] Govaerts PJ, Jacob WA, Marquet J. Histological study of the thin replacement membrane of human tympanic membrane perforations. Acta Otolaryngol 1988;105:297–302. [7] Stenfors L-E, Carlosöö B, Salén B, Winbland B. Repair of experimental tympanic membrane perforations. Acta Otolaryngol 1980;90:332–341. [8] Koba R. Epidermal cell migration and healing of the tympanic membrane: an immunohistochemical study of cell proliferation using bromodeoxyuridine labelling. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995;104:218–225. [9] Wang W-Q, Wang Z-M, Chi F-L. Spontaneous healing of various tympanic membrane perforations in the rat. Acta Otolaryngol 2004;124:1141–1144.
[10] Castagno LA, Lavinksy L. Tympanic membrane healing in myringotomies performed with argon laser or microknife: an experimental study in rats. Braz J Otorhinolaryngol 2006;72:794–799. [11] Santa Maria PL, Redmond SL, Atlas MD, Ghassemifar R. Histology of the healing tympanic membrane following perforation in rats. Laryngoscope 2010;120:2061–2070. [12] Kaur P. Interfollicular epidermal stem cells: identification, challenges, potential. J Invest Dermatol 2006;126:1450–1458. [13] Watt FM, Lo Celso C, Silva-Vargas V. Epidermal stem cells: an update. Curr Op Genet Dev 2006;16:518–524. [14] Braun KM, Prowse DM. Distinct epidermal stem cell compartments are maintained by independent niche microenvironments. Stemp Cell Rev 2006;2:221–232. [15] Reeve DRE. The mitotic response of the stratified squamous epithelium at the edge of large perforations of the tympanic membrane in guinea-pigs. J Anat 1977;124:731–740. [16] Makino K, Amastu M, Kinishi M, Mohri M. Epithelial migration in the haling process of tympanic membrane perforations. Eur Arch Otorhinolaryngol 1990;247: 352–355. [17] Kakoi H, Anniko M, Kinnefors A, Rask-Andersen H. Auditory epidermal cell migration. VII. Antigen expression of proliferating cell nuclear antigens, PCNA and Ki-67 in human tympanic membrane and external auditory canal. Acta Otolaryngol (Stockh) 1997;117:100–108. [18] Knutsson J, von Unge M, Rask-Andersen H. Localization of progenitor/stem cells in the human tympanic membrane. Audiol Neurotol 2011;16:263–269. [19] McMinn RMH. Cellular aspects of tissue repair. Ann R Coll Surg Engl 1978;60:215–218. [20] Tahar Aissa J, Hultcrantz M. Acute tympanic membrane perforations and the early immunological response in rats. Acta Otolaryngol 2009;129:1192–1197. [21] Li J, Eriksson P-O, Hansson A, Hellström S, Ny T. Plasmin/ plasminogen is essential for the healing of tympanic membrane perforations. Tromb Haemost 2006;96:512–519. [22] Prestwich A, Li J, Eriksson P-O, Ny T, Berggren D, Hellström S. Lack of plasminogen does not alter the early inflammatory response following a tympanic membrane perforation; a study in plasminogen-deficient mice. Acta Otolaryngol 2008;128:1294–1302. [23] Hassmann-Poznańska E, Taranta A, Bialuk I, Poznańska M, Zajączkiewicz H, Winnicka MM. Analysis of gene expression profiles in tympanic membrane following perforation using PCR Array in rats – preliminary investigation. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2013;77: 1753–1759. [24] Laurent C, Hellström S. Extracellular matrix components reflect the dynamics of a healing tympanic membrane perforation – a histochemical study. Int J Biochem Cell Biol 1997;29:221–229.
Artykuł w formie in press proszę cytować jako: Zajączkiewicz H, et al. Proces gojenia perforacji błon bębenkowych u szczurów. Otolaryngol Pol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2014.01.001