- Email: [email protected]
Profil ekspresji genów kodujących TGF-β1 i jego receptory TGFβRI, TGFβRII i TGFβRIII w polipach nosa
B. Rostkowska-Nadolska i inni
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa* The profile of expression of transforming growth factor b1 and TGFbRI, TGFbRII and TGFbRIII genes in nasal polyps Beata Rostkowska-Nadolska1, Małgorzata Kapral2, Urszula Mazurek3, Wojciech Gawron1, Marek Bochnia1, Krzysztof Preś1 1Klinika
Otolaryngologii AM we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. T. Kręcicki 2Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śl. UM w Katowicach Kierownik: prof. dr hab. L. Węglarz 3Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śl. UM w Katowicach Kierownik: dr hab. U. Mazurek
Summary Background. Transforming growth factor b (TGF-b) plays an important role in cells proliferation and differentiation as well as in local immunological response. Objectives. An evaluation of genes expression profile for TGF-b1 and its receptors TGF-bRI, TGF-b RII and TGF-b bRIII as well as their potential role in the pathogenesis of nasal polyps in eosynophilic and neutrophilic polyps and in normal nasal mucosa. Material. Material consisted of 22 patients. Nasal polyps were removed during standard polypectomy or FESS. In the histopathological evaluation there were 16 eosynophilic polyps and 5 neutrophilic ones. The control group consisted of 8 healthy patients from whom healthy nasal mucosa was taken during nasal septoplasty. Methods. The expression of the genes coding TGF-b and its receptors was evaluated with the use of RTPCR technique. Results. TGF-b1 mRNA was present in 10 eosynophilic polyps out of 16. In neutrophilic polyps group (n = 6) mRNA TGFb-1 was present in 3 samples. TGFb-1 isoform was present in all the tissues of the control group. It was significantly larger expression of TGFb-1 gene in normal mucosa in comparison with eosinophilic and neutrophilic polyps (p < 0.05). The expression of genes coding TGFbRI, TGF-bRII and TGF-bRIII receptors was obtained in all the polyps and healthy tissues. There was no significant differences in the transcription activity of the receptors in polyps and in the healthy tissue. Conclusions. Considering regulative function of TGFb1 in inflammation processes, its low concentration in nasal polyps tissue may influence on migration and survival of inflammation cells. The high expression of genes coding TGFbRI, TGF-bRII and TGF-bRIII receptors in all the polyps and healthy tissues, show readiness to transduction of TGFb. It may suggest that, less intensive TGFb1 expression in nasal polyps may be connected with the presence of other than first TGFb isoforms. This problem needs further investigations to set precise role of individual TGFb isoforms and other growth factors in the pathogenesis of NSP as their interactions with local cytokines. It may help to work out more effective and specific therapeutic methods in nasal polyps therapy. Hasła i n de kso we : polipy nosa, QRT-PCR, TGFb1, bTGFb-RI, TGFb-RII, b TGFb-RIII Ke y wo rds: nasal polyps, QRT-PCR, TGF- b, bTGF-b-RI, TGF-b-RII, b TGF-b-RIII Otolaryngol Pol 2007; LXI (6): 944–950 © 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
* Badania wykonane w ramach grantu 2P05C 01228 Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
944
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa
WSTĘP Polipy nosowe, zatok przynosowych i choanalne spotykamy u chorych, u których została zaburzona lokalna homeostaza błony śluzowej. Patogeneza tych zaburzeń nie jest do końca poznana. Jednym z głównych mechanizmów powstawania polipów jest miejscowy proces zapalny oraz towarzyszące mu zaburzenia układu immunologicznego [1, 2]. Histologicznie polip pokryty jest nabłonkiem walcowatym migawkowym i wielowarstwowym płaskim, pod którym znajduje się tkanka łączna z fibroblastami oraz naciekami komórek zapalnych. Głównie są to eozynofile, ale również limfocyty, neutrofile i komórki plazmatyczne. Transformujący czynnik wzrostu b (TGF-b – transforming growth factor b), to wieloczynnościowy peptyd, uczestniczący w proliferacji i różnicowaniu komórek, w angiogenezie oraz wpływający na lokalną odpowiedź immunologiczną. Czynnik ten indukuje procesy włóknienia. Jest chemoatraktantem dla fibroblastów i wpływa na ich proliferację. Ponadto, jak wynika z ostatnich badań odgrywa dużą rolę jako regulator migracji i przeżycia komórek w procesach zapalnych [3]. Wykryto 5 homologicznych izoform TGF-b (oznaczonych TGF-b1-b5), kodowanych przez niezależne geny umiejscowione w różnych chromosomach, z których każda może pełnić inną funkcję w procesach immunoregulacyjnych komórek. W tkankach człowieka występują tylko izoformy TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3. Aktywność biologiczna TGF-b w znacznym stopniu uzależniona jest od połączenia się tych czynników z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórki. Zidentyfikowano kilka typów receptorów dla TGFb występujących na powierzchni komórek różnego pochodzenia, różniących się masami cząsteczkowymi i powinowactwem do tej cytokiny. W ciągu ostatnich lat ukazało się kilka prac dotyczących czynnika TGF-b i jego potencjalnej roli w procesie powstawania polipów nosowych. Badania te wykonywane na poziomie białka, technikami immunohistochemicznymi wykazały zróżnicowane wyniki. Ze względu na swoje właściwości niektórzy autorzy przypuszczają, iż może się on przyczyniać do zmian strukturalnych podścieliska polipów takich jak: włóknienie i zgrubienie błony podstawnej [4, 5].
CEL PRACY Celem pracy było wyznaczenie profilu ekspresji genów kodujących TGF-b1 oraz jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach eozyno-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
filowych, neutrofilowych i w prawidłowej błonie śluzowej oraz określenie potencjalnej roli TGFb1 w patogenezie polipów nosowych.
MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły polipy nosa pobrane od 22 chorych (15 mężczyzn i 7 kobiet w wieku od 16 do 79 lat) podczas zabiegów endoskopowych typu FESS oraz polipektomii wykonywanych w Klinice Otolaryngologii AM we Wrocławiu. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę lokalnej Komisji Bioetycznej (Nr 435/2004). Badania histopatologiczne wykazały u 16 chorych polipy eozynofilowe, a u 6 polipy neutrofilowe. 10 pacjentów z polipami chorowało na astmę (3 z polipami neutrofilowymi i 7 z polipami eozynofilowymi), w tym dwóch miało triadę aspirynową, 13 pacjentów było po kilkukrotnych zabiegach polipektomii. Grupę kontrolną stanowiła prawidłowa błona śluzowa pobrana od 8 pacjentów podczas zabiegu septoplastyki. Bezpośrednim materiałem do badań był wyizolowany z pobranych tkanek RNA. Tkanki po zabiegu były dostarczane do laboratorium w ciekłym azocie, a do momentu rozpoczęcia ekstrakcji przechowywane w temperaturze -70°C.
EKSTRAKCJA RNA Całkowite RNA wyizolowano z tkanek polipów nosa z wykorzystaniem odczynnika TRIZOL® (Invitrogen). Stężenie RNA oznaczono spektrofotometrycznie z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia). RT-QPCR w czasie rzeczywistym (RTD-QPCR) Ilościową detekcję ekspresji genów TGFb1, TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII wykonano techniką RTQPCR w czasie rzeczywistym [6–8] z zastosowaniem systemu DNA Engine Opiticon™ (MJ Research). Mieszanina reakcyjna zawierała: 25 μl 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix (Qiagen), 0,5 μl QuantiTect RT Mix, 0,1 μg RNA oraz 0,5bM starterów. Do amplifikacji użyto startery: TGF-b1F 5’-TGAACCGGCCTTTCCTGCTTCTCATG-3’ (starter sensowny), TGF-b1R 5’-GCGGAAGTCAATGTACA GCTGCCGC-3’ (starter antysensowny); TbRIF: 5’ACTGGCAGCTGTCATTGCTGGACCAG-3’ (starter sensowny), TbRIR 5’-CCTGAGCCAGAACCTGACG TTGTCATATCA-3’ (starter antysensowny); TbRIIF 5’-GGCTCAACCACCAGGGCATCCAGAT-3 (starter
945
B. Rostkowska-Nadolska i inni
sensowny); TbRIIR 5’-CTCCCCGAGAGCCTGTCC AGATGCT-3’ (starter antysensowny); TbRIIIF 5’ACCGTGATGGGCATTGCGTTTGCA-3’ (starter sensowny), TbRIIIR 5’-GTGCTCTGCGTGCTGCCGATG CTGT-3’ (starter antysensowny). Wykorzystane do analizy startery zostały zaprojektowane z użyciem programu komputerowego Primer Express™ v1.0 (PE Applied Biosystems). Profil termiczny RTD-QPCR: Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono w temperaturze 50°C przez 30 minut. Po wstępnej aktywacji enzymu HotStar Taq® DNA Polimerazy w 95°C przez 15 min przeprowadzono dwustopniową reakcję: 94°C przez 15 s i 60°C przez 30 s (45 cykli). W każdej badanej próbie wyznaczono aktywność transkrypcyjną genów b-aktyny i GAPDH (dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego) użytych jako kontrole endogenne. Liczbę kopii mRNA badanych genów wyznaczono na podstawie krzywej standardowej sporządzonej dla komercyjnie dostępnych wzorców b-aktyny (Applied Biosystems). Wyniki ilościowej analizy przeliczono na μg całkowitego RNA. Specyficzność RT-PCR oceniono na podstawie wyznaczonych przez detektor Opticon temperatur topnienia dla każdego z amplimerów (TGF-b1 – 85°C; TGFbRI – 80°C; TGFbRII – 84°C; TGFbRIII – 80°C).
transkrypcyjna wynosiła 1,7 × 103 kopii w 1 μg całkowitego RNA. W polipach neutrofilowych (n = 6) mRNA TGFb1 było obecne w czterech próbkach (tab. I). Średni poziom ekspresji TGFb1 w polipach neutrofilowych wynosił 1,1 103 kopii mRNA/μg RNA. Izoforma TGFb1 była obecna we wszystkich wycinkach z prawidłowej błony śluzowej grupy kontrolnej, a średnia liczba produktu wynosiła 2,4×104 kopii mRNA TGFb1/μg RNA. Ekspresja genu TGFb1 w prawidłowej błonie śluzowej była znacząco wyższa niż w tkankach polipów eozynofilowych i neutrofilowych (p < 0,05) (ryc. 1). Ekspresja genów kodujących receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII była obecna we wszystkich wycinkach polipów oraz w prawidłowej błonie śluzowej nosa. Nie stwierdzono różnic statystycznie istotnych w aktywności transkrypcyjnej badanych receptorów TGFb w polipach i w zdrowej tkance (ryc. 2–4). W populacji chorych z polipami wykazano dodatnią korelację pomiędzy poziomem ekspresji genów TGFb1 i TGFbRII (R = 0,58; p < 0,05). Nie stwierdzono korelacji pomiędzy aktywnością transkrypcyjną genu TGFb1 a aktywnością transkrypcyjną receptora typu I (R = 0,18;NS) i receptora typu III (R = 0,34; NS). Nie wykazano korelacji pomiędzy wiekiem, liczbą polipektomii i astmą a ekspresją badanych czynników (tab. II).
ANALIZA STATYSTYCZNA Do analizy statystycznej otrzymanych wyników wykorzystano program komputerowy Statistica 6.0. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genów TGFb1, TGFbRI, TGFbRII, TGFbRIII w badanych grupach polipów nosa i grupie kontrolnej wykonano w oparciu o wartości zlogarytmowane przy użyciu testu t-Studenta. Zależności między poziomem ekspresji genu TGFb1 i jego receptorów oceniono testem korelacji rang Spearman’a. Do porównania ekspresji badanych genów w wybranych grupach w zależności od płci, występowania astmy oraz w zależności od liczby przeprowadzonych zabiegów, zastosowano test Manna-Whitney’a. Istotność statystyczną ustalono na poziomie mniejszym od 0,05 (p < 0,05).
WYNIKI Obecność mRNA TGFb1 stwierdzono w 10 polipach eozynofilowych (10/16), średnia aktywność
946
DYSKUSJA Spektrum aktywności biologicznej TGF-b jest niezwykle szerokie i zróżnicowane. Do najbardziej znamiennych efektów przypisywanych tej cytokinie należy działanie immunosupresyjne. TGFb hamuje proliferację, różnicowanie i aktywność limfocytów T, limfocytów B, komórek NK i LAK [9]. Wywiera działanie immunomodulujące również poprzez regulację wydzielania innych cytokin np. interleukin (IL-1, IL-6), czynnika martwicy nowotworów (TNFb) czy płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) [10]. Jest potencjalnym inhibitorem proliferacji większości komórek w organizmie, w tym komórek epitelialnych, endotelialnych i fibroblastów [11]. Jednocześnie TGF-b ma istotny wpływ na przebieg procesu zapalnego m.in. dlatego, że jest czynnikiem chemotaktycznym dla monocytów, limfocytów T, neutrofilów oraz fibroblastów. Czynnik ten jest produkowany przez praktycznie wszystkie
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa
Tabela I. Ekspresja mRNA TGFb-1 i receptorów TGFb-RI, TGFb-RII i TGFb-RIII w polipach nosa i w prawidłowej błonie śluzowej TGFbRI Liczba TGFbRII Liczba TGFbRIII Liczba Lp. Wiek Płeć Typ Astma TGFb1 Liczba tkanki
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
21 33 24 24 49 38 51 45 52 53 34 53 58 74 61 41 28 16 79 53 59 76 59 46 36 54 48 50 75 52
M K M M K M M M M K M M M M M M K M K M M M K M M K K K M M
K K K K K K K K E E E E E E E E E E E E E E E E N N N N N N
+ +
+ + +
+ + + + +
kopii mRNA na 1 mg RNA 231810 4285 43676 3356 42385 27590 19931 3224 5190 0 1418 2072 0 2139 1236 37445 3729 0 0 0 5801 1908 0 16975 2713 0 0 1132 4641 1104
kopii mRNA na 1 mg RNA 17165 2819 25298 98685 76132 66767 129604 64321 99282 26718 43834 672 113536 56877 112574 24793 85608 3663 52453 2613 112020 84845 58694 66442 24616 9084 7691 108172 38836 37678
kopii mRNA na 1 mg RNA 30574 1401 13269 3952 22352 31603 7082 2070 3782 2357 3377 3626 252 2206 11688 2265 6795 4976 5716 4506 5368 1388 1918 17537 6471 755 981 2719 2834 2752
kopii mRNA na 1 mg RNA 13178 2936 8348 3466 9177 11659 12518 2983 8784 7860 7636 8204 928 13380 11741 7526 13644 3966 3142 9368 3497 3140 9577 6021 7405 3432 3708 3932 8048 5305
K - grupa kontrolna; E - polipy eozynofilowe; N - polipy neutrofilowe
Tabela II. Porównanie ekspresji TGFb-1 i jego receptorów w polipach nosa w zależności od płci, obecności astmy i liczby polipektomii. Liczba kopii mRNA badanych genów x 103 na 1 mg RNA wyrażonych jako mediana i wartość min-max Charakterystyka TGFb-1 P TGFb RI P TGFb RII P TGFb RIII P płeć
m f
Astma
obecna Nieobecna
Liczba polipektomii
N=1 N ≥2
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
2,1 (0–37,4) 0 (0–3,7) 2,4 (0–37,4) 1,4 (0–5,8) 0,6 (0–37,4) 1,9 (0–17)
0,027
0,526
0,772
50,3 (0,7 –113,5) 52,4 (7,7–108,2) 55,6 (9,1–108,2) 43,8 (0,7-113,5) 55,2 (2,6–113,5) 52,4 (0,7–108,2)
0,881
0,573
0,664
3,7 (0,2 – 17,5) 2,3 (0,7–6,8) 2,8 (0,7–17,5) 3,6 (0,2–11,7) 3,4 (0,2–11,7) 3,4 (1,4–17,5)
0,296
0,944
0,664
7,6 (0,9 – 13,4) 3,9 (3,1–13,6) 7,7 (3,1–13,6) 7,4 (0,9–13,4) 5,6 (0,9–13,6) 7,6 (3,1–13,4)
0,709
0,67
0,772
947
B. Rostkowska-Nadolska i inni
Ryc. 1. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGF-b1 w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (* p<0,05; # NS, test T-Studenta)
Ryc. 3. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGFb RII w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (# NS, test T-Studenta)
Ryc. 2. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGFbRI w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (# NS, test T-Studenta)
Ryc. 4. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGFbRIII w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (# NS, test T-Studenta)
typy komórek (płytki krwi, limfocyty, monocyty, fibroblasty) w formie nieaktywnej, związanej z białkami LAP (latency-associated peptide) i LTBP (latent TGF-beta-binding protein), który po uwolnieniu może przyłączać się do receptora [12, 13]. Aktywność biologiczną cytokiny determinują występujące na powierzchni komórek specyficzne receptory białkowe TGFb typu I (TGFbRI), typu II (TGFbRII) [14], zawierające kinazę serynowo-treoninową oraz typu III (TGFbRIII, betaglikan) [15]. Rozpoczęcie sygnału transdukcji jest możliwe tylko podczas stymulacji TGFbRI. Aktywny TGF-b zostaje bezpośrednio związany przez TGFbRII lub przez TGFbRIII, który prezentuje cytokinę receptorowi typu II i dopiero wtedy łączy się z TGFbRII. W następnym etapie do kompleksu TGF-b1/TGFbRII następuje przyłączenie i aktywacja TGFbRI [16]. Wyznaczona w naszych badaniach wysoka, dodatnia korelacja pomiędzy poziomem mRNA TGF-b1 i mRNA TGFbRII może wynikać z mechanizmu działania cytokiny.
TGF-b1 indukuje in vitro proenzym MMP-2 i MMP-9 [17]. Stwierdzono również wpływ MMP-2 i MMP-9 na mechanizm aktywacji formy nieaktywnej TGF-b1 [18]. Lee i wsp. [19] wykorzystując metodę ELISA (enzyme like immunosorbent assay) wyznaczyli poziom białek TGF-b1, ECP, MMP-2, MMP-9 i TIMP-1 w tkance polipów nosowych, wykazując znaczącą korelację pomiędzy ekspresją TGF-b1 a MMP-2, MMP-9 i ECP. Autorzy sugerują, że TGF-b1 i MMP-2 oraz MMP-9 mogą przyczyniać się do migracji eozynofilów i mastocytów do zewnątrzkomórkowej matrix tkanki polipów nosowych. Obecnie uważa się, że TGF-b pełni istotną rolę w oddziaływaniu na zewnątrzkomórkową macierz, nasilając i stymulując transkrypcję i wydzielanie większości jej składników (kolagen, fibronektyna), a także powodując zwłóknienie i nasilając aktywność fibroblastów i myofibroblastów. Zależność między obecnością myofibroblastów i ekspresją TGFb wykazali Wang i wsp. [20]. Głównym źródłem TGF-b1 w tkance poli-
948
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa
pów nosowych są naciekające eozynofile [4, 5, 21]. Zespół Coste’a wykazał wzrost poziomu ekspresji takich czynników wzrostu jak PDGF (platelet-derived growth factor) i VEGF (vascular endothelial growth factor) w hodowli komórek epitelialnych z polipów nosa po stymulacji TGF-b1. Według autorów TGF-b wpływa na inne czynniki wzrostu kontrolujące proliferację komórek epielialnych w polipach nosa [10]. W innych badaniach Coste i wsp. oznaczali metodą immunohistochemiczną ekspresję izoform TGF-b 13 w tkankach prawidłowej błony śluzowej, zmienionej zapalnie błony śluzowej oraz w polipach nosa. Ekspresja izoform TGF-b w polipach nosa i zmienionej zapalnie błonie śluzowej była wyższa niż w zdrowej błonie śluzowej, a TGF-b1 był izoformą dominującą. TGF-b1 obecny był również w makrofagach i eozynofilach [22]. Hirschberg i wsp. uzyskali odmienne wyniki badań, oznaczając metodą ELISA stężenie białka TGF-b1 w polipach nosa pobranych od pacjentów atopowych i nieatopowych oraz w prawidłowej błonie śluzowej nosa. Poziom ekspresji TGF-b1 w prawidłowej błonie śluzowej nosa był znacząco wyższy niż w tkankach polipów. Natomiast polipy atopowe i nieatopowe nie wykazywały różnej ekspresji TGF-b. Autor sugeruje, że może to być spowodowane aktywacją mechanizmów powodujących krótkotrwałość utajenia TGF-b1 [23]. Lee i wsp. wykorzystując metodę RT-PCR wyznaczyli ekspresję mRNA TGF-b we wszystkich badanych tkankach polipów nosa (n-14), natomiast w prawidłowej błonie śluzowej ekspresja była dodatnia w 3 wycinkach na 6 badanych [24]. Bradley i Kountakis [25] techniką RT-PCR w czasie rzeczywistym oznaczali TGF-b w wycinkach błony śluzowej pobranej z zatok od pacjentów z przewlekłym zapaleniem bez polipów (CRS) i z polipami (CRS/ NP). Stwierdzili oni wyższą ekspresję w tkankach u pacjentów z polipami. Wyniki naszych badań wykonanych również techniką RT-PCR w czasie rzeczywistym wykazały istotnie wyższą ekspresję mRNA TGF-b1 w prawidłowej błonie śluzowej w porównaniu do tkanek polipów zarówno eozynofilowych, jak neutrofilowych i są zgodne z badaniami zespołu Hirschberga. Efekt działania TGF-b zależy od jego receptorów. Wysoki poziom ekspresji mRNA dla receptorów TGFbRI-III w badanych tkankach, określa gotowość do transdukcji TGFb. Nasuwa to przypuszczenie, że mniejsza ekspresja TGF-b1 w tkance polipów w naszych badaniach może być związana z obecnością innej izofromy niż TGF-b1. Potwierdzałyby to badania Eismy i wsp., [21] którzy stosując metody immunohistochemiczne wykazali
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
w tkankach polipów nosowych wyższą ekspresję izoformy TGF-b2 w porównaniu do prawidłowej błony śluzowej. Izoforma TGF-b1 podobnie jak w naszych badaniach występowała w tkankach polipów w mniejszych ilościach niż w prawidłowej błonie śluzowej. Niska ekspresja TGF-b1 w tkance polipów może również stymulować proliferację m.in. fibroblastów, co wynika z jego znanych właściwości pobudzania proliferacji komórek w małych stężeniach, a hamowania w dużych stężeniach [26]. Podsumowanie: Przypuszcza się, że TGF-b odgrywa ważną rolę w inicjacji procesów prowadzących do powstania PN. Obecna praca wykazała specyficznie niską ekspresję mRNA izoformy TGFb1 w tkankach polipów nosa zarówno eozynofilowych jak i neutrofilowych w porównaniu do prawidłowej błony śluzowej. Stwierdziliśmy wysoki poziom ekspresji mRNA receptorów TGFbRI-III w badanych tkankach polipów i błony śluzowej. Ze względu na regulacyjną rolę TGF-b1 w procesach zapalnych, jego niskie stężenie w tkankach polipów nosa, może mieć wpływ na migrację i przeżycie komórek zapalnych. To z kolei może przyczyniać się do niekorzystnego pogłębiania procesu powstawania polipów. Problem ten wymaga dalszych badań w celu dokładnego poznania roli poszczególnych izoform TGF-b i innych czynników wzrostu w patogenezie NSP i ich oddziaływania z lokalnymi cytokinami. Może się to przyczynić się do opracowania bardziej skutecznych i specyficznych rodzajów terapii PN.
PIŚMIENNICTWO 01. Pawankar R. Nasal polyps: an update: editorial review. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003; 3: 1–6. 02. Serpero L, Petecchia L, Sabatini F, Giuliani M, Silvestri M, Di Blasi P, i wsp. The effect of transforming growth factor (TGF)beta1 and (TGF)-beta2 on nasal polyp fibroblast activities involved upper airway remodeling: modulation by fluticasone propionate. Immunol Lett 2006; 105: 61–67. 03. Letterio JJ. Murine models define the role of TGFb as a master regulator of immune cell function. Cytokine Growth Factor Rev 2000; 11: 81–87. 04. Ohno L, Lea RG, Flanders KC, Clark DA, Banwatt D, Dolowich J, i wsp. Eosinophils in chronically inflamed human upper airway tissues express transforming growth factor b1 gene (TGFb1). J Clin Invest 1992; 89: 1662–1668. 05. Elovic A, Wong DT, Weller PF, Matossian K, Galli SJ. Expression of transforming growth factor-a and -b1 messenger RNA and product by eosinophils in nasal polyps. J Allergy Clin Immunol 1994; 93: 864–869.
949
B. Rostkowska-Nadolska i inni
06. Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 2000; 25: 169–193. 07. Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 2002; 29: 23–39. 08. Valasek MA, Repa JJ. The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ 2005; 29: 151–159. 09. Schmidt-Weber CB, Blaser K. Regulation and role of transforming growth factor-beta in immune tolerance induction and inflammation. Curr Opin Immunol 2004; 16: 709–716. 10. Coste A, Brugel L, Maitre B, Boussat S, Papon JF, Wingerstmann L, i wsp. Inflammatory cells as well as epithelial cells in nasal polyps express vascular endothelial growth factor. Eur Respir J 2000; 15: 367–372. 11. Huang SS, Huang JS. TGF-beta control of cell proliferation. J Cell Biochem 2005; 96: 447–462. 12. Penttinen C, Saharinen J, Weikkolainen K, Hyytiainen M, Keski-Oja J. Secretion of human latent TGF-beta-binding protein-3 (LTBP-3) is dependent on co-expression of TGF-beta. J Cell Sci 2002; 115: 3457–3468. 13. Pociask DA, Sime PJ, Brody AR. Asbestos-derved reactive oxygen species activate TGF-beta1. Lab Invest 2004; 84: 1013–1023. 14. Bollard CM, Rossig C, Calonge MJ, Huls MH, Wagner HJ, Massague J, i wsp. Adapting a transforming growth factor beta-related tumor protection strategy to enhance anti-tumor immunity. Blood 2002; 99: 3179–3187. 15. Esparza-Lopez J, Montiel JL, Vilchis-Landeros MM, Okadome T, Miyazono K, Lopez-Casillas F. Ligand binding and functional properties of betaglycan, a co-receptor of the transforming growth factor-beta super-family. Specialized binding regions for transforming growth factor-beta and inhibin. J Biol Chem 2001; 276: 14588–14596. 16. Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell 2003; 113: 685–700. 17. Sehgal I, Thompson TC. Novel regulation of type IV collagenase (matrix metallo proteinase-9 and -2) activities by transforming growth factor b1 in human prostate cancer cell lines. Mol Biol Cell 1999; 10: 407–416. 18. Yu Q. Stamenkovic I: Cell surface – localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGFb and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev 1999; 14: 163–176.
950
19. Lee Y-M, Kim S-S, Kim H-A, Suh Y-J, Lee S-K, Nahm D-H, i wsp. Eosinophil inflammation of nasal polyp tissue: relationships with matrix metalloproteinases, tissue inhibitor of metalloproteinase-1, and transforming growth factor-b1. J Korean Med Sci 2003; 18: 97–102. 20. Wang QP, Escudier E, Roudot-Thoraval F, Abd-Al Samad I, Peynegre R, Coste A. Myofibroblast accumulation induced by transforming growth factor-b is involved in the pathogenesis of nasal polyps. Laryngoscope 1997; 107: 926–931. 21. Eisma RJ, Allen JS, Lafreniere D, Leonard G, Kreutzer DL. Eosinophil expression of Transforming Growth Factor Beta and ist receptor in nasal polyposis: role of the cytokines in this disease process. Am J Otolaryngol 1997; 18: 405–411. 22. Coste A, Lefaucheur JP, Wang QP, Lesprit E, Poron F, Peynegre R, i wsp. Expression of the Transforming Growth Factor b isoforms in inflammatory cells of nasal polyps. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1998; 124: 1361–1366. 23. Hirschberg A, Jokuti A, Darvas Z, Almay Z, Repassy G, Falus A. The pathogenesis of nasal polyposis by immunoglobulin E and interleukin-5 is completed by transforming growth factorbeta 1. Laryngoscope 2003; 113: 120–124. 24. Lee CH, Rhee CS, Min YG. Cytokine gene expression in nasal polyps. Ann Otol Rhinol Laryngol 1998; 107: 665–670. 25. Bradley DT, Kountakis SE. Role of interleukins and transforming growth factor b in chronic rhinosinusitis and nasal polyposis. Laryngoscope 2005; 115: 684–686. 26. Zhao Y, Young SL. Requirement of transforming growth factor-beta (TGF-beta) type II receptor for TGF-beta-induced proliferation and growth inhibition. J Biol Chem 1996; 271: 2369–2372.
Adres autora: Beata Rostkowska-Nadolska Klinika Otolaryngologii AM ul. Chałubińskiego 2 50-368 Wrocław tel. (071) 78 42 75, faks: (071) 32 70 950 e-mail: [email protected] Pracę nadesłano: 16.05.2007 r.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa* The profile of expression of transforming growth factor b1 and TGFbRI, TGFbRII and TGFbRIII genes in nasal polyps Beata Rostkowska-Nadolska1, Małgorzata Kapral2, Urszula Mazurek3, Wojciech Gawron1, Marek Bochnia1, Krzysztof Preś1 1Klinika
Otolaryngologii AM we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. T. Kręcicki 2Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śl. UM w Katowicach Kierownik: prof. dr hab. L. Węglarz 3Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śl. UM w Katowicach Kierownik: dr hab. U. Mazurek
Summary Background. Transforming growth factor b (TGF-b) plays an important role in cells proliferation and differentiation as well as in local immunological response. Objectives. An evaluation of genes expression profile for TGF-b1 and its receptors TGF-bRI, TGF-b RII and TGF-b bRIII as well as their potential role in the pathogenesis of nasal polyps in eosynophilic and neutrophilic polyps and in normal nasal mucosa. Material. Material consisted of 22 patients. Nasal polyps were removed during standard polypectomy or FESS. In the histopathological evaluation there were 16 eosynophilic polyps and 5 neutrophilic ones. The control group consisted of 8 healthy patients from whom healthy nasal mucosa was taken during nasal septoplasty. Methods. The expression of the genes coding TGF-b and its receptors was evaluated with the use of RTPCR technique. Results. TGF-b1 mRNA was present in 10 eosynophilic polyps out of 16. In neutrophilic polyps group (n = 6) mRNA TGFb-1 was present in 3 samples. TGFb-1 isoform was present in all the tissues of the control group. It was significantly larger expression of TGFb-1 gene in normal mucosa in comparison with eosinophilic and neutrophilic polyps (p < 0.05). The expression of genes coding TGFbRI, TGF-bRII and TGF-bRIII receptors was obtained in all the polyps and healthy tissues. There was no significant differences in the transcription activity of the receptors in polyps and in the healthy tissue. Conclusions. Considering regulative function of TGFb1 in inflammation processes, its low concentration in nasal polyps tissue may influence on migration and survival of inflammation cells. The high expression of genes coding TGFbRI, TGF-bRII and TGF-bRIII receptors in all the polyps and healthy tissues, show readiness to transduction of TGFb. It may suggest that, less intensive TGFb1 expression in nasal polyps may be connected with the presence of other than first TGFb isoforms. This problem needs further investigations to set precise role of individual TGFb isoforms and other growth factors in the pathogenesis of NSP as their interactions with local cytokines. It may help to work out more effective and specific therapeutic methods in nasal polyps therapy. Hasła i n de kso we : polipy nosa, QRT-PCR, TGFb1, bTGFb-RI, TGFb-RII, b TGFb-RIII Ke y wo rds: nasal polyps, QRT-PCR, TGF- b, bTGF-b-RI, TGF-b-RII, b TGF-b-RIII Otolaryngol Pol 2007; LXI (6): 944–950 © 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
* Badania wykonane w ramach grantu 2P05C 01228 Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
944
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa
WSTĘP Polipy nosowe, zatok przynosowych i choanalne spotykamy u chorych, u których została zaburzona lokalna homeostaza błony śluzowej. Patogeneza tych zaburzeń nie jest do końca poznana. Jednym z głównych mechanizmów powstawania polipów jest miejscowy proces zapalny oraz towarzyszące mu zaburzenia układu immunologicznego [1, 2]. Histologicznie polip pokryty jest nabłonkiem walcowatym migawkowym i wielowarstwowym płaskim, pod którym znajduje się tkanka łączna z fibroblastami oraz naciekami komórek zapalnych. Głównie są to eozynofile, ale również limfocyty, neutrofile i komórki plazmatyczne. Transformujący czynnik wzrostu b (TGF-b – transforming growth factor b), to wieloczynnościowy peptyd, uczestniczący w proliferacji i różnicowaniu komórek, w angiogenezie oraz wpływający na lokalną odpowiedź immunologiczną. Czynnik ten indukuje procesy włóknienia. Jest chemoatraktantem dla fibroblastów i wpływa na ich proliferację. Ponadto, jak wynika z ostatnich badań odgrywa dużą rolę jako regulator migracji i przeżycia komórek w procesach zapalnych [3]. Wykryto 5 homologicznych izoform TGF-b (oznaczonych TGF-b1-b5), kodowanych przez niezależne geny umiejscowione w różnych chromosomach, z których każda może pełnić inną funkcję w procesach immunoregulacyjnych komórek. W tkankach człowieka występują tylko izoformy TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3. Aktywność biologiczna TGF-b w znacznym stopniu uzależniona jest od połączenia się tych czynników z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórki. Zidentyfikowano kilka typów receptorów dla TGFb występujących na powierzchni komórek różnego pochodzenia, różniących się masami cząsteczkowymi i powinowactwem do tej cytokiny. W ciągu ostatnich lat ukazało się kilka prac dotyczących czynnika TGF-b i jego potencjalnej roli w procesie powstawania polipów nosowych. Badania te wykonywane na poziomie białka, technikami immunohistochemicznymi wykazały zróżnicowane wyniki. Ze względu na swoje właściwości niektórzy autorzy przypuszczają, iż może się on przyczyniać do zmian strukturalnych podścieliska polipów takich jak: włóknienie i zgrubienie błony podstawnej [4, 5].
CEL PRACY Celem pracy było wyznaczenie profilu ekspresji genów kodujących TGF-b1 oraz jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach eozyno-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
filowych, neutrofilowych i w prawidłowej błonie śluzowej oraz określenie potencjalnej roli TGFb1 w patogenezie polipów nosowych.
MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły polipy nosa pobrane od 22 chorych (15 mężczyzn i 7 kobiet w wieku od 16 do 79 lat) podczas zabiegów endoskopowych typu FESS oraz polipektomii wykonywanych w Klinice Otolaryngologii AM we Wrocławiu. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę lokalnej Komisji Bioetycznej (Nr 435/2004). Badania histopatologiczne wykazały u 16 chorych polipy eozynofilowe, a u 6 polipy neutrofilowe. 10 pacjentów z polipami chorowało na astmę (3 z polipami neutrofilowymi i 7 z polipami eozynofilowymi), w tym dwóch miało triadę aspirynową, 13 pacjentów było po kilkukrotnych zabiegach polipektomii. Grupę kontrolną stanowiła prawidłowa błona śluzowa pobrana od 8 pacjentów podczas zabiegu septoplastyki. Bezpośrednim materiałem do badań był wyizolowany z pobranych tkanek RNA. Tkanki po zabiegu były dostarczane do laboratorium w ciekłym azocie, a do momentu rozpoczęcia ekstrakcji przechowywane w temperaturze -70°C.
EKSTRAKCJA RNA Całkowite RNA wyizolowano z tkanek polipów nosa z wykorzystaniem odczynnika TRIZOL® (Invitrogen). Stężenie RNA oznaczono spektrofotometrycznie z zastosowaniem spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia). RT-QPCR w czasie rzeczywistym (RTD-QPCR) Ilościową detekcję ekspresji genów TGFb1, TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII wykonano techniką RTQPCR w czasie rzeczywistym [6–8] z zastosowaniem systemu DNA Engine Opiticon™ (MJ Research). Mieszanina reakcyjna zawierała: 25 μl 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix (Qiagen), 0,5 μl QuantiTect RT Mix, 0,1 μg RNA oraz 0,5bM starterów. Do amplifikacji użyto startery: TGF-b1F 5’-TGAACCGGCCTTTCCTGCTTCTCATG-3’ (starter sensowny), TGF-b1R 5’-GCGGAAGTCAATGTACA GCTGCCGC-3’ (starter antysensowny); TbRIF: 5’ACTGGCAGCTGTCATTGCTGGACCAG-3’ (starter sensowny), TbRIR 5’-CCTGAGCCAGAACCTGACG TTGTCATATCA-3’ (starter antysensowny); TbRIIF 5’-GGCTCAACCACCAGGGCATCCAGAT-3 (starter
945
B. Rostkowska-Nadolska i inni
sensowny); TbRIIR 5’-CTCCCCGAGAGCCTGTCC AGATGCT-3’ (starter antysensowny); TbRIIIF 5’ACCGTGATGGGCATTGCGTTTGCA-3’ (starter sensowny), TbRIIIR 5’-GTGCTCTGCGTGCTGCCGATG CTGT-3’ (starter antysensowny). Wykorzystane do analizy startery zostały zaprojektowane z użyciem programu komputerowego Primer Express™ v1.0 (PE Applied Biosystems). Profil termiczny RTD-QPCR: Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono w temperaturze 50°C przez 30 minut. Po wstępnej aktywacji enzymu HotStar Taq® DNA Polimerazy w 95°C przez 15 min przeprowadzono dwustopniową reakcję: 94°C przez 15 s i 60°C przez 30 s (45 cykli). W każdej badanej próbie wyznaczono aktywność transkrypcyjną genów b-aktyny i GAPDH (dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego) użytych jako kontrole endogenne. Liczbę kopii mRNA badanych genów wyznaczono na podstawie krzywej standardowej sporządzonej dla komercyjnie dostępnych wzorców b-aktyny (Applied Biosystems). Wyniki ilościowej analizy przeliczono na μg całkowitego RNA. Specyficzność RT-PCR oceniono na podstawie wyznaczonych przez detektor Opticon temperatur topnienia dla każdego z amplimerów (TGF-b1 – 85°C; TGFbRI – 80°C; TGFbRII – 84°C; TGFbRIII – 80°C).
transkrypcyjna wynosiła 1,7 × 103 kopii w 1 μg całkowitego RNA. W polipach neutrofilowych (n = 6) mRNA TGFb1 było obecne w czterech próbkach (tab. I). Średni poziom ekspresji TGFb1 w polipach neutrofilowych wynosił 1,1 103 kopii mRNA/μg RNA. Izoforma TGFb1 była obecna we wszystkich wycinkach z prawidłowej błony śluzowej grupy kontrolnej, a średnia liczba produktu wynosiła 2,4×104 kopii mRNA TGFb1/μg RNA. Ekspresja genu TGFb1 w prawidłowej błonie śluzowej była znacząco wyższa niż w tkankach polipów eozynofilowych i neutrofilowych (p < 0,05) (ryc. 1). Ekspresja genów kodujących receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII była obecna we wszystkich wycinkach polipów oraz w prawidłowej błonie śluzowej nosa. Nie stwierdzono różnic statystycznie istotnych w aktywności transkrypcyjnej badanych receptorów TGFb w polipach i w zdrowej tkance (ryc. 2–4). W populacji chorych z polipami wykazano dodatnią korelację pomiędzy poziomem ekspresji genów TGFb1 i TGFbRII (R = 0,58; p < 0,05). Nie stwierdzono korelacji pomiędzy aktywnością transkrypcyjną genu TGFb1 a aktywnością transkrypcyjną receptora typu I (R = 0,18;NS) i receptora typu III (R = 0,34; NS). Nie wykazano korelacji pomiędzy wiekiem, liczbą polipektomii i astmą a ekspresją badanych czynników (tab. II).
ANALIZA STATYSTYCZNA Do analizy statystycznej otrzymanych wyników wykorzystano program komputerowy Statistica 6.0. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genów TGFb1, TGFbRI, TGFbRII, TGFbRIII w badanych grupach polipów nosa i grupie kontrolnej wykonano w oparciu o wartości zlogarytmowane przy użyciu testu t-Studenta. Zależności między poziomem ekspresji genu TGFb1 i jego receptorów oceniono testem korelacji rang Spearman’a. Do porównania ekspresji badanych genów w wybranych grupach w zależności od płci, występowania astmy oraz w zależności od liczby przeprowadzonych zabiegów, zastosowano test Manna-Whitney’a. Istotność statystyczną ustalono na poziomie mniejszym od 0,05 (p < 0,05).
WYNIKI Obecność mRNA TGFb1 stwierdzono w 10 polipach eozynofilowych (10/16), średnia aktywność
946
DYSKUSJA Spektrum aktywności biologicznej TGF-b jest niezwykle szerokie i zróżnicowane. Do najbardziej znamiennych efektów przypisywanych tej cytokinie należy działanie immunosupresyjne. TGFb hamuje proliferację, różnicowanie i aktywność limfocytów T, limfocytów B, komórek NK i LAK [9]. Wywiera działanie immunomodulujące również poprzez regulację wydzielania innych cytokin np. interleukin (IL-1, IL-6), czynnika martwicy nowotworów (TNFb) czy płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) [10]. Jest potencjalnym inhibitorem proliferacji większości komórek w organizmie, w tym komórek epitelialnych, endotelialnych i fibroblastów [11]. Jednocześnie TGF-b ma istotny wpływ na przebieg procesu zapalnego m.in. dlatego, że jest czynnikiem chemotaktycznym dla monocytów, limfocytów T, neutrofilów oraz fibroblastów. Czynnik ten jest produkowany przez praktycznie wszystkie
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa
Tabela I. Ekspresja mRNA TGFb-1 i receptorów TGFb-RI, TGFb-RII i TGFb-RIII w polipach nosa i w prawidłowej błonie śluzowej TGFbRI Liczba TGFbRII Liczba TGFbRIII Liczba Lp. Wiek Płeć Typ Astma TGFb1 Liczba tkanki
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
21 33 24 24 49 38 51 45 52 53 34 53 58 74 61 41 28 16 79 53 59 76 59 46 36 54 48 50 75 52
M K M M K M M M M K M M M M M M K M K M M M K M M K K K M M
K K K K K K K K E E E E E E E E E E E E E E E E N N N N N N
+ +
+ + +
+ + + + +
kopii mRNA na 1 mg RNA 231810 4285 43676 3356 42385 27590 19931 3224 5190 0 1418 2072 0 2139 1236 37445 3729 0 0 0 5801 1908 0 16975 2713 0 0 1132 4641 1104
kopii mRNA na 1 mg RNA 17165 2819 25298 98685 76132 66767 129604 64321 99282 26718 43834 672 113536 56877 112574 24793 85608 3663 52453 2613 112020 84845 58694 66442 24616 9084 7691 108172 38836 37678
kopii mRNA na 1 mg RNA 30574 1401 13269 3952 22352 31603 7082 2070 3782 2357 3377 3626 252 2206 11688 2265 6795 4976 5716 4506 5368 1388 1918 17537 6471 755 981 2719 2834 2752
kopii mRNA na 1 mg RNA 13178 2936 8348 3466 9177 11659 12518 2983 8784 7860 7636 8204 928 13380 11741 7526 13644 3966 3142 9368 3497 3140 9577 6021 7405 3432 3708 3932 8048 5305
K - grupa kontrolna; E - polipy eozynofilowe; N - polipy neutrofilowe
Tabela II. Porównanie ekspresji TGFb-1 i jego receptorów w polipach nosa w zależności od płci, obecności astmy i liczby polipektomii. Liczba kopii mRNA badanych genów x 103 na 1 mg RNA wyrażonych jako mediana i wartość min-max Charakterystyka TGFb-1 P TGFb RI P TGFb RII P TGFb RIII P płeć
m f
Astma
obecna Nieobecna
Liczba polipektomii
N=1 N ≥2
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
2,1 (0–37,4) 0 (0–3,7) 2,4 (0–37,4) 1,4 (0–5,8) 0,6 (0–37,4) 1,9 (0–17)
0,027
0,526
0,772
50,3 (0,7 –113,5) 52,4 (7,7–108,2) 55,6 (9,1–108,2) 43,8 (0,7-113,5) 55,2 (2,6–113,5) 52,4 (0,7–108,2)
0,881
0,573
0,664
3,7 (0,2 – 17,5) 2,3 (0,7–6,8) 2,8 (0,7–17,5) 3,6 (0,2–11,7) 3,4 (0,2–11,7) 3,4 (1,4–17,5)
0,296
0,944
0,664
7,6 (0,9 – 13,4) 3,9 (3,1–13,6) 7,7 (3,1–13,6) 7,4 (0,9–13,4) 5,6 (0,9–13,6) 7,6 (3,1–13,4)
0,709
0,67
0,772
947
B. Rostkowska-Nadolska i inni
Ryc. 1. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGF-b1 w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (* p<0,05; # NS, test T-Studenta)
Ryc. 3. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGFb RII w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (# NS, test T-Studenta)
Ryc. 2. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGFbRI w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (# NS, test T-Studenta)
Ryc. 4. Porównanie aktywności transkrypcyjnej genu TGFbRIII w tkankach polipów eozynofilowych, neutrofilowych i prawidłowej błonie śluzowej nosa (# NS, test T-Studenta)
typy komórek (płytki krwi, limfocyty, monocyty, fibroblasty) w formie nieaktywnej, związanej z białkami LAP (latency-associated peptide) i LTBP (latent TGF-beta-binding protein), który po uwolnieniu może przyłączać się do receptora [12, 13]. Aktywność biologiczną cytokiny determinują występujące na powierzchni komórek specyficzne receptory białkowe TGFb typu I (TGFbRI), typu II (TGFbRII) [14], zawierające kinazę serynowo-treoninową oraz typu III (TGFbRIII, betaglikan) [15]. Rozpoczęcie sygnału transdukcji jest możliwe tylko podczas stymulacji TGFbRI. Aktywny TGF-b zostaje bezpośrednio związany przez TGFbRII lub przez TGFbRIII, który prezentuje cytokinę receptorowi typu II i dopiero wtedy łączy się z TGFbRII. W następnym etapie do kompleksu TGF-b1/TGFbRII następuje przyłączenie i aktywacja TGFbRI [16]. Wyznaczona w naszych badaniach wysoka, dodatnia korelacja pomiędzy poziomem mRNA TGF-b1 i mRNA TGFbRII może wynikać z mechanizmu działania cytokiny.
TGF-b1 indukuje in vitro proenzym MMP-2 i MMP-9 [17]. Stwierdzono również wpływ MMP-2 i MMP-9 na mechanizm aktywacji formy nieaktywnej TGF-b1 [18]. Lee i wsp. [19] wykorzystując metodę ELISA (enzyme like immunosorbent assay) wyznaczyli poziom białek TGF-b1, ECP, MMP-2, MMP-9 i TIMP-1 w tkance polipów nosowych, wykazując znaczącą korelację pomiędzy ekspresją TGF-b1 a MMP-2, MMP-9 i ECP. Autorzy sugerują, że TGF-b1 i MMP-2 oraz MMP-9 mogą przyczyniać się do migracji eozynofilów i mastocytów do zewnątrzkomórkowej matrix tkanki polipów nosowych. Obecnie uważa się, że TGF-b pełni istotną rolę w oddziaływaniu na zewnątrzkomórkową macierz, nasilając i stymulując transkrypcję i wydzielanie większości jej składników (kolagen, fibronektyna), a także powodując zwłóknienie i nasilając aktywność fibroblastów i myofibroblastów. Zależność między obecnością myofibroblastów i ekspresją TGFb wykazali Wang i wsp. [20]. Głównym źródłem TGF-b1 w tkance poli-
948
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
Profil ekspresji genów kodujących TGF-b1 i jego receptory TGFbRI, TGFbRII i TGFbRIII w polipach nosa
pów nosowych są naciekające eozynofile [4, 5, 21]. Zespół Coste’a wykazał wzrost poziomu ekspresji takich czynników wzrostu jak PDGF (platelet-derived growth factor) i VEGF (vascular endothelial growth factor) w hodowli komórek epitelialnych z polipów nosa po stymulacji TGF-b1. Według autorów TGF-b wpływa na inne czynniki wzrostu kontrolujące proliferację komórek epielialnych w polipach nosa [10]. W innych badaniach Coste i wsp. oznaczali metodą immunohistochemiczną ekspresję izoform TGF-b 13 w tkankach prawidłowej błony śluzowej, zmienionej zapalnie błony śluzowej oraz w polipach nosa. Ekspresja izoform TGF-b w polipach nosa i zmienionej zapalnie błonie śluzowej była wyższa niż w zdrowej błonie śluzowej, a TGF-b1 był izoformą dominującą. TGF-b1 obecny był również w makrofagach i eozynofilach [22]. Hirschberg i wsp. uzyskali odmienne wyniki badań, oznaczając metodą ELISA stężenie białka TGF-b1 w polipach nosa pobranych od pacjentów atopowych i nieatopowych oraz w prawidłowej błonie śluzowej nosa. Poziom ekspresji TGF-b1 w prawidłowej błonie śluzowej nosa był znacząco wyższy niż w tkankach polipów. Natomiast polipy atopowe i nieatopowe nie wykazywały różnej ekspresji TGF-b. Autor sugeruje, że może to być spowodowane aktywacją mechanizmów powodujących krótkotrwałość utajenia TGF-b1 [23]. Lee i wsp. wykorzystując metodę RT-PCR wyznaczyli ekspresję mRNA TGF-b we wszystkich badanych tkankach polipów nosa (n-14), natomiast w prawidłowej błonie śluzowej ekspresja była dodatnia w 3 wycinkach na 6 badanych [24]. Bradley i Kountakis [25] techniką RT-PCR w czasie rzeczywistym oznaczali TGF-b w wycinkach błony śluzowej pobranej z zatok od pacjentów z przewlekłym zapaleniem bez polipów (CRS) i z polipami (CRS/ NP). Stwierdzili oni wyższą ekspresję w tkankach u pacjentów z polipami. Wyniki naszych badań wykonanych również techniką RT-PCR w czasie rzeczywistym wykazały istotnie wyższą ekspresję mRNA TGF-b1 w prawidłowej błonie śluzowej w porównaniu do tkanek polipów zarówno eozynofilowych, jak neutrofilowych i są zgodne z badaniami zespołu Hirschberga. Efekt działania TGF-b zależy od jego receptorów. Wysoki poziom ekspresji mRNA dla receptorów TGFbRI-III w badanych tkankach, określa gotowość do transdukcji TGFb. Nasuwa to przypuszczenie, że mniejsza ekspresja TGF-b1 w tkance polipów w naszych badaniach może być związana z obecnością innej izofromy niż TGF-b1. Potwierdzałyby to badania Eismy i wsp., [21] którzy stosując metody immunohistochemiczne wykazali
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6
w tkankach polipów nosowych wyższą ekspresję izoformy TGF-b2 w porównaniu do prawidłowej błony śluzowej. Izoforma TGF-b1 podobnie jak w naszych badaniach występowała w tkankach polipów w mniejszych ilościach niż w prawidłowej błonie śluzowej. Niska ekspresja TGF-b1 w tkance polipów może również stymulować proliferację m.in. fibroblastów, co wynika z jego znanych właściwości pobudzania proliferacji komórek w małych stężeniach, a hamowania w dużych stężeniach [26]. Podsumowanie: Przypuszcza się, że TGF-b odgrywa ważną rolę w inicjacji procesów prowadzących do powstania PN. Obecna praca wykazała specyficznie niską ekspresję mRNA izoformy TGFb1 w tkankach polipów nosa zarówno eozynofilowych jak i neutrofilowych w porównaniu do prawidłowej błony śluzowej. Stwierdziliśmy wysoki poziom ekspresji mRNA receptorów TGFbRI-III w badanych tkankach polipów i błony śluzowej. Ze względu na regulacyjną rolę TGF-b1 w procesach zapalnych, jego niskie stężenie w tkankach polipów nosa, może mieć wpływ na migrację i przeżycie komórek zapalnych. To z kolei może przyczyniać się do niekorzystnego pogłębiania procesu powstawania polipów. Problem ten wymaga dalszych badań w celu dokładnego poznania roli poszczególnych izoform TGF-b i innych czynników wzrostu w patogenezie NSP i ich oddziaływania z lokalnymi cytokinami. Może się to przyczynić się do opracowania bardziej skutecznych i specyficznych rodzajów terapii PN.
PIŚMIENNICTWO 01. Pawankar R. Nasal polyps: an update: editorial review. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003; 3: 1–6. 02. Serpero L, Petecchia L, Sabatini F, Giuliani M, Silvestri M, Di Blasi P, i wsp. The effect of transforming growth factor (TGF)beta1 and (TGF)-beta2 on nasal polyp fibroblast activities involved upper airway remodeling: modulation by fluticasone propionate. Immunol Lett 2006; 105: 61–67. 03. Letterio JJ. Murine models define the role of TGFb as a master regulator of immune cell function. Cytokine Growth Factor Rev 2000; 11: 81–87. 04. Ohno L, Lea RG, Flanders KC, Clark DA, Banwatt D, Dolowich J, i wsp. Eosinophils in chronically inflamed human upper airway tissues express transforming growth factor b1 gene (TGFb1). J Clin Invest 1992; 89: 1662–1668. 05. Elovic A, Wong DT, Weller PF, Matossian K, Galli SJ. Expression of transforming growth factor-a and -b1 messenger RNA and product by eosinophils in nasal polyps. J Allergy Clin Immunol 1994; 93: 864–869.
949
B. Rostkowska-Nadolska i inni
06. Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 2000; 25: 169–193. 07. Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 2002; 29: 23–39. 08. Valasek MA, Repa JJ. The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ 2005; 29: 151–159. 09. Schmidt-Weber CB, Blaser K. Regulation and role of transforming growth factor-beta in immune tolerance induction and inflammation. Curr Opin Immunol 2004; 16: 709–716. 10. Coste A, Brugel L, Maitre B, Boussat S, Papon JF, Wingerstmann L, i wsp. Inflammatory cells as well as epithelial cells in nasal polyps express vascular endothelial growth factor. Eur Respir J 2000; 15: 367–372. 11. Huang SS, Huang JS. TGF-beta control of cell proliferation. J Cell Biochem 2005; 96: 447–462. 12. Penttinen C, Saharinen J, Weikkolainen K, Hyytiainen M, Keski-Oja J. Secretion of human latent TGF-beta-binding protein-3 (LTBP-3) is dependent on co-expression of TGF-beta. J Cell Sci 2002; 115: 3457–3468. 13. Pociask DA, Sime PJ, Brody AR. Asbestos-derved reactive oxygen species activate TGF-beta1. Lab Invest 2004; 84: 1013–1023. 14. Bollard CM, Rossig C, Calonge MJ, Huls MH, Wagner HJ, Massague J, i wsp. Adapting a transforming growth factor beta-related tumor protection strategy to enhance anti-tumor immunity. Blood 2002; 99: 3179–3187. 15. Esparza-Lopez J, Montiel JL, Vilchis-Landeros MM, Okadome T, Miyazono K, Lopez-Casillas F. Ligand binding and functional properties of betaglycan, a co-receptor of the transforming growth factor-beta super-family. Specialized binding regions for transforming growth factor-beta and inhibin. J Biol Chem 2001; 276: 14588–14596. 16. Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell 2003; 113: 685–700. 17. Sehgal I, Thompson TC. Novel regulation of type IV collagenase (matrix metallo proteinase-9 and -2) activities by transforming growth factor b1 in human prostate cancer cell lines. Mol Biol Cell 1999; 10: 407–416. 18. Yu Q. Stamenkovic I: Cell surface – localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGFb and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev 1999; 14: 163–176.
950
19. Lee Y-M, Kim S-S, Kim H-A, Suh Y-J, Lee S-K, Nahm D-H, i wsp. Eosinophil inflammation of nasal polyp tissue: relationships with matrix metalloproteinases, tissue inhibitor of metalloproteinase-1, and transforming growth factor-b1. J Korean Med Sci 2003; 18: 97–102. 20. Wang QP, Escudier E, Roudot-Thoraval F, Abd-Al Samad I, Peynegre R, Coste A. Myofibroblast accumulation induced by transforming growth factor-b is involved in the pathogenesis of nasal polyps. Laryngoscope 1997; 107: 926–931. 21. Eisma RJ, Allen JS, Lafreniere D, Leonard G, Kreutzer DL. Eosinophil expression of Transforming Growth Factor Beta and ist receptor in nasal polyposis: role of the cytokines in this disease process. Am J Otolaryngol 1997; 18: 405–411. 22. Coste A, Lefaucheur JP, Wang QP, Lesprit E, Poron F, Peynegre R, i wsp. Expression of the Transforming Growth Factor b isoforms in inflammatory cells of nasal polyps. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1998; 124: 1361–1366. 23. Hirschberg A, Jokuti A, Darvas Z, Almay Z, Repassy G, Falus A. The pathogenesis of nasal polyposis by immunoglobulin E and interleukin-5 is completed by transforming growth factorbeta 1. Laryngoscope 2003; 113: 120–124. 24. Lee CH, Rhee CS, Min YG. Cytokine gene expression in nasal polyps. Ann Otol Rhinol Laryngol 1998; 107: 665–670. 25. Bradley DT, Kountakis SE. Role of interleukins and transforming growth factor b in chronic rhinosinusitis and nasal polyposis. Laryngoscope 2005; 115: 684–686. 26. Zhao Y, Young SL. Requirement of transforming growth factor-beta (TGF-beta) type II receptor for TGF-beta-induced proliferation and growth inhibition. J Biol Chem 1996; 271: 2369–2372.
Adres autora: Beata Rostkowska-Nadolska Klinika Otolaryngologii AM ul. Chałubińskiego 2 50-368 Wrocław tel. (071) 78 42 75, faks: (071) 32 70 950 e-mail: [email protected] Pracę nadesłano: 16.05.2007 r.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 6