- Email: [email protected]
Promieniowanie jonizujące jako czynnik wspomagający różnicowanie komórek macierzystych
Dostępne online www.sciencedirect.com
ScienceDirect Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61 www.elsevier.com/locate/onko
Praca poglądowa/Literature Review
Promieniowanie jonizujące jako czynnik wspomagający różnicowanie komórek macierzystych Stem cells differentiation and ionizing radiation Wiktoria M. Suchorska *, Adam A. Mieloch Pracownia Radiobiologii, Zakład Fizyki Medycznej, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Poznań, Polska Otrzymano: 25.05.2015; Zaakceptowano: 10.09.2015 Dostępne online: 14.09.2015
Abstract Efficient stem cell differentiation is considered to be the future of regenerative medicine. Pursuing the most productive method of directed differentiation has been the subject of numerous studies, resulting in the development of many effective protocols. However, the necessity for further improvement in differentiation efficiency remains. This review contains a description of molecular processes underlying the response of stem cells to ionizing radiation, indicating its potential application in differentiation procedures. In the first part, the radiation-induced damage response in various types of stem cells is described. Second, the role of the p53 protein in embryonic and adult stem cells is highlighted. Last, the hypothesis on the mitochondrial involvement in stem cell development including its response to ionizing radiation is presented. In summary, subjecting cells to the appropriate dosage of ionizing radiation may become a useful method for enhancing directed differentiation in certain stem cell types. © 2015 Wielkopolskie Centrum Onkologii. Published by Elsevier Sp. z o.o. All rights reserved. Słowa kluczowe: komórki macierzyste; różnicowanie; promieniowanie jonizujące; medycyna regeneracyjna; inżynieria tkankowa Keywords: Stem cells; Differentiation; Ionizing radiation; Regenerative medicine; Tissue engineering
1. Wstęp Komórki macierzyste (SC; stem cells) mają szereg unikatowych właściwości, takich jak np. zdolność do nieograniczonej proliferacji oraz do różnicowania w wiele typów komórek (pluripotencja). Odgrywają one kluczową rolę w rozwoju i utrzymaniu prawidłowej struktury tkanek. SC uzupełniają pulę komórek, które zostały uszkodzone lub uległy fizjologicznej apoptozie [1]. Wiele badań skupia się wokół dwóch typów SC: embrionalnych komórek macierzystych (ESC; embryonic stem cells) oraz somatycznych komórek macierzystych (SSC; somatic stem cells), zwanych też dorosłymi komórkami macierzystymi [2]. ESC pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty i mają zdolność do różnicowania w trzy listki zarodkowe: ektodermę, mezodermę i endodermę, zatem dają początek niemal wszystkim typom komórek. SSC znajdują się w swoistych dla danej tkanki niszach i przebywają w stanie uśpienia. Gdy dojdzie do ich aktywacji, przechodzą podział asymetryczny, który równocześnie zwiększa liczbę komórek macierzystych niszy i liczbę komórek tkankowo specyficznych. Komórki progenitorowe tkanki ulegają dalszemu różnicowaniu, uzupełniając pulę komórek danego narządu [3,4].
* Adres do korespondencji: Pracownia Radiobiologii, Zakład Fizyki Medycznej, Wielkopolskie Centrum Onkologii,ul. Garbary 15, 61-866 Poznań, Polska. Tel.: +48 618 850 477. Adres email: [email protected] (W.M. Suchorska). http://dx.doi.org/10.1016/j.onko.2015.09.002 1734-0489/© 2015 Wielkopolskie Centrum Onkologii. Published by Elsevier Sp. z o.o. All rights reserved.
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
55
SC mają znaczący wpływ na rozwój wielu gałęzi biotechnologii, w tym na wprowadzenie terapii regeneracyjnych z wykorzystaniem komórek, testowanie i screening leków, modelowanie chorób, analizę efektów ubocznych radioterapii i wiele innych. W 2006 roku Yamanaka i wsp. opublikowali rezultaty pracy, w której opisali proces reprogramowania mysich dorosłych fibroblastów w indukowane komórki macierzyste (iPS; induced pluripotent stem cells) za pomocą czterech czynników transkrypcyjcnych: Oct3/4 (octamer-binding transcription factor 3/4), Sox2 (sex determining region Y-box 2), c-Myc i Klf4 (Kruppel-like factor 4). iPS są funkcjonalnie i strukturalnie zbliżone do ESC [5]. To przełomowe odkrycie rozwiązało wiele etycznych sporów dotyczących pozyskiwania ESC z ludzkich zarodków i zainicjowało badania nad klinicznym wykorzystaniem iPS. Intensywne badania nad ukierunkowanym różnicowaniem komórek pluripotentnych pozwoliły na opracowanie skutecznych protokołów różnicujących [6,7]. Niektóre z nich wymagają przejściowego utworzenia ciał embrionalnych (EB; embryoid bodies). EB można uzyskać zarówno z iPS, jak i ESC. EB składają się z komórek macierzystych, które w większości uległy zróżnicowaniu do jednego z trzech listków zarodkowych [8]. Obecnie wiele terapii z wykorzystaniem komórek macierzystych znajduje się na etapie badań klinicznych. Intravenous Stem Cells After Ischemic Stroke, Human Neural Stem Cell Transplantation in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) czy Treatment of Knee Osteoarthritis by Intra-articular Injection of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells [9–11] to zaledwie kilka z zarejestrowanych w światowej bazie danych ClinicalTrials.gov badań dotyczących potencjalnego wykorzystania komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. Wskazuje to na rosnącą potrzebę opracowania skutecznych metod ukierunkowanego różnicowania. Promieniowanie jonizujące (PJ) jest jednym z podstawowych narzędzi wykorzystywanych w terapii nowotworów [12]. Odpowiedź komórek somatycznych na PJ jest od dawna przedmiotem intensywnych badań, dlatego też wiele z mechanizmów molekularnych biorących udział w tym procesie zostało dokładnie wyjaśnionych [13–15]. Jednakże odpowiedź komórek macierzystych na PJ nie jest bezpośrednią ekstrapolacją wyników uzyskanych dla komórek somatycznych. Różnicowanie wywołane działaniem PJ zostało opisane wcześniej [16,17]. Niemniej, mechanizm wspomagania różnicowania komórek macierzystych przez PJ nie został jeszcze dokładnie poznany. Celem tej pracy jest wskazanie naukowych przesłanek sugerujących działanie PJ jako jednej z potencjalnych metod zwiększenia efektywności różnicowania komórek macierzystych. 2. Odpowiedź komórek macierzystych na uszkodzenia DNA Uszkodzenie genomowego DNA wywołane PJ uruchamia kaskadę reakcji biochemicznych mających na celu naprawę uszkodzeń lub eliminację komórki w przypadku braku możliwości naprawy. Funkcjonalność tego mechanizmu jest kluczowa w utrzymaniu stabilności genetycznej. Najbardziej niebezpieczne dla komórki są dwuniciowe pęknięcia DNA, które dominują w przypadku ekspozycji na PJ lub wolne rodniki. Naprawa dwuniciowych pęknięć odbywa się poprzez dwa główne szlaki: homologiczną rekombinację (HR; homologous recombination) i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ; non-homologous end joining) [18]. W procesie HR chromatydy siostrzane wykorzystywane są jako matryca, dlatego też ten typ naprawy cechuje się niską częstością wprowadzania błędów. NHEJ nie wykorzystuje siostrzanych chromatyd, w związku z czym jest zdecydowanie bardziej podatny na wprowadzanie błędów. Typ odpowiedzi dominującej zależy od fazy cyklu komórkowego [19]. Wymóg obecności chromatyd siostrzanych ogranicza HR do fazy S i G2 cyklu komórkowego. NHEJ dominuje w pozostałych fazach cyklu. Do mechanizmów naprawy DNA zalicza się także naprawę przez wycinanie nukleotydów, naprawę przez wycinanie zasady i naprawę niesparowanych zasad. Jednak w kontekście pobudzania różnicowania indukowanego PJ procesy te wydają się być mniej istotne i z tego względu nie zostaną opisane w niniejszym artykule. 2.1. Naprawa uszkodzeń DNA w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) Udowodniono, że mechanizm naprawy DNA w ESC jest zdecydowanie bardziej wydajny w porównaniu z innymi typami komórek [20]. ESC wykazują wyjątkową strukturę cyklu komórkowego. Faza G1 jest znacznie skrócona, a przejście z fazy G1 do fazy S jest ułatwione, co w efekcie przyspiesza podziały komórkowe. Większość populacji ESC znajduje się w fazach cyklu, w których obecne są chromatydy siostrzane. Dzięki temu dominującym mechanizmem naprawy podwójnoniciowych uszkodzeń DNA jest HR [21]. ESC są źródłem komórek służących do budowy całego organizmu, dlatego też wysoka skuteczność naprawy uszkodzeń DNA jest niezbędna do utrzymania stabilności genetycznej. W przypadku wystąpienia nienaprawialnych uszkodzeń genomowego DNA komórka przechodzi apoptozę. Uruchomienie apoptozy w ESC jest znacznie uproszczone dzięki mechanizmowi tzw. mitochondrialnego primingu [22]. Polega on na zmianie stężenia białek anty- i proapototycznych rodziny Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), co ułatwia inicjację apoptozy. W efekcie indukcja apoptozy zachodzi na skutek stymulacji bodźcami proapoptotycznymi słabszymi, niż ma to miejsce w przypadku komórek zróżnicowanych. Celem tego zjawiska jest eliminacja niestabilnych genetycznie komórek, co zapobiega przekazywaniu mutacji komórkom potomnym.
56
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
Badania przeprowadzone przez Sokolov i Naumann wykazały, że ESC ulegają apoptozie przy stosunkowo niskich dawkach PJ. Powyżej dawki 1,0 Gy obserwowano masywną apoptozę w populacji ESC [23]. W doświadczeniu przeprowadzonym przez Lan i wsp. dawka 2,0 Gy promieniowania X spowodowała spadek przeżywalności ESC o 60% 5 dni po napromienianiu. W tym samym doświadczeniu wykazano popromienny wzrost aktywności metabolicznej (test XTT) ESC wynoszący odpowiednio 150% po dawce 2,0 Gy i 250% po dawce 5,0 Gy. Podanie dawek 2,0 i 5,0 Gy spowodowało również znaczący wzrost stężenia reaktywnych form tlenu i azotu do tygodnia po ekspozycji [24]. 2.2. Naprawa uszkodzeń DNA w somatycznych komórkach macierzystych (SSC) Radiowrażliwość SSC różni się znacząco w zależności od ich typu i etapu rozwoju. Spadek wydajności naprawy uszkodzeń DNA koreluje ze stopniem zróżnicowania. Dlatego też bardziej zróżnicowane SSC wykazują mniejszą wydajność naprawy uszkodzeń DNA w porównaniu z mniej zróżnicowanymi ESC [25]. Mechanizm odpowiedzi SSC na uszkodzenia DNA jest inny od zaobserwowanego w ESC [26]. SSC przebywają głównie w stanie uśpienia w fazie G0 cyklu komórkowego. Spowolniony cykl komórkowy skutkuje obniżoną radiowrażliwością [27,28]. W związku z tym, pomimo mniejszej wydajności naprawy uszkodzeń DNA, SSC cechują się mniejszą radiowrażliwością niż szybko dzielące się ESC. Udowodniono, że na skutek uszkodzeń DNA SSC mogą opuścić stan uśpienia i przejść w fazę G1 cyklu komórkowego, w którym przeprowadzana jest naprawa za pomocą niedokładnego mechanizmu NHEJ [29]. W konsekwencji SSC są bardziej podatne na akumulację mutacji i przekazywanie ich komórkom potomnym. W 1996 roku Schwenke i wsp. wykazali, że poddanie mysich erytroidalnch komórek progenitorowych działaniu promieniowania gamma powoduje stymulację różnicowania. Zaobserwowany wzrost wydajności różnicowania był efektem ominięcia cyklu mitotycznego, co jest niezbędne w komórkach progeniotorowych do przejścia końcowej fazy różnicowania [16]. Ponadto w innych badaniach stwierdzono, że podwójnoniciowe pęknięcia DNA hamują podziały komórkowe i stymulują różnicowanie neuronalnych komórek macierzystych przy udziale białka p53 [30]. 3. Rola białka p53 w komórkach macierzystych Białko p53 jest przedmiotem wielu badań, jednak ze względu na złożoność interakcji i różnorodność procesów molekularnych, w których bierze udział, nie wszystkie jego właściwości zostały poznane [31]. p53 jest białkiem supresorowym odpowiedzialnym za indukcję odwracalnego zatrzymania cyklu komórkowego, które umożliwia przeprowadzenie naprawy uszkodzeń DNA lub zainicjowanie apoptozy, jeśli naprawa jest niemożliwa. p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który wskutek aktywacji wiąże się do promotorów genów docelowych, indukując lub hamując ich transkrypcję [32]. p53 indukuje apoptozę za pomocą dwóch szlaków: transkrypcyjnego (wewnętrznego), który przebiega tak, jak opisano wcześniej, i nietranskrypcyjnego (mitochondrialnego), poprzez bezpośrednie interakcje z białkami pro- i antyapoptotycznymi. Genami docelowymi dla jego proapoptotycznej aktywności są geny kodujące białka z rodziny Bcl-2, takie jak Puma ( p53 upregulated modulator of apoptosis) i Bax (Bcl-2-associated X protein) [33]. Uszkodzenia DNA powodują aktywację białka ATM (ataxia telangiectasia mutated), które następnie prowadzi do poliubikwitynylacji i degradacji białka Mdm2 (mouse double minute 2 homolog). Białko Mdm2 jest onkoproteiną, która przeprowadza poliubikwitynylację i degradację białka p53 w proteasomach 26S. Dlatego też degradacja białka Mdm2 skutkuje zwiększeniem stężenia białka p53. Warto wspomnieć, że istnieją również inne mechanizmy regulacji stężenia p53. p53 reguluje także proliferację komórek poprzez kontrolę ekspresji białka p21 działającego jako inhibitor kinaz zależnych od cyklin [34]. Udowodniono, że wyciszenie ekspresji białka p53 zwiększa wydajność reprogramowania w procesie uzyskiwania iPS, co wskazuje na jego udział w podtrzymaniu stanu zróżnicowania [35]. 3.1. Rola białka p53 w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) Wykazano, że białko p53 gromadzi się w niskich stężeniach w jądrze komórkowym ESC w nieaktywnej, zdeacetylowanej formie. Jak już wspomniano, p53 odpowiada również za regulację proliferacji poprzez kontrolę ekspresji białka p21 będącego inhibitorem kinaz zależnych od cyklin. p21 hamuje aktywność kompleksu cyklina/CDK2, co skutkuje wstrzymaniem cyklu komórkowego. Dolezalova i wsp. wykazali, że po napromienieniu EKB promieniowaniem UVC, mRNA białka p21 jest obecne, jednak jego translacja jest blokowana przez różne mPJNA [36]. Z drugiej strony, doświadczenie przeprowadzone przez Maimets i wsp. udowodniło, że Nutlina, będąca aktywatorem p53, zwiększa stężenie białka p21 w ESC [37]. W związku z tym rola białka p21 w szlaku p53 pozostaje nie do końca wyjaśniona. p53 odgrywa ważną rolę w różnicowaniu ESC. Wykazano, że spontaniczne różnicowanie zachodzi znacznie rzadziej, gdy poziom p53 jest niski [38]. Jednakże jednym z najbardziej kluczowych mechanizmów przemawiających za słusznością teorii wspomaganego różnicowania jest redukcja ekspresji czynników pluripotencji powodowana aktywnością p53. Białko p53 bezpośrednio wiąże się z promotorem genu NANOG i Oct3/4, hamując ich transkrypcję. Ponadto, podwyższony poziom
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
57
białka p53 indukuje ekspresję markerów różnicowania, takich jak GATA4 i GATA6 [37]. p53 indukuje również ekspresję mPJ-34a i mPJ-145, które, hamując translację czynników pluripotencji Oct3/4, Klf4, Lin-28A ( protein lin-28 homolog A) i SOX2, stymulują różnicowanie [39]. Kwas retinowy jest powszechnie stosowanym czynnikiem różnicującym, m.in. w powstawaniu komórek neuronalnych, kardiomiocytów czy chondrocytów [40–42]. W warunkach fizjologicznych kwas retinowy hamuje ekspresję NANOG. Nie zaobserwowano tego efektu w komórkach z delecją genu p53 [43]. To sugeruje współdziałanie tych białek w indukcji różnicowania. Należy również wspomnieć, że p53 może także hamować różnicowanie poprzez szlak przekazywania sygnału Wnt, który odpowiada za podtrzymanie i proliferację ludzkich oraz mysich ESC [44,45]. 3.2. Rola białka p53 w somatycznych komórkach macierzystych (SSC) Poznano wiele typów somatycznych komórek macierzystych specyficznych dla danego organu. Każdy typ SSC daje początek innym liniom komórkowym, dlatego też przesłanki przemawiające za stymulującym działaniem promieniowania jonizującego mogą być prawdziwe tylko w niektórych przypadkach. W celu udowodnienia tego stwierdzenia, w dalszej części opisano właściwości białka p53 w neuronalnych komórkach macierzystych (NSC; neural stem cells), hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC; hematopoietic stem cells) i komórkach macierzystych gruczołu sutkowego (MaSC; mammary stem cells). 3.2.1. Neuronalne komórki macierzyste (NSC) Neuronalne komórki macierzyste mogą ulec różnicowaniu do neuronów, astrocytów i oligodendrocytów. U dorosłych neurogeneza centralnego układu nerwowego zaczyna się w strefie podkomorowej (SP) i strefie podziarnistej zakrętu zębatego hipokampu, które pełnią funkcję niszy dla NSC. SP jest wąską strefą tkanki ściany komory bocznej przedmózgowia [46]. Proliferacja tkanki neuronalnej jest procesem dwuetapowym. W pierwszym etapie produkowana jest duża populacja komórek progenitorowych. W drugim cześć komórek przechodzi dalsze różnicowanie, podczas gdy reszta ulega apoptozie. Wykazano, że neuronalne komórki progenitorowe myszy p53-/- charakteryzuje znacząco wyższa proliferacja w porównaniu z komórkami typu dzikiego. NSC mogą być utrzymywane w hodowli w postaci agregatów zwanych neurosferami. NSC p53-/- formują większe neurosfery niż komórki typu dzikiego, jednak jest to spowodowane zwiększeniem liczby komórek, a nie ich rozmiarów. To doświadczenie wykazało, że jedną z funkcji białka p53 w NSC jest zahamowanie ich nadmiernej proliferacji [47]. Wykazano, że poddanie NSC promieniowaniu gamma powoduje wzrost wydajności różnicowania. Komórki poddane napromienianiu dawką 10,0 Gy cechowały się zwiększonym poziomem zróżnicowania w porównaniu z komórkami poddanymi działaniu dawki 2,0 Gy i komórkami grupy kontrolnej. Warto również zaznaczyć, że stosunek astrocytyów do oligodendrocytów pozostał niezmieniony [48]. Jak wspomniano wcześniej, p53 oddziałuje również za pośrednictwem szlaku sygnałowego Wnt. Wykazano, że szlak sygnalny Wnt/b-katenina odgrywa istotną role w proliferacji i różnicowaniu NSC hipokampu. We wspomnianym doświadczeniu niskie dawki promieniowania jonizującego (0,3 Gy) spowodowały aktywację szlaku Wnt/b-katenina. W rezultacie, NSC poddane napromienianiu cechował zwiększony poziom proliferacji i zróżnicowania przy jednoczesnym spadku liczby apoptoz in vivo. Co więcej, w behawioralnym teście labiryntu wodnego udowodniono zwiększone zdolności uczenia się myszy poddanych napromienianiu niskimi dawkami PJ, w porównaniu z myszami nienapromienionymi [49]. 3.2.2. Komórki macierzyste gruczołu sutkowego (MaSC) Komórki macierzyste gruczołu sutkowego mają zdolność do różnicowania się we wszystkie typy komórek epitelialnych charakterystyczne dla tego gruczołu. MaSC odpowiadają również za rozwój gruczołu sutkowego w okresie dojrzewania i w czasie ciąży [50]. W hodowli in vitro MaSC mają postać pływających agregatów, tzw. mammosfer. Mammosfery to kuliste kolonie powstałe na skutek klonalnej proliferacji jednej komórki [51]. MsSC przechodzą głównie podziały asymetryczne, dlatego mammosfery składają się w większości z komórek bardziej zróżnicowanych, otaczających niewielką populację komórek macierzystych [52]. Jednak pomimo zdolności do dużej liczby podziałów MsSC cechują się ograniczoną żywotnością in vitro. MsSC pozyskane z myszy p53-/- wykazują wyższy potencjał proliferacyjny, na co wskazuje zwiększona liczba ASC przypadających na jedną mammosferę, jak i możliwość niegraniczonego utrzymywania ich w warunkach in vitro. To sugeruje zaangażowanie białka p53 w hamowaniu niekontrolowanej proliferacji poprzez stymulację asymetrycznych podziałów, co w efekcie prowadzi również do zwiększonego różnicowania [53]. Te wyniki są zgodne z danymi dotyczącymi mutacji genu p53 w rozwoju nowotworów piersi [54]. Ponadto, MsSC napromienione dawką 4,0 Gy wykazały 2,7-krotny wzrost zdolności do regeneracji mammosfery, potwierdzając wpływ promieniowania X na zwiększenie proliferacji [55].
58
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
3.2.3. Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) Hematopoetyczne komórki macierzyste są jednymi z najlepiej scharakteryzowanych ludzkich komórek. Od wielu lat mają zastosowanie kliniczne w leczeniu białaczek. HSC znajdują się w szpiku kostnym i dają początek wszystkim liniom komórkowym krwi. HSC różnicują się do komórek progenitorowych mieloidalnych i limfoidalnych, które mogą ulec dalszemu różnicowaniu do takich komórek, jak monocyty, erytrocyty, neutrofile, makrofagi (progenitory mieloidalne) lub limfocyty-B, -T czy komórki NK (progenitory limfoidalne). Większość HSC pozostaje nieaktywna. Niewielka, aktywna część populacji tych komórek produkuje komórkowe komponenty krwi, uzupełniając ich ewentualne braki [56]. W czasie fizjologicznej hematopoezy p53 reguluje aktywność HSC. Ponadto jest odpowiedzialne za współzawodnictwo HSC znajdujących się w niszy. Komórki cechujące się stosunkowo wysokim poziomem p53 podlegają wstrzymaniu cyklu komórkowego i starzeniu. Ten mechanizm gwarantuje utrzymanie homeostazy tkanki poprzez eliminację komórek o gorszych właściwościach. Udowodniono, że HSC poddane działaniu dawki 3,0 Gy wykazują opóźnioną naprawę podwójoniciowych pęknięć DNA i wzrost odpowiedzi apoptotycznej poprzez szlak białka APP1 (antiphagocytic protein 1). Wyniki te potwierdzają dużą radiowrażliwość HSC na PJ [57]. Pomimo tego, poddanie mysich HSC działaniu promieniowania X spowodowało prawie dwukrotny wzrost bezwzględnej liczby komórek obserwowany dwa miesiące po napromienieniu. W komórkach izolowanych od myszy p21-/- nie wykazano takiej zależności, co może sugerować istotną rolę tego białka w procesie indukcji proliferacji na skutek promieniowania [55]. 4. Mitochondria w kontekście wspomaganego różnicowania Mitochondria są dwuwarstwowymi organellami przeprowadzającymi wewnątrzkomórkowe procesy metaboliczne związane z produkcją energii w reakcji oksydacyjnej fosforylacji. Ich morfologia różni się w zależności od tkanki i jest ściśle związana z aktywnością metaboliczną danej komórki. Poza różnicami morfologicznymi wynikającymi z pochodzenia i aktywności metabolicznej, mitochondria mogą ulegać fuzji lub podziałom, tworząc mitochondria cylindryczne lub pofragmentowane. Mechanizm fuzji i podziałów jest ściśle związany z procesem proliferacji i różnicowania [58]. Należy jednak podkreślić, że efekt wywołany fuzją lub różnicowaniem jest zależny od typu komórki, w której zachodzi. W ESC mitochondria znajdują się w formie pofragmentowanej. Ich fuzja poprzedza proces różnicowania. PJ oddziałuje na mitochondria na kilka sposobów. Mitochondrialne DNA nie ma tak skutecznych mechanizmów naprawy uszkodzeń jak DNA genomowe, co sprawia, że jest ono bardziej podatne na uszkodzenia. Ponadto, nie ma ono histonów stabilizujących jego strukturę, co prowadzi do dalszego zwiększenia podatności na występowanie uszkodzeń i mutacji [59]. Zostało udowodnione, że PJ zwiększa zarówno wewnątrzkomórkowy, jak i mitochondrialny poziom wolnych rodników [60]. Jednakże to mitochondrialna produkcja reaktywnych form tlenu jest w główną przyczyną uszkodzeń komórkowych [61]. Zaburzenie funkcji mitochondriów może wywołać apoptozę, autofagię lub, w przypadku uszkodzeń mniej intensywnych, fuzję. Ten mechanizm umożliwia krzyżowe dopełnienie, w skutek którego dochodzi do wymiany składników uszkodzonych mitochondriów i podtrzymania ich aktywności [62]. Dawki od 0,005 do 5,0 Gy spowodowały odpowiednio 1,5- do 3,8krotnego wzrost masy mitochondriów, co uzasadnia zwiększenie częstości fuzji mitochondriów na skutek działania PJ [63]. W jednym z wymienionych wcześniej doświadczeń poddanie ESC działaniu PJ spowodowało wzrost stężenia reaktywnych form tlenu i równoczesny wzrost aktywności metabolicznej [24]. Oba te zjawiska odpowiadają za indukcję fuzji mitochondriów, co z kolei jest bodźcem stymulującym różnicowanie. Stąd sugerowany efekt zwiększenia wydajności różnicowania na skutek oddziaływania PJ prawdopodobnie otrzyma się przy znaczącym współudziale mitochondriów. 5. Podsumowanie Istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że promieniowanie jonizujące może być użytecznym narzędziem wykorzystywanym w ukierunkowanym różnicowaniu komórek macierzystych (Ryc. 1). PJ powoduje wiele efektów ubocznych, dlatego też nie może być stosowane jako jedyne narzędzie w procesie różnicowania. Jednak odpowiednio dobrane dawki mogą w znaczny sposób zwiększyć wydajność istniejących już protokołów otrzymywania komórek wyspecjalizowanych. Pomimo bardzo wysokiej wydajności naprawy uszkodzeń DNA w komórkach macierzystych, promieniowanie jonizujące powoduje wzrost ryzyka zachwiania stabilności genetycznej. Stąd istotne jest zdefiniowanie optymalnej dawki całkowitej przy ograniczeniu prawdopodobieństwa wystąpienia uszkodzeń. Odpowiedź komórek macierzystych na promieniowanie jonizujące zależy od ich typu. Dlatego też wysokość efektywnej dawki należy dobrać eksperymentalnie. Negatywny wpływ PJ można częściowo ograniczyć w przypadku hES przez wytworzenie EB, które charakteryzują się zmniejszoną radiowrażliwością. Ponadto różnice w odpowiedzi na PJ pomiędzy komórkami mysimi i ludzkimi wymagają potwierdzenia uzyskanych wyników także w hodowli ludzkich komórek in vitro [64]. Pomimo zatem naukowych przesłanek sugerujących prawdopodobne korzyści płynące z włączenia promieniowania jonizującego do metodologii ukierunkowanego różnicowania, koncepcja ta wymaga jeszcze wielu badań i bezpośredniego potwierdzenia jej skuteczności.
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
59
Ryc. 1. Mechanizm stymulacji różnicowania na skutek działania promieniowania jonizującego Fig. 1. The mechanism of stimulation of differentiation by the action of ionizing radiation
Wkład autorów/Authors’ contributions WS – koncepcja pracy, akceptacja ostatecznej wersji, przygotowanie literatury, pozyskanie środków. AM – zebranie i interpretacja danych, analiza statystyczna. Konflikt interesu/Conflict of interest Nie występuje. Finansowanie/Financial support Praca została sfinansowana z grantu WCO nr UMO – 27/2014 (86). Etyka/Ethics Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymi wymaganiami dla czasopism biomedycznych. Piśmiennictwo/References [1] D.L. Jones, A.J. Wagers, No place like home: anatomy and function of the stem cell niche, Nat Rev Mol Cell Biol. Nature Publishing Group 9 (2008) 11–21. [2] V. Tropepe, K. Turksen, The Ontogeny of Somatic Stem Cells. (2012) 548–550. [3] K.a Moore, I.R. Lemischka, Stem cells and their niches, Science. 311 (2006) 1880–1885. [4] K. Turksen, Adult stem cells and cardiac regeneration, Stem Cell Rev. 9 (2013) 537–540. [5] K. Takahashi, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell. 126 (2006) 663–676. [6] Y. Shi, P. Kirwan, F.J. Livesey, Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks, Nat Protoc. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved. 7 (2012) 1836–1846.
60
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
[7] X. Lian, J. Zhang, S.M. Azarin, K. Zhu, L.B. Hazeltine, X. Bao, et al., Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/b-catenin signaling under fully defined conditions, Nat Protoc. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved. 8 (2013) 162–175. [8] A.M. Bratt-Leal, R.L. Carpenedo, T.C. McDevitt, Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation, Biotechnol Prog. 25 (2009) 43–51. [9] O. Detante, Intravenous Stem Cells After Ischemic Stroke (ISIS) [Internet]. (2014). [10] A.L. Vescovi, Human Neural Stem Cell Transplantation in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) (hNSCALS) [Internet]. (2014). [11] J. Lamo-Espinosa, F. Prosper, J. Blanco, Treatment of Knee Osteoarthritis by Intra-articular Injection of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells [Internet]. (2014). [12] N. Isa, Evidence based radiation oncology with existing technology, Reports Pract Oncol Radiother. 19 (2014) 259–266. [13] K. Valerie, A. Yacoub, M.P. Hagan, D.T. Curiel, P.B. Fisher, S. Grant, et al., Radiation-induced cell signaling: inside-out and outside-in, Mol Cancer Ther. 6 (2007) 789–801. [14] H.P. Rodemann, Ma. Blaese, Responses of Normal Cells to Ionizing Radiation, Semin Radiat Oncol. 17 (2007) 81–88. [15] A.C. Paulino, L.S. Constine, P. Rubin, J.P. Williams, Normal Tissue Development, Homeostasis, Senescence, and the Sensitivity to Radiation Injury Across the Age Spectrum, Semin Radiat Oncol. Elsevier Inc. 20 (2010) 12–20. [16] K. Schwenke, H.P. Peterson, K.H. von Wangenheim, L.E. Feinendegen, Radiation-enhanced differentiation of erythroid progenitor cells and its relation to reproductive cell death, Int J Radiat Biol. 69 (1996) 309–317. [17] K.H. Von Wangenheim, H.P. Peterson, K. Schwenke, Review: a major component of radiation action: interference with intracellular control of differentiation, Int J Radiat Biol. 68 (1995) 369–388. [18] P. Fortini, C. Ferretti, E. Dogliotti, The response to DNA damage during differentiation: pathways and consequences, Mutat Res. 743–744 (2013) 160–168. [19] P. Nagaria, C. Robert, F.V. Rassool, DNA double-strand break response in stem cells: mechanisms to maintain genomic integrity, Biochim Biophys Acta. 1830 (2013) 2345–2353. [20] C.R.R. Rocha, L.K. Lerner, O.K. Okamoto, M.C. Marchetto, C.F.M. Menck, The role of DNA repair in the pluripotency and differentiation of human stem cells, Mutat Res. 752 (2013) 25–35. [21] E.D. Tichy, R. Pillai, L. Deng, L. Liang, J. Tischfield, S.J. Schwemberger, et al., Mouse embryonic stem cells, but not somatic cells, predominantly use homologous recombination to repair double-strand DNA breaks, Stem Cells Dev. 19 (2010) 1699–1711. [22] J.C. Liu, X. Guan, J.A. Ryan, A.G. Rivera, C. Mock, V. Agrawal, et al., High mitochondrial priming sensitizes hESCs to DNA-damage-induced apoptosis, Cell Stem Cell. 13 (2013) 483–491. [23] M.V. Sokolov, R.D. Neumann, Radiation-induced bystander effects in cultured human stem cells, PLoS One. 5 (2010) e14195. [24] M.L. Lan, M.M. Acharya, K.K. Tran, J. Bahari-Kashani, N.H. Patel, J. Strnadel, et al., Characterizing the radioresponse of pluripotent and multipotent human stem cells, PLoS One. 7 (2012) e50048. [25] B.R. Adams, S.E. Golding, R.R. Rao, K. Valerie, Dynamic Dependence on ATR and ATM for Double-Strand Break Repair in Human Embryonic Stem Cells and Neural Descendants, PLoS One. Public Library of Science 5 (2010) e10001. [26] C. Blanpain, M. Mohrin, P.a Sotiropoulou, E. Passegué, DNA-damage response in tissue-specific and cancer stem cells, Cell Stem Cell. 8 (2011) 16–29. [27] P.K. Mandal, C. Blanpain, D.J. Rossi, DNA damage response in adult stem cells: pathways and consequences, Nat Rev Mol Cell Biol. Nature Publishing Group; 12 (2011) 198–202. [28] L. Latella, J. Lukas, C. Simone, P.L. Puri, J. Bartek, Differentiation-induced radioresistance in muscle cells, Mol Cell Biol. 24 (2004) 6350–6361. [29] M. Mohrin, E. Bourke, D. Alexander, M.R. Warr, K. Barry-Holson, M.M. Le Beau, et al., Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis, Cell Stem Cell. 7 (2010) 174–185. [30] H. Zheng, H. Ying, H. Yan, A.C. Kimmelman, D.J. Hiller, A.-J. Chen, et al., p53 and Pten control neural and glioma stem/progenitor cell renewal and differentiation, Nature. Macmillan Publishers Limited. All rights reserved; 455 (2008) 1129–1133. [31] G. Bonizzi, A. Cicalese, A. Insinga, P.G. Pelicci, The emerging role of p53 in stem cells, Trends Mol Med. Elsevier; 18 (2014) 6–12. [32] V. Solozobova, C. Blattner, P53 in Stem Cells, World J Biol Chem. 2 (2011) 202–214. [33] S. Haupt, M. Berger, Z. Goldberg, Y. Haupt, Apoptosis - the p53 network, J Cell Sci. 116 (2003) 4077–4085. [34] J. Yu, L. Zhang, The transcriptional targets of p53 in apoptosis control, Biochem Biophys Res Commun. 331 (2005) 851–858. [35] H. Hong, K. Takahashi, T. Ichisaka, T. Aoi, O. Kanagawa, M. Nakagawa, et al., Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway, Nature. Macmillan Publishers Limited. All rights reserved; 460 (2009) 1132–1135. [36] D. Dolezalova, M. Mraz, T. Barta, K. Plevova, V. Vinarsky, Z. Holubcova, et al., MicroRNAs regulate p21(Waf1/Cip1) protein expression and the DNA damage response in human embryonic stem cells, Stem Cells. 30 (2012) 1362–1372. [37] T. Maimets, I. Neganova, L. Armstrong, M. Lako, Activation of p53 by nutlin leads to rapid differentiation of human embryonic stem cells, Oncogene. 27 (2008) 5277–5287. [38] K. Sabapathy, M. Klemm, R. Jaenisch, E.F. Wagner, Regulation of ES cell differentiation by functional and conformational modulation of p53, EMBO J. John Wiley & Sons Ltd; 16 (1997) 6217–6229. [39] A.K. Jain, K. Allton, M. Iacovino, E. Mahen, R.J. Milczarek, T.P. Zwaka, et al., p53 regulates cell cycle and microRNAs to promote differentiation of human embryonic stem cells, PLoS Biol. 10 (2012) e1001268. [40] Y. Okada, T. Shimazaki, G. Sobue, H. Okano, Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells, Dev Biol. 275 (2004) 124–142. [41] P.W. Burridge, G. Keller, J.D. Gold, J.C. Wu, Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming, Cell Stem Cell. 10 (2012) 16–28. [42] J. Kawaguchi, P.J. Mee, A.G. Smith, Osteogenic and chondrogenic differentiation of embryonic stem cells in response to specific growth factors, Bone. 36 (2005) 758–769. [43] T. Lin, C. Chao, S. Saito, S.J. Mazur, M.E. Murphy, E. Appella, et al., p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression, Nat Cell Biol. 7 (2005) 165–171. [44] G. Dravid, Z. Ye, H. Hammond, G. Chen, A. Pyle, P. Donovan, et al., Defining the Role of Wnt/b-Catenin Signaling in the Survival, Proliferation, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells. John Wiley & Sons, Ltd.; 23 (2005) 1489–1501. [45] N. Sato, L. Meijer, L. Skaltsounis, P. Greengard, A.H. Brivanlou, Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor, Nat Med. 10 (2004) 55–63.
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
61
[46] P. Taupin, F.H. Gage, Adult neurogenesis and neural stem cells of the central nervous system in mammals, J Neurosci Res. 69 (2002) 745–749. [47] A. Armesilla-Diaz, P. Bragado, I. Del Valle, E. Cuevas, I. Lazaro, C. Martin, et al., p53 regulates the self-renewal and differentiation of neural precursors, Neuroscience. 158 (2009) 1378–1389. [48] M.L. Monje, S. Mizumatsu, J.R. Fike, T.D. Palmer, Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction, Nat Med. 8 (2002) 955–962. [49] L.-C. Wei, Y.-X. Ding, Y.-H. Liu, L. Duan, Y. Bai, M. Shi, et al., Low-Dose Radiation Stimulates Wnt/b-Catenin Signaling, Neural Stem Cell Proliferation and Neurogenesis of the Mouse Hippocampus in vitro and in vivo, Curr Alzheimer Res. 9 (2012) 278–289. [50] J.E. Visvader, J. Stingl, D. Genes, Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives, Genes Dev. 28 (2014) 1143–1158. [51] M. Shackleton, F. Vaillant, K.J. Simpson, J. Stingl, G.K. Smyth, M.-L. Asselin-Labat, et al., Generation of a functional mammary gland from a single stem cell, Nature. 439 (2006) 84–88. [52] G. Dontu, W.M. Abdallah, J.M. Foley, K.W. Jackson, M.F. Clarke, M.J. Kawamura, et al., In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells, Genes Dev. 17 (2003) 1253–1270. [53] A. Cicalese, G. Bonizzi, C.E. Pasi, M. Faretta, S. Ronzoni, B. Giulini, et al., The Tumor Suppressor p53 Regulates Polarity of Self-Renewing Divisions in Mammary Stem Cells, Cell. Elsevier; 138 (2014) 1083–1095. [54] D. Ziyaie, T.R. Hupp, Thompson a M. P53 and breast cancer, Breast. 9 (2000) 239–246. [55] Insinga a, Cicalese a, M. Faretta, B. Gallo, L. Albano, S. Ronzoni, et al., DNA damage in stem cells activates p21, inhibits p53, and induces symmetric self-renewing divisions, Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2013) 3931–3936. [56] M. Kondo, A.J. Wagers, M.G. Manz, S.S. Prohaska, D.C. Scherer, G.F. Beilhack, et al., Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application, Annu Rev Immunol. 21 (2003) 759–806. [57] M. Milyavsky, O.I. Gan, M. Trottier, M. Komosa, O. Tabach, F. Notta, et al., A Distinctive DNA Damage Response in Human Hematopoietic Stem Cells Reveals an Apoptosis-Independent Role for p53 in Self-Renewal, Cell Stem Cell. Elsevier; 7 (2014) 186–197. [58] K. Mitra, Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation, Bioessays. 35 (2013) 955–964. [59] F.M. Yakes, B. Van Houten, Mitochondrial DNA damage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stress, Proc Natl Acad Sci. 94 (1997) 514–519. [60] W.W.-Y. Kam, R.B. Banati, Effects of ionizing radiation on mitochondria, Free Radic Biol Med. Elsevier; 65 (2013) 607–619. [61] E.I. Azzam, J.P. Jay-Gerin, D. Pain, Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury, Cancer Lett. Elsevier Ireland Ltd; 327 (2012) 48–60. [62] R.J. Youle, A.M. van der Bliek, Mitochondrial fission, fusion, and stress, Science. 337 (2012) 1062–1065. [63] S.M.E. Nugent, C.E. Mothersill, C. Seymour, B. McClean, F.M. Lyng, J.E.J. Murphy, Increased Mitochondrial Mass in Cells with Functionally Compromised Mitochondria after Exposure to both Direct g Radiation and Bystander Factors, Radiat Res. The Radiation Research Society; 168 (2007) 134–142. [64] C.A. Bañuelos, J.P. Banáth, S.H. MacPhail, J. Zhao, C.A. Eaves, M.D. O’Connor, et al., Mouse but not human embryonic stem cells are deficient in rejoining of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks, DNA Repair (Amst). 7 (2008) 1471–1483.
ScienceDirect Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61 www.elsevier.com/locate/onko
Praca poglądowa/Literature Review
Promieniowanie jonizujące jako czynnik wspomagający różnicowanie komórek macierzystych Stem cells differentiation and ionizing radiation Wiktoria M. Suchorska *, Adam A. Mieloch Pracownia Radiobiologii, Zakład Fizyki Medycznej, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Poznań, Polska Otrzymano: 25.05.2015; Zaakceptowano: 10.09.2015 Dostępne online: 14.09.2015
Abstract Efficient stem cell differentiation is considered to be the future of regenerative medicine. Pursuing the most productive method of directed differentiation has been the subject of numerous studies, resulting in the development of many effective protocols. However, the necessity for further improvement in differentiation efficiency remains. This review contains a description of molecular processes underlying the response of stem cells to ionizing radiation, indicating its potential application in differentiation procedures. In the first part, the radiation-induced damage response in various types of stem cells is described. Second, the role of the p53 protein in embryonic and adult stem cells is highlighted. Last, the hypothesis on the mitochondrial involvement in stem cell development including its response to ionizing radiation is presented. In summary, subjecting cells to the appropriate dosage of ionizing radiation may become a useful method for enhancing directed differentiation in certain stem cell types. © 2015 Wielkopolskie Centrum Onkologii. Published by Elsevier Sp. z o.o. All rights reserved. Słowa kluczowe: komórki macierzyste; różnicowanie; promieniowanie jonizujące; medycyna regeneracyjna; inżynieria tkankowa Keywords: Stem cells; Differentiation; Ionizing radiation; Regenerative medicine; Tissue engineering
1. Wstęp Komórki macierzyste (SC; stem cells) mają szereg unikatowych właściwości, takich jak np. zdolność do nieograniczonej proliferacji oraz do różnicowania w wiele typów komórek (pluripotencja). Odgrywają one kluczową rolę w rozwoju i utrzymaniu prawidłowej struktury tkanek. SC uzupełniają pulę komórek, które zostały uszkodzone lub uległy fizjologicznej apoptozie [1]. Wiele badań skupia się wokół dwóch typów SC: embrionalnych komórek macierzystych (ESC; embryonic stem cells) oraz somatycznych komórek macierzystych (SSC; somatic stem cells), zwanych też dorosłymi komórkami macierzystymi [2]. ESC pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty i mają zdolność do różnicowania w trzy listki zarodkowe: ektodermę, mezodermę i endodermę, zatem dają początek niemal wszystkim typom komórek. SSC znajdują się w swoistych dla danej tkanki niszach i przebywają w stanie uśpienia. Gdy dojdzie do ich aktywacji, przechodzą podział asymetryczny, który równocześnie zwiększa liczbę komórek macierzystych niszy i liczbę komórek tkankowo specyficznych. Komórki progenitorowe tkanki ulegają dalszemu różnicowaniu, uzupełniając pulę komórek danego narządu [3,4].
* Adres do korespondencji: Pracownia Radiobiologii, Zakład Fizyki Medycznej, Wielkopolskie Centrum Onkologii,ul. Garbary 15, 61-866 Poznań, Polska. Tel.: +48 618 850 477. Adres email: [email protected] (W.M. Suchorska). http://dx.doi.org/10.1016/j.onko.2015.09.002 1734-0489/© 2015 Wielkopolskie Centrum Onkologii. Published by Elsevier Sp. z o.o. All rights reserved.
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
55
SC mają znaczący wpływ na rozwój wielu gałęzi biotechnologii, w tym na wprowadzenie terapii regeneracyjnych z wykorzystaniem komórek, testowanie i screening leków, modelowanie chorób, analizę efektów ubocznych radioterapii i wiele innych. W 2006 roku Yamanaka i wsp. opublikowali rezultaty pracy, w której opisali proces reprogramowania mysich dorosłych fibroblastów w indukowane komórki macierzyste (iPS; induced pluripotent stem cells) za pomocą czterech czynników transkrypcyjcnych: Oct3/4 (octamer-binding transcription factor 3/4), Sox2 (sex determining region Y-box 2), c-Myc i Klf4 (Kruppel-like factor 4). iPS są funkcjonalnie i strukturalnie zbliżone do ESC [5]. To przełomowe odkrycie rozwiązało wiele etycznych sporów dotyczących pozyskiwania ESC z ludzkich zarodków i zainicjowało badania nad klinicznym wykorzystaniem iPS. Intensywne badania nad ukierunkowanym różnicowaniem komórek pluripotentnych pozwoliły na opracowanie skutecznych protokołów różnicujących [6,7]. Niektóre z nich wymagają przejściowego utworzenia ciał embrionalnych (EB; embryoid bodies). EB można uzyskać zarówno z iPS, jak i ESC. EB składają się z komórek macierzystych, które w większości uległy zróżnicowaniu do jednego z trzech listków zarodkowych [8]. Obecnie wiele terapii z wykorzystaniem komórek macierzystych znajduje się na etapie badań klinicznych. Intravenous Stem Cells After Ischemic Stroke, Human Neural Stem Cell Transplantation in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) czy Treatment of Knee Osteoarthritis by Intra-articular Injection of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells [9–11] to zaledwie kilka z zarejestrowanych w światowej bazie danych ClinicalTrials.gov badań dotyczących potencjalnego wykorzystania komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. Wskazuje to na rosnącą potrzebę opracowania skutecznych metod ukierunkowanego różnicowania. Promieniowanie jonizujące (PJ) jest jednym z podstawowych narzędzi wykorzystywanych w terapii nowotworów [12]. Odpowiedź komórek somatycznych na PJ jest od dawna przedmiotem intensywnych badań, dlatego też wiele z mechanizmów molekularnych biorących udział w tym procesie zostało dokładnie wyjaśnionych [13–15]. Jednakże odpowiedź komórek macierzystych na PJ nie jest bezpośrednią ekstrapolacją wyników uzyskanych dla komórek somatycznych. Różnicowanie wywołane działaniem PJ zostało opisane wcześniej [16,17]. Niemniej, mechanizm wspomagania różnicowania komórek macierzystych przez PJ nie został jeszcze dokładnie poznany. Celem tej pracy jest wskazanie naukowych przesłanek sugerujących działanie PJ jako jednej z potencjalnych metod zwiększenia efektywności różnicowania komórek macierzystych. 2. Odpowiedź komórek macierzystych na uszkodzenia DNA Uszkodzenie genomowego DNA wywołane PJ uruchamia kaskadę reakcji biochemicznych mających na celu naprawę uszkodzeń lub eliminację komórki w przypadku braku możliwości naprawy. Funkcjonalność tego mechanizmu jest kluczowa w utrzymaniu stabilności genetycznej. Najbardziej niebezpieczne dla komórki są dwuniciowe pęknięcia DNA, które dominują w przypadku ekspozycji na PJ lub wolne rodniki. Naprawa dwuniciowych pęknięć odbywa się poprzez dwa główne szlaki: homologiczną rekombinację (HR; homologous recombination) i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ; non-homologous end joining) [18]. W procesie HR chromatydy siostrzane wykorzystywane są jako matryca, dlatego też ten typ naprawy cechuje się niską częstością wprowadzania błędów. NHEJ nie wykorzystuje siostrzanych chromatyd, w związku z czym jest zdecydowanie bardziej podatny na wprowadzanie błędów. Typ odpowiedzi dominującej zależy od fazy cyklu komórkowego [19]. Wymóg obecności chromatyd siostrzanych ogranicza HR do fazy S i G2 cyklu komórkowego. NHEJ dominuje w pozostałych fazach cyklu. Do mechanizmów naprawy DNA zalicza się także naprawę przez wycinanie nukleotydów, naprawę przez wycinanie zasady i naprawę niesparowanych zasad. Jednak w kontekście pobudzania różnicowania indukowanego PJ procesy te wydają się być mniej istotne i z tego względu nie zostaną opisane w niniejszym artykule. 2.1. Naprawa uszkodzeń DNA w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) Udowodniono, że mechanizm naprawy DNA w ESC jest zdecydowanie bardziej wydajny w porównaniu z innymi typami komórek [20]. ESC wykazują wyjątkową strukturę cyklu komórkowego. Faza G1 jest znacznie skrócona, a przejście z fazy G1 do fazy S jest ułatwione, co w efekcie przyspiesza podziały komórkowe. Większość populacji ESC znajduje się w fazach cyklu, w których obecne są chromatydy siostrzane. Dzięki temu dominującym mechanizmem naprawy podwójnoniciowych uszkodzeń DNA jest HR [21]. ESC są źródłem komórek służących do budowy całego organizmu, dlatego też wysoka skuteczność naprawy uszkodzeń DNA jest niezbędna do utrzymania stabilności genetycznej. W przypadku wystąpienia nienaprawialnych uszkodzeń genomowego DNA komórka przechodzi apoptozę. Uruchomienie apoptozy w ESC jest znacznie uproszczone dzięki mechanizmowi tzw. mitochondrialnego primingu [22]. Polega on na zmianie stężenia białek anty- i proapototycznych rodziny Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), co ułatwia inicjację apoptozy. W efekcie indukcja apoptozy zachodzi na skutek stymulacji bodźcami proapoptotycznymi słabszymi, niż ma to miejsce w przypadku komórek zróżnicowanych. Celem tego zjawiska jest eliminacja niestabilnych genetycznie komórek, co zapobiega przekazywaniu mutacji komórkom potomnym.
56
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
Badania przeprowadzone przez Sokolov i Naumann wykazały, że ESC ulegają apoptozie przy stosunkowo niskich dawkach PJ. Powyżej dawki 1,0 Gy obserwowano masywną apoptozę w populacji ESC [23]. W doświadczeniu przeprowadzonym przez Lan i wsp. dawka 2,0 Gy promieniowania X spowodowała spadek przeżywalności ESC o 60% 5 dni po napromienianiu. W tym samym doświadczeniu wykazano popromienny wzrost aktywności metabolicznej (test XTT) ESC wynoszący odpowiednio 150% po dawce 2,0 Gy i 250% po dawce 5,0 Gy. Podanie dawek 2,0 i 5,0 Gy spowodowało również znaczący wzrost stężenia reaktywnych form tlenu i azotu do tygodnia po ekspozycji [24]. 2.2. Naprawa uszkodzeń DNA w somatycznych komórkach macierzystych (SSC) Radiowrażliwość SSC różni się znacząco w zależności od ich typu i etapu rozwoju. Spadek wydajności naprawy uszkodzeń DNA koreluje ze stopniem zróżnicowania. Dlatego też bardziej zróżnicowane SSC wykazują mniejszą wydajność naprawy uszkodzeń DNA w porównaniu z mniej zróżnicowanymi ESC [25]. Mechanizm odpowiedzi SSC na uszkodzenia DNA jest inny od zaobserwowanego w ESC [26]. SSC przebywają głównie w stanie uśpienia w fazie G0 cyklu komórkowego. Spowolniony cykl komórkowy skutkuje obniżoną radiowrażliwością [27,28]. W związku z tym, pomimo mniejszej wydajności naprawy uszkodzeń DNA, SSC cechują się mniejszą radiowrażliwością niż szybko dzielące się ESC. Udowodniono, że na skutek uszkodzeń DNA SSC mogą opuścić stan uśpienia i przejść w fazę G1 cyklu komórkowego, w którym przeprowadzana jest naprawa za pomocą niedokładnego mechanizmu NHEJ [29]. W konsekwencji SSC są bardziej podatne na akumulację mutacji i przekazywanie ich komórkom potomnym. W 1996 roku Schwenke i wsp. wykazali, że poddanie mysich erytroidalnch komórek progenitorowych działaniu promieniowania gamma powoduje stymulację różnicowania. Zaobserwowany wzrost wydajności różnicowania był efektem ominięcia cyklu mitotycznego, co jest niezbędne w komórkach progeniotorowych do przejścia końcowej fazy różnicowania [16]. Ponadto w innych badaniach stwierdzono, że podwójnoniciowe pęknięcia DNA hamują podziały komórkowe i stymulują różnicowanie neuronalnych komórek macierzystych przy udziale białka p53 [30]. 3. Rola białka p53 w komórkach macierzystych Białko p53 jest przedmiotem wielu badań, jednak ze względu na złożoność interakcji i różnorodność procesów molekularnych, w których bierze udział, nie wszystkie jego właściwości zostały poznane [31]. p53 jest białkiem supresorowym odpowiedzialnym za indukcję odwracalnego zatrzymania cyklu komórkowego, które umożliwia przeprowadzenie naprawy uszkodzeń DNA lub zainicjowanie apoptozy, jeśli naprawa jest niemożliwa. p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który wskutek aktywacji wiąże się do promotorów genów docelowych, indukując lub hamując ich transkrypcję [32]. p53 indukuje apoptozę za pomocą dwóch szlaków: transkrypcyjnego (wewnętrznego), który przebiega tak, jak opisano wcześniej, i nietranskrypcyjnego (mitochondrialnego), poprzez bezpośrednie interakcje z białkami pro- i antyapoptotycznymi. Genami docelowymi dla jego proapoptotycznej aktywności są geny kodujące białka z rodziny Bcl-2, takie jak Puma ( p53 upregulated modulator of apoptosis) i Bax (Bcl-2-associated X protein) [33]. Uszkodzenia DNA powodują aktywację białka ATM (ataxia telangiectasia mutated), które następnie prowadzi do poliubikwitynylacji i degradacji białka Mdm2 (mouse double minute 2 homolog). Białko Mdm2 jest onkoproteiną, która przeprowadza poliubikwitynylację i degradację białka p53 w proteasomach 26S. Dlatego też degradacja białka Mdm2 skutkuje zwiększeniem stężenia białka p53. Warto wspomnieć, że istnieją również inne mechanizmy regulacji stężenia p53. p53 reguluje także proliferację komórek poprzez kontrolę ekspresji białka p21 działającego jako inhibitor kinaz zależnych od cyklin [34]. Udowodniono, że wyciszenie ekspresji białka p53 zwiększa wydajność reprogramowania w procesie uzyskiwania iPS, co wskazuje na jego udział w podtrzymaniu stanu zróżnicowania [35]. 3.1. Rola białka p53 w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) Wykazano, że białko p53 gromadzi się w niskich stężeniach w jądrze komórkowym ESC w nieaktywnej, zdeacetylowanej formie. Jak już wspomniano, p53 odpowiada również za regulację proliferacji poprzez kontrolę ekspresji białka p21 będącego inhibitorem kinaz zależnych od cyklin. p21 hamuje aktywność kompleksu cyklina/CDK2, co skutkuje wstrzymaniem cyklu komórkowego. Dolezalova i wsp. wykazali, że po napromienieniu EKB promieniowaniem UVC, mRNA białka p21 jest obecne, jednak jego translacja jest blokowana przez różne mPJNA [36]. Z drugiej strony, doświadczenie przeprowadzone przez Maimets i wsp. udowodniło, że Nutlina, będąca aktywatorem p53, zwiększa stężenie białka p21 w ESC [37]. W związku z tym rola białka p21 w szlaku p53 pozostaje nie do końca wyjaśniona. p53 odgrywa ważną rolę w różnicowaniu ESC. Wykazano, że spontaniczne różnicowanie zachodzi znacznie rzadziej, gdy poziom p53 jest niski [38]. Jednakże jednym z najbardziej kluczowych mechanizmów przemawiających za słusznością teorii wspomaganego różnicowania jest redukcja ekspresji czynników pluripotencji powodowana aktywnością p53. Białko p53 bezpośrednio wiąże się z promotorem genu NANOG i Oct3/4, hamując ich transkrypcję. Ponadto, podwyższony poziom
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
57
białka p53 indukuje ekspresję markerów różnicowania, takich jak GATA4 i GATA6 [37]. p53 indukuje również ekspresję mPJ-34a i mPJ-145, które, hamując translację czynników pluripotencji Oct3/4, Klf4, Lin-28A ( protein lin-28 homolog A) i SOX2, stymulują różnicowanie [39]. Kwas retinowy jest powszechnie stosowanym czynnikiem różnicującym, m.in. w powstawaniu komórek neuronalnych, kardiomiocytów czy chondrocytów [40–42]. W warunkach fizjologicznych kwas retinowy hamuje ekspresję NANOG. Nie zaobserwowano tego efektu w komórkach z delecją genu p53 [43]. To sugeruje współdziałanie tych białek w indukcji różnicowania. Należy również wspomnieć, że p53 może także hamować różnicowanie poprzez szlak przekazywania sygnału Wnt, który odpowiada za podtrzymanie i proliferację ludzkich oraz mysich ESC [44,45]. 3.2. Rola białka p53 w somatycznych komórkach macierzystych (SSC) Poznano wiele typów somatycznych komórek macierzystych specyficznych dla danego organu. Każdy typ SSC daje początek innym liniom komórkowym, dlatego też przesłanki przemawiające za stymulującym działaniem promieniowania jonizującego mogą być prawdziwe tylko w niektórych przypadkach. W celu udowodnienia tego stwierdzenia, w dalszej części opisano właściwości białka p53 w neuronalnych komórkach macierzystych (NSC; neural stem cells), hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC; hematopoietic stem cells) i komórkach macierzystych gruczołu sutkowego (MaSC; mammary stem cells). 3.2.1. Neuronalne komórki macierzyste (NSC) Neuronalne komórki macierzyste mogą ulec różnicowaniu do neuronów, astrocytów i oligodendrocytów. U dorosłych neurogeneza centralnego układu nerwowego zaczyna się w strefie podkomorowej (SP) i strefie podziarnistej zakrętu zębatego hipokampu, które pełnią funkcję niszy dla NSC. SP jest wąską strefą tkanki ściany komory bocznej przedmózgowia [46]. Proliferacja tkanki neuronalnej jest procesem dwuetapowym. W pierwszym etapie produkowana jest duża populacja komórek progenitorowych. W drugim cześć komórek przechodzi dalsze różnicowanie, podczas gdy reszta ulega apoptozie. Wykazano, że neuronalne komórki progenitorowe myszy p53-/- charakteryzuje znacząco wyższa proliferacja w porównaniu z komórkami typu dzikiego. NSC mogą być utrzymywane w hodowli w postaci agregatów zwanych neurosferami. NSC p53-/- formują większe neurosfery niż komórki typu dzikiego, jednak jest to spowodowane zwiększeniem liczby komórek, a nie ich rozmiarów. To doświadczenie wykazało, że jedną z funkcji białka p53 w NSC jest zahamowanie ich nadmiernej proliferacji [47]. Wykazano, że poddanie NSC promieniowaniu gamma powoduje wzrost wydajności różnicowania. Komórki poddane napromienianiu dawką 10,0 Gy cechowały się zwiększonym poziomem zróżnicowania w porównaniu z komórkami poddanymi działaniu dawki 2,0 Gy i komórkami grupy kontrolnej. Warto również zaznaczyć, że stosunek astrocytyów do oligodendrocytów pozostał niezmieniony [48]. Jak wspomniano wcześniej, p53 oddziałuje również za pośrednictwem szlaku sygnałowego Wnt. Wykazano, że szlak sygnalny Wnt/b-katenina odgrywa istotną role w proliferacji i różnicowaniu NSC hipokampu. We wspomnianym doświadczeniu niskie dawki promieniowania jonizującego (0,3 Gy) spowodowały aktywację szlaku Wnt/b-katenina. W rezultacie, NSC poddane napromienianiu cechował zwiększony poziom proliferacji i zróżnicowania przy jednoczesnym spadku liczby apoptoz in vivo. Co więcej, w behawioralnym teście labiryntu wodnego udowodniono zwiększone zdolności uczenia się myszy poddanych napromienianiu niskimi dawkami PJ, w porównaniu z myszami nienapromienionymi [49]. 3.2.2. Komórki macierzyste gruczołu sutkowego (MaSC) Komórki macierzyste gruczołu sutkowego mają zdolność do różnicowania się we wszystkie typy komórek epitelialnych charakterystyczne dla tego gruczołu. MaSC odpowiadają również za rozwój gruczołu sutkowego w okresie dojrzewania i w czasie ciąży [50]. W hodowli in vitro MaSC mają postać pływających agregatów, tzw. mammosfer. Mammosfery to kuliste kolonie powstałe na skutek klonalnej proliferacji jednej komórki [51]. MsSC przechodzą głównie podziały asymetryczne, dlatego mammosfery składają się w większości z komórek bardziej zróżnicowanych, otaczających niewielką populację komórek macierzystych [52]. Jednak pomimo zdolności do dużej liczby podziałów MsSC cechują się ograniczoną żywotnością in vitro. MsSC pozyskane z myszy p53-/- wykazują wyższy potencjał proliferacyjny, na co wskazuje zwiększona liczba ASC przypadających na jedną mammosferę, jak i możliwość niegraniczonego utrzymywania ich w warunkach in vitro. To sugeruje zaangażowanie białka p53 w hamowaniu niekontrolowanej proliferacji poprzez stymulację asymetrycznych podziałów, co w efekcie prowadzi również do zwiększonego różnicowania [53]. Te wyniki są zgodne z danymi dotyczącymi mutacji genu p53 w rozwoju nowotworów piersi [54]. Ponadto, MsSC napromienione dawką 4,0 Gy wykazały 2,7-krotny wzrost zdolności do regeneracji mammosfery, potwierdzając wpływ promieniowania X na zwiększenie proliferacji [55].
58
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
3.2.3. Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) Hematopoetyczne komórki macierzyste są jednymi z najlepiej scharakteryzowanych ludzkich komórek. Od wielu lat mają zastosowanie kliniczne w leczeniu białaczek. HSC znajdują się w szpiku kostnym i dają początek wszystkim liniom komórkowym krwi. HSC różnicują się do komórek progenitorowych mieloidalnych i limfoidalnych, które mogą ulec dalszemu różnicowaniu do takich komórek, jak monocyty, erytrocyty, neutrofile, makrofagi (progenitory mieloidalne) lub limfocyty-B, -T czy komórki NK (progenitory limfoidalne). Większość HSC pozostaje nieaktywna. Niewielka, aktywna część populacji tych komórek produkuje komórkowe komponenty krwi, uzupełniając ich ewentualne braki [56]. W czasie fizjologicznej hematopoezy p53 reguluje aktywność HSC. Ponadto jest odpowiedzialne za współzawodnictwo HSC znajdujących się w niszy. Komórki cechujące się stosunkowo wysokim poziomem p53 podlegają wstrzymaniu cyklu komórkowego i starzeniu. Ten mechanizm gwarantuje utrzymanie homeostazy tkanki poprzez eliminację komórek o gorszych właściwościach. Udowodniono, że HSC poddane działaniu dawki 3,0 Gy wykazują opóźnioną naprawę podwójoniciowych pęknięć DNA i wzrost odpowiedzi apoptotycznej poprzez szlak białka APP1 (antiphagocytic protein 1). Wyniki te potwierdzają dużą radiowrażliwość HSC na PJ [57]. Pomimo tego, poddanie mysich HSC działaniu promieniowania X spowodowało prawie dwukrotny wzrost bezwzględnej liczby komórek obserwowany dwa miesiące po napromienieniu. W komórkach izolowanych od myszy p21-/- nie wykazano takiej zależności, co może sugerować istotną rolę tego białka w procesie indukcji proliferacji na skutek promieniowania [55]. 4. Mitochondria w kontekście wspomaganego różnicowania Mitochondria są dwuwarstwowymi organellami przeprowadzającymi wewnątrzkomórkowe procesy metaboliczne związane z produkcją energii w reakcji oksydacyjnej fosforylacji. Ich morfologia różni się w zależności od tkanki i jest ściśle związana z aktywnością metaboliczną danej komórki. Poza różnicami morfologicznymi wynikającymi z pochodzenia i aktywności metabolicznej, mitochondria mogą ulegać fuzji lub podziałom, tworząc mitochondria cylindryczne lub pofragmentowane. Mechanizm fuzji i podziałów jest ściśle związany z procesem proliferacji i różnicowania [58]. Należy jednak podkreślić, że efekt wywołany fuzją lub różnicowaniem jest zależny od typu komórki, w której zachodzi. W ESC mitochondria znajdują się w formie pofragmentowanej. Ich fuzja poprzedza proces różnicowania. PJ oddziałuje na mitochondria na kilka sposobów. Mitochondrialne DNA nie ma tak skutecznych mechanizmów naprawy uszkodzeń jak DNA genomowe, co sprawia, że jest ono bardziej podatne na uszkodzenia. Ponadto, nie ma ono histonów stabilizujących jego strukturę, co prowadzi do dalszego zwiększenia podatności na występowanie uszkodzeń i mutacji [59]. Zostało udowodnione, że PJ zwiększa zarówno wewnątrzkomórkowy, jak i mitochondrialny poziom wolnych rodników [60]. Jednakże to mitochondrialna produkcja reaktywnych form tlenu jest w główną przyczyną uszkodzeń komórkowych [61]. Zaburzenie funkcji mitochondriów może wywołać apoptozę, autofagię lub, w przypadku uszkodzeń mniej intensywnych, fuzję. Ten mechanizm umożliwia krzyżowe dopełnienie, w skutek którego dochodzi do wymiany składników uszkodzonych mitochondriów i podtrzymania ich aktywności [62]. Dawki od 0,005 do 5,0 Gy spowodowały odpowiednio 1,5- do 3,8krotnego wzrost masy mitochondriów, co uzasadnia zwiększenie częstości fuzji mitochondriów na skutek działania PJ [63]. W jednym z wymienionych wcześniej doświadczeń poddanie ESC działaniu PJ spowodowało wzrost stężenia reaktywnych form tlenu i równoczesny wzrost aktywności metabolicznej [24]. Oba te zjawiska odpowiadają za indukcję fuzji mitochondriów, co z kolei jest bodźcem stymulującym różnicowanie. Stąd sugerowany efekt zwiększenia wydajności różnicowania na skutek oddziaływania PJ prawdopodobnie otrzyma się przy znaczącym współudziale mitochondriów. 5. Podsumowanie Istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że promieniowanie jonizujące może być użytecznym narzędziem wykorzystywanym w ukierunkowanym różnicowaniu komórek macierzystych (Ryc. 1). PJ powoduje wiele efektów ubocznych, dlatego też nie może być stosowane jako jedyne narzędzie w procesie różnicowania. Jednak odpowiednio dobrane dawki mogą w znaczny sposób zwiększyć wydajność istniejących już protokołów otrzymywania komórek wyspecjalizowanych. Pomimo bardzo wysokiej wydajności naprawy uszkodzeń DNA w komórkach macierzystych, promieniowanie jonizujące powoduje wzrost ryzyka zachwiania stabilności genetycznej. Stąd istotne jest zdefiniowanie optymalnej dawki całkowitej przy ograniczeniu prawdopodobieństwa wystąpienia uszkodzeń. Odpowiedź komórek macierzystych na promieniowanie jonizujące zależy od ich typu. Dlatego też wysokość efektywnej dawki należy dobrać eksperymentalnie. Negatywny wpływ PJ można częściowo ograniczyć w przypadku hES przez wytworzenie EB, które charakteryzują się zmniejszoną radiowrażliwością. Ponadto różnice w odpowiedzi na PJ pomiędzy komórkami mysimi i ludzkimi wymagają potwierdzenia uzyskanych wyników także w hodowli ludzkich komórek in vitro [64]. Pomimo zatem naukowych przesłanek sugerujących prawdopodobne korzyści płynące z włączenia promieniowania jonizującego do metodologii ukierunkowanego różnicowania, koncepcja ta wymaga jeszcze wielu badań i bezpośredniego potwierdzenia jej skuteczności.
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
59
Ryc. 1. Mechanizm stymulacji różnicowania na skutek działania promieniowania jonizującego Fig. 1. The mechanism of stimulation of differentiation by the action of ionizing radiation
Wkład autorów/Authors’ contributions WS – koncepcja pracy, akceptacja ostatecznej wersji, przygotowanie literatury, pozyskanie środków. AM – zebranie i interpretacja danych, analiza statystyczna. Konflikt interesu/Conflict of interest Nie występuje. Finansowanie/Financial support Praca została sfinansowana z grantu WCO nr UMO – 27/2014 (86). Etyka/Ethics Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymi wymaganiami dla czasopism biomedycznych. Piśmiennictwo/References [1] D.L. Jones, A.J. Wagers, No place like home: anatomy and function of the stem cell niche, Nat Rev Mol Cell Biol. Nature Publishing Group 9 (2008) 11–21. [2] V. Tropepe, K. Turksen, The Ontogeny of Somatic Stem Cells. (2012) 548–550. [3] K.a Moore, I.R. Lemischka, Stem cells and their niches, Science. 311 (2006) 1880–1885. [4] K. Turksen, Adult stem cells and cardiac regeneration, Stem Cell Rev. 9 (2013) 537–540. [5] K. Takahashi, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell. 126 (2006) 663–676. [6] Y. Shi, P. Kirwan, F.J. Livesey, Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks, Nat Protoc. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved. 7 (2012) 1836–1846.
60
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
[7] X. Lian, J. Zhang, S.M. Azarin, K. Zhu, L.B. Hazeltine, X. Bao, et al., Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/b-catenin signaling under fully defined conditions, Nat Protoc. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved. 8 (2013) 162–175. [8] A.M. Bratt-Leal, R.L. Carpenedo, T.C. McDevitt, Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation, Biotechnol Prog. 25 (2009) 43–51. [9] O. Detante, Intravenous Stem Cells After Ischemic Stroke (ISIS) [Internet]. (2014). [10] A.L. Vescovi, Human Neural Stem Cell Transplantation in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) (hNSCALS) [Internet]. (2014). [11] J. Lamo-Espinosa, F. Prosper, J. Blanco, Treatment of Knee Osteoarthritis by Intra-articular Injection of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells [Internet]. (2014). [12] N. Isa, Evidence based radiation oncology with existing technology, Reports Pract Oncol Radiother. 19 (2014) 259–266. [13] K. Valerie, A. Yacoub, M.P. Hagan, D.T. Curiel, P.B. Fisher, S. Grant, et al., Radiation-induced cell signaling: inside-out and outside-in, Mol Cancer Ther. 6 (2007) 789–801. [14] H.P. Rodemann, Ma. Blaese, Responses of Normal Cells to Ionizing Radiation, Semin Radiat Oncol. 17 (2007) 81–88. [15] A.C. Paulino, L.S. Constine, P. Rubin, J.P. Williams, Normal Tissue Development, Homeostasis, Senescence, and the Sensitivity to Radiation Injury Across the Age Spectrum, Semin Radiat Oncol. Elsevier Inc. 20 (2010) 12–20. [16] K. Schwenke, H.P. Peterson, K.H. von Wangenheim, L.E. Feinendegen, Radiation-enhanced differentiation of erythroid progenitor cells and its relation to reproductive cell death, Int J Radiat Biol. 69 (1996) 309–317. [17] K.H. Von Wangenheim, H.P. Peterson, K. Schwenke, Review: a major component of radiation action: interference with intracellular control of differentiation, Int J Radiat Biol. 68 (1995) 369–388. [18] P. Fortini, C. Ferretti, E. Dogliotti, The response to DNA damage during differentiation: pathways and consequences, Mutat Res. 743–744 (2013) 160–168. [19] P. Nagaria, C. Robert, F.V. Rassool, DNA double-strand break response in stem cells: mechanisms to maintain genomic integrity, Biochim Biophys Acta. 1830 (2013) 2345–2353. [20] C.R.R. Rocha, L.K. Lerner, O.K. Okamoto, M.C. Marchetto, C.F.M. Menck, The role of DNA repair in the pluripotency and differentiation of human stem cells, Mutat Res. 752 (2013) 25–35. [21] E.D. Tichy, R. Pillai, L. Deng, L. Liang, J. Tischfield, S.J. Schwemberger, et al., Mouse embryonic stem cells, but not somatic cells, predominantly use homologous recombination to repair double-strand DNA breaks, Stem Cells Dev. 19 (2010) 1699–1711. [22] J.C. Liu, X. Guan, J.A. Ryan, A.G. Rivera, C. Mock, V. Agrawal, et al., High mitochondrial priming sensitizes hESCs to DNA-damage-induced apoptosis, Cell Stem Cell. 13 (2013) 483–491. [23] M.V. Sokolov, R.D. Neumann, Radiation-induced bystander effects in cultured human stem cells, PLoS One. 5 (2010) e14195. [24] M.L. Lan, M.M. Acharya, K.K. Tran, J. Bahari-Kashani, N.H. Patel, J. Strnadel, et al., Characterizing the radioresponse of pluripotent and multipotent human stem cells, PLoS One. 7 (2012) e50048. [25] B.R. Adams, S.E. Golding, R.R. Rao, K. Valerie, Dynamic Dependence on ATR and ATM for Double-Strand Break Repair in Human Embryonic Stem Cells and Neural Descendants, PLoS One. Public Library of Science 5 (2010) e10001. [26] C. Blanpain, M. Mohrin, P.a Sotiropoulou, E. Passegué, DNA-damage response in tissue-specific and cancer stem cells, Cell Stem Cell. 8 (2011) 16–29. [27] P.K. Mandal, C. Blanpain, D.J. Rossi, DNA damage response in adult stem cells: pathways and consequences, Nat Rev Mol Cell Biol. Nature Publishing Group; 12 (2011) 198–202. [28] L. Latella, J. Lukas, C. Simone, P.L. Puri, J. Bartek, Differentiation-induced radioresistance in muscle cells, Mol Cell Biol. 24 (2004) 6350–6361. [29] M. Mohrin, E. Bourke, D. Alexander, M.R. Warr, K. Barry-Holson, M.M. Le Beau, et al., Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis, Cell Stem Cell. 7 (2010) 174–185. [30] H. Zheng, H. Ying, H. Yan, A.C. Kimmelman, D.J. Hiller, A.-J. Chen, et al., p53 and Pten control neural and glioma stem/progenitor cell renewal and differentiation, Nature. Macmillan Publishers Limited. All rights reserved; 455 (2008) 1129–1133. [31] G. Bonizzi, A. Cicalese, A. Insinga, P.G. Pelicci, The emerging role of p53 in stem cells, Trends Mol Med. Elsevier; 18 (2014) 6–12. [32] V. Solozobova, C. Blattner, P53 in Stem Cells, World J Biol Chem. 2 (2011) 202–214. [33] S. Haupt, M. Berger, Z. Goldberg, Y. Haupt, Apoptosis - the p53 network, J Cell Sci. 116 (2003) 4077–4085. [34] J. Yu, L. Zhang, The transcriptional targets of p53 in apoptosis control, Biochem Biophys Res Commun. 331 (2005) 851–858. [35] H. Hong, K. Takahashi, T. Ichisaka, T. Aoi, O. Kanagawa, M. Nakagawa, et al., Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway, Nature. Macmillan Publishers Limited. All rights reserved; 460 (2009) 1132–1135. [36] D. Dolezalova, M. Mraz, T. Barta, K. Plevova, V. Vinarsky, Z. Holubcova, et al., MicroRNAs regulate p21(Waf1/Cip1) protein expression and the DNA damage response in human embryonic stem cells, Stem Cells. 30 (2012) 1362–1372. [37] T. Maimets, I. Neganova, L. Armstrong, M. Lako, Activation of p53 by nutlin leads to rapid differentiation of human embryonic stem cells, Oncogene. 27 (2008) 5277–5287. [38] K. Sabapathy, M. Klemm, R. Jaenisch, E.F. Wagner, Regulation of ES cell differentiation by functional and conformational modulation of p53, EMBO J. John Wiley & Sons Ltd; 16 (1997) 6217–6229. [39] A.K. Jain, K. Allton, M. Iacovino, E. Mahen, R.J. Milczarek, T.P. Zwaka, et al., p53 regulates cell cycle and microRNAs to promote differentiation of human embryonic stem cells, PLoS Biol. 10 (2012) e1001268. [40] Y. Okada, T. Shimazaki, G. Sobue, H. Okano, Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells, Dev Biol. 275 (2004) 124–142. [41] P.W. Burridge, G. Keller, J.D. Gold, J.C. Wu, Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming, Cell Stem Cell. 10 (2012) 16–28. [42] J. Kawaguchi, P.J. Mee, A.G. Smith, Osteogenic and chondrogenic differentiation of embryonic stem cells in response to specific growth factors, Bone. 36 (2005) 758–769. [43] T. Lin, C. Chao, S. Saito, S.J. Mazur, M.E. Murphy, E. Appella, et al., p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression, Nat Cell Biol. 7 (2005) 165–171. [44] G. Dravid, Z. Ye, H. Hammond, G. Chen, A. Pyle, P. Donovan, et al., Defining the Role of Wnt/b-Catenin Signaling in the Survival, Proliferation, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells. John Wiley & Sons, Ltd.; 23 (2005) 1489–1501. [45] N. Sato, L. Meijer, L. Skaltsounis, P. Greengard, A.H. Brivanlou, Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor, Nat Med. 10 (2004) 55–63.
W.M. Suchorska, A.A. Mieloch / Zeszyty Naukowe WCO, Letters in Oncology Science 12 (2015) 54–61
61
[46] P. Taupin, F.H. Gage, Adult neurogenesis and neural stem cells of the central nervous system in mammals, J Neurosci Res. 69 (2002) 745–749. [47] A. Armesilla-Diaz, P. Bragado, I. Del Valle, E. Cuevas, I. Lazaro, C. Martin, et al., p53 regulates the self-renewal and differentiation of neural precursors, Neuroscience. 158 (2009) 1378–1389. [48] M.L. Monje, S. Mizumatsu, J.R. Fike, T.D. Palmer, Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction, Nat Med. 8 (2002) 955–962. [49] L.-C. Wei, Y.-X. Ding, Y.-H. Liu, L. Duan, Y. Bai, M. Shi, et al., Low-Dose Radiation Stimulates Wnt/b-Catenin Signaling, Neural Stem Cell Proliferation and Neurogenesis of the Mouse Hippocampus in vitro and in vivo, Curr Alzheimer Res. 9 (2012) 278–289. [50] J.E. Visvader, J. Stingl, D. Genes, Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives, Genes Dev. 28 (2014) 1143–1158. [51] M. Shackleton, F. Vaillant, K.J. Simpson, J. Stingl, G.K. Smyth, M.-L. Asselin-Labat, et al., Generation of a functional mammary gland from a single stem cell, Nature. 439 (2006) 84–88. [52] G. Dontu, W.M. Abdallah, J.M. Foley, K.W. Jackson, M.F. Clarke, M.J. Kawamura, et al., In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells, Genes Dev. 17 (2003) 1253–1270. [53] A. Cicalese, G. Bonizzi, C.E. Pasi, M. Faretta, S. Ronzoni, B. Giulini, et al., The Tumor Suppressor p53 Regulates Polarity of Self-Renewing Divisions in Mammary Stem Cells, Cell. Elsevier; 138 (2014) 1083–1095. [54] D. Ziyaie, T.R. Hupp, Thompson a M. P53 and breast cancer, Breast. 9 (2000) 239–246. [55] Insinga a, Cicalese a, M. Faretta, B. Gallo, L. Albano, S. Ronzoni, et al., DNA damage in stem cells activates p21, inhibits p53, and induces symmetric self-renewing divisions, Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2013) 3931–3936. [56] M. Kondo, A.J. Wagers, M.G. Manz, S.S. Prohaska, D.C. Scherer, G.F. Beilhack, et al., Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application, Annu Rev Immunol. 21 (2003) 759–806. [57] M. Milyavsky, O.I. Gan, M. Trottier, M. Komosa, O. Tabach, F. Notta, et al., A Distinctive DNA Damage Response in Human Hematopoietic Stem Cells Reveals an Apoptosis-Independent Role for p53 in Self-Renewal, Cell Stem Cell. Elsevier; 7 (2014) 186–197. [58] K. Mitra, Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation, Bioessays. 35 (2013) 955–964. [59] F.M. Yakes, B. Van Houten, Mitochondrial DNA damage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stress, Proc Natl Acad Sci. 94 (1997) 514–519. [60] W.W.-Y. Kam, R.B. Banati, Effects of ionizing radiation on mitochondria, Free Radic Biol Med. Elsevier; 65 (2013) 607–619. [61] E.I. Azzam, J.P. Jay-Gerin, D. Pain, Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury, Cancer Lett. Elsevier Ireland Ltd; 327 (2012) 48–60. [62] R.J. Youle, A.M. van der Bliek, Mitochondrial fission, fusion, and stress, Science. 337 (2012) 1062–1065. [63] S.M.E. Nugent, C.E. Mothersill, C. Seymour, B. McClean, F.M. Lyng, J.E.J. Murphy, Increased Mitochondrial Mass in Cells with Functionally Compromised Mitochondria after Exposure to both Direct g Radiation and Bystander Factors, Radiat Res. The Radiation Research Society; 168 (2007) 134–142. [64] C.A. Bañuelos, J.P. Banáth, S.H. MacPhail, J. Zhao, C.A. Eaves, M.D. O’Connor, et al., Mouse but not human embryonic stem cells are deficient in rejoining of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks, DNA Repair (Amst). 7 (2008) 1471–1483.