Protocole de séquençage des gènes codant les régions variables des anticorps murins

lmmunoanal Biol Sp& 0 Elsevier, Paris

(1995)

a7

10, 87-90

Revues

Protocole

ghkales

et analyses

de shqueryage des genes codant variables des anticorps murins

prospectives

les regions

Application ti Etude des autoanticorps produits au tours de la maladie lupique chez la souris (NZB x NZW)Fl F Jovelin, Groupe

de recherche

F Brard,

D Gilbert,

F Tron

en immunopathologie, Laboratoire d’immunopathologie clinique et exp&imentale, Charles-PI/co//e, 1, rue de Germont, 76031 Rouen Cedex, France

(ReGu le ler f&rier

1995 ; accept6

h6pital

le 6 mars 1995)

R&urn6 - Notre laboratoire a d&eloppk un protocole complet de skquenCage des ADNc des ARNm codant lesrkgionsvariablesdes chaines lourdes et kg&es d’autoanticorps murins produits chez la souris (NZB x NZW)Fl qui dbveloppe spontankment un lupus BrythBmateux disskmink. Ce protocole, rkalisable en un temps relativement court (quelques jours), s’appuie sur la transcription inversedesARNmen ADNc monocat&naires qui sont ensuite amplifk par une technique de PCR ancrbe, puis clank en bouts francs dans pUC 18 avantd’etre skquencks par la mkthode des did6oxynuclkotides. La procedure est illustrke par 1’6tude des gbnes VH et VL codant un anticorps antinuckosome d&iv& d’une souris lupique (NZB x NZVV)Fi. autoanticorps

/ regions variables / s6quence nucl6otidique

/ PCR ancrbe

Summary - A method for sequencing genes coding for autoantibody variable regions in a murine model of systemic Lupus erythemafosus. We developed an efficient method for the sequencing of mRNA coding for variable regions of murine autoantibodies. We present a completeprotocol that successive/y includes F/T/RX, cloning and sequencing of PCR products. This procedure begins with total RNA extraction and ends with the DNA sequences in a few days. Toillustratethe procedure, the heavy and light-chain gene sequence of an antinucleosome antibody was studied. This approach allows to get insights concerning the origin and structural properties of these autoantibodies. autoantibody

/ variable region gene / sequence / anchored PCR

Introduction Afin

de determiner

les sequences

des

regions

variables des autoanticorps survenant lors du developpement de la maladie lupique dans un modkle murin, notre laboratoire a d&eloppk un protocole de sbquenqage composi! de I’extraction des ARN totaux, de la transcription inverse des ARNm, de I’amplification enzymatique des ADN compkmentaires (ADNc) par une technique de PCR ancrke, du clonage en bouts francs des rbplicons et de leur &quen$age par la m&hode des didkoxynuclbotides [8]. Pour illustrer ce protocole, les sequences des ADNc des ARNm codant les regions variables des chaines lourdes et lbgeres d’un anticorps antinuclitosome d&iv6 d’une souris lupique (NZB x NZW)Fl ont 6tB dkterminbes.

Le lupus kythbmateux dissemine (LED) est une maladie autoimmune non spkifique d’organe, caractkiske par la production massive d’autoanticorps dirigks plus particulkrement contre le noyau ou des organites subcellulaires [lo, 121. La prksence de ces autoanticorps, comme ceux dirig& contre I’ADN ou contre des protbines de liaison & I’ADN telles que les histones, semble corkIbe & 1’6volution des l&ions et notamment des dBp8ts de complexes immuns au niveau des glomerules r&aux [6, 91. Les souris (NZB x NZW)FI d&eloppent spontanbment un syndrome autoimmun au tours duquel des anticorps antinuclbaires similaires ti ceux retrouvks lors du lupus humain sont observks. L’analyse des regions variables de ces autoanticorps permet d’ktudier les mircanismes de production des anticorps et de determiner si la reponse autoimmune rksulte plutbt

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F Jovelin

d’une activation polyclonale des lymphocytes B ou si, au contraire, il s’agit d’un processus dirige par I’autoantigene. En effet, il est clair que, dans I’hypothese d’une production d’autoanticorps resultant d’une activation polyclonale des cellules B, les sequences des segments VH et VL seront en configuration germinale. A I’inverse, si la stimulation antigenique constitue le mecanisme primaire d’une activation oligoclonale des cellules B, les etudes des sequences de ces memes segments permettront de mettre en evidence de nombreuses mutations somatiques dont la localisation au niveau des regions assurant la complementarite avec I’antigene (CDR) et le caractere non silencieux suggerent un processus de mutation dirige par I’antigene.

Matkriels et mbthodes Extraction des ARN totaux L’extraction des ARN totaux se fait a partir de 20.106 cellules d’hybridome par la technique au TRlzol (Total RNA Isolation Reagent, GIBCO BRL, Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD, Etats-Unis) qui utilise une solution monophasique de phenol et d’isothiocyanate de guanidium, selon le protocole fourni par la firme. Brievement, le reactif TRlzol permet de lyser les cellules. Une extraction au chloroforme (0,2 ml par ml de reactif utilise) suivie d’une precipitation par un volume d’isopropanol permet de recuperer environ 150 ug d’ARN totaux. La concentration et la purete de ces ARN totaux sont estimees par spectrophotometrie a 260 et 280 nm. L’etape d’extraction des ARN totaux est contrblee sous UV (312 nm) a I’aide d’un transilluminateur apres electrophorese sur gel d’agarose ,l,5% (Seakem LE, FMC Bioproducts, Rockland, ME, Etats-

Unis) en presence de bromure d’ethidium (BET 10 ug/uI, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EtatsUnis) en tampon TAE (40 mM Tris, 20 mM Acetate, 2 mM EDTA pH 8) a 100 volts, 30 min a 20°C.

Syn these des premiers brins d ‘ADN complemen taires Les premiers brins d’ADNc des ARN polyA+ (moins de 5% des ARN totaux extraits) sont synthetises selon les instructions d’un kit de synthese de premier brin d’ADN complementaire (First Strand cDN,A Synthesis Kit, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Etats-Unis) a pat-tir de 10 ug d’ARN totaux prealablement denatures 5 min a 65°C. Apres reaction, I’heteroduplex ARNlADNc est denature 2 min a 95°C puis plonge dans la glace, le brin ADNc monocatenaire pouvant alors servir de

matrice pour la reaction enzymatique de polymerisation en chaine (PCR). Amplification des A DNc syn th6 ti.s& Les premiers brins d’ADNc sont prealablementpurifies par chromatographie sur minicolonne (GlassMax DNA Isolation, GIBCO BRL) afin d’eliminer les contaminants et clues par 40 PI de TE (10 mM Tris - 1 mM EDTA) a 65°C. Vingt microlitres des ADN purifies sont utilises pour une reaction d’homopolymerisation : 3 ul de tam-

et a/

pon (100 mM Tris-Acetate, 100 mM acetate de magnesium, 100 mM acetate de potassium), 2 ~1 de dGTP 100 MM et 50 unites de Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT 16000 U/ml, Pharmacia) sont ajoutes dans un volume total de 30 ul. La reaction se deroule pendant 20 min a 37°C et est stoppee par 3 j.11d’EDTA 0,5 M. Le milieu reactionnel est de nouveau purifie sur minicolonne Glass-Max. Un microlitre de la solution contenant les ADN purifies est utilise pour I’amplification enzymatique. Dix microlitres de tampon de I’enzyme (50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI pH 9, I,5 mM mgCI,, 0,2 mg/ml de gelatine et 0,1% de triton X-100), 100 pmoles d’amorces CK (5’-CGG GAT CCC GAC GAC TGA GGC ACC TCC AG-3’) ou Cy (5’-CCT TGA CCA GGC ATG CCA-3’) et 100 pmoles d’amorces oligod(C) (5’-CGG AAT TCC GCC CCC CCC CCC-3’) sont ajoutes aux ADNc polyd(G). Le volume est complete a 100 l~l par de I’eau distillee sterile puis 2 gouttes d’huile minerale avant d’etre incube 5 min a 94°C. Apres cette etape de denaturation, 2,5 unites de I’enzyme Taq DNA polymerase (Appligene Oncor, Illkirch, France) sont ajoutees. Le tube est alors place dans un thermocycleur. La reaction de polymerisation en chaine se compose de 35 cycles : denaturation 1 min a 94°C appariement 1 min a 55”C, elongation 90 s a 72°C. La reaction se termine par un cycle d’elongation de 5 min A 72°C (fig 1). Les acides nucleiques amplifies sont ensuite deposes sur un gel d’agarose a bas point de fusion a 15% (Nusieve GTG Agarose, FMC Bioproducts) contenant du BET. La migration s’effectue en tampon TAE a 4°C a 80 volts. La bande d’interet, visualisee sous UV, est decouple au scalpel puis chauffee 10 min a 65°C pour faire fondre I’agarose. L’ADN est purifie par digestion de I’agarose par la P-Agarase I (New Englands Biolabs, Beverly, MA, Etats-Unis) a raison de 1 unite pour 200 ul d’agarose fondu.

Clonage La ligature de I’insert dans le vecteur de clonage pUC 18, dephosphoryle et coupe par I’enzyme de restriction Smal (pUC 18 Smal/BAP 50 ug/ml - Pharmacia), est realisee a I’aide du kit de clonage Sure Clone ligation kit (Pharmacia) a partir de 100 ng de produit de PCR purifie. Deux cents microlitres de batteries rendues competentes par le CaCI, [6] sont ajoutes a 20 pl du milieu de ligature. L’ensemble est incube 30 min dans la glace puis 5 min a 37”C, ce choc thermique permettant I’entree de I’ADN plasmidique dans les batteries competentes ; puis 1 ml de milieu riche est ajoute avant d’incuber 1 h a 37°C. Les batteries sont ensuite centrifugees 30 s a 10 000 rpm a temperature ambiante puis remises en suspension dans 100 ul avant d’etre etalees sur gelose contenant 100 pg d’ampicilline, 20 ul d’lsopropylthiogalactoside (IPTG) 2% et 50 ul de X-Gal. La boite est incubee la nuit a 37°C.

SBlection des plasmides Les colonies blanches ayant effect& I’a-complementation sont et&tees avec la pointe d’un cure-dent sterile et mises en culture dans 3 ml de milieu LB contenant 100 ug/ml d’ampicilline pendant la nuit a 37°C sous agitation. Parallelement, le cure-dent, avant la mise en culture, est trempe dans un milieu d’amplification (10 ul de tampon Taq DNA polymerase, 200 PM de dNTP, 50 pmoles d’amorces Ml3 universelle et reverse, H,O qsp 100 ul). Apres une amplification de 30 cycles dans

Protocole de s6quenGage des ADNc des ARNm..

les conditions citees precedemment, 10 ul du milieu sont deposes sur un gel d’agarose 15% contenant du BET, ce qui permet de determiner la taille des inserts et de selectionner les colonies bacteriennes recombinantes pour le sequencage (fig 2). Un millilitre de la preculture des batteries recombinantes est repris dans 100 ml de LB contenant 50 ug/ml d’ampicilline pendant la nuit a 37°C sous agitation. L’extraction des plasmides des batteries recombinantes est realisee au moyen d’un kit d’extraction de plasmide (Plasmid Maxi Kit, QIAGEN Inc, Chatsworth, CA, Etats-Unis). L’ADN purifie est mis en suspension dans du tampon TE (10 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA pH 8) et est pret a sequencer.

Skquenpfge Depuis sa premiere description en 1977 [8], la methode enzymatique de sequencage de I’ADN utilisant des didesoxynucleotides triphosphates (ddNTP) a ete largement diffusee. En pratique, le sequencage de I’ADN est realise avec le kit de sequencage T7 Sequencing Kit (Pharmacia) selon les conditions definies dans le protocole fourni, en utilisant 2 ug d’ADN extrait precedemment et les amorces de sequencage Ml 3 universelle et reverse. Les reactions de marquage radioactif sont effect&es par I’a33PdATP (10 uCi/uI). L’electrophorese des produits des reactions de sequence est realisee en conditions denaturantes sur un gel de polyacrylamide a 8% de 0,2 mm d’epaisseur contenant 40 ml de solution bisacryl/actylamide 30%, 50 ml de solution d’uree 46% et 10 ml de TBE 10 fois concentre (Tris Borate 0,9 M - EDTA 0,02 M). Le melange est degaze sous vide pendant 10 min puis la polymerisation est catalysee par I’ajout de 300 ul de persulfate d’ammonium a 10% en presence de 100 ul de I’agent reticulant (TEMED, Bioprobe Systems, Montreuil-sous-Bois, France). Apres denaturation 2 min a 80°C 3 pl de chaque reaction de sequence sont deposes dans des puits adjacents par series de quatre. La migration se fait pendant environ 5 h a voltage constant (1380 V) en tampon de migration TBE. Apres migration, le gel est place dans un bain contenant 10% d’acide acetique et 10% de methanol pendant 20 min. Le gel est transfere sur une feuille de papier filtre (Whaan 3MM), recouvert d’un film plastique et s&he 1 h a 80°C sous vide a I’aide d’un secheur de gel. Le gel est ensuite place en chambre noire, dans une cassette d’exposition, et recouvert avec un film X-ray (XOMAT XAR-5 - Kodak). L’exposition dure environ 12 a 14 h a temperature ambiante puis le film est developpe. La lecture du film autoradiographique se fait sur un negatoscope et la sequence nucleotidique obtenue est soumise a comparaison dans les banques de donnees EMBL et Genbank.

RBsultats et discussion Nous avons applique ce protocole au sequencage de genes codant de nombreux anticorps derives de souris lupiques BW. La transcription inverse a et6 realisee avec une amorce oligod(l). Elle peut Bgalement l’etre avec des hexameres aleatoires. Toutefois, dans ce cas, les rendements d’ADNc obtenus sont inferieurs. Malgre I’etablissement des conditions optimales

M

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B

J 500450 bp

Fig 1. Amplification des premiers brins d’ADNc des regions variables des chaines lourdes (A) et des chaines leg&es (B). La piste M contient 500 ng de marqueur de poids moleculaire @x174/Hint II. Dix microlitres du milieu d’amplification sont deposes sur un gel d’agarose a 1,5% en presence de 3 ul de BET. La migration s’effectue en tampon TAE pendant 30 min a

]500-SSObp

Fig 2. Test PCR des inserts lies dans pUC 18. L’amplification de I’insert & partir de colonies blanches (pistes 1 a 3) donne des bandes respectivement a environ 500-550 bp. La piste M contient 500 ng de marqueur de poids moleculaire (100 bp Ladder, Pharmacia).

de PCR permettant l’obtention d’une seule bande specifique d’amplification, ce resultat n’est pas toujours atteint. C’est pourquoi la purification des replicons sur gel a bas point de fusion s’est r&elee indispensable de facon a ne cloner que des fragments specifiques. Dans le cadre de cette etude, c’est-a-dire du sequencage des genes d’immunoglobulines, des amorces complementaires des regions constantes situees en 5’ des premiers brins d’ADNc sont utilisees. Comme on ne dispose pas d’amorces specifiques des extremites 3’ des premiers brins d’ADNc correspondant aux genes VH ou VL, la technique de la PCR ancree est utilisee [2]. Elle consiste a rajouter une queue polyd(G) en 3’ du premier brin d’ADN (reaction d’homopolymerisation) grace a une Terminal desoxynucleotidyl Transferase (TdT) puis a utiliser, d’une part, une amorce complementaire du premier domaine de la region constante et, d’autre

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F Javelin

et a/

vecteur peut Qtre a I’origine de colonies blanches. C’est pourquoi I’etape de selection par PCR est importante. La figure 2 montre une de ces selections. L’experience montre qu’on selectionne, parmi les colonies blanches, environ 10% de faux positifs. Ces faux positifs se traduisent par une bande d’amplification d’environ 100 paires de bases alors que I’insert est attendu a environ 500550 bp. L’extraction des plasmides recombinants est une etape delicate car le sequencage necessite une matrice pure. C’est pourquoi nous avons opte pour le kit d’extraction plasmidique Qiagen qui aboutit a I’obtention d’acides nucleiques qui satisfont aux criteres de purete requis. La figure 3 montre une sequence partielle des regions variables de I’anticorps d’etude inset-e dans pUCl8. Cette technique nous a permis d’analyser les caracteristiques structurales de plusieurs autres anticorps monoclonaux produits chez la souris BW et preferentiellement diriges contre un epitope moleculaire complexe dont I’ADN ferait pat-tie integrante et qui pourrait en fait rep&enter tout ou partie du nucleosome, comme cela a ete rapporte chez la souris MRL [4, 51.

FGf6rences Fig 3. Analyse de sequence. Les plasmides prepares a partir d’E co/i presentant un insert de bonne taille (pistes 2 et 3, cf fig 2) ont ete sequences par la methode des dideoxynucleotides en utilisant le kit de sequenpage 17 1~ Sequencing Kit aa (Pharmacia).

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part, une amorce polyd(C) complementaire de la queue polyd(G) pour amplifier I’ADN cible [3]. La ligature en bouts francs necessite la presence d’extremites franches sur I’insert et sur le vecteur de clonage. II a ete montre qu’au tours des cycles de polymerisation en chaine, la polymerase ajoute des adenines en absence de matrice generant des fragments 3’ sortant [l]. Par consequent, le produit de PCR doit 6tre prealablement prepare en utilisant I’activite exonucleasique 3’-+5’du fragment Klenow de I’ADN polymerase I en absence de dNTP de facon a obtenir des bouts francs. Les fragments PCR sont, de facon concomitante, phosphoryles en 5’ grace g I’ATP par la T4 polynucleotide kinase. Apres extraction par le phenol/chloroforme et purification sur colonne de chromatographie (MicroSpin Column-Pharmacia), le produit PCR peut etre lie B n’importe quel vecteur dephosphoryle pot-tant des extremites franches. Une recircularisation de

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a 9

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