Puces à ADN et autres systèmes d'analyse génomique

CAHIER DANS

Les puces & ADN L’alternative des microbilles Hors de la miniaturisation, point de salut ? Les laboratoires sur puces

Puces ii ADNet autres

No128 LA

REVUE

BIOFUTUR

No208

DkCEMBRE

2000

0

ncore utopique il y a quelques an&es, 1’Ctude des gPnes et des processus cellulaires zk l’analyse simultanie : de plusieurs dizaines de milliers d’ADN et d’ADNc diffkents, est aujourd’hui devenue une rPalit& Rendue possible par les rtkultats des programmes de skquenfage, notamment celui du gknome humain, cette nvancke est igalement intimement like i la mise au point de nouveaux outils avant considkablement accru 1’Cchelle des analyses ginomiques. Parmi ceuxci, les puces i ADN sent aujourd’hui les plus ripandues. Ces systknes, caractirisks par leur miniaturisation, une forte capacite de trait~ment en paraikk, et une remarquable aptitude H I’automatisation, sent utilisables dans diffirents types d’applications : la dktection des mutations, le gknorypage, la mesure des niveaux d’expression des gknes, ou encore le diagnostic.. Toutefois, d’autres approches technologiques, pour I’heure mains midiatides, sent en tours de mise au point - hybridation sur microbilles, laboratoires sur puces (luhs-OU-chiljs). Elles pourraient s’imposer comme des alternatives ou des c(~mpl~ments in&essants dans le contexte d’applications prkises. Comme bon nombre de mkthodes de biologic mokuiaire, la technologie de beaucoup de puces 1 ADN est fondle sur le phknomkne d’hybridation. Cette reaction,

rCalisPe dans les conditions physico-chimiques idoines, permet 2+deux brins d’acides nuclCiques de sequences complk~entaires de s’associer ktroitement pour former une mokule double brin, un duplex. Ilune des utilisations de cette &action naturelle a consist6 2 fixer des molicules caractCristes agissant comme des hamecons, encore appelkes sondes, sur un support solide, le filtre, puis a faire kagir ce drmier avcc un tkhantillon d’acides nucliiques contewnt potetltiellement des siquences compl~mentaires. TransposCe d&s le debut des an&es 1990 sur un support solide (et non plus une membrane poreuse), miniaturis~e g&e a des pro&d& relevant de la biologie moliculaire, mais igalement de I’klectronique, de I’informanque et de la chimie combinatoire, cette technique ailait dormer naissance aux puces j ADN. Aujourd’hui, la puce j ADN (n-&ssouvent qualifike de DNA ~z~c~~~rr~r~s, voir plus loin) ne doit pas Ctre considkee comme une technique, mais plut6t comme une plate-forme technologique, regroupant un vaste ensemble de syskmes qui diffkent en fonction du type de support utilisP, dc la nature et de la densit des sondes (leur nombre par unit6 de surface), du mode de fixation ou de synthkse de ces sondes, des conditions d’utilisation et dr lecture. Ajoutons i cela

par Fraqois Gbli,

Biorhone, koie Normaie Superieure de Lyon, 46, av. d’ltalie, 69007 Lyon Gerland. francols.geli@ wanadoo.fr

Photo d’ouverture (0 A. SYRE0ISP.L.I

A chaque sonde son adresse. Les sondes sont r&parties sous la forme de spots A la surface de la puce. A l’emplacement d’un spot don&, B son aciresse, correspond une sonde particuli&e. Callumage d’un spot traduit I’hybridation d’une sequence &.hantillon avec une sonde. LE TECHNOSCOPE DE BIOFUTUR 206

l

Ohxmbre 2000

3

que certaines de ces puces ne sent pas seulement des supports d’hybridation, mais be1 et bien des (( microreacteurs abou peuvent itre rialises l’amp~ification ou I’elongation d’un fragment d’acide nucleique (on parle alors de puces d’amplification ou de puces d’elongation), et L’on comprendra la t&s grande diversite de ses systemes.

technique est fondee sur le pro&de classiquement employe par les synthetiseurs d’oligonucleotides et consiste a deplacer une chambre de reaction (oif se deroule la reaction d’elongation de l’ohgonucliotide), le long d’une surface de verre. D’autres approches, beaucoup plus elaborees, la photolithographie (2) et 1’1~impression )) (8) ont egalement CtC developpies. La photolithographie, le pro&de a l’origine des GeneChiprM de la societe californienne Affymetrix (Santa Clara), est derivee des techniques de conception des microprocesseurs. La surface de la puce est modifiee par la fixation de groupements chimiques photolabiles pouvant Ptre actives par la lumiere. Une fois iliuminis, ces groupes sent susceptibles de riagir avec l’extremite 3’ d’un nucleotide. En protegeant cette surface par des masques de formes definies, on peut illuminer et done activer selectivement des zones de la puce oti l’on souhaite fixer l’un ou l’autre des quatre nucleotides (A,T,G,C). L’utihsation successive de masques differents permet d’alterner des cycles de protection/reactions et en consequence, de <(faire pousser ja les sondes d’oligonuci~otides sur des spots d’environ 24 micrometres carres. Cette resolution permet de creer jusqu’a 250 000 spots sur une surface de 6,64 cm2. Sa diminution a 10 pm2 permettrait d’atteindre une densite de 1 million de spots par centimetre carre. La photolithographie presente des parallele, eile permet de avantages : massivement crier une puce de N-mires en seulement 4xN cycles de d~protection/r~actions (1 pour chaque base) et ce, quel que soit le nombre de sondes. De plus, elle ne requiert aucune preparation ni manipulation d’ADNc. Toutefois, la conception des masques de photolithographie est a la fois longue et onereuse (4,6). Des chercheurs de l’universite du Wisconsin (Madison) ont rtcemment propose une alternative Cligante a l’utilisation de ces masques (6). Leur solution consiste B activer la surface de la puce grace a la lumiere

l_E Quoi qu’il en soit, il est possible de skier cet ensemble en considerant les principaux modes de fabrication des puces a ADN. Ces differentes techniques, synthese in situ ou microdepot, ont ete concues afin de ccgreffer )) une sonde (ADNc, oligonucleotide) de sequence don&e sur un spot dont la position est parfaitement definie. On peut done dire, selon la terminologie utilisee par les informaticiens, que chaque sonde est ccadressie )) a la surface de la puce. Ainsi, lire une puce a ADN revient )a reperer ies spots ou la reaction d’hybridation a effectivement eu lieu, ses differentes positions &ant specifiques d’une sonde jvoiv la photo p. 3) . Si la capacite d’adresser un grand nombre de sondes sur un petit support d’hybridation traduit une certaine maitrise technologique, toutefois, elle ne suffit pas a constituer des puces a ADN performantes. Un des points essentiels, pour certaines applications ccl le gtnotypage, est surtout la ma&rise des conditions d’hybridations.

Comment faire une puce ? La synthese in situ aboutit a l’elaboration de sondes courtes, des oligonuclCotides, directement sur la surface de la puce. Edwin Southern, l’inventeur du fameux Southern Blot, est Cgalement l’un des pionniers de la synthese d’oligonucleotides in situ (1). Sa

50-2866 spots

64w3ofhpim

8xT2cm2

9868Spots 2,7 x 1,0 cm2

88-84oosp&~ 1,8xl,8cmZ

25 &RN totel

f ARNm

2 AiWm

10 AFtNm

0,l ARN total

40 Valwn~ d’hybrkfation (ml)

lO.fO-3

2-10,lW

0,2

091

Limite de d&ecticll

l/20 000

EFlvimll1120000

l/lOi?OOO

113ooocK)

l/WY000

Quantit6 dlstectebte minimum (108 mcl6culesf

25

60

20

$0

0,2

Fonet

Wantit&

~1,28xl,zBcm2

2o@spots Sx4mmz

d%chantillon (J&J)

D’aprb le groupe Technologies avanct?espour le gdnome et la clinique (TAGC) de I’lnstitut de candrologie et d’immunobgie de Marseille. http://taQc.univ-mrs.fr/microarrays

4 LETECHNOSCOPE DE BIOFUTUR206 l Dkembre2000

reflitchie

par

une

matrice de micromiroirs. Des sont concus sur ordinateur et la matrice &l&hit des faisceaux d’ultraviolets selon le patron dPfini zn s&co. Cette technique, dksormais exploitee par la soci& Nimblegen (South Rosa, Madison), a permis de crt?er 16 000 spots d’une surface de 16 pm1 et pourrait theoriquement permettre de cr&er environ SO0 000 sondes sur une surface de 1,4 cm’. L’S
masques virruels

Pourquoi faire une puce ? La mesure des niveaux d’expression des genes constitue une des applications les plus remarquables des puces i ADN. Cette mesure peut itre realisCe de faGon B quantifier les diff~re~tes especes d’ARNm prCsentes dans une celiule. I1 s’agit alors d’une

@valuation absolue de l’expression des gknes. I1 est t?gaIement possible de dkterminer les variations de niveau d’expression, caractkrisant par exempie une mime cell&e c&i&e dans deux conditions diff& rentes. Les puces portant des sondes d’ADNc sent plus particuli&rement concues pour ce type de mesure

Une belle tranche de puces. RBalis6es sur un circuit intkgr6, les puces a ADN de technologie MICAM sont produites & de multiples exemplaires sur des tranches de silicium, encore appelbes wafers.

diffkrentielle de I’expression des gtnes. En prarique, pour rPaliser une mesure, on marquc tout d’abord au moyen de deux fluorochromes differents, l’un rouge et I’autre vert, les ADNc r&&ant de la transcription inverse des ARNm de deux Pchantillons A et B. Ces deux lots sent ensuite mClangis et hybrid& sur la puce. Ap& &action, les intensitPs des signaux relatifs h l’un et l’autre des fluorochro~les sont mesurees et normalisies en fonction des paramktres exp&imentaux. En calculant pour chaque spot le rapport de I’intensitC des signaux (fluorescence rouge / fluorescence verte), il est possible d’Cvaluer I’expression diffkrentielle des g&es. Un rapport supPrieur j 1 implique une surexpression du gene dans I’ichantillon A par rapport k l’&hantillon B. A I’inverse, un rapport inferieur i 1 est Iii i une surexpression dans l’~chantillon. Enfin, si le rapport est kgsal i 1, le g&e est exprimi de faGon Cquivalente dans les deux &hantillons. La publication de certains articles rtlatant l’utilisation des GeneChipTM pour la mesure absolue des quantitis des diff;rentes espices d’ARNm d’une cellule ou d’un tissu a trPs largement contrihui j faire la rtputation des (( expression GeneChip )a d’Atfymetrix) (10). li chaque ARN messager correspondent deux jeux de sondes, l’un parfaitement compl~mentaire de la siquence cible, et l’autre c(~nteslant en sa position centrale une base qui donnera lieu 2 un mPsappariement. Or, la diffirence des signaux relatifs aux hybridations de ces deux types de sondes est directement proportionnelle i la concentration de I’ARN messager. Cette technique se caracterisc par une trPs grande sensibiliti (voir le tableau 1, p. 4) et par une spPcificit& t&s nettement superieure i une mPthode comme la PCR yuantitative. Toutefois, elle ne permet pas d’itudier l’expression des g&es inconnus. Enfin, il semhle important de souligner que l’utilisation des membranes de LETECHNOSCOPEOEBlOFUTUR206

l

DCcembre2000 5

nylon pour ce type d’etude reste parfaitement compititive. Lequipe du projet Technologies avancees pour le genome et la clinique (TAGC) de 1’Insritut de cancerologie et d’immunologie de Marseille, tout comme le projet Biospace conduit au CNRS par l’iquipe de Jacques Mallet, ont en effet, utilise ce type de support pour mettre au point des puces a ADN presentant notamment une sensibilite remarquable (voir le tableas 2, p. 4) ($1).

mutation et hybridation Le parallClisme est incontestablement I’une des caracteristiques phares des puces a ADN. Toutefois, cette notion souleve aussi un probleme. Comment reaiiser en parallele des centaines de reactions d’hybridation, alors que la temperature a laquelle cette reaction s’effectue dans des conditions optimales varie justement d’une sonde a une autre, en fonction de sa composition en base A-T et G-C ? Le defi majeur pour l’industrie des puces i ADN n’est pas de greffer un maximum de sondes sur une surface solide, mais plutot de maitriser les conditions d’hybridation. D’une importance relative dans les experiences de mesure d’expression des genes, ce probleme se rivele crucial pour le ginotypage. En effet, pour ce type d’application, il est absolument ntcessaire de s’assurer de la specificit de I’llybridation a la base pres. Plusieurs solutions ont ete proposees pour resoudre ce probleme et mettre au point des puces dediees a la detection des mutations. Pour identifier un nucleotide particulier au sein d’une sequence don&e, les GeneChip d’Affymetrix utilisent quatre sondes, distinctes par la nature de leur base centrale. La comparaison de la yualite des hybridations pour ces quatre bases permet alors de determiner quelle sonde s’est parfaitement appariie i la sequence echantillon. Cette astute trouve toutefois ses limites d&s lors qu’il est necessaire de distinguer de facon fiable des sequences hetirozygotes. Pour contourner cette difficult6 supplementaire, Affymetrix multiplie encore le nombre de sondes : cinq groupes de quatre sondes de longueurs differentes (15 mers, 17 mers, 19 et 21 mers) sont employ&. L’approche de Nanogen (San Diego, Californie) repose sur un contrdle des conditions d’hybridation au niveau de chaque sonde par un champ glectrique. Ce pro&de permet de moduler ces conditions et de reduire la stringence du milieu de reaction. II limite aussi la formation de structures secondaires au sein des fragments J’ADN de l’echantillon. Motorola utilise les technologies developpies par Andrei Mirzabekov a I’Institut Engelhardt de Moscou, puis au Laboratoire national d’Argonne, dans 1’Illinois (Gtats-Unis) (12). D’une part, des sondes d’une longueur d’environ huit nucieotides sont fix&es dans des microcoussinets de gel de polyacrylamide, ce qui a pour effet d’augmenter le nombre de sondes specifiques au niveau des spots oh se deroule l’hybridation. D’autre part, apres l’hybridation des echantillons sur ces sondes cc fixes )), on ajoute un deuxieme jeu de quatre sondes courtes (des 5 mers) en solution et marquees par un fluorochrome. Chacune de ces quatre sondes possede un nucleotide different a son extremitt 3’. L’hybridation de ces sondes est normalement peu stable et surtout t&s sensible au mesappariement. Mais lorsque le 5 mers parfaitement compl~mentaire s’est fix&, son hybridation est stabilisee par le voisinage du 8 mers. 6 LETECHNOSCOPEDEBlOFUTUR206

l

Dkxmbre2000

Une aucre approche de ce probleme cons&e a mettre en ceuvre des sondes d’acides nucl~iques modifies. Le PNA, ou peptide nucleic acid, est un ersatz d’ADN dont le squelette a et& modifie en remplacant les groupements pentose phosphate par un acide amine, la glycine. Les duplex PNA/ADN prisentent une specificite et une stabilite superieures aux duplex ADN/ADN, car la molecule de PNA est neutre (contrairemenr i 1’4DN qui est n~gativeInent charge). Cette stabilite naturelle permet de diminuer la stringence du milieu, et de limiter Cgalement la formation de structures secondaires dans les fragments d’ADN echantillon. Toutefois le PNA se caracterise encore par un co& Clevi limitant son utilisatioli. Une autre idee, exploitee grace au brevet depose par la societe Applig~ne-~ncor (QLiantunl BiotechIlologies, aujourd’hui Q.Biogene, Illkirch, France), consiste a modifier les bases azotees pour Cquilibrer la force des liaisons A-T et G-C.

Pourquoi se limiter il i’hybridation ? Si une analyse precise des mutations se revele difficile a realiser par la simple reaction d’hybridation, pourquoi ne pas mettre en ceuvre d’autres strategies ? De fait, ii existe plusieurs types de puces i ADN dont les sondes vont capturer des sequences en preambule a une reaction qui permettra de caractiriser ces mimes sequences. Ce principe est illustre par ies puces de type APEX, Arrayed Primer Extension Method (13, 14). Les sondes sont fixees sur la puce par leur extremite 5 et leur sequence est concue de telle sorte que Ieur extrimiti 3’ est contigue a la base dont on souhaite connaitre l’identid dans la sequence cible. Une fois la cible capturee, les sondes sont utilisees comme des amorces dam une reaction de On ajoute au milieu reactionnel les sequenfage. quatre didisoxynucleotides marques chacun par un fluorochrome de couleur differente et I’ADN polymerase. L’amorce est allongee d’une base complementaire au site Ctudie et sa nature est rev&e par la couleur du fluorochrome. La technique de criblage de polymorphismes d’un seul nucliotide (SNP), mise au point par Sequenom (San Diego), est assez proche de la precidente. Une sonde sert d’amorce a une reaction d’elongation. Toutefois, le mode de lecture des rtsuhats est totalement different. 11 fait ici appel a la spectrometrie de masse, mithode d’analyse permettant des mesures de masses d’une extreme precision. Ainsi, il est possible de determiner, a partir de la masse de la sonde/amorce atlongee, quelle base a Cte ajoude a sa sequence. Certaines puces, concues notamment par Cepheid et Applied Biosystem, permettent de realiser des rtactions de PCR. La societi Molecular Staging (New Haven, Connecticut) a mis au point une technique d’amplification, la Rolling circle amplification (RCA), qui d’apres ses promoteurs, permet de produire en condition isotherme 1011 copies d’un fragment d’ADN pouvant cam&riser spicifiquement une sequence don&e (c’est ce qu’on appelle une signature ; voir Qltls loin) d’ADN en 1 heure. Realisable sur une puce, la RCA s’impose comme une alternative tres serieuse pour le diagnostic genetique et l’analyse i haut debit des SNP.

COMMENT SE PASSER D’ADRESSAGE ? Fondement essentiel de la technologie des puces ADN, I’adressage spatial des sondes sur un support solide n’est pas la seule methode permettant la rialisation d’analyses genomiques paralleles. En effet, deux societes americaines, Luminex (Austin, Texas) et Illumina (San Diego, Californie), ont diveloppe des techniques ekgantes qui m&sent des microbilles et Pliminent toute utilisation d’automates de depots de sondes. Leur idee : fixer des sondes (oligonucleotides) ou des ligands (anticorps, substrats d’enzymes) specifiques sur des microspheres portant une ccetiquette )) individuelle, et plus prtcisement un code optique. Ainsi, aprks la reaction, la lecture de cette etiquette permet d’identifier sans ambigtnte une microbille don&e, et done la sonde ou le ligand se trouvant a sa surface. Une autre entreprise, la californienne Lynx Therapeutics (Hayward), a quant a elle mis au point une technique de clonage in vitro ou des ADNc sont fix& a des microbilles individualisees par un court oligonucleotide.

La technologie, BeadArrayThl, proposee par I’universite Tufts (Medford, Massachusetts) et disormais exploitee par la socitke caiifornienne Illumina (San Diego) repose, elle aussi, sur I’utilisation de microbilles portant un code couleur (l&17,18). Toutefois, la dktection des hybridations est dans ce cas realisee par un systeme de lecture trts original, dont I’element central est constitue de faisceaux de fibres optiques modifiies. Comment se compose cc systeme ? La section d’un faisceau regroupant .5 000 a 50 000 fibres optiques (le diamitre de chaque fibre peut varier de 3 a 7 pm ; voir la photo ci-dessous) est traitie par une solution d’acide hydrof~u(~rique. Ce compose attaque la section de chaque fibre (uoir Biofutur 205, le Tichnoscope ) et creuse a sa surface une petite caviti d’une profondeur d’environ 2 pm. Au final, le faisccau de fibres se trouve couvert de nucropuits. avec une densite de I’ordre de SO 000 puits/mmz. Chaque puits constitue un receptacle dans lequel pourra se loper une microbille (3 pm de diametre) portant un code optique resultant, comme dans la technologic Luminex, d’un

Des micro~illes B code optique La technologie de Luminex, encore appeke

LabMAP, emploie des microbilles de polystyrene de 5,5 pm, dont la signature consiste en un code optique associant deux fluorochromes, Pun orange et I’autre rouge (15). En faisant varier les proportions de ces deux colorants, il est possible d’obtenir 100 ccteintes b) differentes et identifiables, et done de disposer de 100 lots de microbilles caracteriis par une signature individuelle. Des ligands de differentes sortes, des oligonucliotides, des anticorps.. . peuvent ctre lies de faGon covalente a la surface de la microsphere, Y&Zdes groupements carboxyl. Une fois remelangees, les microspheres sent mises en reaction avec l’echantillon test marque, par exemple un fragment d’acide nucliique obtenu par PCR et auquel on a fix6 un fluor~hrome vert. Le melange est ensuite analysk par un cytometre de flux qui va d’une part identifier chaque bille en fonction de son code couleur, et d’autre part mesurer la fluorescence verte trahissant une reaction d’hybridation effective. Les problemes IiCes aux conditions d’hybridation sont les mCmes que ceux Cvoquf’s prkMemment pour Ies puces a ADN. Cette technique peut @tre adaptee P des types d’analyses tres varies (dosage d’immunoglobuline, mesure de charge virale, genotypage). Elle consomme tres peu de reactifs, ne necessite pas d’itape de lavage ; enfin, la detection est quasi instantanee : des milliers de microspheres par seconde sont R lues 1).Le marquage de deux ichantillons avec deux fluorochromes distincts autorise l’analyse simultanee de melanges d’tchantillons et permet d’envisager des mesures d’expression differentielles. Enfin, il est possible de decupler le nombre d’analyse menees en parallele (de 100 a plusieurs centaines, voire plusieurs milliers) en multipliant le nombre de codes optiques. Visant cet objectif, Luminex a entame avec Life Technologies (desormais dans le giron d’Invitrogen) un programme de recherche et developpement, finance a hauteur de 49 % par le gouvernement americain via le National Institute of Standards and Technology. Les deux partenaires souhaitent developper i partir du LabMAP une veritable plate-forme pour les analyses genomiques a ham debit.

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--

l-es microbilles d’lllumina. En bas, une partie d’un ensemble de 96 faisceaux compatible avec les plaques & 96 puits (a droite, un zoom sur un faisceau).

melange de fiuorochrome. Identifiee par sa signature 2 000 codes optiques differents sent disponibles - et porteuse d’une sonde oligonucleotidique particuliere, chaque bille constitue un hameqon sptcifique susceptible de pecher une sequence sptcifique au sein d’un mklange complexe. Pour analyser un cchantillon de fragments d’acides nucleiques, on les marque dans premier temps avec un fluorochrome Cmettant un signal different de ceux Pmis par Its microbilles. Les microbilles sont ensuite melangees j I’echantillon. Apres la reaction, le faisceau de fibres optiques est trempi dans le milieu reactionnei et les microbilies viennent se ioger dans les micropuits. 1.e signal imis par le fluorochrome port6 par les sequences de l’tchantillon indique si une reaction d’hybridation s’est produite. L’analyse du code couleur permet de determiner quelle sonde a reagi. LE TECHNDSCOPE DE BlOFUTUR206l D~cembreZDOO 7

e clonage in vibv, Nlegackme, est le point de depart de la technique MPSS (Massivepadlel signature sequencing), pemtettant d’inven-

L

s’hybrider un second oligonucl&otide marqub par un fluorochrome et

torier tous les genes exprim& par une cellule, y compris les plus rares

jouant le r&le de d&odeur. La for&ion de ce dkodeur est d’identifier l’adaptateur effectivement hybrid& a I’ADNc et done de r&&r lee

(1). Une caract&istique essentielle diifferencie cette technique des mi?thodes utilisant les puces a ADN d’expression : elle peut &ire r&i-

quatre nuckotides de I’extrknii6 3’ terminale de cette &quence (v&r la f&we). Comment s’effectue le s6quenc;age d’une banque Megado-

s&e sans connaissance de la &quence des g&es exprim&

ne ? Les bilks trika par cytom&rie sent d&&mass&s du fiuorochmme fix& B I’ADNc et regroup&s dans une cellule de verm compartimentee

la mQhode SAGE (2), la MPSS cons&

ZId&rminer

Comme

puis B d&ombrer

de courtes s@~ences des 16 B 20 nucl&ides, des signatures ou tags sptkifiques de chacune des diff&en%s esp&ces d’ARN messager

(18 compartiments, regroupant chacun environ 62 000 microbilles) air elk sent rang&s les unes t‘ c&e des autres. Deux ouverhlres pemwt-

(ARNm) exprimk.

tent I’anfv6e des r&ctife et leur &acuation aprk r&action. La cellule est

Toutefois, la technique mise au point par Lynx The-

rapeutics prkente I’avantage de ne ntkessiter aucune &ape de s&aration physique des ARN transctfts. Les signatures spkiiquea

sent

plac& sous on microscope confocal. A I’issue de chaque cycle, un dch$ en Ruoreecence de chacun des 16 compartimente est en-

obtenues par une m&hode originale consistant a skquencer lee 16 B

par une cam&a CCXI. la colleote des inky

20 nuclktides constituant I’exttimit4 des ADNc, correspondent aux ARNm de la cellule &udi&, une fois ceux-ci captur& sur les micm-

Gage de 20 bases sur I’ensemble des microbilles contenues dans une cellule de lecture s’effectue en cinq jaws (1). Par la suite, un traitement

billes constiiant

logic&l pennet de twonstituer les @i&en&s signatures et de Ies skier en diikentes familles de g&es. La carac&istique la plus impression-

la banque Megaclone. Cette m&hode de skquen~

ge est fond& sur I’it&a&w de plusieuts cycles d’hybridation de l’ext&m&5 de I’ADNc avec un petit oligonucl&tide, d&ommb adaptateur.

relatives au s&uen-

nante du MPSS est, comme aon nom I’indique d’ailleurs, son pamWs-

Get adaptateur poss&ie deux caract&istiiues particuli&es. Premikement, il contient le site de reconnaissance d’une enzyme de

me. Cinq cycles d’un pro&d& certes complexe, petmettent le s&uenFage simultant5 de millions d’ADNc. Le nombre d’occurences d’une

restrictiin, Bbvl (une endonuclkse

signature donnbe est repr&entatif de I’abondance de I’ADNc corres-

de type II), qui coupe I’ADN 6

nuckotides au-de& de la Stsquence00 elle se fixe cycle de s&quen+~ge, I’addii nuck%ides qui wont

; ainsi & I’issue d’un

s&uenceS lot5 du cycle n+l. Deuxi&nement, il

est do% d’une s&uence

pondant dans I’Bchantillon.

n

de I’enzyme Bbvl va d&oiler les quatre

code de 10 nuclktides,

sur laquelle peut

(1) S. Brenner et al. (2000) Nat Biotechnol. 18,880%34. (2) V. E. Velculsecu et a/. (1996) Science 270,484-485.

Un cycle de stjquenqage de la m&hode MPSS. Quatre groupes de 266 adaptateurs - chaque groupe contient un adaptateur compl&nentaire de l’exWmit& de I’ADNc - r&gissent avec I’ADNc fix4 sur la microbille. Seize dkodeurs,

qua&e par groupe

d’adaptateurs,

portant un

fluorochrome (la phycoerythrine) sont ajoutes successivemeti. Ces seize &apes permettent de s&quencer base par base les quatre nucl&Hides terminaux de I’ADNc. L’addition de Bbvi lib&m les quatre nuclbotides suivants pour le prochain cycle.

Une fibre optique portant un puits donnk transmet le signal de fluorescence relatif g ce puits jusqu’au dttecteur d’une cam&a CCD. Chaque microsphkre et done chaque sonde n’est pas identifige en fonction de sa position spatiale, mais par son code optique. La technologie BeadArrayTM peut s’adapter i de nombreuses configurations. L’assemblage de 96 faisceaux de fibres correspond au format classiyue des microplaques, mais muItiplier leur nombre par 4 ou 16 permet de traiter les plaques B 384 ou 1 536 puits. I1 est kgalement possible de rtaliser 1’Ctude 8 LETECHNOSCOPEDEBlOFUTlJR206 l D~c~mbre2000

exhaustive d’un Cchantillon en le melangeant i des lots de billes portant difftrents jeux de sondes, ou d’analyser simultaniment plusieurs Cchantillons avec un seul tot de billes. Cette grande flexibilid prisente un avantage certain par rapport au GeneChipTM d’affymetrix. Associt? B Applied Biosystems, Iilumina Ptudie l’application de sa technique au criblage des SNP, ou g l’analyse des niveaux d’expression des gPnes. Par ailleurs, BeadArrayThl n’est pas uniquement limit&e k 1’Ptude des acides nucliiques et pourrait Ctre employke pour l’ktude des relations protkine-protkne.

Quand le clonage se joue sur des billes La sock+& Lynx Therapeutics a utilise les microbilles pour divelopper une technique de clonage in vitro particulierement novatrice. Denommie Megaclone, cette derniere permet de constituer une banque representative de I’ensemble des ARNm d’une cellule, quel que soit son niveau d’expression, sow la forme de sequences d’ADNc associies a un vaste ensemble de microbilles de 5 pm de diametre (19). La puissance de la technique est lice au fait que chaque microbille, et par consequent chaque ADNc, est identifiee par un oligonucl~otide 32 mers unique. Une fois constituee, une banque megaclone peut itre Ptudite par differentes techniques permettant de cribler des SNP (methode Megatype) ou de mesurer les niveaux d’expression des genes de facon absolue (20) (mtthode

.

soit approximativement 0,Ol %. La population d’ADNc couplee aux anti-etiquettes est amplifiee par PCR et marquee par un fluorochrome. Elle est ensuite melangte aux microbilles, dont chacune Porte une anti-etiquette. L’hybridation anti-etiquettes/etiquettes permet alors de cccharger n les ADNc sur les microbilles (chaque microbille peut capturer environ 100 000 copies d’un ADNc). Une derniere Ctape de cytomktrie en flux permet de recuperer les billes fluorescentes, celfes ayant effectivement capture un ADNc. Ces ADNc sont ainsi directement accessibles a differents types d’analyses et presentem l’avantage de pouvoir etre analyses simultanement sans autres manipLllations. Pour l’etude de l’expression differentielle des genes, on fabrique deux banques Megaclones representant les deux Pchantillons a comparer. Des sondes correspondant aux ADNc d’inttrit sont r&parties en deux lots

; Polnta Whims

l%Bln@m

‘ili3fMm

Combi~delassHet ~-f@-mY

Simpllcitb, fkbiiii

et

Wthode

redondante

Limit& i3 I’anaiyee de

faible coot biine lw fWx poeitifs,

I’expmseion diffkentielle entre des types cellufaires wieiis

Pact du Differmnti$ dhpky

Ntkzeseite une phase de don%@ Limit& B I’an&yse de I’expreesion diffkentielle Pee de quantification

~~~~~u~ eftee

mof4culi#m

dV4RNm par l’attritwrion $9 stgMwe? Swim

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S’applrcrre aux Btudee dii~tienes ou ebeoluee

Requiert de nombmux ebquen@gee

e6quef?ces n’est wuke f&udee diitielfee Paederedondance ._.._._. -._.

MPSS, voir Z’encadve’ 1, p. 8) ou differentielle (mithode Megasort). La premiere &ape de creation d’une banque Megaclone est la synthese des oligonucl~otides identifiant les microbilfes et les ADNc. Huit tetranucleotides : TTAC, AATC, TACT, ATCA, ACAT, TCTA, CT-I-T, CAAA sont associes selon toutes les combinaisons possibles (soit 88) au tours d’un pro&de de chimie combinatoire (voir Biofutur Z&&26-32). On obtient alors 16,7 millions de sequences simple brin differentes, qui sent par la suite transformees en double brin. L’un des brins de ce duplex constitue une Ctiquette, tandis que I’autre brin (de sequence complementaire) joue Ie role d’anti-etiquette. Dans un second temps, les etiquettes sont associees a 1’ADNc obtenu a partir des ARNm extraits par exemple d’une cellule ; les anti-etiquettes sont pour leur part fixPes a des microbilles. Le nombre d’etiquettes (plus de 16 millions) est t&s largement superieur a celui des ADNc (de l’ordre de quelques centaines de miIliers) et des lors, la probabiliti que deux ADNc differents se lient a une mime etiquette est particulierement faible,

marques par deux fluorochromes differents. Une hybridation competitive des deux jeux de sondes est realisie sur le melange des deux banques. Enfin, un cytometre de flux permet de trier les billes en fonction du taux des deux fhzorochromes, puis de sequencer les ADNc de ces billes trikes.

HCJRS QE LA ~INIATU~ISAT~~~, POINT DE SALUT ? Une bonne part de I’intCrit suscite par les puces i ADN est directement like a leur efficacite pour l’analyse du niveau d’expression des genes (10). Si les techniques sur microbilles ne sont pas encore aussi avancees, leur potentiel parait deja Cnorme. Toutefois, miniaturisation et haute technologie ne constituent pas forcement un passage oblige pour Ctudier les modulations de I’expression des genes. Avant l’emergence des puces a ADN, diffirentes techniques ont et& mises au point a cet effet : le Northern Blot, la RT-PCR, protection a la RNase, LETECHNOSCOPEDE~iOFUTUR206

l

D~~embreZOOO 9

M

ise au point par plusieurs Bquipes am&icaines et russes et pu-

fractions. Ces deux lots d’ADNc sont d6naturk,

blibe en 1996, la m&hode SSH (Suppression

deux brins de I’ADNc, puis m4ang&

substractive

hy-

bridization) permet de c&r des banques regroupant les ADNc de g&nes exprim& de faGon diff&entielle, et ce quelle que soit leur abondance

afin de &parer les

B I’ADNc Smoin en exc&s.

Cette reaction aboutit ~3une rarbfaction des homohybrides non diffkentiels de Wchantillon. En effet, les simples brins d’ADNc

relative. Cette technique se fonde sur deux &actions d’hybridation

diffkentiels de l’~chantillon s’hybrident surtout avec les simples b&s

successives destin&s d’une pat-l B Bliminer les &quences dont le taux ne varie pas, et d’autre part ~3bquilibrer les concentrations de celles

d’ADNc non diff&entiels, complementaires et en excbs, provenant du tissu de rfSf&ence. Cette r&action aboutit aussi B l’~quilibrage des

dont I’expression a effectivement btB modifibe. Une derniltre &ape de PCR petmet finalement une amplification exponent&&e des seuls ADNc

diffdrentes espkccesde ce type d’ADNc. Ensuite, les deux lots sont de nouveaux melang& avant une deuxibme et derni&e &ape

diffkentiels (les ADNc c(communs )) sont quant B eux amplifik linkai-

d’hybridation

rement ou pas du tout). Pour ce faire, on divise

s’hybrident pour former des duplex qui constituent, comme on peut le voir sur la figure, les seules sequences & pouvoir Btre amplifibes

correspondant

en deux

lots

distincts

les ADNc

aux ARNm de 1’8chantillon MuditS. Deux couples

d’adaptateurs, correspondant B deux couples d’amorces de PCR diffbrents, sont fixes aux ADNc de I’une et I’autre de ces deux

avec le Gmoin.

RBsultat, les ADNc

diffkentiels

par le couple d’amorce choisi.

n

(1) L. Diatchenko eta/. (1996) PNAS93, 60256030.

; b) pas d’amplification (formation d’6pingles (3 cheveux) ; c) amplification IinWre ; d) pas d’amplification (absence d’arnorces) ; e) amplification exponentieile ; 9 raMi&

a) pas d’amplification peu efficace

le Differential Displuy (21). Des techniques relativement efficaces pour 1’Ctude d’un nombre limit6 de genes. Elles prksentent toutefois plusieurs limitade parallilisme et tions majeures : elles manquent 10 LETECHNOSCOPEDEBlOFUTUR206

l

Dkembre2000

restent peu adapttes a I’automatisation. D’autres mithodes, apparues peu avant I’kmergence des puces k ADN, telles que SAGE (Serial analysis of gene ou analyse sCrielle de l’expression gknique (Z?]),

SSH (Suppression substructive hybridization [23]) (voir l’encadre’ 2), ou I’indexage moleculaire (Molecular indexing) (24, 25), constituent quant 1 elles des solutions &games pour l’analyse d’un grand nombre de genes, tout en exploitant des techniques molCculaire classiques de biologie (voir Le tableatr 2). La plupart de ces methodes consistent i faire une partition d’une population d’ARN complexe en plusieurs sow-populations CaractCrisCes par une signature spCcifique.

signature particuligre f26). Dans le cas present, cette signature contient deux informations, d’une part une courte sequence de huit nucliotides, constituge du site de clivage d’une enzyme de restriction (MspI) et des quatre nucliotides suivant immCdiatement ce site de restriction, d’autre part la distance sCparant cet octanu&otide de I’extremitC 3’ terminale de 1’ARNm (voir l’encadrk 3, p. 12). Cette methode revient & diviser une population d’ARNm en 256 sous-populations d’ADNc (voir la figure cidessous). Au sein de ces sous-populations, chaque

A chaque ARN sa signature Selon le postulat qui sert de fondement 5 la SAGE, une courte sequence de neuf nucliotides (ii en existe 49, soit 262 144) sit&e i une position donnCe d’un ARN messager constitue une marque, une signature spCcifique de cet ARN messager. D& lors, une population complexe d’ARNm peut gtre riduite i un ensemble de signatures, et le recensement de celles-ci, 1’Cvaluation de leur friquence, permet une analyse quantitative de la population des ARN messagers transcripts. En pratique, les Ctiquettes sont obtenues, de faGon reproductible, en coupant les ADNc j proximitt: de leur extrCmitt 3’ grlce B l’action de deux enzymes de restriction, NIA III dans un premier temps, puis l’endonucl~ase (de type IIS) Fok I. Aprts amplification, les itiquettes produites sont assemblees sous la forme d’une longue molicule, un concat&m&e, qui sera ensuite clonC et sCquencC. Cette toute dernikre itape r&le la frCquence de chaque &iquette et permet d’&aluer la proportion des diff& rents ARNm dans l’&hantillon de dipart. Le grand avantage de la SAGE est de permettre g tout Iaboratoire disposant de ressources limitkes - une machine h PCR et un skquenqage mCme c
La TOGA. Un oligonuci~tide,

portant un rksidu biotine

(pour faciliter sa r&cupCration ultkieure) et constitu6 d’une skie de thymidine et du site de coupure de I’enzyme Not I, set-t d’amorce & la r&otranscription des ARNm en ADNc. Apr&s coupure des ADNc par I’enzyme Mspl, on r&up&e, gr&ce B des billes magn&iques couvertes de streptavidine, des fragments correspondant pour chaque ARN a la stSquence s’6talant de son extrhmit6 au premier site de coupure de Mspl. Apr&s digestion par Not I, ces fragments sont ins&s dans un vecteur d’expression (pb SK+). Apr&s lin6arisation et transcription, on obtient pour chaque fragment un ARNc qui sert de matrice a une &ape de r~~tran~dption. On enchaine ensuite deux PCR utilisant une amoree 3’ compl6mentait-e d’une sequence connue de CADNc et

TOGA, une technique S part

marquee en fluorescence et toutes les amorces pouvant correspondre 1 I’extr6mit6 5’ de I’ADNc. Une seule de

Plus rCcemment, la sociCtt5 Digital Gene Technology (La Jolla, Californie) et le dipartement de biologie moliculaire du Scripps Research Institute ont igalement d&eloppt une technique, la Total gene expression analysis (TOGA), pour Cvaluer l’abondance et la nature des ARNm. A I’instar des techniques evoquies plus haut, le principe du TOGA consiste h assigner i chaque espkce d’ARNm une

ces amorces donnera l’amplification d’un produit, dont la pr&ence et la taille sont spkifiques de I’ARNm dont il d6rive.

ARNm est reprCsentt par un fragment d’ADNc de longueur spkcifique. Sa realisation demande un tr& grand nombre d’ampIifications par PCR, qu’il n’est pas envisageable de realiser 1smanuellement j). LETECHNOSCOPEDEBlOFUTUR206

l

Dkcembre200011

D

es lors qu’elle correspond a un ARNm connu, la 1~si-

virtuelIes pour differents organismes (homme, souris...)._

gnature * d’un fragment d’ADNc generee par la methode TOGA est suffisante pour identifier de faqon sp&i-

L’analyse des resultats de la TOGA est realisee sur un logiciel qui interroge pour chaque fragment les bases de

fique cet ARNm. Ce type de fragment, observe sur gel

donnees virtuelles. Si un fragment est identifie comme

ou produit in silica &partir dune banque de donnees, pout done etre considere comme une etiquette de sequence

constituant effectivement un DST, sa representation gra-

exprim&e (expressed sequence tag, EST) derivant de I’ext&mite 3’ de la sequence qu’il caracterise. Digital Gene

phique est marquee par un asterisque. Want aux fragments inconnus, ils ne sont pas marques. Pour chaque fragment marque, le logiciel de DGT fait correspondre

Technology (DGT) a d’ailleurs donne a ces fragments le

un lien hypertexte

nom de DST, pour digital sequence tag. L’utilite des DST

GenBank et diverses au&es bases de donnees publiques ou priv&ss des informations supplementaires (annotations,

est iiee au fait que DGT a developpe, a partir des sequences repertoriees dans les banques de don&es publiques, des bases de donnees regroupant des DST

Digital Gene Technology a done congu une station a PCR automatike qui permet de traiter les echantillons rapidement, et avec un contritle de qualite suffisant. Cette approche a I’avantage de permettre d’analyser I’expression des genes sans requerir au prealable la moindre information sur les sequences potentiellement exprimees. D’apres ces auteurs, une experience de TOGA permet d’identifier 60 % des ARNm exprimes dans une cellule, a un taux sup& rieur P 1 pour 100 000.

LES LA_BQRATOlfjES $UR PUCES Compte tenu des difficultes techniques soulevtes par les etudes genomiques a grande tchelle, ou encore par le diagnostic genttique, l’appareil d’analyse ideal devrait pouvoir a lui seul realiser toutes les phases de traitement et d’analyse de l’echantillon, Etre suffisamment sensible pour se satisfaire d’une t&s petite quantite d’tchantillon, consommer des volumes limitis de reactifs et realiser les analyses a haut debit. Un ultime perfectionnement de cet instrument pourrait meme lui permettre de tenir dans la main, ou tout du moins d’etre portatif. Cet appareil n’a pas encore vu le jour, mais il n’a rien d’utopique car la technologie

litterature, etc.) sur la sequence correspondant a priori au DST caracterise.

l

D&embre2000

n

des c
L’hmergence des laboratoires sur puces Le concept de laboratoires miniaturists concentrant sur une mute petite surface I’ensemble des procedes necessaires a la reatisation d’analyses chilniques ou biologiques a emerge a la fin des annees 1980 dans des laboratoires des societes Hitachi (27) et C&a-Geigy (28). Au sein du laboratoire bllois de I’entreprise pharmaceutique, Andreas Manz et son Cquipe ont developpe le concept de m-TAS (Miniaturized total analysis system). II s’agit d’une famille d’appareils miniaturises, comme des puces de verre susceptibles de realiser sur une surface de moins de 6 cm2 tomes les &apes d’une separation par ilectrophorese capiilaire ou d’une chromatographie. Un prod&e rendu possible par l’utilisation de pro&d& de microt~hno~ogie, photolithographie, gravure chimique, suffisamment p&is pour creer i la surface de differents materiaux (principalement le verre, le quartz et le silicium) des reseaux de microcanaux dont la largeur et la profondeur sont comprises dans une fourchette de 10 a quelques dizaines de micrometres ! Logiquement, les premieres

A gauche, le circuit microfluidique de Caliper Technologies d’Agilent Technologies.

12 LETECHNOSCOPEDEBlOFUTUR206

qui permet d’aller chercher dans

; 2 droite, la * cassette >>laboratoire sur puce

applications du concept de m-TAS a la biotechnologie ont concern6 la separation des acides nucleiques par Clectrophorese capillaire. Des 1994, I’equipe de Richard Mathies, a l’universite de Californie, publiait la separation de fragments d’ADN, de 72 a 1 353 paires de bases, sur une puce a ilectrophorese capillaire (EC) (29). Cette experience se caracterisait Cgalement par sa rapiditi : les fragments itaient en effet separes en seulement 120 secondes, soit 10 fois plus vite qu’avec un appareil classique. Mais un defi essentie1 des laboratoires sur puces consiste a integrer plusieurs procedes combinant la preparation des Cchantillons et leur analyse. Des 1996, il Ptait en partie realisi avec un prototype de puces combinant amplification par PCR et amplification par EC (30). Aujourd’hui, I’une des caracteristiques les plus frappantes de la technologie des laboratoires sur puces est certainement son dynamisme et la grande diversitC des solutions techniques mises en place par les laboratoires ou les societes privees presents sur ce secteur emergent. Plusieurs approches de microfluidiques ont, par exemple, ete proposees pour assurer le transport des tres petits volumes de liquides, de I’ordre du nano- voire du picolitre, utilises par les laboratoires sur puces. La creation d’un flux Plectroosmotique, la force thermocapillaire, la gravite ou encore la force centrifuge constituent autant de modes de propulsion des liquides susceptibles de constituer une alternative a I’utilisation des micropompes et des microvannes. La detection des analytes repose encore sur des mesures de fluorescence ; toutefois la spectrometrie de masse ainsi que la detection Clectrochimique sont Cgalement envisageables (31). L’electrochimie a I’intCrCt de permettre le developpement d’appareils portatifs.

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3

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De I’utilit6 des laboratoires sur puces Resultats de I’assemblage de techniques tres diverses, les laboratoires sur puces se caracterisent igalement par un champ d’application particulierement vaste. Le premier systeme commercialise a CtC Clabore conjointement par Caliper et &lent. I1 constitue une alternative a l’electrophorese sur gel des acides nucleiques (ADN ou ARN). Les separations par electrophorise capillaire sont realisees sur une puce qu’on pourrait decrire comme une petite cassette (voir les photos page prkc~dente). Ce systeme permet de s&parer et de caracteriser la taille de fragments d’ADN (de 2.5 a 12 000 paires de bases selon la cassette employee). Des cassettes sont dtsormais igalement disponibles pour I’analyse des proteines. Plusieurs prototypes de laboratoires sur puces did& a la caracterisation de la taille de fragments d’ADN ou leur sequencage ont Cti developpes par des laboratoires universitaires americains. La possibilite de realiser des microsequenpages sur une longueur de 20 a 50 bases, qui permettent des genotypages, fait de ces systemes des concurrents tres serieux des puces a ADN dans le domaine du diagnostic genetique. Le fris prolifique departement de chimie de l’universitt de Californie (Berkeley) a notamment mis au point un systeme miniaturise d’electrophorese capillaire in&grant 48 capillaires pour le traitement parallele de 96 echantillons (32). Son interit ? I1 permet, selon ses concepteurs, de realiser des experiences de genotypage avec une rapidite 50 a 100 fois superieure a

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celle des techniques automatisees conventionnelles. Cette equipe californienne a integre ce systeme dans une chaine associant la preparation des echantillons par lyse cellulaire, l’amplification et la separation, afin de developper un appareil cctout en un )) pour le diagnostic genitique : le Personal Genetic Analyser. La division de chimie et de sciences analytiques de I’Oak Ridge National Laboratory travaille egalement sur une puce i&grant PCR et separation des produits d’amplification (33). La societe Gamera (Medford, Massachusetts) a pour sa part developpe, sur un disque d’une surface Cquivalente i celie d’un cederom, un veritable microiaboratoire d’analyse biologique, dans lequel les fluides sont mus par la force centrifuge. Une fois charge sur ce LahCD, un Pchantillon sanguin peut etre &pare en deux fractions : serum d’une part et constituants cellulaires d’autre part, puis soumis a une batterie de tests diagnostiques, notamment I’Elisa.

Les acteurs L’innovation des laboratoirer n’est cependant pas limit&e teur public, bien au contraire tres nombreuses societes prive multiplient les inventions e interessent de p&s les @ants de l’instrumentation. On a deja evoqut l’association d’Agilent et de Caliper. La societe Applied Biosystems a quant i elle entame, des avril 1998, une collaboration avec Aclara Bioscience (mountain View, Californie une sock% ayant entres au1 diveloppe des puces a electn rese en plastique. En Europe, le groupe anglo-suedois Amersham Pharmacia Biotech a crCC une societe d’essaimage, Gyros, didiee aux laboratoires sur puce. L’Institut de microtechnique de Mayence, en AlIemagne, est a la pointe des techniques de micro-usinage : il a developpe une puce i Clectrophorese au format d’une carte de credit. Les principaux acteurs du secteur britannique ont forme un consortium reunissant sept universites (Cardiff, Bangor, Newcastle, I’Imperiai College de Londres.. .) et plusieurs societes privees. Dans I’Hexagone, Genset s’est Ian&e en 1999 dans une collaboration avec le CEA pour le developpement d’une puce a genotypage. Le projet Nanolab reunissant la societe Biorhbne (Lyon) et le laboratoire d’analyse et d’architecture des systemes (LAAS, Toulouse) Porte quant a lui sur l’elaboration d’un laboratoire miniaturise combinant une puce a ADN et un circuit microfluidique permettant la prise en charge d’un Cchantillon d’un bout a I’autre de son anaiyse.

Conclusion

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I L

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La valorisation, dans le domaine de la recherche fondamentale ou de la recherche appliquee (pharmacogenomique, diagnostic genetique...), de la fantastique masse de don&es issues des programmes de sPquenc;age passera par la mise au point de nouveaux systemes d’analyse. Pour s’imposer sur un marche estime z?tpres de 10 milliards de dollars en 2010, ces 14 LE TECHNOSCOPE DE BIOFUTUR 206

outils devront ttre susceptibles de fonctionner i ham debit, tout en &ant bon marche. Outils de reference dans le domaine de I’analyse de l’expression des genes, les puces cca hybridation )) rencontrent certaines limites pour des applications comme I’analyse en masse des polymophismes de simples nucliotides. Certaines solutions reposant sur la mise en ceuvre de reactions plus complexes, ou sur un contritle pousse de la reaction d’hybridation permettent toutefois de contourner ces difficult&. Quoi qu’il en soit, et en depit de leur defaut, notamment leur manque de standardisation, les puces a ADN ont en quelque sorte ouvert la voie P une nouveiie instrumentation des sciences biotogiques. Le t&s fort inter& suscite ces derniers temps par la proteomique, la discipline clef de la post-genomique, s’accompagne de I’tmergence du concept de puces a proteines. La encore, les difficultes techniques ne manquent pas ; toutefois, un certain nombre de societes (notamment I’americain Ciphergen ; voiv Bioentreprke) ou de laboratoires academiques rivahsent deja d’ing~niosit~ pour les franchir, d’un saut de puces.

l

Docembre 2000

(28) A. Manz et al. (1990) Sensors Actuators Bl, 244-248. (29) R.A. Mathies, A.T. Wooley (1994) Proc. Naf/Acad. Sci. USA 91, 11348-11352, (30) A.T. Wooley et at. (1996) Anai. Chem. 68,4081-4086. (31) R.S. Ramsey, J.M. Ramsey (1997) Anal. C/rem. 69, 1174-1178. (32) P.C. Simpson eta/. (1998) Proc. NatlAcad. Sci. USA 95, 2256-2261. (33) J.Khandurina eta/. (2000) Anal. Chem. 72,13, 2995-3000.