Qualité ovocytaire et embryonnaire : les marqueurs apoptotiques ont-ils leur place dans le potentiel préimplantatoire ?

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Gyne´cologie Obste´trique & Fertilite´ 36 (2008) 730–742 http://france.elsevier.com/direct/GYOBFE/

Faits et arguments

Qualite´ ovocytaire et embryonnaire : les marqueurs apoptotiques ont-ils leur place dans le potentiel pre´implantatoire ? Oocyte and embryo quality: Do the apoptotic markers have a place in the preimplantation genetic diagnostic? D. Haouzi a,b,c, J. De Vos a,c, V. Loup a,b,c, S. Assou a,c, S. Gasca a,b,c, L. Reyftmann b, B. Klein a,c, S. Hamamah a,b,*,c Institut de recherche en biothe´rapie, hoˆpital Saint-E´loi, CHU de Montpellier, 80, avenue Augustin-Fliche, 34295 Montpellier cedex 5, France b De´partement de me´decine et biologie de la reproduction, service de gyne´cologie–obste´trique, hoˆpital Arnaud-de-Villeneuve, CHU de Montpellier, 371, avenue du Doyen-Gaston-Giraud, 34295 Montpellier cedex 5, France c Inserm, U847, Montpellier, France a

Rec¸u le 28 novembre 2007 ; accepte´ le 5 fe´vrier 2008 Disponible sur Internet le 21 juillet 2008

Re´sume´ Dans le cadre de l’Assistance me´dicale a` la procre´ation (AMP), les taux de grossesse et de naissance apre`s fe´condation in vitro (FIV) restent faibles. Depuis quelques anne´es, la recherche dans ce domaine explore de nouveaux crite`res de se´lection ovocytaire et embryonnaire par l’utilisation de marqueurs apoptotiques. De nombreux travaux rapportent qu’une mauvaise qualite´ des ovocytes et des embryons pre´implantatoires a e´te´ associe´e, entre autres, a` l’apoptose. Le but de cette revue est de faire un e´tat des connaissances actuelles, d’une part, sur l’apoptose des ovocytes et des embryons pre´implantatoires ; d’autre part, d’analyser la possibilite´ d’utiliser des marqueurs apoptotiques comme un moyen fiable de se´lection des ovocytes et des embryons afin de pre´dire le devenir d’une FIV. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. Abstract In Assisted Reproductive Technology (ART), the pregnancy and birth rates following in vitro fertilization (IVF) attempts are still low. Recently, research in the field of ART has explored new oocyte and embryo quality selection criteria such as apoptotic markers. Many studies provided evidence that bad oocyte and embryo quality can be associated with apoptosis. The aim of this review is to summarize our current knowledge on the apoptosis process in oocytes and embryos, and focus on the possibility of using apoptotic markers as a reliable and predictive marker to select competent oocytes and embryos during IFV. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. Mots cle´s : Assistance me´dicale a` la procre´ation (AMP) ; Apoptose ; Controˆle ge´ne´tique ; Ovocyte ; Embryon ; FIV ; Microenvironnement ; Diagnostic Keywords: Assisted Reproductive Technologies (ART); Apoptosis; Genetic control; Oocyte; Embryo; IVF; Microenvironment; Diagnosis

1. Introduction L’infertilite´ est un proble`me de sante´ publique qui affecte environ 60 000 couples en aˆge de procre´er par an en France. Les * Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (S. Hamamah).

infertilite´s fe´minines repre´sentent environ 60 % des causes d’infertilite´. Les raisons pour lesquelles certains couples subissent des e´checs re´pe´te´s de fe´condation in vitro (FIV) sont subtiles et complexes. Cependant, certains e´checs sont associe´s a` une mauvaise qualite´ embryonnaire, qui de´pend en premier lieu de celle des game`tes. Bien que ce domaine ait connu d’importants progre`s technologiques, la se´lection des

1297-9589/$ – see front matter # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. doi:10.1016/j.gyobfe.2008.02.028

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ovocytes repose encore et principalement sur l’e´valuation de crite`res morphologiques et demeure une e´tape ope´rateurde´pendante. Les taux de naissance par transfert d’embryon ne de´passent gue`re les 15 % [1]. Aussi, tous les laboratoires d’Assistance me´dicale a` la procre´ation (AMP) s’entendent-ils sur la ne´cessite´ d’ame´liorer les me´thodes d’e´valuation de la qualite´ des ovocytes et des embryons afin d’augmenter les chances de grossesse. Plus re´cemment, des phe´nome`nes d’apoptose ou mort cellulaire programme´e ont e´te´ de´crits dans l’embryon pre´implantatoire [2,3]. La re´gulation du de´veloppement des embryons est e´troitement controˆle´e par des signaux de mort et de survie cellulaire. La destine´e d’un embryon en de´veloppement de´pend donc d’un e´quilibre entre les facteurs induisant la prolife´ration, la croissance, la diffe´renciation et ceux induisant l’apoptose. L’apoptose peut eˆtre induite ou accrue par des conditions suboptimales de culture in vitro, mais sa cause primaire pourrait e´galement re´sulter de l’apoptose de´ja` de´clenche´e dans l’ovocyte ayant permis l’obtention de l’embryon. Nous de´taillons dans cette revue l’e´tat de la connaissance du controˆle ge´ne´tique de l’apoptose ovocytaire et embryonnaire, ainsi que les conse´quences des conditions de culture sur ce processus. 2. L’apoptose L’apoptose est une forme de mort cellulaire programme´e indispensable au de´veloppement embryonnaire, a` l’home´ostasie et a` la surveillance des agressions contre l’organisme, comme les infections, une prolife´ration incontroˆle´e ou des le´sions cellulaires se´ve`res [4]. Au cours de notre de´veloppement, des cellules sont produites en exce`s, puis selon des crite`res pre´cis, certaines meurent afin de ge´ne´rer des structures particulie`res a` l’organe forme´. Le nombre de cellules est donc controˆle´ par l’e´quilibre entre prolife´ration cellulaire et apoptose. Par exemple, la morphogene`se des doigts implique l’apoptose des cellules de l’espace interdigital ge´ne´re´es au de´but de l’embryogene`se. Dans notre syste`me nerveux, les neurones sont ge´ne´re´s en exce`s, puis plus de la moitie´ est e´limine´e par apoptose afin de cre´er un e´quilibre entre ceux-ci et les cibles qu’ils innervent. Par ailleurs, les canaux de Mu¨ller qui e´voluent en ute´rus, trompes de Fallope et partie supe´rieure du vagin chez la femme sont d’abord pre´sents dans les fœtus maˆles, puis sont e´limine´s par apoptose. Les de´re`glements de l’apoptose sont donc associe´s a` de nombreuses pathologies : une stimulation excessive de l’apoptose est responsable de la maladie de Huntington, la maladie d’Alzheimer, ou encore le syndrome d’immunode´ficience acquise et joue un roˆle fondamental dans la carcinogene`se. 2.1. Manifestations morphologiques de l’apoptose Lorsqu’elles meurent, les cellules acquie`rent progressivement une morphologique typique caracte´rise´e par de profonds remaniements structuraux et fonctionnels, diffe´rents de ceux observe´s dans la ne´crose et permettant a` la cellule de se de´tacher de ses voisines pour eˆtre e´limine´e par phagocytose.

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Ces modifications structurales impliquent la condensation du cytoplasme et du noyau, l’alte´ration des organites cytoplasmiques tels que les mitochondries et les lysosomes et l’invagination des membranes plasmiques et nucle´aires [5–7]. Des boursouflures membranaires apparaissent alors au niveau de la membrane plasmique confe´rant a` la cellule un aspect en « grappe de raisin » facilement visualisable en vide´o microscopie en temps re´el [8]. Tous ces e´ve´nements vont ainsi permettre a` la cellule de se fragmenter en corps apoptotiques qui seront alors phagocyte´s par les cellules voisines [5,6]. Une modification de l’asyme´trie membranaire, accompagne´e de l’externalisation de la phosphatidylse´rine (PS), permet la reconnaissance de la cellule et son e´limination par les cellules phagocytaires. L’annexine V, qui se lie spe´cifiquement a` la PS, permet ainsi la de´tection (par immunofluorescence et cytome´trie de flux) et la quantification des cellules apoptotiques [9]. Paralle`lement, l’ADN est de´grade´ par des endonucle´ases qui agissent pre´fe´rentiellement au niveau des liens internucle´osomiques. En e´lectrophore`se sur gel d’agarose, ces fragments d’ADN sont mis en e´vidence sous la forme d’une e´chelle dont chaque barreau correspond a` un multiple de 200 paires de bases. Ce clivage internucle´osomique de l’ADN peut aussi eˆtre facilement de´tecte´ par la technique histochimique dite de terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labelling (TUNEL), qui marque les fragments d’ADN au niveau de l’extre´mite´ 3’OH terminale libre [10–12]. 2.2. Les ge`nes de l’apoptose Deux approches comple´mentaires ont e´te´ particulie`rement fructueuses pour la description de l’apoptose, la forme apparemment la plus re´pandue et certainement la plus e´tudie´e de la mort cellulaire : l’analyse biochimique et l’analyse ge´ne´tique de mode`les biologiques simples (notamment C. elegans et D. melanogaster) [13,4]. La machinerie enzymatique de l’apoptose est constitue´e d’une famille de ` ce jour, 14 caspases ont e´te´ cyste´ine prote´ases, les caspases. A ´ identifiees chez l’Homme, mais il est probable que cette liste ne soit pas exhaustive [14–18]. Les caspases sont pre´sentes dans chaque cellule sous forme de zymoge`nes, dont l’activation est soumise a` des nombreux points de controˆle [14–18]. Les membres de la famille Bcl-2 et de la famille des inhibitor of apoptosis protein (IAPs) sont des e´le´ments fondamentaux des voies responsables du controˆle de l’apoptose [19–21]. Les deux voies principales de la transmission du signal apoptotique, aboutissant a` l’activation de caspases, sont la voie extrinse`que, qui de´marre par l’engagement de re´cepteurs de surface de la famille TNFR (re´cepteurs de mort) [22], et la voie intrinse`que ou une ple´thore de signaux convergent vers la mitochondrie via les membres pro- et antiapoptotiques de la famille Bcl-2 [19–23]. Les deux voies sont connecte´es par Bid, une prote´ine proapoptotique de la famille Bcl2 qui est active´e par la signalisation extrinse`que [24]. Des phe´nome`nes d’apoptose ont e´te´ de´crits dans le blastocyste, et plus re´cemment, tout au cours du de´veloppement de l’embryon pre´implantatoire [25,26]. Le de´veloppement des

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embryons pourrait de´pendre d’un e´quilibre entre la prolife´ration cellulaire et l’apoptose. Toutes les donne´es actuelles confirment que l’utilisation de conditions suboptimales de culture in vitro affectent se´ve`rement la survie des embryons. Cependant, il est fort probable qu’elle re´sulte en partie d’une mauvaise qualite´ des ovocytes fe´conde´s, mais de´ja` compromis par l’apoptose. L’e´tude du controˆle ge´ne´tique de l’apoptose dans les game`tes et les embryons pre´implantatoires est donc d’une importance conside´rable. 3. Apoptose ovocytaire 3.1. Au cours de la pe´riode fœtale Le stock de´finitif de follicules primordiaux, qui entreront ulte´rieurement en phase de croissance folliculaire chez l’adulte, s’e´tablit pendant l’ovogene`se dans le fœtus. Plus de 90 % des cellules germinales pre´sentes dans le fœtus a` mi-gestation auront disparu a` la naissance. Les re´sultats expe´rimentaux dans le mode`le animal confirment que ce processus de de´ge´ne´rescence des cellules germinales se produit par apoptose au cours des phases de mitoses goniales, de prophase de la me´iose I et de formation des follicules primordiaux. Les cellules apoptotiques ont e´te´ identifie´es par marquage in situ aussi bien chez l’Homme [27,28] que chez la souris [29]. Du fait de la limitation d’utilisation et d’exploitation d’e´chantillons humains, la plupart des donne´es set fournie par l’utilisation d’espe`ces animales. En particulier, l’invalidation de ge`nes chez la souris, aussi bien de certains membres de la famille Bcl-2 que des caspases, a permis de mettre en e´vidence leur roˆle cle´s dans l’apoptose ovocytaire et folliculaire [30,31]. Chez l’Homme, l’implication de ces voies dans le de´terminisme du nombre de cellules germinales dans les ovaires fœtales est indique´e majoritairement par des techniques d’immunolocalisation. Ainsi, certains membres antiapoptotiques de la famille Bcl-2, tels que Bcl-2 et Mcl-1, et proapoptotiques tel que Bax [28,32], ainsi que l’ensemble des caspases 2, 3, 7, 8 et 9, ont e´te´ de´tecte´s dans l’ovaire fœtal humain [33]. La forme active´e clive´e des caspases initiatrices 8 et 9 et des caspases effectrices 2 et 7 a e´te´ confirme´e par immunoblot, ce qui n’est pas le cas de la caspase 3, l’une des caspases effectrices la mieux caracte´rise´e [33]. Cependant, l’activation de la caspase 3 a e´te´ visualise´e par marquage immunohistochimique dans toutes les espe`ces e´tudie´es. Le nombre de cellules germinales exprimant la caspase 3 active´e augmente entre la quatorzie`me et la dix-neuvie`me semaine de gestation, puis devient nul dans les follicules primordiaux humains [33] et murins [34]. L’invalidation du ge`ne de la caspase 3 chez la souris sugge`re que cette prote´ase est primordiale dans l’apoptose des cellules de la granulosa, mais pas pour les cellules germinales de l’ovaire en de´veloppement [35,36]. En revanche, l’inactivation des ge`nes de la caspase 2 ou Bax chez la souris se traduit par une augmentation drastique du nombre de follicules primordiaux dans l’ovaire postnatal [37,38]. L’e´tude de la cine´tique d’expression des acteurs et re´gulateurs de l’apoptose apparaıˆt donc cruciale afin de de´finir les me´canismes et les voies de signalisation implique´s dans ce processus.

Plusieurs facteurs trophiques ont e´te´ identifie´s dans l’ovaire en de´veloppement et re´duisent in vitro la perte des cellules germinales aussi bien chez l’Homme [39] que chez les rongeurs [40]. La cause et la re´gulation de cette apoptose ne sont cependant pas entie`rement e´lucide´es a` ce jour. Cependant, des e´tudes re´centes sugge`rent l’implication du re´cepteur a` tyrosine kinase TrkB, dont les ligands principaux sont les neurotrophines bone derived neurotrophic factor (BDNF) et neurotrophine 4 (NT4), dans la re´gulation de la survie des cellules germinales [41]. Ce re´cepteur « a` de´pendance » est capable de de´livrer deux messages : en pre´sence de ces ligands principaux, ces re´cepteurs transduisent un signal positif classique, par exemple la survie ; en absence de leurs ligands, ils induisent, en revanche, la mort de la cellule par apoptose. L’implication de cette voie de signalisation est conforte´e par l’analyse du phe´notype associe´ a` l’invalidation chez la souris de l’activite´ catalytique de TrkB, l’utilisation d’inhibiteurs spe´cifiques de ces re´cepteurs sur des cultures d’ovaires de souris et humains, ainsi que la localisation des ARNm de la neurotrophine 4 [41]. 3.2. Chez l’adulte Dans l’ovaire humain adulte, la destine´e d’un follicule individuel (croissance/ovulation ou atre´sie) est e´troitement re´gule´e par le dialogue des signaux de mort et de survie cellulaire, qui incluent des re´gulateurs endocriniens (gonadotrophines) et paracrines (ex : GDF9, BPM15). Seule une faible proportion de follicules primordiaux pre´sents dans les ovaires a` la naissance arriveront au stade ovulatoire. Les autres meurent par apoptose durant le processus re´gule´e d’atre´sie folliculaire. Il existe une atre´sie de base affectant principalement les follicules de la re´serve et les follicules en de´but de croissance. Cette atre´sie observe´e tout au long de la vie de reproduction est inde´pendante du cycle. Elle se manifeste par l’involution pre´coce de l’ovocyte et par un faible taux de fragmentation nucle´aire des cellules de la granulosa [36]. Les follicules pre´antraux et a` antrum de´butant pre´sentent un taux d’atre´sie e´leve´ ( 30 %), tandis que les follicules d’une taille comprise ` cette entre 0,5 et 2 mm sont moins touche´s (environ 15 %). A atre´sie de base, s’ajoute une atre´sie cyclique affectant les follicules de plus grande taille (follicules > 2 mm). L’atre´sie cyclique se manifeste d’abord au niveau des cellules de la granulosa qui pre´sentent un taux e´leve´ de fragmentation nucle´aire, puis l’ovocyte de´ge´ne`re rapidement. Les taux d’atre´sie les plus e´leve´s sont observe´s en milieu de phase lute´ale pour les follicules de 2 a` 5 mm et de 6 a` 10 mm, respectivement 73 et 100 %. Plusieurs travaux sur l’e´tude de la qualite´ ovocytaire, aussi bien chez l’homme que la souris, rapportent un taux e´leve´ de fragmentation de l’ADN analyse´ par TUNEL qui est souvent associe´ a` un taux de fe´condation faible [42–44]. L’expression de la caspase 3 est fortement augmente´e dans les follicules pre´ovulatoires entrant en atre´sie [45] et la caspase 3 active´e est de´tecte´e aussi bien dans l’ovocyte [34] que dans les cellules de la granulosa des follicules atre´tiques dans des ovaires de souris [46]. L’apoptose pourrait donc eˆtre un moyen d’e´liminer les ovocytes de´fectueux

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et incompe´tents a` la fe´condation. La description de la cascade apoptotique, son de´clenchement et sa re´gulation ont fait et continuent a` faire l’objet d’un nombre de travaux conside´rables (Fig. 1). Il est probable que le re´cepteur de mort Fas, exprime´ dans l’ovaire postnatal, dans les ovocytes de follicules primordiaux et primaires, soit implique´ dans cette signalisation apoptotique [43]. Or le ligand de Fas (Fas-L) est e´galement exprime´ par les ovocytes de follicules primaires, secondaires et

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tertiaires : le couple Fas/Fas L apparaıˆt donc comme un candidat potentiel du controˆle de l’apoptose ovocytaire [47]. D’ailleurs, l’activation de la voie Fas lors de la maturation des ovocytes in vitro augmente l’incidence de l’apoptose des cellules du cumulus oophorus [48] et plus re´cemment des cellules de la granulosa [49]. De plus, Fas soluble, une forme tronque´e de Fas, connue pour inhiber l’apoptose induite par la stimulation de Fas, est retrouve´e a` un taux important dans les fluides folliculaires et

Fig. 1. Expression des transcrits des membres de la famille Bcl-2 et des caspases au cours du de´veloppement embryonnaire pre´implantatoire humain.

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les milieux contenant les complexes cumulo-ovocytaires d’ovocyte mature [50]. D’autres facteurs inducteurs de l’apoptose ont e´te´ incrimine´s. Parmi ces facteurs, on peut citer des cytokines telles que le TNF-a et l’IL-6 [51–53]. Ces facteurs peuvent agir, soit en conduisant a` la production incontroˆle´e de radicaux libres induisant une e´le´vation de Ca2+ intracellulaire activant a` son tour des endonucle´ases, soit en activant des ge`nes proapoptotiques de la famille Bcl-2 (Bax, BclXS), soit encore en ge´ne´rant certains seconds messagers de type ce´ramide qui iront activer les caspases [54,55]. D’ailleurs, le knock-out de Bax ou de Bcl-2 alte`re la population de follicules primordiaux [56,30]. De meˆme, le knock-out de la caspase 2 aboutit a` une augmentation spectaculaire du nombre de follicules primordiaux dans les ovaires [57,37]. Ces signaux apoptotiques ne sont cependant pas pre´sents au niveau du follicule en croissance dans des conditions normales. En fait, il existe une the´orie selon laquelle l’activation de la prolife´ration cellulaire amorce le programme de mort, qui a` moins d’eˆtre contrecarre´ par des signaux approprie´s de survie, conduit a` la mort de la cellule. Le principal de ces signaux de survie est la follicle stimulating hormone (FSH). Elle est ne´cessaire a` la survie folliculaire apre`s le stade antrum et agit en stimulant, d’une part, la production de facteurs de croissance, tels que l’EGF, TGFa, bFGF et les IGFs qui agissent de fac¸on positive sur les facteurs de re´ponse au stress oxydatif, d’autre part, en modulant l’expression de re´gulateurs apoptotiques. En effet, la FSH agit en inhibant l’expression des ge`nes proapoptotiques de la famille Bcl-2 (Bax et BclXS). De plus, la culture de petits follicules antraux de rat en pre´sence de FSH se traduit par une augmentation de l’expression de XIAP, une inhibition de l’apoptose et une augmentation de la croissance folliculaire [58]. Les IAPs sont une famille de prote´ines de survie d’abord identifie´es chez le baculovirus et qui re´gulent le destin de la cellule en modulant la signalisation apoptotique postmitochondriale. Chez l’Homme, cette famille comprend plusieurs membres dont l’X-linked IAP (XIAP) [59]. La relation entre le contenu en XIAP et l’apoptose est conforte´e par le fait que l’inhibition de l’expression des XIAPs induit l’apoptose et empeˆche le de´veloppement folliculaire en de´pit de la stimulation FSH : les XIAPs jouent donc un roˆle cle´ dans le de´veloppement folliculaire stimule´ par la FSH. Nos re´sultats re´cents analysant le transcriptome des ovocytes adultes montrent que les ovocytes expriment fortement deux facteurs antiapoptotiques, BCL2L10/Diva et la survivine (un membre de la famille des IAPs) et un facteur proapoptotique BNIP1. La balance entre ces facteurs pro- et antiapoptotiques pourrait contribuer a` re´guler l’apoptose ovocytaire chez l’adulte [60]. Il est inte´ressant de noter qu’a` l’inverse d’un roˆle antiapoptotique bien e´tabli des gonadotrophines dans le de´veloppement des follicules antraux pre´coces, la luteinizing hormone (LH) et la FSH augmentent les activite´s des caspases 3 et 7 dans les cultures in vitro de follicules pre´ovulatoires de rat et, par conse´quent, qu’elles potentialisent l’apoptose dans les cellules de la the`que et non dans les cellules de la granulosa [61]. Ce fait sugge`re fortement que l’apoptose des cellules de la the`que est un processus physiologique permettant l’ovulation induite par les gonadotrophines [62].

Bien que l’e´tude du controˆle ge´ne´tique de l’apoptose des ovocytes a pris une importance conside´rable ces dernie`res anne´es et ait permis d’e´lucider les acteurs implique´s dans cette signalisation, la cause en est toujours qu’hypothe´tique (moyen de se´lection d’un ovocyte par ovulation, inte´grite´ de l’ADN, etc.). 4. Apoptose et embryon pre´implantatoire Le terme d’embryon pre´implantatoire se re´fe`re a` l’embryon en de´veloppement au stade zygote (re´sultat imme´diat de la fe´condation) jusqu’au moment de son implantation dans l’ute´rus maternel, ou` l’embryon est appele´ blastocyste. Pendant cette pe´riode, qui inclut d’importantes e´tapes de de´veloppement et de diffe´renciation cellulaire, l’embryon parcourt les voies ge´nitales fe´minines avant de s’implanter dans l’ute´rus, en e´tablissant avec le milieu maternel un intense dialogue mole´culaire. Durant le de´veloppement de l’embryon pre´implantatoire, des phe´nome`nes d’apoptose ne´cessaires a` l’e´limination des cellules ge´ne´tiquement anormales ou mute´es sont observe´s [3]. Le taux d’apoptose, particulie`rement e´leve´ au stade blastocyste, ne peut pas de´passer un certain niveau, sans mener a` la rupture de l’home´ostasie embryonnaire avec pour conse´quence l’arreˆt du de´veloppement. Malgre´ cette se´lection naturelle durant les stades pre´implantatoires, il existe un taux de perte important du fait de l’e´chec fre´quent de l’implantation, estime´e entre 20 a` 25 % in vivo [63]. La phase critique de l’implantation se situe entre le sixie`me et le quinzie`me jour apre`s la fe´condation. Elle est encore peu e´tudie´e, car l’embryon humain obtenu in vitro jusqu’a` ces stades de de´veloppement n’est pas encore cultivable de fac¸on satisfaisante. Dans le cadre d’une FIVet malgre´ des efforts pour ame´liorer des conditions de culture des embryons pre´implantatoires (utilisation de concentration en glucose re´duite, supple´ment d’acides amine´s et de facteurs de croissance dans le milieu de culture, hypoxie controˆle´e), il n’en reste pas moins que seuls 20–40 % des embryons peuvent atteindre le stade blastocyste apre`s six ou sept jours de culture et tre`s peu, par la suite, pre´sentent les caracte´ristiques morphologiques de l’embryon au stade d’implantation. Les embryons sont se´lectionne´s sur la base de crite`res essentiellement morphologiques : re´gularite´ et nombre des blastome`res, vitesse de de´veloppement et taux de fragmentation de l’embryon [64,65]. Le taux d’implantation des embryons aˆge´s de deux ou trois jours est faible puisqu’il n’est que de 10 a` 12 % par embryon. Ce faible taux peut s’expliquer en partie par l’hypermotricite´ ute´rine et le moment inapproprie´ du transfert. Ces embryons sont, en effet, place´s dans un environnement inade´quat puisque, in vivo, des embryons a` ce stade de de´veloppement seraient encore dans les trompes et n’atteindraient l’ute´rus qu’au stade de blastocyste, c’est-a`-dire, cinq a` six jours apre`s la fe´condation. C’est une des raisons qui ont pousse´ les biologistes a` cultiver l’embryon in vitro jusqu’au stade blastocyste. Outre la synchronisation entre l’endome`tre et l’embryon, la culture prolonge´e permet de se´lectionner les embryons les plus compe´tents, au potentiel de de´veloppement e´leve´ et d’e´liminer les embryons bloque´s dans la pe´riode

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correspondant a` l’activation ge´nomique (stade quatre a` huit cellules, j3 a` j4 postinse´mination). Ainsi, depuis 2000, la plupart des e´quipes re´alise des transferts d’embryons de blastocystes et rapportent des taux de grossesse clinique par transfert et d’implantation par blastocyste transfe´re´ plus e´leve´s qu’avec des transferts re´alise´s avec des embryons pre´coces. Cependant, seulement 40 % des embryons se de´veloppent jusqu’au stade blastocyste [66]. Chez beaucoup d’embryons, le ge´nome embryonnaire ne s’active pas et les embryons restent au stade 4 a` huit cellules. L’arreˆt du de´veloppement a` ce stade est peut-eˆtre cause´ par des facteurs ge´ne´tiques, l’apoptose, l’aˆge maternel ou par le ge´nome paternel. De plus, environ deux tiers des embryons obtenus in vitro pre´sentent une fragmentation cellulaire. Cette fragmentation est observe´e aussi bien dans les embryons fe´conde´s in vivo, que in vitro [63,2]. Le roˆle, l’origine et les me´canismes de la fragmentation restent encore mal connus. Cependant, l’impact de la fragmentation sur le de´veloppement embryonnaire n’est plus a` l’heure actuelle plus une notion discute´e. De nombreux travaux soulignent la corre´lation ne´gative entre le pourcentage de fragmentation et le de´veloppement jusqu’au stade blastocyste : la fragmentation excessive est associe´e a` une viabilite´ embryonnaire re´duite et a` un faible taux d’implantation [67]. Plusieurs hypothe`ses sur le roˆle ne´faste des fragments sur le de´veloppement embryonnaire pre´implantatoire ont e´te´ propose´es. Premie`rement, ces fragments peuvent physiquement geˆner des interactions intercellulaires interfe´rant avec le de´veloppement de l’embryon, en particulier aux stades de la compaction, de la cavitation et de la formation de blastocyste [68,69]. Deuxie`mement, ces fragments peuvent re´duire le volume cytoplasmique et ainsi de´ple´ter les embryons d’organelles essentiels ou de domaines polarise´s indispensables au bon de´roulement du de´veloppement [70]. Troisie`mement, l’analyse ultrastructurale des blastome`res adjacents aux fragments montre des signes de de´ge´ne´rescence. Il est probable que ces fragments libe`rent des substances toxiques qui endommagent les cellules voisines [71,2]. Du fait d’une grande similitude morphologique entre ces fragments et les corps apoptotiques, de nombreuses e´quipes se sont inte´resse´es au roˆle de l’apoptose au cours du de´veloppement embryonnaire pre´implantatoire cultive´ in vitro [72]. Il est probable que l’activation de l’apoptose dans les embryons humains pre´implantatoires permette de restreindre la transmission de dommages ge´ne´tiques, par exemple. Cette apoptose se manifeste apre`s la compaction, essentiellement au stade morula et blastocyste, d’abord dans les cellules souches embryonnaires (cellules de la masse interne), puis chez le fœtus entier [70]. Pour une fragmentation re´duite ou absente, 7 a` 8 % des cellules de la masse interne entrent en apoptose. Deux hypothe`ses sont propose´es : d’une part, le nombre de cellules de la masse interne des blastocystes en de´veloppement est maintenu par l’ajustement de la balance entre la prolife´ration et la mort cellulaire [73]. Un roˆle re´gulateur de l’apoptose dans la maintenance de l’home´ostasie cellulaire est conforte´ par le fait que les embryons de faible qualite´ morphologique avec un nombre re´duit de cellules de la masse interne pre´sentent un taux d’apoptose infe´rieur a` celui des embryons morphologiquement

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parfaits. D’autre part, sachant que des cellules aneuploı¨des peuvent eˆtre pre´sentes dans les cellules de la masse interne, l’apoptose permettrait l’e´limination des cellules du ge´nome alte´re´ dans le fœtus en de´veloppement. Jusqu’a` re´cemment, ces fragments e´taient suppose´s eˆtre des structures inde´pendantes des blastome`res, de´rivant uniquement de la masse des cellules embryonnaires. Cette notion est a` l’heure actuelle discute´e. Plusieurs travaux rapportent une fragmentation des blastome`res ainsi que dans les cellules trophectodermiques [74,75]. Notamment, une e´tude re´cente montre qu’une fragmentation se´ve`re e´quivalente a` la perte d’au moins un blastome`re au deuxie`me jour apre`s la fe´condation est associe´e a` une re´duction drastique du taux de formation de blastocyste au sixie`me jour apre`s la fe´condation (12 % versus 60 % dans les embryons non fragmente´s) [76,76]. Les embryons humains pre´implantatoires, caracte´rise´s par une fragmentation excessive au j6 de la postfe´condation ou par un arreˆt pre´coce de leur de´veloppement, montrent un taux important de cellules en apoptose (plus de 15 % des cellules) avec des caracte´ristiques typiques telles que la fragmentation cytoplasmique et nucle´aire, la condensation chromatinienne, la fragmentation de l’ADN et la phagocytose. Ces caracte´ristiques ont e´te´ essentiellement observe´es par des techniques de microscopie classique, et ne sont pas confirme´es par l’utilisation de marqueurs apoptotiques classiques tels que le marquage TUNEL ou Annexine V [70,77,78]. Il est donc justifie´ de se demander si la fragmentation embryonnaire est associe´e a` une activation de cascade apoptotique. Le rapport d’expression des transcrits des membres proapoptotiques (Bak, Bax, Bid, Bik, Bad) et antiapoptotiques (Bcl2, BclXL, Mcl1, Bclw) de la famille Bcl-2 ne varie pas au cours du de´veloppement embryonnaire normal ni chez l’Homme, ni chez la souris (Fig. 1) [79,80]. L’expression prote´ique a e´te´ confirme´e pour la plupart de ces ge`nes, et seule la prote´ine Bax s’exprime de fac¸on constitutive, alors que les autres pre´sentent une expression variable au cours du de´veloppement avec des donne´es contradictoires dans la litte´rature scientifique [80,81]. L’expression de Bcl-2 semble cependant restreinte a` certaines cellules de la masse interne, alors que Bax se localise dans le cytoplasme des blastome`res, les cellules de la masse interne et trophectodermiques. De meˆme, si une e´tude a sugge´re´ que l’expression de Bax pouvait eˆtre augmente´e dans les blastocystes humains de morphologie pauvre [72,75], une autre montre que chez la souris, Bcl-2 est surexprime´e dans les blastocystes de bonne morphologie par rapport aux blastocystes fragmente´s [79]. Il semblerait donc qu’un de´se´quilibre du rapport des membres pro- et antiapoptotiques de la famille Bcl2 soit observe´ dans les blastocystes avec un haut degre´ de fragmentation [79,72,82]. Les transcrits des caspases 2 et 3 sont de´tectables dans tous les stades de de´veloppement de l’embryon humain pre´implantatoire [82,76]. Diffe´rentes e´tudes rapportent une augmentation de l’activite´ de type caspase 3, ainsi que de la prote´ine Harakiri, un membre proapoptotique de la famille Bcl-2, dans les embryons fragmente´s de`s le stade quatre cellules [76]. Enfin la survivine, membre de la famille des IAPs, joue un roˆle cle´ dans le de´veloppement embryonnaire. Elle est

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largement exprime´e au cours de la vie embryonnaire et absente des tissus diffe´rencie´s. Cependant, son expression est retrouve´e dans les ligne´es tumorales et les cancers les plus courants [83]. La fonction antiapoptotique de cette prote´ine s’effectue en partie par sa liaison avec certaines caspases (caspases 3, 7 et 9 notamment). Re´cemment, de nouveaux variants de transcription, issus d’un e´pissage alternatif, avec des effets apoptotiques ou antiapoptotiques diffe´rents, voire oppose´s, ont e´te´ identifie´s [84]. La survivine pre´sente la particularite´ d’agir pendant la mitose. D’abord associe´e au fuseau, il semblerait qu’elle soit re´gule´e par l’absence de tension au niveau des kine´tochores. Les embryons transge´niques de´pourvus de survivine meurent in utero par apoptose massive [85]. De meˆme, l’inhibition de l’expression de la survivine par des ARN antisens provoque un ralentissement autour de la me´taphase et d’autres anomalies en fonction du mode`le e´tudie´. Dans l’embryon pre´coce murin, cela se traduit par un arreˆt du de´veloppement au stade morula ou blastocyste, suivi par de l’apoptose [86]. Cette apoptose peut d’ailleurs eˆtre inhibe´e par les inhibiteurs de la caspase 3 et 9. La survivine est donc un ge`ne antiapoptotique essentiel, exprime´ dans tous les stades de de´veloppement de l’embryon pre´implantatoire humain, qui peut prote´ger les embryons de l’apoptose en inhibant les voies apoptotiques impliquant les caspases. Malgre´ la controverse sur le roˆle de l’apoptose dans l’induction de la fragmentation, il semblerait que l’alte´ration de l’expression de prote´ines re´gulatrices de l’apoptose soit associe´e a` la viabilite´ embryonnaire.

milieu 3D vise a` mimer les conditions dans lesquelles les cellules perc¸oivent et interpre`tent correctement les indications biochimiques et biophysiques du microenvironnement, et notamment leurs relations avec la matrice extracellulaire, les facteurs de croissance et les cellules avoisinantes [90–93]. Dans ce contexte, les cellules conservent les caracte´ristiques d’un tissu, tout en restant facilement accessibles a` l’analyse. L’importance des cultures 3D est particulie`rement cruciale pour les syste`mes cellulaires complexes, comme les syste`mes e´pithe´liaux. En effet, la composition et l’organisation topographique de la matrice extracellulaire sont des e´le´ments essentiels de la survie, de la migration et de la diffe´renciation des cellules e´pithe´liales qui ne peuvent eˆtre correctement polarise´es et subir une diffe´renciation comple`te que dans un environnement 3D [94]. La polarisation d’une cellule e´pithe´liale, qui de´pend de l’adhe´sion aussi bien a` la matrice extracellulaire, via les inte´grines, qu’a` d’autres cellules, via les jonctions adhe´rentes et serre´es [95,96], affecte et est influence´e par des voies de signalisation intracellulaires, y compris celle de la PI(3)K [96]. Un de ses effecteurs, la se´rine/thre´onine kinase AKT, constitue un ve´ritable nœud signale´tique re´gulant la survie cellulaire [97]. Des substrats d’Akt incluent des compose´s directs de la machinerie apoptotique. Par conse´quent, la compre´hension mole´culaire des me´canismes de survie et d’apoptose doit passer par l’utilisation de mode`les expe´rimentaux qui re´capitulent des aspects majeurs de la re´alite´ physiologique, en terme de matrice extracellulaire et de facteurs de croissance.

5. Microenvironnement et signalisation apoptotique

5.1. Impact du microenvironnement sur la folliculogene`se

Nous venons de de´tailler dans cette revue l’e´tat de la connaissance du controˆle ge´ne´tique de l’apoptose ovocytaire et embryonnaire, et abordons maintenant les conse´quences des conditions de culture sur la folliculogene`se et le de´veloppement embryonnaire pre´implantatoire. Il existe un consensus a` l’heure actuelle pour lier une partie des e´checs de FIV associe´s a` une mauvaise qualite´ embryonnaire aux conditions de culture in vitro suboptimales [74,78]. Dans le milieu de culture synthe´tique, l’apoptose des embryons pre´coces pourrait eˆtre due a` la perte de facteurs maternels tels que des facteurs de croissance essentiels et des cytokines libe´re´s par les cellules maternelles [87–89]. Cependant, les me´canismes conduisant a` l’induction de l’apoptose dans des conditions de culture inade´quates in vitro ne sont pas clairement identifie´s. De fac¸on optimale, un mode`le expe´rimental devrait rendre compte de l’organisation en trois dimensions (3D) d’un tissu. Or la culture cellulaire, dite classique, oblige les cellules a` s’adapter a` des contraintes physiques et environnementales fortement e´loigne´es de la situation in vivo. En effet, les cellules doivent adapter leur comportement aux contraintes de rigidite´ du support et a` l’espace anormal de liberte´ de´gage´ par l’absence de cellules au-dessus et en dessous. Dans l’organisme, les cellules forment un tissu et sont lie´es par un re´seau de matrice extracellulaire constitue´ de mole´cules comme le collage`ne, la fibronectine, la laminine. L’exposition des cellules aux contraintes spatiales impose´es par une culture in vitro en

5.1.1. Milieux de culture et microenvironnement Les milieux de culture utilise´s pour la maturation in vitro n’affectent pas seulement la maturation des ovocytes, mais ils influencent aussi le de´veloppement subse´quent. De nombreux travaux montrent l’importance du choix du milieu de culture pour la maturation et le de´veloppement embryonnaire. Pour l’instant, il semble que l’utilisation de milieux simples (milieux tamponne´s au bicarbonate contenant un salin physiologique, du pyruvate, du glucose et du lactate), a` faible teneur en acides amine´s non essentiels et en vitamines, de´pourvus de pre´curseurs de purine (glutamine, glycine, acide aspartique. . .) et d’hypoxanthine (responsable de l’arreˆt me´iotique), et supple´mente´s en se´rum humain favorise significativement la survie et la maturation ovocytaire [98]. Depuis plus d’une de´cennie, les biologistes accordent de l’importance a` la pre´servation du microenvironnement [99]. Cela a commence´ avec les cultures de follicules et s’est e´tendu aux cultures de fragments de cortex ovariens. De nombreux travaux rapportent que la croissance et le de´veloppement des ovocytes et des follicules sont optimise´s lorsque l’inte´grite´ de l’ovocyte, des cellules de la granulosa et des autres compose´s folliculaires est pre´serve´e. En effet, la survie des follicules n’est significativement augmente´e dans les cultures de tissus ovariens qu’apre`s l’isolement partiel [100]. Dans ces conditions, il est possible de conserver les interactions interfolliculaires ainsi que l’action des diffe´rents facteurs pre´sents dans le

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liquide folliculaire. Cependant, le caracte`re tridimensionnel du tissu reste proble´matique a` maintenir in vitro et le follicule de´ge´ne`re apre`s quelques jours de culture. L’utilisation d’une couche de matrice extracellulaire pour la culture de tissus ovariens et de follicules isole´s permet, certes, de maintenir la structure folliculaire sur une plus longue pe´riode [100], mais les syste`mes de culture de´veloppe´s a` l’heure actuelle souffrent encore de contraintes physiques associe´es a` l’absence de matrice au-dessus de l’e´chantillon biologique. De plus, malgre´ l’avantage de procurer le meilleur environnement possible a` l’ovocyte, la culture de follicules intacts se fait dans des conditions ou` le facteur temporel est important et les nombreuses manipulations ne permettent pas de produire des embryons en grande quantite´. 5.1.2. Hormones et facteurs de croissance Les follicules primordiaux repre´sentent la re´serve de follicules d’une femme durant toute sa vie reproductive. Le follicule e´tant caracte´rise´ par une croissance rapide, d’importantes interactions entre les cellules folliculaires et diffe´rents facteurs de croissance, hormones et ste´roı¨des sont ne´cessaires pour transmettre a` l’ovocyte des e´le´ments indispensables a` sa maturation. Notamment, sous l’effet du FSH, les cellules du cumulus oophorus se´cre`tent, via la glycolyse, diffe´rents compose´s (lactate, pyruvate. . .) intervenant dans la nutrition de la ligne´e germinale. D’ailleurs, les ovocytes seuls ne pre´sentent pas ou peu d’activite´ glycolytique [101] et l’augmentation de la glycolyse dans les cultures de complexe cumulo-ovocytaires est associe´e a` une maturation comple`te de l’ovocyte humain in vitro [102]. L’hormone FSH est de´ja` utilise´e en routine dans la plupart des milieux de culture utilise´s pour la maturation des ovocytes in vitro [102], mais aucun protocole n’est aujourd’hui standardise´. En effet, les concentrations de FSH utilise´es sont variables d’un laboratoire a` un autre. Chez certaines espe`ces animales, le traitement par une forte dose de gonadotrophines exoge`nes affecte la pe´riode pre´implantatoire et le de´veloppement postimplantatoire. Des e´tudes in vitro ont montre´ que le me´tabolisme du pyruvate, et non du glucose, dans des cultures de complexes cumuloovocytaires est affecte´ par une forte dose de FSH. Cet exemple souligne l’urgence de standardiser les protocoles de maturation in vitro des ovocytes [102]. Le me´canisme permettant la consommation de glucose par les cellules du cumulus oophorus, apre`s stimulation gonadotrophique, est aujourd’hui connu et implique l’activation de la voie phosphoinositide-3-kinase/V-AKT murine thymoma viral oncogene [PI(3)K/AKT] [102,103]. Cette voie de signalisation joue un roˆle de´terminant dans la suppression de la reprise me´iotique ovocytaire spontane´e et dans l’induction de la reprise me´iotique stimule´e par les gonadotrophines [102]. En effet, les bas niveaux d’activite´ d’AKT dans le cumulus, comme ceux observe´s juste apre`s la re´colte de l’ovocyte dans son follicule, sont ne´cessaires a` l’arreˆt me´iotique. Puis, une augmentation d’activite´ d’AKT favorise, d’une part, la production de progeste´rone par les cellules du cumulus, ce qui favoriserait la reprise me´iotique et, d’autre part, la signalisation de survie. D’ailleurs, l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la

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voie PI(3)K bloquant l’activation d’AKT, augmente l’activite´ de type caspase 3 et la proportion de cellules apoptotiques dans les cellules du cumulus oophorus et affecte la reprise me´iotique stimule´e des ovocytes porcins [104]. Or l’utilisation de milieu basique pour la culture des complexes cumulo-ovocytaires ne permet pas le maintien de l’activite´ d’AKT qui chute de fac¸on drastique en quelques heures apre`s la mise en culture [104]. Il est probable que la perte de cette signalisation de survie dans les complexes cumulo-ovocytaires provoque l’apoptose des cellules du cumulus oophorus. Or les interactions entre l’ovocyte et les cellules du cumulus demeurent essentielles au de´veloppement embryonnaire, et l’absence ou le petit nombre de cellules du cumulus affecte ne´gativement le taux de de´veloppement [105]. De nombreux facteurs sont implique´s dans la progression et la croissance des follicules. Notamment le facteur Kit, un re´cepteur a` tyrosine kinase synthe´tise´ par l’ovocyte, et KITL, son ligand pre´sent a` la surface des cellules folliculaires. Les souris pre´sentant naturellement des mutations dans KITL peuvent former des follicules primordiaux, mais ils sont ensuite incapables d’atteindre le stade de follicules primaires. Toutes ces e´tapes initiales de formation, puis de progression des follicules jusqu’au stade secondaire se de´roulent inde´pendamment des gonadotrophines hypophysaires et ce sont des facteurs paracrines intraovariens qui sont implique´s. Parmi eux, trois sont des membres de la superfamille des TGFb (transforming growth factor) : l’anti-Mullerian hormone (AMH) qui semble implique´e dans le recrutement des follicules primordiaux vers les phases suivantes, GDF9 (growth differentiation factor) qui est implique´ dans la progression au-dela` du stade primaire, et BMP15 (bone morphogenetic protein) qui affecte la prolife´ration des cellules folliculaires [106–110]. GDF9 est exprime´ tre`s toˆt au cours du de´veloppement folliculaire et est se´cre´te´ par les ovocytes dans les follicules ovariens en croissance [111]. L’utilisation de GDF9 dans le milieu de culture favorise la survie et la progression folliculaire jusqu’au stade secondaire sur des coupes d’ovaires en culture [112]. Dans ce meˆme mode`le, d’autres facteurs de croissance tels que IGF-I, IGF-II et l’insuline ont e´te´ montre´s comme de ve´ritables facteurs de survie ovocytaire [113–115]. Les approches syste´matiques d’identification de nouveaux transcrits exprime´s dans l’ovaire en de´veloppement et le se´quenc¸age syste´matique des ge´nomes humains et d’animaux (souris, bovin, porcin. . .) ont de´ja` permis d’isoler de nouveaux facteurs ovariens [116,117] qui devraient, dans les anne´es a` venir, permettre d’optimiser les conditions de culture aussi bien de l’ovocyte que de l’embryon pre´coce en de´veloppement. 5.2. Impact du microenvironnement sur le de´veloppement embryonnaire pre´implantatoire Des e´tudes chez la souris ont montre´ que la culture in vitro augmente la mort cellulaire et que la composition du milieu de culture affecte l’incidence de mort cellulaire dans l’embryon [78,118]. Il existe de nombreuses preuves du roˆle du microenvironnement sur le taux de fragmentation des embryons pre´implantatoires. Par exemple, les embryons

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cultive´s sur une monocouche de cellules « d’alimentation » (ex : fibroblastes) ont un taux de fragmentation infe´rieur aux embryons cultive´s seuls [119]. De meˆme, l’incidence de fragmentation est atte´nue´e lorsque les embryons sont cultive´s dans de petits volumes de milieu de culture et quand ils expriment une varie´te´ de facteurs de croissance et de leurs re´cepteurs [120,121]. C’est ainsi qu’en prenant en compte les changements nutritionnels (modification du me´tabolisme glucidique) et environnementaux (passage des trompes de Fallope a` l’ute´rus) de l’embryon en de´veloppement in vivo, deux milieux de culture se´quentiels sont maintenant utilise´s dans la plupart des laboratoires de FIV : l’un pour la culture jusqu’au stade quatre cellules, l’autre pour la culture apre`s activation du ge´nome du zygote et la compaction. Or la plupart des cellules de mammife`res cultive´es en absence de se´rum ou de signaux mole´culaires extracellulaires entre en apoptose. Dans la majorite´ des types cellulaires, les prote´ines ne´cessaires a` l’exe´cution du programme de mort sont exprime´es de fac¸on constitutive et des signaux extracellulaires de survie agissent en empeˆchant leur activation. Bien qu’il n’y ait peu de donne´es sur la composition du fluide environnant qui entoure l’embryon in vivo, il existe de plus en plus de preuves du roˆle cle´ des facteurs de croissance aussi bien d’origine maternelle, qu’embryonnaire sur le de´veloppement embryonnaire pre´implantatoire. Notamment, la supple´mentation des milieux de culture en facteurs de croissance tels que le TGF-a, l’IGF-I, et l’insuline, a un effet be´ne´fique sur le de´veloppement embryonnaire, augmentant ainsi la formation et le nombre de cellules de blastocystes (60 % d’embryons au stade blastocystes en pre´sence d’IGF-I versus 35 % sans IGF-I). De plus, la pre´sence d’IGF-I ou de TGF-a re´duit fortement le pourcentage de noyaux apoptotiques dans les blastocystes humains [72,98,118,89]. D’autres facteurs de croissance tels que leukaemia inhibitory factor (LIF), heparin binding EGF (HB-EGF) augmentent respectivement la formation de blastocystes de 24 et 30 % [122,123]. Cependant, des e´tudes supple´mentaires apparaissent a` l’heure actuelle ne´cessaires afin d’examiner le re´sultat en terme de taux d’implantation et de grossesse clinique. 6. Marqueurs apoptotiques et potentiel pre´implantatoire L’ensemble des travaux de´crits pre´ce´demment permet de s’interroger sur la valeur pre´dictive de marqueurs apoptotiques dans la se´lection des ovocytes compe´tents et d’embryons pre´implantatoires de bonne qualite´. Les travaux de MalamitsiPuchner et al. [49] sont, a` cet effet, particulie`rement inte´ressant puisqu’ils soulignent la corre´lation entre le taux de Fas soluble dans les fluides folliculaires et/ou les complexes cumuloovocytaires, la qualite´ morphologique de l’embryon pre´implantatoire et l’obtention d’une grossesse clinique. En effet, les auteurs de´montrent, d’une part, qu’un taux e´leve´ de Fas soluble dans les fluides folliculaires est le reflet d’un ovocyte mature. D’autre part, un taux bas de Fas soluble dans les complexes cumulo-ovocytaires est observe´ uniquement en cas de fe´condation de l’ovocyte, d’une morphologie parfaite de l’embryon pre´implantatoire ou d’obtention d’une grossesse

clinique [49]. Cependant, cette e´tude, bien que prometteuse, a e´te´ effectue´e sur un petit nombre de patientes et ne´cessite de plus larges e´tudes, afin de de´terminer le pouvoir pre´dictif re´el en FIV de la quantification de Fas soluble dans les liquides folliculaires et/ou dans les complexes cumulo-ovocytaires. D’autres e´tudes affirment que la taille des te´lome`res dans les ovocytes humains est un facteur pre´dictif de la fragmentation cytoplasmique de l’embryon [124]. Des te´lome`res trop raccourcis peuvent provoquer une fusion de deux chromosomes aboutissant a` une alte´ration non re´parable pouvant provoquer une apoptose de la cellule. Ainsi, le raccourcissement des te´lome`res dans l’ovocyte pourrait eˆtre a` l’origine de l’apoptose dans l’embryon humain pre´implantatoire. Cependant, cette corre´lation inverse entre la longueur des te´lome`res, mesure´e par la technique de fluorescent in situ hybridization (FISH), et la fragmentation cytoplasmisque n’a e´te´ observe´e qu’au troisie`me jour apre`s la fe´condation, jour de transfert des embryons pre´implantatoires dans les voies ge´nitales de la patiente [124]. En prenant en compte la lourdeur (24 a` 48 heures) et la complexite´ d’exe´cution de cette technique de cytoge´ne´tique mole´culaire (FISH), nous devons nous interroger quant a` la pertinence d’un tel outils dans le diagnostic de la qualite´ ovocytaire et embryonnaire. De plus, des e´tudes re´centes rapportent que 26 % des marquages FISH re´alise´s sur ovocytes humains peuvent eˆtre arte´factuels [125,126]. Enfin, les marqueurs apoptotiques classiques de´crits pre´ce´demment (fragmentation nucle´aire, marquage a` l’annexine V, activation des caspases. . .) semblent eˆtre a` l’heure actuelle une piste peu prometteuse. Des donne´es de la litte´rature ne permettent toujours pas de savoir clairement si la fragmentation embryonnaire est associe´e a` une activation de cascade apoptotique. Bien que l’alte´ration de l’expression de prote´ines re´gulatrices de l’apoptose (membres de la famille Bcl-2 et des IAPs) soit associe´e a` la viabilite´ embryonnaire, les donne´es de la litte´rature restent a` cet effet contradictoires [70,77,78,80,81,88]. Aussi, la ne´cessite´ d’identifier d’autres marqueurs reste d’actualite´ et cibler des e´ve´nements pre´coces de la signalisation apoptotique semble, a` cet effet, pertinent et judicieux. L’identification d’une signature ge´nique comme moyen fiable du de´terminisme du pouvoir fe´condant et du de´veloppement embryonnaire pre´implantatoire reste donc d’un inte´reˆt capital. La connaissance de l’expression des ge`nes est la premie`re e´tape indispensable a` l’identification de potentiels marqueurs mole´culaires de l’expression de ge`nes anormaux, aussi bien dans les ovocytes que dans les embryons pre´implantatoires. Ce type d’approche a de´ja` e´te´ en partie re´alise´ sur les cellules du cumulus, sur des ovocytes et sur des embryons pre´implantatoires humains surnume´raires [116,117,127,128]. Cependant, il est important de rappeler que toutes ces donne´es sont issues de mate´riel biologique stimule´ ou superovule´, et de ce fait, fort e´loigne´ d’un environnement physiologique normal. Graˆce a` une nouvelle technologie, la microdissection au laser, l’e´quipe de Arraztoa et al. [128] a ainsi pu isoler des ovocytes primordiaux sur des sections d’ovaires de singe Rhe´sus, non soumis a` une stimulation ovarienne, et montre l’implication de 84 nouveaux ge`nes dans la survie et la maturation ovocytaire. Les e´tudes actuelles ont cependant une approche tre`s globale et ne permettent pas encore

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de tirer des conclusions probantes. Des e´tudes supple´mentaires en terme de valeur pre´dictive doivent eˆtre valide´es et devraient donner naissance a` des tests ge´ne´tiques de diagnostic de la qualite´ ovocytaire et embryonnaire. 7. Conclusion et perspectives Malgre´ le progre`s de la FIV depuis quelques de´cennies, plus de 50 % des embryons humains cultive´s in vitro n’arrivent pas au stade blastocyste en raison de de´faut de de´veloppement. Une partie de ces e´checs est impute´e a` des de´fauts de maturation des ovocytes qui peuvent eˆtre en partie associe´s a` l’utilisation de conditions de culture in vitro suboptimales. Bien que le de´veloppement embryonnaire pre´coce soit encore mal connu au niveau mole´culaire, l’utilisation du transcriptome et du prote´ome devrait permettre une avance´e majeure dans la compre´hension de la premie`re semaine de la vie humaine, la de´finition de la compe´tence ovocytaire et embryonnaire, ainsi que dans l’identification d’indicateurs pertinents et fiables de la qualite´ embryonnaire. Re´fe´rences [1] Hamamah S. Oocyte and embryo quality: is their morphology a good criterion? J Gynecol Obstet Biol Reprod 2005;34(7 Pt 2):5S38–15S. [2] Alikani M, Cohen J, Tomkin G, Garrisi GJ, Mack C, Scott RT. Human embryo fragmentation in vitro and its implications for pregnancy and implantation. Fertil Steril 1999;71(5):836–42. [3] Delimitreva SM, Zhivkova RS, Vatev IT, Toncheva DI. Chromosomal disorders and nuclear and cell destruction in cleaving human embryos. Int J Dev Biol 2005;49(4):409–16. [4] Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell 1997;88(3):347–54. [5] Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26:239–57. [6] Wyllie AH, Kerr JFR, Currie AR. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol 1980;68:251–306. [7] Feldmann G, Haouzi D, Moreau A, Durand-Schneider AM, Bringuier A, Berson A, et al. Opening of the mitochondrial permeability transition pore causes matrix expansion and outer membrane rupture in Fasmediated hepatic apoptosis in mice. Hepatology 2000;31(3):674–83. [8] Evan GI, Wyllie AH, Gilbert CS, Littlewood TD, L and H, Brooks M, Waters CM, et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell 1992;69(1):119–128. [9] Van Engeland M, Nieland LJ, Ramaekers FC, Schutte B, Reutelingsperger CP. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry 1998;31(1): 1–9. [10] Gold R, Schmied M, Rothe G, Zischler H, Breitschopf H, Wekerle H, et al. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue sections. J Histochem Cytochem 1993;41:1023–30. [11] Migheli A, Attanasio A, Schiffer D. Ultrastructural detection of DNA strand breaks in apoptotic neural cells by in situ end-labelling techniques. J Pathol 1995;176:27–35. [12] Mundle SD, Gao XZ, Khan S, Gregory SA, Preisler HD, Raza A. Two in situ end labeling techniques reveal different patterns of DNA fragmentation during spontaneous apoptosis in vivo and induced apoptosis in vitro. Anticancer Res 1995;15:1895–904. [13] Hengartner MO, Horvitz HR. C. elegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene bcl-2. Cell 1994;76(4):665–76. 25.

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