Les marqueurs apoptotiques ont-ils leur place comme marqueurs potentiels de l’exploration de l’infertilité masculine ?

Disponible en ligne sur www.sciencedirect.com

Gyne´cologie Obste´trique & Fertilite´ 36 (2008) 721–729 http://france.elsevier.com/direct/GYOBFE/

Faits et arguments

Les marqueurs apoptotiques ont-ils leur place comme marqueurs potentiels de l’exploration de l’infertilite´ masculine ? Could apoptotic markers help the exploration of men infertility? D. Haouzi a,b,c, M. Fourar a,b,c, F. Pellestor a,b,c, H. De´chaud b, J. De Vos a,c, B. Klein a,c, S. Hamamah a,b,*,c Institut de recherche en biothe´rapie, hoˆpital Saint-E´loi, CHU de Montpellier, 80, avenue Augustin-Fliche, 34295 Montpellier cedex 5, France b De´partement de me´decine et biologie de la reproduction, hoˆpital Arnaud-de-Villeneuve, CHU de Montpellier, 371, avenue du Doyen-Gaston-Giraud, 34295 Montpellier cedex 5, France c Inserm U847, Montpellier, France a

Rec¸u le 28 novembre 2007 ; accepte´ le 5 fe´vrier 2008 Disponible sur Internet le 1 juillet 2008

Re´sume´ L’apoptose joue un roˆle cle´ au cours des diffe´rentes e´tapes de la production des game`tes maˆles. Elle intervient massivement a` la puberte´ lors de la mise en route de la spermatogene`se, puis dans les testicules adultes en controˆlant la spermatogene`se. Une de´re´gulation de ce processus affecte, par conse´quent, la spermatogene`se normale. De nombreux travaux sugge`rent que certaines formes d’infertilite´ masculine soit associe´es a` une perturbation du processus apoptotique des cellules germinales. Aussi, la de´tection d’apoptose dans les spermatozoı¨des e´jacule´s suscite-t-elle un inte´reˆt croissant dans l’e´tude du pouvoir fe´condant spermatique. Le but de cette revue est, d’une part, de faire un e´tat des connaissances actuelles de l’apoptose physiologique au cours de la spermatogene`se et, d’autre part, d’analyser la possibilite´ d’utiliser des marqueurs apoptotiques comme un moyen de se´lection fiable des spermatozoı¨des afin d’ame´liorer les chances de re´ussite d’une fe´condation in vitro (FIV). # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. Abstract Apoptosis is a cell death program involved in different steps of spermatogenesis, first at puberty, at the beginning of spermatogenesis, then in adult testicles by controlling normal spermatogenesis. As a result, apoptosis deregulation can affect spermatogenesis. Many studies have provided evidence that apoptosis deregulation in germinal cells resulted in male infertility. In addition, apoptosis detection in ejaculated spermatozoa arouses a growing interest in research as a reliable marker of spermatozoon quality. The aim of this review is to summarize our knowledge on physiological apoptosis during spermatogenesis, and then analyse the possibility of using apoptotic markers as selective markers of spermatozoon quality to optimize the rate of success of in vitro fertilization. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. Mots cle´s : Apoptose ; Controˆle ge´ne´tique ; Spermatogene`se ; Spermatozoı¨de ; Assistance me´dicale a` la procre´ation (AMP) Keywords: Apoptosis; Genetic control; Spermatogenesis; Spermatozoa; Assisted Reproductive Techniques (ART)

1. Introduction : apoptose et spermatogene`se

* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (S. Hamamah).

L’apoptose est une forme de mort cellulaire programme´e indispensable au de´veloppement embryonnaire, a` l’home´ostasie et a` la surveillance des agressions contre l’organisme [1]. Au cours du de´veloppement, les cellules sont produites en exce`s

1297-9589/$ – see front matter # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. doi:10.1016/j.gyobfe.2008.02.027

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puis, selon des crite`res pre´cis, certaines meurent afin de ge´ne´rer des structures particulie`res a` l’organe engendre´. L’home´ostasie cellulaire est donc controˆle´e par l’e´quilibre entre la prolife´ration cellulaire et l’apoptose. Par exemple, au cours du de´veloppement testiculaire pre´pube`re, l’expansion clonale excessive des cellules germinales, au-dela` de ce qui est ne´cessaire pour la spermatogene`se normale, est suivie d’une vague d’apoptose aboutissant a` l’e´limination des spermatogonies en exce`s. Dans le testicule adulte, l’apoptose intervient e´galement dans le controˆle de l’home´ostasie de la spermatogene`se et dans l’e´limination des cellules germinales qui n’ont pas atteint tous les crite`res pour franchir certains points de controˆle. En effet, les trois quarts des cellules germinales, en particulier les spermatogonies et les spermatocytes, ne parviendront pas a` la phase ultime de la spermatogene`se. En cas de spermatogene`se anormale, un nombre atypiquement e´leve´ de cellules germinales apoptotiques a pu eˆtre observe´. Nous de´taillons dans cette revue l’e´tat de connaissance du controˆle ge´ne´tique de l’apoptose physiologique au cours de la spermatogene`se et la possibilite´ d’utiliser des marqueurs apoptotiques comme un moyen de se´lection fiable des spermatozoı¨des. 2. Apoptose physiologique et spermatogene`se L’e´pithe´lium se´minife`re est le sie`ge d’un phe´nome`ne d’apoptose complexe et re´gule´, impliquant cellules germinales et cellules de Sertoli. 2.1. Au cours du de´veloppement pubertaire Chez la plupart des mammife`res, l’initiation de la spermatogene`se s’accompagne d’une vague d’apoptose qui limite l’efficience des premiers cycles spermatoge´ne´tiques. Les spermatogonies et les spermatocytes pre´coces sont des cibles privile´gie´es d’une apoptose physiologique. Cette vague d’apoptose massive des spermatogonies est observe´e entre les j10 et j32 postnatals chez le rat, les j10 et j20 chez la souris, et semble indispensable au de´clenchement et a` la poursuite d’une spermatogene`se normale. La spermatogene`se est donc un processus dynamique permettant la formation des game`tes maˆles qui associe trois grandes e´tapes : la prolife´ration des spermatogonies, les divisions me´iotiques des spermatocytes et la diffe´renciation des spermatides haploı¨des en spermatozoı¨des matures. Ce processus se de´roule dans les testicules au niveau des tubes se´minife`res. La survie des spermatogonies est e´troitement lie´e, d’une part, aux rapports structuraux et fonctionnels entretenus avec les cellules de Sertoli voisines – cellules de soutien – et, d’autre part, au maintien d’un contact avec la lame basale de la paroi du tube se´minife`re. La plupart des donne´es concernant les voies de signalisation et les me´canismes de re´gulation de la spermatogene`se au cours du de´veloppement pubertaire proviennent de mode`les de souris transge´niques [2–5]. Les diffe´rents mode`les ont ainsi pu mettre en e´vidence le roˆle cle´ des membres de la famille Bcl-2, des e´le´ments fondamentaux des voies responsables du controˆle de l’apoptose. La surexpression de Bcl-xL ou de Bcl-2, membres

anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, se traduit notamment par une accumulation accrue et aberrante des cellules germinales, et ce avant l’accomplissement des premiers cycles spermatoge´niques rendant ces souris infertiles [3,4]. Chez le souriceau pre´pube`re, l’invalidation du ge`ne Bax, un membre proapoptotique de la famille Bcl-2, se traduit par la surproduction de spermatogonies, associe´e a` un de´faut d’apoptose, dont la conse´quence principale est une hyperplasie des tubules se´minife`res [5]. Avec ce meˆme type d’approche, des facteurs de survie des cellules germinales au cours du de´veloppement testiculaire ont e´te´ identifie´s. Le facteur stem cell factor (SCF), produit par les cellules de Sertoli, stimule la prolife´ration et la survie des cellules germinales primordiales et des spermatogonies. L’interaction du SCF avec son re´cepteur c-kit pre´sent a` la surface des spermatogonies, des spermatocytes, des spermatides et des cellules de Leydig dans le testicule de rat peut prote´ger non seulement les spermatogonies, mais aussi les spermatocytes et les spermatides de l’apoptose [6]. Chez la souris, l’inactivation du re´cepteur c-kit affecte la ligne´e germinale [7]. Les maˆles he´te´rozygotes sont hypofertiles et deux vagues d’apoptose plus intenses que dans les souris te´moins sont observe´es au de´but de la spermatogene`se. Par ailleurs, une diminution de l’expression du re´cepteur c-kit a e´te´ observe´e dans les spermatogonies de testicules de patients infertiles pre´sentant un arreˆt de maturation. Les me´canismes d’action du SCF ne sont pas entie`rement e´lucide´s. Cependant, il semblerait qu’il soit responsable de l’augmentation de l’expression de membres anti-apoptotiques (tels que Bcl-xL et Bcl-w) et de la diminution de l’expression de membres proapoptotiques (tels que Bax et Bak) de la famille Bcl-2 [6,7]. Il est probable que le changement dynamique dans le profil d’expression des membres de la famille Bcl-2 au cours du de´veloppement testiculaire permette d’amorcer la premie`re vague d’apoptose des cellules germinales pendant le premier cycle de la spermatogene`se [7–10]. Ce processus ne´cessite, par conse´quent, les expressions de novo d’effecteurs de l’apoptose, en particulier de Bax et Bak, qui sembleraient de´pendants de la prote´ine multifonctionnelle P53 [11]. L’e´tude du profil d’expression et de localisation des membres de la famille Bcl-2 et de P53 conforte cette hypothe`se [12]. En effet, l’initiation de cette premie`re vague d’apoptose se traduit par une augmentation de l’expression des prote´ines Bax et Bad de´plac¸ant le rapport des membres pro- et antiapoptotiques en faveur d’une signalisation mortelle (Fig. 1). Vers le vingtie`me jour postnatal, l’apoptose des cellules germinales est fortement inhibe´e. Ce phe´notype est associe´ a` l’augmentation de l’expression du ge`ne anti-apoptotique Bcl-w et a` la diminution de l’expression des ge`nes pro-apoptotiques Bax et Bad [8]. Chez le rat, tous les membres de la famille Bcl-2 sont exprime´s dans le testicule immature et se localisent dans la plupart des types cellulaires a` l’inte´rieur de l’e´pithe´lium se´minife`re. Cependant, l’apoptose est essentiellement de´tecte´e dans les cellules germinales. L’e´limination par apoptose d’un pourcentage important de cellules germinales pendant la premie`re vague de la spermatogene`se, afin d’adapter la taille de la population germinale au nombre qui peut eˆtre ade´quatement supporte´ par les cellules de

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Fig. 1. Repre´sentation sche´matique des deux voies majeures de transmission du signal apoptotique. Il existe deux voies majeures de transmission du signal apoptotique. La premie`re implique les re´cepteurs de mort de la famille tumor necrosis factor (TNF) dont le recrutement se traduit par l’activation d’une caspase initiatrice, la caspase 8, qui a` son tour permet l’activation de caspases effectrices telles que la caspase 3. L’autre voie, dite voie mitochondriale, implique les membres pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. Au cours d’un stress cellulaire (dommage a` l’ADN, ERO), les membres de la famille Bcl-2 sont transloque´s a` la mitochondrie et induisent une transition de perme´abilite´ mitochondriale. Il en re´sulte la libe´ration de facteurs apoptoge`nes dans le cytosol permettant l’activation d’une autre caspase initiatrice, la caspase 9, renforc¸ant ainsi la cascade de caspases de´crite pre´ce´demment. Il existe un lien mole´culaire entre ces deux voies, relaye´ par un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2. ERO : espe`ces re´actives de l’oxyge`ne.

soutien Sertoli, est une e´tape essentielle de la mise en place de la spermatogene`se. Cette apoptose semble re´sulter de l’alte´ration dans l’expression de prote´ines re´gulatrices de ce processus. Un de´faut d’e´limination des cellules germinales a des re´percussions dramatiques sur la spermatogene`se chez l’adulte. 2.2. Chez l’adulte Le processus d’apoptose semble intervenir tout au long de la spermatogene`se afin de maintenir constant le nombre de cellules entrant en me´iose (les spermatocytes) et pre´server l’home´ostasie entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales. Dans le testicule adulte de rat, il semblerait que les cibles privile´gie´es de l’apoptose soient les spermatogonies et les spermatocytes pre´coces lors de la premie`re division me´iotique. Les souris dont le ge`ne pro-apoptotique Bax a e´te´ invalide´ sont infertiles et leurs testicules pre´sentent paradoxalement une atrophie, au stade adulte, associe´e a` une augmentation accrue de l’apoptose [13]. L’analyse histologique re´ve`le une accumulation de cellules germinales pre´me´iotique avec une absence totale de spermatocytes et de spermatozoı¨des : Bax est ne´cessaire pour la maturation normale des spermatocytes. Ce blocage de maturation se traduit par une apoptose extensive des cellules germinales pre´coces, et cela inde´pendamment de Bax, conduisant a` une atrophie testiculaire massive chez l’adulte. Le phe´notype associe´ a` l’invalidation du ge`ne Bcl-w chez la souris de´montre son roˆle cle´ dans la spermatogene`se normale. En effet, les souris maˆles Bcl-w/ pre´sentent une vague d’apoptose pre´pubertaire normale, alors que chez l’adulte, les tubes se´minife`res sont de´sorganise´s avec une diminution drastique du nombre de cellules de Sertoli, une augmentation de l’apoptose de tous les types cellulaires de la ligne´e germinale et une absence de spermatozoı¨des matures. Les souris maˆles adultes sont ainsi infertiles [14]. La fonction essentielle de

nutrition par les cellules de Sertoli des futurs spermatozoı¨des ne pouvant eˆtre assure´e, la spermatogene`se ne peut pas avoir lieu. La prote´ine Bcl-w agit donc comme un facteur de survie des cellules de Sertoli et indirectement des spermatogonies, des spermatocytes, et elle participe a` la re´gulation de l’apoptose en se liant a` certains membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2, en particulier Bax et Bak [14,15]. L’un des roˆles majeurs des prote´ines de la famille Bcl-2 est la re´gulation de la transition de perme´abilite´ mitochondriale permettant la libe´ration de facteurs apoptoge`nes dans le cytosol tels que le cytochrome c (Fig. 1). Ce dernier, en association entre autres avec Apaf-1, va alors permettre l’activation des caspases. L’invalidation du ge`ne Apaf-1 est le´tale, bien que 5 % des mutants survivent jusqu’a` l’aˆge adulte. Les souris maˆles sont alors infertiles, avec un phe´notype similaire a` celui observe´ en cas d’invalidation du ge`ne Bax [16,17]. Bien que largement discute´, il semblerait que Fas, un re´cepteur de mort de la famille TNF, soit implique´ dans l’apoptose des cellules germinales [18] (Fig. 1). Le traitement de cultures de tissus testiculaires humains avec un anticorps bloquant anti-Fas se traduit par une inhibition de l’apoptose des cellules germinales [19]. En accord avec ce mode`le, Fas ligand et Fas, exprime´s respectivement par les cellules de Sertoli et les cellules germinales, assurent l’home´ostasie des cellules germinales. Il faut noter que les souris maˆles de´pourvues du ge`ne Fas (souris lpr) ou du ge`ne FasL (souris gld) sont ne´anmoins fertiles [20,21]. La possibilite´ de l’existence d’autres voies de signalisation doit donc eˆtre envisage´e. ` cet e´gard, le roˆle des inte´grines dans le maintien de A la cohe´sion de l’e´pithe´lium se´minife`re semble une piste particulie`rement inte´ressante. L’invalidation de CIB1, une prote´ine implique´e entre autres dans la re´gulation de l’inte´grine aIIbb3, re´ve`le son roˆle essentiel dans la spermatogene`se. Les souris maˆles Cib/ sont ste´riles et leurs testicules pre´sentent une atrophie se´ve`re associe´e a` une population re´duite des

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cellules germinales. L’analyse histologique re´ve`le une augmentation de l’apoptose des cellules germinales et l’absence de spermatides et de spermatozoı¨des, la phase haploı¨de de la spermatogene`se e´tant perturbe´e. CIB1 est fortement exprime´e dans les cellules de Sertoli. Son invalidation peut ainsi entraıˆner une perturbation de la diffe´renciation de ces cellules de soutien, et donc de leurs fonctions, lesquelles sont ne´cessaires au de´roulement normal de la spermatogene`se [22]. En effet, la composition et l’organisation topographique de la matrice extracellulaire sont des e´le´ments essentiels de la survie, de la migration et de la diffe´renciation des cellules qui ne peuvent eˆtre correctement polarise´es et subir une diffe´renciation comple`te que dans un environnement 3D [23]. Aussi, la perte de l’expression de CIB1 dans les cellules de Sertoli peut alte´rer les complexes jonctionnels micro-environnementaux et affecter par la` meˆme la diffe´renciation. 3. Apoptose et infertilite´ masculine Bien qu’il existe de´ja` une multitude de marqueurs de la qualite´ de l’e´jaculat (guide de la World Health Organization [WHO]), il n’en reste pas moins que, du fait d’une grande variabilite´ intra- et interindividuelle de ces marqueurs, leur pouvoir pre´dictif, souvent associe´ a` une lourdeur d’exe´cution des protocoles, devient extreˆmement difficile et donc insatisfaisant. Leur utilisation apparaıˆt donc relative et ne permet d’appre´cier qu’imparfaitement l’hypofertilite´. En effet, les donne´es du spermogramme posse`dent une valeur pre´dictive limite´e en fe´condation in vitro (FIV) puisque dans pre`s de la moitie´ des e´checs de FIV, le spermogramme re´alise´ avant la tentative s’ave´rait strictement normal. Les valeurs seuils retenues pour diffe´rencier les sujets fertiles et infertiles sont critiquables, et, a` l’heure actuelle, aucun examen ne permet de pre´dire le pouvoir fe´condant e´ventuel des e´jaculats. Or les e´checs de fe´condation repre´sentent 5 a` 10 % des cycles de FIV et dans la plupart des cas re´sultent de spermatozoı¨des de´ficients. De plus, l’e´valuation classique de la qualite´ spermatique (spermogramme), bien que fondamentale pour l’appre´ciation de l’infertilite´ masculine, repose sur des crite`res exclusivement morphologiques, et par conse´quent subjectifs, ne permettant pas de prendre en compte l’inte´grite´ du ge´nome masculin, un facteur essentiel de la transmission de l’information ge´ne´tique paternelle. L’un des inte´reˆts majeurs des laboratoires d’asssitance me´dicale a` la procre´ation (AMP) consiste en la mise en place de me´thodes de se´lection des spermatozoı¨des plus fiables afin de re´duire la variabilite´ ope´rateur-de´pendante et d’opti` cet effet, les marqueurs miser les re´sultats de la FIV. A apoptotiques semblent eˆtre une piste prometteuse. E´tant donne´ l’association entre la pre´sence de marqueurs apoptotiques et le dysfonctionnement des spermatozoı¨des, la possibilite´ d’exclure les spermatozoı¨des apoptotiques pourrait pre´senter un avantage majeur en AMP [24–26]. Le but de l’utilisation de marqueurs apoptotiques est la se´lection d’un nombre suffisant de spermatozoı¨des viables, mobiles, capables de fertiliser l’ovocyte. De nombreux travaux rapportent une corre´lation entre la pre´sence de marqueurs apoptotiques et l’e´chec de fertilisation [27–31]. En effet, la semence d’homme infertile contient une

forte proportion de spermatozoı¨des pre´sentant des signes apoptotiques, tels que des modifications morphologiques typiques, la chute du potentiel de membrane mitochondriale, l’activation de caspases, la fragmentation nucle´aire ou encore la perte de la distribution asyme´trique de phosphatidylse´rine de la membrane plasmique [32,33]. Bien que cette notion soit actuellement tre`s controverse´e, la de´tection d’apoptose dans les spermatozoı¨des e´jacule´s suscite, ` cet e´gard, en diagnostic, un inte´reˆt croissant [25,31,34–37]. A diffe´rentes techniques sont utilise´es, la plupart e´tant utilise´es en routine dans la de´tection des cellules somatiques apoptotiques. 4. Infertilite´ masculine et marqueurs apoptotiques Nous commenc¸ons dans cette partie par de´tailler les diffe´rents marqueurs apoptotiques teste´s dans l’e´valuation de l’infertilite´ masculine, puis abordons leurs e´ventuels inte´reˆts en AMP comme moyen fiable de se´lection de la qualite´ spermatique. 4.1. Marqueurs de l’inte´grite´ de l’ADN spermatique L’une des approches classiquement utilise´es pour la de´tection de l’apoptose repose sur l’e´tude de l’inte´grite´ de l’ADN spermatique. La technique la plus courante est le marquage dit de TUNEL, qui marque les fragments d’ADN au niveau de l’extre´mite´ 30 OH terminal libre ge´ne´re´s en abondance au cours de l’apoptose. Une fragmentation accrue est ainsi observe´e dans les spermatozoı¨des de patients infertiles en comparaison avec des patients fertiles [24,35,38]. Si plus de 25 % des noyaux des spermatozoı¨des sont fragmente´s, le taux de fe´condation apre`s intracytoplasmic sperm injection (ICSI) est infe´rieur a` 20 % [39,40]. La de´tection de la fragmentation de l’ADN permet ainsi d’e´viter l’injection d’un ovocyte avec un spermatozoı¨de potentiellement non fe´condant, voire meˆme ne´faste. Chez la souris, il semble que le taux de fragmentation spermatique n’affecte pas la capacite´ fe´condante des spermatozoı¨des, mais qu’elle alte`re la capacite´ de de´veloppement pre´coce des embryons. Il semblerait que l’index apoptotique quantifie´ par cette technique dans le sperme de patients pre´sentant au moins trois e´checs d’ICSI soit variable : d’un patient a` l’autre, mais e´galement en fonction de l’e´jaculat pour un meˆme patient donne´ [41]. Par ailleurs, il semble que la corre´lation inverse entre le degre´ de fragmentation de l’ADN des spermatozoı¨des de l’e´jaculat et le spermogramme disparaisse apre`s pre´paration des spermatozoı¨des in vitro (Tableau 1) [41]. Ce fait souligne le faible potentiel de cette technique dans le diagnostic d’infertilite´ masculine. Il existe d’autres techniques d’e´tudes de l’inte´grite´ de l’ADN spermatique, les plus fre´quentes e´tant le test COMET qui permet de mesurer les cassures simples et doubles brins de l’ADN, le test nick translation (NT) pour mettre en e´vidence in situ les cassures simples brins, l’analyse de la structure de la chromatine des spermatozoı¨des (sperm chromatin structure assay [SCSA]) pour la de´tection d’anomalies de compaction de la chromatine suivie d’une coloration a` l’acridine orange qui permet de marquer diffe´remment l’ADN simple et double brin

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Tableau 1 Les marqueurs apoptotiques dans l’appre´ciation de l’infertilite´ masculine

[24,42–49]. L’analyse de l’e´tat de compaction de la chromatine des spermatozoı¨des est une approche particulie`rement de´licate. Classiquement, un e´tat de compaction de la chromatine des spermatozoı¨des est observe´ au cours de la spermiogene`se, c’esta`-dire pendant la dernie`re phase de la spermatogene`se. Cet e´tat assure la protection du ge´nome paternel au cours du passage des spermatozoı¨des dans les voies ge´nitales maˆles. Cependant, l’e´tat de compaction est difficilement appre´ciable. Cette compaction est extreˆmement dense, en comparaison de celle observe´e dans la cellule somatique, he´te´roge`ne et variable d’un spermatozoı¨de a` l’autre. Bien que des anomalies de la condensation de la chromatine puissent entraıˆner des alte´rations de l’ADN de type de´naturation ou fragmentation, il semble que ces anomalies se refle`tent aussi bien dans les spermatozoı¨des morphologiquement normaux que ceux anormaux. L’examen par cytome´trie en flux des spermatozoı¨des colore´s a` l’acridine orange apre`s de´naturation in situ de l’ADN (SCSA) permet de de´terminer un index de fragmentation de l’ADN (DFI) qui repre´sente le pourcentage de cellules contenant de l’ADN de´nature´. Le DFI semble corre´le´ avec les re´sultats obtenus par le test COMET et le marquage TUNEL, mais pas avec les donne´es du spermogramme. Cependant, il est important de souligner que le test COMET n’est pas une technique utilise´e couramment pour la de´tection de cellules somatiques apoptotiques. De plus, il semble que seule la ne´crospermie pre´sente une corre´lation tre`s importante avec le DFI [49]. Classiquement, la valeur seuil au-dela` de laquelle le pouvoir fe´condant de spermatozoı¨des est compromis est de 30 %. En dec¸a` de cette valeur, il semblerait que cela n’affecte ni le pourcentage d’ovocytes fe´conde´s, ni le nombre de blastocystes forme´s. Cependant, aucune grossesse e´volutive n’a e´te´ obtenue pour un DFI supe´rieur a` 45 %. En conclusion, la de´termination de l’index de fragmentation de l’ADN n’a que peu d’inte´reˆt comme marqueur de l’infertilite´ masculine puisqu’il ne repre´sente qu’une valeur pre´dictive

ne´gative de grossesse. En revanche, puisqu’il existe une corre´lation entre le taux de grossesse obtenue par ICSI et la fragmentation de l’ADN spermique quantifie´e par le marquage TUNEL, cette technique apporterait une valeur pre´dictive positive du devenir d’une proce´dure d’AMP en permettant la se´lection de spermatozoı¨des non fragmente´s. Cependant, leurs applications dans les laboratoires d’AMP restent, a` l’heure actuelle, difficiles du fait de leur complexite´ d’utilisation et d’un de´faut de syste`me de standardisation. Re´cemment, un nouveau syste`me e´lectrophore´tique permettant une isolation rapide de populations de spermatozoı¨des exhibant un fort degre´ d’inte´grite´ d’ADN a e´te´ de´crit [50]. L’utilite´ clinique de cette technique a e´te´ valide´e chez des patients infertiles pre´sentant de forts dommages d’ADN spermique, et ce a` partir de biopsies testiculaires, de semence et de suspension spermique cryocongele´es. Cette approche a permis d’isoler une population de spermatozoı¨des mobiles, viables et morphologiquement normaux. Une premie`re grossesse a e´te´ rapporte´e chez un couple confronte´ depuis une longue pe´riode a` l’infertilite´, associe´e a` des dommages excessifs de l’ADN spermique, graˆce a` l’application de ce syste`me e´lectrophore´tique [50]. Bien que le be´ne´fice de cette technique ne soit pas a` discuter, la complexite´ de ce syste`me de se´paration peut apparaıˆtre comme un facteur limitant pour une application a` grande e´chelle dans les laboratoires d’AMP. 4.2. Marqueurs des alte´rations membranaires Deux anomalies membranaires principales des spermatozoı¨des ont e´te´ de´crites. La premie`re repose sur une modification de l’asyme´trie membranaire, accompagne´e de l’externalisation de la phosphatidylse´rine (PS), une caracte´ristique du processus apoptotique. La translocation de la PS de la membrane interne a` la membrane externe permet, en effet, l’envoi d’un signal destine´ aux macrophages proches qui vont alors phagocyter les

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cellules apoptotiques. L’annexine V, qui se lie spe´cifiquement a` la phosphatidylse´rine, permet ainsi la de´tection (par immunofluorescence et cytome´trie de flux) et la quantification des cellules apoptotiques [51]. Bien que la population de spermatozoı¨des marque´s a` l’annexine V soit plus importante dans les e´jaculats de patients infertiles par rapport a` des patients fertiles, l’interpre´tation d’un tel re´sultat est a` prendre avec prudence (Tableau 1) [45,48]. En effet, des modifications de l’asyme´trie membranaire peuvent eˆtre observe´es en dehors de tout contexte apoptotique. Notamment, la capacitation des spermatozoı¨des « expression finale du pouvoir fe´condant de spermatozoı¨des » s’accompagne de l’expression aberrante des phosphatidylse´rines sur le feuillet externe de la membrane plasmique jetant un doute sur la pertinence de l’utilisation de l’annexine V comme marqueur de l’apoptose des spermatozoı¨des [52,53]. De plus, un marquage a` l’annexine V peut eˆtre observe´ lorsque la membrane plasmique est perme´abilise´e. Aussi, la deuxie`me anomalie membranaire observe´e concerne la perte de l’inte´grite´ membranaire et repre´sente un marqueur de la viabilite´ cellulaire. Cette perme´abilisation membranaire peut eˆtre de´tecte´e par l’utilisation de colorants vitaux, le plus couramment utilise´ e´tant l’iodure de propidium. De nombreux autres fluorochromes sont utilise´s pour mesurer la viabilite´ des spermatozoı¨des [46]. Seulement, leurs applications restent limite´es puisqu’ils ne permettent pas d’e´valuer le pouvoir fe´condant. Cependant, ce type de marqueurs offre la possibilite´ d’exclure les spermatozoı¨des apoptotiques et/ou non viables ` cet effet, une pouvant pre´senter un avantage majeur en AMP. A approche a e´te´ de´veloppe´e : il s’agit d’utiliser des billes magne´tiques recouvertes d’annexine V afin de permettre d’exclure les spermatozoı¨des pre´sentant des alte´rations membranaires. Cette technique a l’avantage de ne pas alte´rer les spermatozoı¨des, au contraire du tri par cytome´trie en flux, et de re´cupe´rer une population de spermatozoı¨des fonctionnelle non marque´e excluant ainsi le risque de la pre´sence de marqueurs potentiellement toxiques [54–56]. Le tri sur la base de l’annexine V a e´te´ utilise´ avec succe`s pour ame´liorer conside´rablement le potentiel fertilisant des spermatozoı¨des ainsi que la viabilite´ et la motilite´ spermatique apre`s cryoconservation [55,56]. 4.3. Marqueurs des alte´rations du potentiel de membrane mitochondrial Il est maintenant clairement e´tabli que l’apoptose implique les mitochondries comme effecteur central. Ces organites collectent les informations relatives au me´tabolisme cellulaire et aux cascades de transduction de signaux, ils inte`grent ces informations, de´cident alors du sort de la cellule et participent le cas e´che´ant a` l’exe´cution de la mort. Le passage et la libe´ration de prote´ines pre´sentes dans l’espace intermembranaire mitochondrial au travers de la membrane externe me`nent a` l’activation de re´actions cataboliques qui vont culminer dans la de´gradation de macromole´cules essentielles et l’acquisition du morphotype apoptotique. Ainsi, l’apoptose nucle´aire est pre´ce´de´e de se´ve`res alte´rations des fonctions mitochondriales, dont une chute du potentiel de membrane mitochondrial. Cette

chute du potentiel de membrane est associe´e a` une production accrue d’espe`ces re´actives de l’oxyge`ne, lesquelles participent a` l’acquisition du phe´notype apoptotique [57]. Il existe des fluorochromes lipophiles cationiques qui permettent de mesurer le potentiel de membrane sur cellules vivantes [58,59]. Une chute du potentiel de membrane mitochondrial et la production d’espe`ces re´actives de l’oxyge`ne (ERO) sont observe´es dans les spermatozoı¨des de patients infertiles par rapport a` des patients fertiles et ces donne´es sont corre´le´es avec celles du spermogramme meˆme apre`s pre´paration des spermatozoı¨des in vitro (Tableau 1) [41,58,59,33]. Des e´tudes supple´mentaires pour lier la chute du potentiel de membrane mitochondrial et le taux d’implantation et de grossesse clinique restent cependant ne´cessaires. 4.4. Activation des caspases Les caspases sont une famille de prote´ases a` cyste´ine, exprime´es constitutivement sous la forme de zymoge`nes et active´es par clivage prote´olytique dans les phases d’initiation et ` ce jour, 14 caspases d’exe´cution du processus apoptotique. A ont e´te´ identifie´es chez l’homme, mais il est probable que cette liste ne soit pas exhaustive [60–64]. La pre´sence de caspases 1, 3, 8 et 9 actives dans l’e´jaculat de patients infertiles a e´te´ de´tecte´e par dosage enzymatique et confirme´e par western blot [65]. L’activation des caspases est corre´le´e aux donne´es du spermogramme, ce qui en fait un bon test pronostic pour de´terminer la qualite´ spermatique (Tableau 1) [59,65]. Cependant, il est important de souligner que les acteurs classiques de la signalisation apoptotique, tels que l’activation de caspases, ne sont pas toujours pre´sents dans ce processus. En effet, il existe une mort cellulaire programme´e, inde´pendante de l’activation de caspases [66]. De plus, les caspases peuvent eˆtre implique´es dans d’autres voies de signalisation que celles de l’apoptose, notamment la re´ponse inflammatoire, la diffe´renciation et la prolife´ration [67]. Ces faits soulignent la difficulte´ d’utiliser comme crite`re unique ce type de marquage pour la se´lection de spermatozoı¨des. Nous venons de voir que les preuves reliant l’infertilite´ masculine a` l’apoptose sont de plus en plus abondantes. L’utilisation de marqueurs apoptotiques comme moyen d’e´liminer les spermatozoı¨des endommage´s s’ave`re donc eˆtre une piste prometteuse et devrait, dans un proche avenir, trouver sa place dans les laboratoires d’AMP. Dans cette perspective, des e´tudes supple´mentaires semblent ne´cessaires. Certains de ces marqueurs ne´cessitent a` ce jour des e´tudes sur une plus grande e´chelle de patients afin d’e´tablir une corre´lation claire avec le devenir d’une FIV (exemple : marqueurs de la chute du potentiel de membrane mitochondrial). La ne´cessite´ d’optimiser l’utilisation de ces marqueurs en termes de simplicite´ et rapidite´ d’exe´cution des protocoles est aussi un enjeu majeur a` leurs e´ventuelles applications en AMP. De meˆme, la de´finition de valeurs seuils permettant de diffe´rencier sans ambiguı¨te´ une population spermatique normale d’une population anormale reste indispensable et ne´cessite la mise en place de syste`mes de standardisation fiables. Ces crite`res, ne´cessaires pour une application clinique, devraient permettre l’identification d’un

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cocktail de marqueurs apoptotiques le plus fiable pour appre´cier la qualite´ spermatique. 5. L’apoptose : une cible pour le traitement de l’infertilite´ ? La survie des spermatozoı¨des in vivo chez les mammife`res est fonction des espe`ces, elle peut eˆtre de plusieurs semaines a` plusieurs mois. In vitro, la conservation de ces cellules est limite´e et ne de´passe gue`re plus d’une semaine. Par sa constitution et sa diffe´renciation, le game`te maˆle n’est plus capable de renouveler ses constituants et est fortement conditionne´ par la composition du milieu environnant. La connaissance de ce milieu, notamment le milieu e´pididymaire, doit permettre de comprendre les me´canismes physiologiques implique´s dans la survie in vivo des game`tes. Un exemple de l’importance de ce milieu dans la survie des spermatozoı¨des : une incidence significativement plus faible de la fragmentation de l’ADN par un marquage TUNEL est observe´e dans des spermatozoı¨des provenant de biopsie testiculaire par rapport a` l’e´jaculat [68]. L’analyse comparative du milieu e´pididymaire chez plusieurs mammife`res domestiques a montre´ la pre´sence majeure de plusieurs enzymes a` activite´ antioxydante, notamment la glutathion peroxydase, la superoxyde dismutase et la glutathion re´ductase [69]. Ces de´fenses antioxydantes permettent de tamponner la production de radicaux libres dans l’appareil ge´nital masculin. L’augmentation de ces de´rive´s actifs de l’oxyge`ne provient soit des re´sidus cytoplasmiques pre´sents au niveau de la pie`ce interme´diaire des spermatozoı¨des malforme´s, soit des leucocytes. Au niveau des spermatozoı¨des, les espe`ces re´actives de l’oxyge`ne sont principalement produites par les mitochondries et leur production excessive conduit a` des alte´rations membranaires et nucle´aires typiques de l’apoptose. Plusieurs travaux rapportent que les dommages induits par les espe`ces re´actives de l’oxyge`ne ge´ne´re´ repre´sentent un facteur majeur d’infertilite´ masculine en provoquant des cassures de l’ADN [70,71]. Aussi, l’utilisation d’un milieu de culture comprenant les e´le´ments majeurs du milieu e´pididymaire permet d’optimiser la survie des spermatozoı¨des in vitro [72]. Notamment, une e´tude re´cente a rapporte´ l’effet be´ne´fique d’un traitement oral antioxydant sur la re´duction du pourcentage de spermatozoı¨des a` ADN fragmente´ provenant de patients infertiles. De plus, le traitement antioxydant oral ame´liore conside´rablement le taux de grossesse apre`s ICSI lorsqu’il re´duit le pourcentage de spermatozoı¨des endommage´s de patients infertiles [73]. Il est probable que les milieux de culture utilise´s a` l’heure actuelle puissent favoriser la production d’espe`ces re´actives de l’oxyge`ne, affectant ainsi la survie des spermatozoı¨des. De plus, les e´tapes de pre´paration du sperme avant AMP affectent la viabilite´ des spermatozoı¨des – notamment les centrifugations – en induisant la production de radicaux libres nocifs et augmentent conside´rablement le pourcentage de spermatozoı¨des a` ADN fragmente´. La centrifugation en pre´sence d’antioxydant permet de diminuer la production de radicaux libres au cours des e´tapes de pre´paration du sperme et de prote´ger l’ADN des spermatozoı¨des des le´sions induites par

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les radicaux libres [74,75]. Les re´sultats obtenus avec les antioxydants sont a` ce jour les plus remarquables, permettant d’augmenter la viabilite´ des spermatozoı¨des. Des applications the´rapeutiques telles que la proposition d’un traitement oral antioxydant pre´ventif et/ou l’utilisation d’antioxydants dans les protocoles de pre´paration du sperme, ainsi que dans les milieux de culture, devraient eˆtre be´ne´fiques dans le traitement de l’infertilite´ masculine. 6. Conclusion Dans 30 % des cas, la ste´rilite´ du couple est d’origine masculine et bien qu’il existe de´ja` une multitude de marqueurs de la qualite´ de l’e´jaculat (spermogramme, spermocytogramme), leur pouvoir pre´dictif est extreˆmement de´licat et donc insatisfaisant. Leur utilisation ne permet d’appre´cier qu’imparfaitement l’hypofertilite´ et, pour l’heure, aucun examen ne permet de pre´dire le pouvoir fe´condant e´ventuel des e´jaculats. Il semble donc important que le pronostic en termes de fertilite´ requie`re l’utilisation de parame`tres diffe´rents et comple´mentaires. Les marqueurs apoptotiques dans les e´jaculats de patients semblent eˆtre une piste prometteuse, meˆme si la spe´cificite´ de certaines techniques utilise´es dans la de´tection de l’apoptose est a` ce jour discute´e. Plusieurs pistes semblent inte´ressantes, la plus spectaculaire en termes de re´sultats e´tant le tri des spermatozoı¨des sur la base de l’annexine V permettant l’exclusion des spermatozoı¨des pre´sentant des alte´rations membranaires. Cette technique a permis d’ame´liorer conside´rablement le potentiel fertilisant des spermatozoı¨des. Deux autres pistes semblent corre´ler en partie avec les donne´es du spermogramme : la chute du potentiel de membrane et l’activation des caspases. Des e´tudes supple´mentaires doivent eˆtre ne´anmoins envisage´es afin d’estimer le potentiel de ces tests en termes de marqueurs de la qualite´ des spermatozoı¨des. Cependant, la ne´cessite´ d’identifier d’autres marqueurs reste d’actualite´. Enfin, pre´venir ou limiter l’apoptose des spermatozoı¨des est un enjeu majeur en AMP. Les traitements antioxydants sont, a` cet effet, remarquables et devraient prochainement trouver une place dans le traitement de l’infertilite´ masculine. Re´fe´rences [1] Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell 1997;88(3):347–54. [2] Ferlin A, Raicu F, Gatta V, Zuccarello D, Palka G, Foresta C. Male infertility: role of genetic background. Reprod Biomed Online 2007;14(6):734–45. [3] Rodriguiz I, Ody C, Araki K, Garcia I, Vassalli P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J 1997;16:2262–70. [4] Furuchi T, Masuko K, Nishimune Y, Obinata M, Matsui Y. Inhibition of testicular germ cell apoptosis and differentiation in mice expressing Bcl2 in spermatogonia. Development 1996;122:1703–9. [5] Russell LD, Chiarini-Garcia H, Korsmeyer SJ, Knudson CM. Bax-dependent spermatogonia apoptosis is required for testicular development and spermatogenesis. Biol Reprod 2002;66(4):950–8. [6] Yan W, Suominen J, Toppari J. Stem cell factor protects germ cells from apoptosis in vitro. J Cell Sci 2000;113:161–216.

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