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Place des marqueurs de l'apoptose dans l'exploration de l'infertilité masculine
Gynécologie Obstétrique & Fertilité 33 (2005) 669–677 http://france.elsevier.com/direct/GYOBFE/
Dixièmes journées nationales de la FFER (Deauville, 5–7 octobre 2005)
Place des marqueurs de l’apoptose dans l’exploration de l’infertilité masculine Detection of apoptotic markers in human ejaculated spermatozoa as new methods in human reproductive biology C. Marchetti a,*, P. Marchetti b a
Laboratoire de biologie de la reproduction, hôpital Jeanne-de-Flandre, CHRU de Lille, 2, avenue Oscar-Lambret, 59037 Lille cedex, France b Inserm U459, 1, place de Verdun, 59045 Lille cedex, France Reçu le 15 juin 2005 ; accepté le 27 juin 2005 Disponible sur internet le 30 août 2005
Résumé Les spermatozoïdes éjaculés, en particulier dans la population des hommes infertiles, présentent de nombreuses anomalies similaires à celles observées dans les cellules somatiques subissant un processus apoptotique. Ces anomalies sont l’expression de Fas, la production de ROS, l’activation des caspases, la fragmentation de l’ADN, la réduction du potentiel de membrane mitochondrial, la translocation des phosphatidylsérines à la face externe de la membrane plasmique, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité membranaire. Dans ce travail, nous examinerons la signification biologique de ces phénomènes, ainsi que les rôles potentiels que peuvent avoir ces marqueurs apoptotiques dans l’exploration de l’infertilité masculine. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Ejaculated spermatozoa, particularly in infertile men, have been shown to display numerous features that are typical of apoptosis in somatic cells including Fas expression, ROS production, activation of caspases, DNA fragmentation, reduction in mitochondrial membrane potential, plasma membrane translocation of phosphatidylserine and permeability. In this review we summarize the biological significance and the potential role of these markers in the exploration of men infertility. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Spermatozoïdes ; Mitochondries ; AMP ; FIV ; Mort cellulaire Keywords: Spermatozoa; Mitochondria; ART; IVF; Cell death
L’apoptose est un processus physiologique qui conduit à la mort des cellules âgées, endommagées, nuisibles ou surnuméraires. Il est clair désormais qu’un dysfonctionnement du processus apoptotique par excès ou par défaut participe à la physiopathologie de nombreuses maladies ouvrant ainsi la possibilité d’utiliser les stigmates apoptotiques comme marqueurs biologiques et également de développer de nouvelles * Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (C. Marchetti). 1297-9589/$ - see front matter © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.gyobfe.2005.06.019
voies thérapeutiques ciblées sur les molécules régulatrices de l’apoptose. Depuis une dizaine d’années des efforts considérables ont conduit à l’amélioration de nos connaissances apoptotiques tant au niveau moléculaire que fonctionnel. Avec l’apparition de techniques reproductibles utilisables sur des échantillons cellulaires, un certain nombre de stigmates apoptotiques identiques à ceux retrouvés dans les cellules somatiques ont été mis en évidence non seulement dans les cellules germinales mais également dans les spermatozoïdes éjaculés. Bien que
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leur signification soit largement controversée, les marqueurs apoptotiques retrouvés dans les spermatozoïdes éjaculés pourraient présenter un intérêt dans l’exploration de l’infertilité masculine, en particulier dans le cadre de l’Assistance médicale à la procréation (AMP) et pourraient ainsi être amenés dans le futur à se développer en routine dans les laboratoires de biologie de la reproduction. Cette revue propose de faire le point sur les techniques de détection de l’apoptose dans les éjaculats, les principaux résultats obtenus, la valeur biologique de ces marqueurs ainsi que sur la signification de la présence de stigmates apoptotiques dans les spermatozoïdes éjaculés.
1. Présence de marqueurs apoptotiques potentiels dans les spermatozoïdes éjaculés de patients infertiles De manière générale, l’apoptose est un phénomène de mort actif aboutissant à la fragmentation de l’ADN nucléaire sous contrôle de nombreuses étapes cytoplasmiques en amont. Bien qu’il ait été postulé que des cellules transcriptionnellement inactives ne pouvaient pas mourir par apoptose, un certain nombre de signes apoptotiques appartenant aux différentes étapes du processus sont présents dans les spermatozoïdes éjaculés de patients infertiles (Fig. 1). Il y a presque dix ans, Baccetti et al. [1] ont apporté pour la première fois d’intéressantes informations sur la présence d’apoptose chez l’homme dans le sperme éjaculé. L’analyse minutieuse en microscopie électronique d’éjaculats indique : • la présence d’altérations nucléaires et cytoplasmiques compatibles avec l’aspect morphologique de cellules somatiques apoptotiques incluant une condensation chromatinienne périphérique associée à la rupture partielle de la membrane nucléaire, la présence de mitochondries gonflées et regroupées dans la pièce intermédiaire, qui présente également des vacuoles translucides, une membrane plasmique globalement conservée, la présence de corps apoptotiques ; • ces altérations apoptotiques sont présentes dans les spermatozoïdes et les spermatides ; • les stigmates apoptotiques sont visibles en faible quantité (0,1 %) dans les éjaculats de donneurs fertiles tandis que l’on observe une fréquence accrue chez les patients infertiles présentant une varicocèle (10 %), une infection, une cryptorchidie ou un séminome testiculaire [1]. Depuis ces études princeps, d’autres paramètres apoptotiques ont été découverts dans le sperme éjaculé. Mais cette présence n’est pas en soi suffisante pour en faire un marqueur apoptotique potentiellement utilisable en clinique puisqu’il faut également que celui-ci soit détectable facilement et efficacement dans les prélèvements. Ainsi, les techniques utilisées doivent répondre à certains critères pour être utilisables en biologie clinique. Notamment, elles devraient permettre une standardisation méthodologique en produisant des résultats fiables et reproductibles avec peu de variations interessais, de déterminer des seuils au-dessus duquel il existe un
Fig. 1. Représentation schématique des voies apoptotiques hypothétiques présentent dans le sperme éjaculé de patients infertiles. La signalisation apoptotique représentée provient de l’extrapolation des connaissances des voies apoptotiques décrites classiquement dans les cellules somatiques. Les voies apoptotiques extrinsèques débutent par l’engagement des récepteurs de mort (ex. Fas), suivies par l’activation de la caspase-8, puis de la caspase-3, qui précède la fragmentation de l’ADN. Ces voies extrinsèques provoquent également la libération mitochondriale de facteurs proapoptotiques, pour conduire à l’activation de la caspase-3, qui à son tour conduit à la fragmentation de l’ADN. L’implication des mitochondries dans l’apoptose est associée à des altérations fonctionnelles mitochondriales, caractérisées par une chute du potentiel de membrane mitochondrial. * Désigne les marqueurs associés à l’apoptose retrouvés dans spermatozoïdes de patients infertiles.
risque d’infertilité masculine in vivo et/ou in vitro en Assistance médicale à la procréation, être applicables dans un laboratoire de biologie clinique (analyse rapide de plusieurs échantillons humains) sans alourdir les coûts (temps du personnel, réactifs etc.). D’emblée, l’utilisation de la microscopie à fluo-
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rescence ne répond pas à ces critères. A contrario, l’utilisation de la cytométrie en flux est une alternative de choix. Déjà utilisée depuis longtemps avec succès dans le domaine hématologique, la cytométrie en flux est une technique qui s’applique à l’analyse de paramètres sur les spermes éjaculés [2]. Cette technique facile, rapide et objective présente en outre l’avantage de pouvoir travailler sur des cellules vivantes et d’analyser de manière concomitante de multiples paramètres fonctionnels des spermatozoïdes [3]. Pour les raisons énoncées précédemment, nous avons restreint la description des marqueurs apoptotiques potentiels de l’infertilité masculine à ceux dont la technique de détection est compatible avec l’usage au laboratoire de biologie clinique. 1.1. Altérations nucléaires associées à l’apoptose dans le sperme éjaculé Outre la microscopie électronique, d’autres techniques ont été utilisées pour mettre en évidence les dommages nucléaires dans le sperme éjaculé [4]. Parmi celles-ci, la technique TUNEL (Terminal Uridine Nick End Labelling) permet de détecter facilement la fragmentation de l’ADN. Les cassures de l’ADN induisent la génération de groupement 3’OH accessibles à l’incorporation de dUTP en présence de terminale désoxynucléotide transférase. Lorsque le dUTP est couplé à un fluorochrome, la fluorescence est alors détectable in situ et permet la quantification de cellules dont l’ADN est fragmenté. Ainsi, la technique TUNEL appliquée aux spermes éjaculés puis analysée en cytométrie en flux est une technique sensible de détection de la fragmentation de l’ADN (pour revue [4]). La fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes détectée par TUNEL est plus fréquente chez les patients infertiles (38 %) que chez les donneurs sains (19,9 %) [5]. Une corrélation inverse a été significativement retrouvée entre le degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes et la mobilité, la morphologie normale et la concentration des spermatozoïdes dans l’éjaculat [6,7]. Toutefois, cette corrélation généralement faible [4] disparaît lorsqu’on analyse la population de spermatozoïdes après gradient de densité [6] indiquant une faible contribution de ce marqueur au diagnostic d’infertilité. Néanmoins, son intérêt résulte de la constatation que la fragmentation de l’ADN peut à elle seule influencer négativement la capacité fécondante des spermatozoïdes in vitro [4]. Ainsi, si plus de 25 % des noyaux des spermatozoïdes sont fragmentés, le taux de fécondation après ICSI est inférieur à 20 % [8]. En conséquence, la détection de la fragmentation de l’ADN permettrait d’éviter l’injection d’un ovocyte avec un spermatozoïde potentiellement non fécondant voire même néfaste. En effet, la fécondation avec un spermatozoïde à ADN fragmenté peut également provoquer des fausses couches ou des anomalies du développement embryonnaire [4]. Plusieurs études ont ainsi proposé des valeurs seuils au-dessus desquelles les chances de grossesse sont peu probables mais malheureusement l’hétérogénéité des résultats
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obtenus ne permet pas actuellement leur utilisation clinique [4]. L’avenir de cette technique dépendra du résultat d’études prospectives à grande échelle dans le but de fixer clairement un seuil prédictif. 1.2. Expression de protéines apoptotiques dans le sperme éjaculé De nombreuses études suggèrent que le système Fas– FasLigand est important pour le privilège immunitaire conféré au testicule et qu’il contrôle également l’apoptose testiculaire [9]. Fas (CD95/APO-1) est un récepteur de mort, protéique et transmembranaire de 45 kDa qui appartient à la superfamille des récepteurs du TNF/NGF (Tumor Necrosis Factor et Nerve Growth Factor). L’interaction spécifique de Fas avec son ligand, Fas ligand (FasL), conduit au suicide de la cellule qui porte le récepteur Fas à travers le recrutement de molécules de signalisation par la portion intramembranaire de Fas. Chez de nombreux mammifères dont l’Homme, FasL et Fas sont exprimés dans l’épithélium séminifère du testicule. Il est couramment admis que Fas est exprimé à la surface des cellules germinales et que l’expression de FasL est restreinte aux cellules de Sertoli bien que leurs localisations cellulaires exactes soient encore sujettes à controverse [10–12]. La présence de Fas a été rapportée chez l’Homme à la surface des spermatozoïdes éjaculés [13,14]. L’expression de Fas atteignait 10 % des spermatozoïdes de donneurs normospermiques et s’élevait jusqu’à 50 % chez les patients présentant différents degrés d’altérations de leurs paramètres spermatiques [13] suggérant que chez ces patients un processus incomplet d’apoptose (ou apoptose abortive) s’était installé. Cependant, un travail récent contredit les données antérieures puisqu’il ne permet pas de retrouver en cytométrie en flux l’expression de Fas ni à la surface des spermatozoïdes de donneurs ni à la surface de ceux de patients infertiles [15]. Cette différence de résultats illustre l’importance de l’utilisation d’une technique appropriée. En effet, ces données contradictoires semblent résulter plus de l’utilisation d’une méthodologie mal adaptée à l’analyse des spermatozoïdes (analyse par microscopie à fluorescence, anticorps anti-Fas non spécifiques etc.) produisant des faux-positifs que de la sélection de sous-populations de patients différents [15]. À ce jour, l’expression du récepteur Fas à la surface des spermatozoïdes ne représente pas un marqueur suffisamment fiable pour être utilisable en biologie clinique. 1.3. Altérations membranaires associées à l’apoptose dans le sperme éjaculé Une fécondation efficace nécessite la présence de spermatozoïdes dont la membrane plasmique reste intègre et fonctionnelle [16]. Ainsi, par rapport à un échantillon de donneurs, les hommes infertiles présentent plus fréquemment une perte d’intégrité des membranes de spermatozoïdes qui contribue à l’infertilité malgré des paramètres spermatiques normaux [17]. Au moins deux anomalies membranaires des sper-
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matozoïdes ont été décrites : d’une part la perte d’asymétrie des phospholipides de la membrane plasmique et d’autre part, une perméabilisation accrue de la membrane plasmique caractéristique d’une perte de viabilité cellulaire. La membrane plasmique des cellules intactes est une bicouche lipidique composée de phospholipides distribués asymétriquement. Parmi ceux-ci, la phosphatidylsérine (PS) est localisée sur le feuillet interne de la membrane plasmique. La PS possède une forte affinité spécifique pour une protéine de 35 kDa, l’annexine V. La membrane plasmique est naturellement imperméable à l’annexine V, et la fixation de l’annexine V à la membrane des spermatozoïdes traduit une détérioration de celle-ci. Ainsi, la fixation de l’annexine V peut être secondaire soit à la translocation de la PS sur le feuillet externe de la membrane plasmique, une étape précoce du processus apoptotique ; soit à la perméabilisation accrue de la membrane plasmique laissant entrer l’annexine V dans la cellule observée lorsque la cellule est nécrotique (primitivement ou secondairement au stade ultime de l’apoptose). L’analyse en cytométrie en flux de spermatozoïdes après double marquage par l’annexine V couplée à un fluorochrome et par l’iodure de propidium (IP), utilisé comme indicateur de la perméabilité membranaire permet de différencier : • une population de spermatozoïdes viables (annexine V–, IP–) ; • une population de spermatozoïdes nécrotiques (annexine V+, IP+) ; • une population de spermatozoïdes viables mais avec des altérations membranaires apoptotiques (Annexin V+, IP–) [18]. Cette dernière population est plus fréquente dans les éjaculats de patients infertiles que chez des donneurs fertiles [19]. Outre l’iodure de propidium, de nombreux autres fluorochromes ont été utilisés seuls pour déterminer la perte de la viabilité des spermatozoïdes [3]. Cependant, leur utilité reste limitée puisque la viabilité des spermatozoïdes est un paramètre peu sensible pour évaluer la fertilité [18]. L’usage de ces fluorochromes vitaux conserve néanmoins un intérêt en association avec d’autres marqueurs fonctionnels détectant l’intégrité acrosomique ou mitochondriale des spermatozoïdes. 1.4. Altérations mitochondriales associées à l’apoptose dans le sperme éjaculé Dans de nombreux systèmes expérimentaux, l’apoptose nucléaire est précédée de sévères altérations des fonctions mitochondriales qui se traduisent par une chute du potentiel de membrane mitochondrial (Dwm). Cette réduction du Dwm s’accompagne de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et contribue activement à la mort de la cellule. Plusieurs fluorochromes lipophiles cationiques ont été employés pour déterminer le Dwm des spermatozoïdes [6,20– 23]. Ces fluorochromes ont la particularité de s’incorporer dans la matrice mitochondriale de cellules vivantes en fonction de la différence de potentiel de membrane mitochondrial
et l’intensité de la fluorescence accumulée est proportionnelle au Dwm. L’application de ces méthodes fluorométriques en cytométrie en flux permet une mesure reproductible du Dwm dans les éjaculats humains [21]. Cette détermination semble pertinente pour l’étude de la fertilité puisque le Dwm des spermatozoïdes de patients infertiles est significativement plus faible (moyenne de fluorescence 1337,7) que celui des donneurs sains (moyenne de fluorescence 2482,9) [23]. De plus, une réduction du Dwm est corrélée positivement à une faible concentration des spermatozoïdes ainsi qu’à une faible mobilité des spermatozoïdes dans l’éjaculat. De manière intéressante cette corrélation persiste après préparation des spermatozoïdes par gradient [6,21] confirmant ainsi le lien fort entre le statut fonctionnel des mitochondries et la qualité des spermatozoïdes [20,24]. Les spermatozoïdes à faible Dwm présentent également un pourcentage élevé de formes morphologiquement anormales (manuscrit en préparation). De plus, le pourcentage de spermatozoïdes à fort Dwm, avant comme après gradient de densité, est corrélé au taux de fécondation après FIV [6]. Enfin, aucune grossesse n’a pu être observée lorsque le pourcentage de spermatozoïdes à Dwm faible atteignait un seuil de 62 % (manuscrit en préparation). Face à ces résultats encourageants, la détermination du Dwm des spermatozoïdes pourrait s’avérer utile dans l’exploration de l’infertilité masculine. 1.5. Stress oxydatif dans le sperme éjaculé Au niveau des spermatozoïdes, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont principalement produites par les mitochondries et leur production excessive conduit à des altérations membranaires et nucléaires compatibles avec un phénotype apoptotique [25]. De plus, la voie apoptotique dépendante des ROS est totalement fonctionnelle puisque l’induction d’un stress oxydatif conduit à l’apoptose des spermatozoïdes [26]. Les dommages induits par les ROS générés soit par le spermatozoïde lui-même, soit de manière exogène (par les polynucléaires lors d’une inflammation chronique par exemple) représentent un facteur majeur d’infertilité [27]. Il s’est donc avéré primordial de développer des méthodes fiables capables de détecter le stress oxydatif en cas d’infertilité masculine. Le stress oxydatif résulte de la balance entre la production de ROS et le niveau des capacités antioxydantes cellulaires. La production de ROS peut être mesurée précisément sur spermatozoïdes après lavage, soit par chimioluminescence [25] soit en cytométrie en flux [6] et une production excessive de ROS a été détectée dans les spermatozoïdes de patients infertiles [25]. Les capacités antioxydantes sont mesurées par chimioluminescence sur le plasma séminal et celles-ci ont été retrouvées à un niveau faible dans certains cas d’infertilité [25]. Cependant, l’utilisation de formules statistiques tenant compte à la fois de la production de ROS et des capacités antioxydantes présente un pouvoir discriminant entre les donneurs sains et les sujets infertiles supérieurs à la détermination de chaque paramètre mesuré séparément [25]. L’augmentation de la production de ROS est corrélée aux données du spermogramme : une corrélation positive a été
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Tableau 1 Intérêt principal des marqueurs apoptotiques en biologie de la reproduction (voir texte pour détail) Marqueurs associés à l’apoptose Récepteur Fas Fragmentation de l’ADN Mesure du Dwm Détermination des caspases Translocation des phosphatidylsérines au feuillet externe de la membrane plasmique Perméabilité accrue de la membrane plasmique Stress oxydatif
Intérêts potentiels majeurs n.d. Détection de spermatozoïdes néfastes avant ICSI Corrélation aux données du spermogramme-Prédictif d’échec de FIV Corrélation aux données du spermogramme Élimination des spermatozoïdes endommagés après cryopréservation Élimination des spermatozoïdes endommagés (paramètre peu sensible) Test de milieux pour AMP-Traitement anti-oxydants avant AMP
n.d. : non déterminé.
retrouvée entre la production des ROS dans l’éjaculat et une faible concentration, une faible mobilité et une morphologie anormale des spermatozoïdes [28]. Cette immobilisation des spermatozoïdes peut résulter d’un effet du peroxyde d’hydrogène sur le métabolisme glucidique et/ou une diminution de la phosphorylation des protéines de l’axonème [25]. Cependant, aucune corrélation avec les données du spermogramme n’est observée lorsqu’on détermine uniquement la production d’anions superoxydes [6] suggérant que ce type de ROS n’est pas directement impliqué dans les altérations des spermatozoïdes. 1.6. Production des caspases dans le sperme éjaculé Les caspases sont une famille de cystéine protéases impliquées dans les phases d’initiation et d’exécution du processus apoptotique [29]. Bien que les caspases jouent un rôle lors de la spermatogenèse [29], leur implication dans les spermes éjaculés apoptotiques n’a été découverte que très récemment. Les caspases sont absentes des spermes de souris [30] tandis que l’activité enzymatique des caspases-3 a été retrouvée dans une faible proportion de spermatozoïdes humains [31]. La présence de multiples caspases actives (caspases-1, -3, -8, -9) a depuis été détectée dans les spermatozoïdes de patients infertiles à l’aide de dosages enzymatiques fluorimétriques ou adaptés à la cytométrie en flux [32,33] puis confirmée par western-blot et anticorps spécifiques [32]. Les caspases actives -1, -8, -3 sont observées principalement au niveau de la région postacrosomique tandis que la caspase-9, activée par la mitochondrie, est retrouvée au niveau de la pièce intermédiaire [34]. La présence de caspases actives est significativement associée à une faible mobilité des spermatozoïdes [31,32] chez les donneurs comme chez les patients infertiles [35] et à une diminution de la concentration des spermatozoïdes, de leur mobilité et de leur morphologie normale [36]. Après correction des analyses pour chaque paramètre, la présence de caspase-3 active est significativement associée à une asthénospermie dans l’éjaculat avant préparation et à une tératospermie après migration ascendante (swimup) [37]. De plus, nous avons montré que, avant comme après gradient de densité, le pourcentage de spermatozoïdes présentant des caspases actives est inversement corrélé au taux de fécondation après FIV [32]. Il reste cependant à déterminer si la détection des caspases dans les spermatozoïdes peut améliorer les critères de sélection pour l’AMP.
2. Intérêts des marqueurs apoptotiques retrouvés dans les spermatozoïdes éjaculés Les résultats énoncés au chapitre précédent permettent de classer les altérations apoptotiques en fonction de leur utilité potentielle en biologie de la reproduction (Tableau 1). Théoriquement, la mise en évidence des paramètres apoptotiques dans le sperme éjaculé devrait : • contribuer au diagnostic d’infertilité masculine tel qu’il est défini par les données du spermogramme ; • permettre d’évaluer le risque d’échec de la fécondation in vivo ou in vitro ; • permettre l’analyse des dommages induits par des toxiques ou par les préparations des spermatozoïdes réalisés en AMP ; • permettre d’exclure une population de spermatozoïdes non fécondants après tri cellulaire sur la base d’un paramètre apoptotique ; • enfin, l’inhibition de l’apoptose pourrait permettre de maintenir une population de spermatozoïdes fonctionnels. 2.1. Contribution des marqueurs apoptotiques au diagnostic d’infertilité masculine Au laboratoire de biologie de la reproduction, l’analyse conventionnelle des spermatozoïdes est réalisée en microscopie et comporte le comptage des spermatozoïdes, l’évaluation de leur mobilité et de leur morphologie. Cette analyse est considérée comme un indicateur fondamental de la fertilité masculine. Cependant, étant donné l’extrême subjectivité de ces estimations, plusieurs auteurs ont attiré l’attention sur la nécessité de développer des mesures plus objectives. Étant donné leurs corrélations avec les données du spermogramme, la détermination du Dwm et/ou des caspases par des techniques facilement applicables dans un laboratoire de biologie clinique rentrent dans cette catégorie [6,32]. Si l’on compare l’ensemble des techniques de détection de l’apoptose énoncées dans le chapitre précédent, seules les mesures du Dwm [6] et des caspases dans les spermatozoïdes [32] s’avèrent suffisamment sensibles pour être corrélées aux données du spermogramme. Ces résultats encourageants justifient la mise en place d’études prospectives à plus grande échelle. 2.2. Apport d’une valeur pronostique Puisque la détermination du Dwm et des caspases est corrélée aux données du spermogramme, on peut concevoir que
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ces paramètres puissent être également corrélés au taux de fécondation in vivo ou in vitro [6,32]. Les échecs de fécondation représentent 5 à 10 % des cycles de FIV et dans la plupart des cas résultent de spermatozoïdes déficients [38]. Toutefois, les données du spermogramme possèdent une valeur prédictive limitée en FIV puisque dans près de la moitié des échecs de FIV, le spermogramme réalisé avant la tentative s’avérait strictement normal. De manière intéressante, nous avons trouvé qu’un pourcentage important de spermatozoïdes à Dwm bas était synonyme d’absence de grossesse après FIV alors que les données du spermogramme s’avéraient incapables de prédire cet échec (manuscrit en préparation). Ainsi, il est possible que ces paramètres apoptotiques soient capables d’apporter une information plus sensible que celle du spermogramme et de ce fait permettent de prédire des échecs de fécondation in vitro. Comme mentionné précédemment, la détection de la fragmentation de l’ADN dans les spermatozoïdes possède un intérêt supplémentaire par rapport aux marqueurs précédents puisque cette altération à elle seule et indépendamment des résultats du spermogramme est associée à une baisse du pouvoir fécondant des spermatozoïdes. De plus, en ICSI, le risque est grand de transmettre des défauts génétiques aux descendants avec un spermatozoïde à ADN fragmenté [4]. Ainsi, il a été proposé que la détection des altérations nucléaires puisse, au moins théoriquement, trouver sa place en ICSI afin d’éviter de sélectionner des spermatozoïdes potentiellement dangereux. En ce sens, la détection de l’apoptose nucléaire des spermatozoïdes contribue à améliorer les critères de sélection pour l’AMP. 2.3. Evaluation des dommages induits par les techniques de préparation des spermes L’intérêt de la mesure des ROS en AMP découle de l’hypothèse selon laquelle ceux-ci peuvent provoquer des dommages aux spermatozoïdes en particulier au niveau nucléaire compromettant ainsi leurs capacités fécondantes. Les milieux de culture cellulaire peuvent favoriser la production de ROS notamment par la présence de métaux. Or, des taux élevés de ROS dans les cultures affectent négativement le développement des embryons in vitro ainsi que le taux de grossesse après ICSI [25]. Les milieux et composés utilisés en AMP varient largement dans leur capacité d’induire des dommages nucléaires induits par les ROS et cette éventualité devrait être testée sur tout nouveau milieu avant son utilisation en clinique. La congélation suivie de décongélation induit une perte de viabilité cellulaire des spermatozoïdes [18] ainsi que des stigmates compatibles avec un phénotype apoptotique. Récemment, l’activation des caspases-3, -8, -9 ainsi que la réduction du Dwm ont été mesurées sur des spermatozoïdes après décongélation [39]. Le passage ultérieur sur gradient diminue le pourcentage de spermatozoïdes présentant des caspases actives et le choix du milieu cryoprotecteur ainsi que la vitesse de refroidissement conditionnent également l’activa-
tion des caspases lors de la congélation–décongélation [29]. Il est à noter que la décongélation des spermatozoïdes bien qu’elle induise une activation des caspases n’est pas capable de provoquer une fragmentation nucléaire [40] y compris chez l’homme [41,42]. L’intérêt réel de la détermination des caspases et du Dwm n’a cependant pas encore été investigué dans ces conditions. À l’inverse, il est désormais clair que le stress cellulaire induit par la cryoconservation provoque des altérations membranaires des spermatozoïdes [41–44] probablement responsables d’une baisse de la qualité et des capacités fécondantes des spermatozoïdes [42,44]. Ainsi la cryoconservation des spermatozoïdes provoque l’externalisation des PS ainsi que la perte de viabilité des spermatozoïdes. L’externalisation des PS est positivement corrélée à une faible mobilité des spermatozoïdes avant et après cryoconservation ainsi qu’à une faible capacité fécondante [42,44]. De plus ce paramètre est beaucoup plus sensible que la perte de viabilité mesurée par l’incorporation d’iodure de propidium [18]. 2.4. Sélection d’une sous-population de spermatozoïdes en fonction de marqueurs apoptotiques Étant donné l’association entre la présence de marqueurs apoptotiques et le dysfonctionnement des spermatozoïdes, la possibilité d’exclure les spermatozoïdes apoptotiques pourrait présenter un avantage majeur en AMP. Théoriquement, on pourrait concevoir de trier par cytométrie en flux les spermatozoïdes sur la base de leur Dwm et/ou de la présence de caspases. Actuellement, une autre approche a été développée. Il s’agit d’utiliser des billes magnétiques recouvertes d’annexine V pour permettre d’exclure de l’échantillon les spermatozoïdes présentant des altérations membranaires. Cette technique présente l’avantage de ne pas altérer par ellemême les spermatozoïdes et de permettre un tri négatif où la population fonctionnelle qu’il est souhaitable de récupérer, n’est pas marquée excluant ainsi le risque de la présence de marqueurs potentiellement toxiques sur les spermatozoïdes fonctionnels. Le tri sur la base de l’annexine V a été utilisé avec succès pour améliorer considérablement la viabilité et la mobilité après cryoconservation [42]. 2.5. L’apoptose : une cible pour le traitement de l’infertilité ? Si l’on considère que l’apoptose des spermatozoïdes représente une cause et non une conséquence de l’infertilité, ce qu’il reste à démontrer, idéalement, l’utilisation d’inhibiteurs d’apoptose devrait pouvoir améliorer la fonctionnalité des spermatozoïdes. Cependant, l’addition d’inhibiteurs de caspases ne permet pas d’augmenter la mobilité après décongélation [45]. À l’inverse, les résultats les plus remarquables ont été obtenus avec les antioxydants. Plusieurs études in vitro ont montré un effet protecteur des antioxydants sur la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes [46] et il serait envisageable d’utiliser des agents antioxydants pendant les étapes de préparation du sperme avant AMP pour protéger les
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spermatozoïdes. Bien que les résultats de ces traitements sur l’amélioration des paramètres du spermogramme soient contradictoires [46], la démonstration récente que chez des patients infertiles, le pourcentage de spermatozoïdes à ADN fragmenté peut-être efficacement réduit par un traitement antioxydant oral de courte durée relance l’intérêt de cette approche [47]. Cela d’autant plus que le traitement antioxydant oral améliore considérablement le taux de grossesse après ICSI en réduisant le pourcentage de spermatozoïdes endommagés de patients infertiles [48]. À l’avenir, cette étude nécessitera d’être confirmée afin de pouvoir tirer des conclusions définitives sur le bénéfice des antioxydants comme modalité thérapeutique de l’infertilité masculine.
de potentiel de membrane mitochondrial [6], entre le niveau des ROS et les caspases [36], ou entre les spermatozoïdes annexine V positifs et les caspases [52]. L’implication de ces marqueurs dans l’apoptose des spermatozoïdes éjaculés est d’autant plus difficile à démontrer que les spermatozoïdes sont parmi les cellules les plus résistantes à l’induction d’apoptose ([30] et données personnelles non publiées). De plus, les spermatozoïdes éjaculés ne meurent pas spontanément par apoptose in vitro [53]. Cela signifie que si ces marqueurs sont bien le témoin d’un processus apoptotique celui-ci n’a pas pris naissance dans les spermatozoïdes éjaculés mais à un stade précédent de leur différenciation et que celui-ci est probablement incomplet puisqu’il ne permet pas l’élimination des spermatozoïdes.
3. Signification des marqueurs apoptotiques présents dans le sperme éjaculé
3.2. Théorie de l’apoptose abortive des spermatozoïdes
Bien que de nombreux arguments, énoncés précédemment, démontrent clairement l’existence et l’intérêt potentiel de marqueurs apoptotiques dans le sperme éjaculé, à l’inverse leur signification reste majoritairement incomprise. Cela provient du fait que les connaissances actuelles des voies apoptotiques reposent sur des expériences réalisées principalement sur des cellules somatiques et qu’aucune donnée ne permet d’affirmer que les spermatozoïdes subissent un processus apoptotique identique à celui des cellules somatiques. 3.1. Insuffisance de la présence isolée des marqueurs Dans les chapitres précédents, nous avons assimilé, sur la base des connaissances couramment admises, l’externalisation des PS, la production de ROS, de caspases, la fragmentation de l’ADN et la réduction du Dwm à des signes d’apoptose (Fig. 1). Il est cependant nécessaire de rester prudent car aucun de ces signes pris isolément ne signifie la mort des spermatozoïdes par apoptose. À titre d’exemple : • l’externalisation des PS accompagne la capacitation des spermatozoïdes [49] ; • les ROS participent à de nombreuses fonctions des spermatozoïdes différentes de la mort [25] ; • les caspases sont également impliquées dans les processus de différenciation et de maturation cellulaire peut-être même dans les spermatozoïdes ; • la fragmentation de l’ADN peut être le témoin d’une maturation incomplète durant la spermiogenèse [50] ; • les altérations fonctionnelles mitochondriales ont été associées à l’infertilité masculine indépendamment de l’apoptose [51] ; • enfin, même le récepteur de mort Fas ne transmet pas uniquement des signaux apoptotiques. Cependant, plusieurs arguments indirects suggèrent que ces marqueurs pourraient participer à une cascade signalétique apoptotique telle qu’elle est décrite classiquement dans les cellules somatiques. Une corrélation positive a été décrite entre la présence d’ADN fragmenté, de ROS et d’une chute
En accord avec ces constatations, Sakkas et al. ont élaboré une théorie rendant compte de l’origine probable de la fragmentation de l’ADN dans le sperme éjaculé [13,14,50,54]. La spermatogenèse est un processus dynamique de prolifération des cellules germinales suivie d’étapes de différenciation qui conduisent aux spermatozoïdes matures. Chez les mammifères, les cellules germinales testiculaires subissent d’abord une expansion clonale à travers de nombreuses mitoses. Cette expansion clonale excessive est contrôlée par une apoptose sélective des progéniteurs peut-être à travers le récepteur de mort Fas. Chez les patients infertiles, Fas est présent à la surface des spermatozoïdes mais ceux-ci ne meurent pas indiquant que bien qu’ayant enclenché un processus apoptotique, les spermatozoïdes échappent à leur élimination. En conséquence, la production de spermatozoïdes possédant des marqueurs apoptotiques pourrait indiquer l’existence d’une apoptose incomplète ou abortive [13,14,50,54]. L’apoptose abortive permettrait de retrouver dans l’éjaculat des spermatozoïdes anormaux, qui auraient normalement dû être éliminés. Ce processus d’apoptose abortive pourrait être secondaire à un manque de synchronisation entre l’engagement des voies apoptotiques et la spermatogenèse. La découverte des molécules responsables du blocage de la mort des spermatozoïdes éjaculés contribuera largement à la compréhension de ce phénomène. 3.3. Marqueurs apoptotiques : témoins d’anomalies de la différenciation terminale et de la maturation des spermatozoïdes ? Certaines données récentes de la littérature amènent à nous interroger sur une signification « non mortelle » de ces marqueurs. La différenciation terminale de certaines cellules partage de nombreux événements biochimiques et morphologiques avec le processus apoptotique. Par exemple, les cellules épithéliales du cristallin ou les globules rouges perdent leurs noyaux ainsi que d’autres organites pendant la différenciation terminale tout en restant néanmoins métaboliquement actives [55]. De même, la différenciation terminale des sper-
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matozoïdes implique des changements complexes de l’architecture cellulaire dont certains rappellent l’apotose [56]. De plus, les marqueurs apoptotiques (caspases, annexine V) sont restreints à des compartiments cellulaires, les corps résiduels, qui se détachent lors de la maturation des spermatides du rat [56]. Cela est également compatible avec la constatation que les spermatozoïdes immatures présentent un niveau élevé de caspases, et un faible Dwm [57]. Chez l’Homme un défaut de remodelage cytoplasmique est associé à la présence de marqueurs apoptotiques [14]. Un argument de poids provient d’études chez la drosophile indiquant que les caspases et le cytochrome C sont nécessaires à la différenciation des spermatozoïdes [58,59]. Dans ces conditions les marqueurs apoptotiques pourraient témoigner d’anomalies de la différenciation terminale des spermatozoïdes en l’absence de programme de mort à proprement parler. Quelles que soient ces considérations interprétatives non résolues, l’intérêt grandissant des marqueurs apoptotiques en AMP justifie la poursuite d’études clinicobiologiques de qualité afin de fixer la valeur exacte de chaque marqueur.
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Dixièmes journées nationales de la FFER (Deauville, 5–7 octobre 2005)
Place des marqueurs de l’apoptose dans l’exploration de l’infertilité masculine Detection of apoptotic markers in human ejaculated spermatozoa as new methods in human reproductive biology C. Marchetti a,*, P. Marchetti b a
Laboratoire de biologie de la reproduction, hôpital Jeanne-de-Flandre, CHRU de Lille, 2, avenue Oscar-Lambret, 59037 Lille cedex, France b Inserm U459, 1, place de Verdun, 59045 Lille cedex, France Reçu le 15 juin 2005 ; accepté le 27 juin 2005 Disponible sur internet le 30 août 2005
Résumé Les spermatozoïdes éjaculés, en particulier dans la population des hommes infertiles, présentent de nombreuses anomalies similaires à celles observées dans les cellules somatiques subissant un processus apoptotique. Ces anomalies sont l’expression de Fas, la production de ROS, l’activation des caspases, la fragmentation de l’ADN, la réduction du potentiel de membrane mitochondrial, la translocation des phosphatidylsérines à la face externe de la membrane plasmique, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité membranaire. Dans ce travail, nous examinerons la signification biologique de ces phénomènes, ainsi que les rôles potentiels que peuvent avoir ces marqueurs apoptotiques dans l’exploration de l’infertilité masculine. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Ejaculated spermatozoa, particularly in infertile men, have been shown to display numerous features that are typical of apoptosis in somatic cells including Fas expression, ROS production, activation of caspases, DNA fragmentation, reduction in mitochondrial membrane potential, plasma membrane translocation of phosphatidylserine and permeability. In this review we summarize the biological significance and the potential role of these markers in the exploration of men infertility. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Spermatozoïdes ; Mitochondries ; AMP ; FIV ; Mort cellulaire Keywords: Spermatozoa; Mitochondria; ART; IVF; Cell death
L’apoptose est un processus physiologique qui conduit à la mort des cellules âgées, endommagées, nuisibles ou surnuméraires. Il est clair désormais qu’un dysfonctionnement du processus apoptotique par excès ou par défaut participe à la physiopathologie de nombreuses maladies ouvrant ainsi la possibilité d’utiliser les stigmates apoptotiques comme marqueurs biologiques et également de développer de nouvelles * Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (C. Marchetti). 1297-9589/$ - see front matter © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.gyobfe.2005.06.019
voies thérapeutiques ciblées sur les molécules régulatrices de l’apoptose. Depuis une dizaine d’années des efforts considérables ont conduit à l’amélioration de nos connaissances apoptotiques tant au niveau moléculaire que fonctionnel. Avec l’apparition de techniques reproductibles utilisables sur des échantillons cellulaires, un certain nombre de stigmates apoptotiques identiques à ceux retrouvés dans les cellules somatiques ont été mis en évidence non seulement dans les cellules germinales mais également dans les spermatozoïdes éjaculés. Bien que
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leur signification soit largement controversée, les marqueurs apoptotiques retrouvés dans les spermatozoïdes éjaculés pourraient présenter un intérêt dans l’exploration de l’infertilité masculine, en particulier dans le cadre de l’Assistance médicale à la procréation (AMP) et pourraient ainsi être amenés dans le futur à se développer en routine dans les laboratoires de biologie de la reproduction. Cette revue propose de faire le point sur les techniques de détection de l’apoptose dans les éjaculats, les principaux résultats obtenus, la valeur biologique de ces marqueurs ainsi que sur la signification de la présence de stigmates apoptotiques dans les spermatozoïdes éjaculés.
1. Présence de marqueurs apoptotiques potentiels dans les spermatozoïdes éjaculés de patients infertiles De manière générale, l’apoptose est un phénomène de mort actif aboutissant à la fragmentation de l’ADN nucléaire sous contrôle de nombreuses étapes cytoplasmiques en amont. Bien qu’il ait été postulé que des cellules transcriptionnellement inactives ne pouvaient pas mourir par apoptose, un certain nombre de signes apoptotiques appartenant aux différentes étapes du processus sont présents dans les spermatozoïdes éjaculés de patients infertiles (Fig. 1). Il y a presque dix ans, Baccetti et al. [1] ont apporté pour la première fois d’intéressantes informations sur la présence d’apoptose chez l’homme dans le sperme éjaculé. L’analyse minutieuse en microscopie électronique d’éjaculats indique : • la présence d’altérations nucléaires et cytoplasmiques compatibles avec l’aspect morphologique de cellules somatiques apoptotiques incluant une condensation chromatinienne périphérique associée à la rupture partielle de la membrane nucléaire, la présence de mitochondries gonflées et regroupées dans la pièce intermédiaire, qui présente également des vacuoles translucides, une membrane plasmique globalement conservée, la présence de corps apoptotiques ; • ces altérations apoptotiques sont présentes dans les spermatozoïdes et les spermatides ; • les stigmates apoptotiques sont visibles en faible quantité (0,1 %) dans les éjaculats de donneurs fertiles tandis que l’on observe une fréquence accrue chez les patients infertiles présentant une varicocèle (10 %), une infection, une cryptorchidie ou un séminome testiculaire [1]. Depuis ces études princeps, d’autres paramètres apoptotiques ont été découverts dans le sperme éjaculé. Mais cette présence n’est pas en soi suffisante pour en faire un marqueur apoptotique potentiellement utilisable en clinique puisqu’il faut également que celui-ci soit détectable facilement et efficacement dans les prélèvements. Ainsi, les techniques utilisées doivent répondre à certains critères pour être utilisables en biologie clinique. Notamment, elles devraient permettre une standardisation méthodologique en produisant des résultats fiables et reproductibles avec peu de variations interessais, de déterminer des seuils au-dessus duquel il existe un
Fig. 1. Représentation schématique des voies apoptotiques hypothétiques présentent dans le sperme éjaculé de patients infertiles. La signalisation apoptotique représentée provient de l’extrapolation des connaissances des voies apoptotiques décrites classiquement dans les cellules somatiques. Les voies apoptotiques extrinsèques débutent par l’engagement des récepteurs de mort (ex. Fas), suivies par l’activation de la caspase-8, puis de la caspase-3, qui précède la fragmentation de l’ADN. Ces voies extrinsèques provoquent également la libération mitochondriale de facteurs proapoptotiques, pour conduire à l’activation de la caspase-3, qui à son tour conduit à la fragmentation de l’ADN. L’implication des mitochondries dans l’apoptose est associée à des altérations fonctionnelles mitochondriales, caractérisées par une chute du potentiel de membrane mitochondrial. * Désigne les marqueurs associés à l’apoptose retrouvés dans spermatozoïdes de patients infertiles.
risque d’infertilité masculine in vivo et/ou in vitro en Assistance médicale à la procréation, être applicables dans un laboratoire de biologie clinique (analyse rapide de plusieurs échantillons humains) sans alourdir les coûts (temps du personnel, réactifs etc.). D’emblée, l’utilisation de la microscopie à fluo-
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rescence ne répond pas à ces critères. A contrario, l’utilisation de la cytométrie en flux est une alternative de choix. Déjà utilisée depuis longtemps avec succès dans le domaine hématologique, la cytométrie en flux est une technique qui s’applique à l’analyse de paramètres sur les spermes éjaculés [2]. Cette technique facile, rapide et objective présente en outre l’avantage de pouvoir travailler sur des cellules vivantes et d’analyser de manière concomitante de multiples paramètres fonctionnels des spermatozoïdes [3]. Pour les raisons énoncées précédemment, nous avons restreint la description des marqueurs apoptotiques potentiels de l’infertilité masculine à ceux dont la technique de détection est compatible avec l’usage au laboratoire de biologie clinique. 1.1. Altérations nucléaires associées à l’apoptose dans le sperme éjaculé Outre la microscopie électronique, d’autres techniques ont été utilisées pour mettre en évidence les dommages nucléaires dans le sperme éjaculé [4]. Parmi celles-ci, la technique TUNEL (Terminal Uridine Nick End Labelling) permet de détecter facilement la fragmentation de l’ADN. Les cassures de l’ADN induisent la génération de groupement 3’OH accessibles à l’incorporation de dUTP en présence de terminale désoxynucléotide transférase. Lorsque le dUTP est couplé à un fluorochrome, la fluorescence est alors détectable in situ et permet la quantification de cellules dont l’ADN est fragmenté. Ainsi, la technique TUNEL appliquée aux spermes éjaculés puis analysée en cytométrie en flux est une technique sensible de détection de la fragmentation de l’ADN (pour revue [4]). La fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes détectée par TUNEL est plus fréquente chez les patients infertiles (38 %) que chez les donneurs sains (19,9 %) [5]. Une corrélation inverse a été significativement retrouvée entre le degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes et la mobilité, la morphologie normale et la concentration des spermatozoïdes dans l’éjaculat [6,7]. Toutefois, cette corrélation généralement faible [4] disparaît lorsqu’on analyse la population de spermatozoïdes après gradient de densité [6] indiquant une faible contribution de ce marqueur au diagnostic d’infertilité. Néanmoins, son intérêt résulte de la constatation que la fragmentation de l’ADN peut à elle seule influencer négativement la capacité fécondante des spermatozoïdes in vitro [4]. Ainsi, si plus de 25 % des noyaux des spermatozoïdes sont fragmentés, le taux de fécondation après ICSI est inférieur à 20 % [8]. En conséquence, la détection de la fragmentation de l’ADN permettrait d’éviter l’injection d’un ovocyte avec un spermatozoïde potentiellement non fécondant voire même néfaste. En effet, la fécondation avec un spermatozoïde à ADN fragmenté peut également provoquer des fausses couches ou des anomalies du développement embryonnaire [4]. Plusieurs études ont ainsi proposé des valeurs seuils au-dessus desquelles les chances de grossesse sont peu probables mais malheureusement l’hétérogénéité des résultats
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obtenus ne permet pas actuellement leur utilisation clinique [4]. L’avenir de cette technique dépendra du résultat d’études prospectives à grande échelle dans le but de fixer clairement un seuil prédictif. 1.2. Expression de protéines apoptotiques dans le sperme éjaculé De nombreuses études suggèrent que le système Fas– FasLigand est important pour le privilège immunitaire conféré au testicule et qu’il contrôle également l’apoptose testiculaire [9]. Fas (CD95/APO-1) est un récepteur de mort, protéique et transmembranaire de 45 kDa qui appartient à la superfamille des récepteurs du TNF/NGF (Tumor Necrosis Factor et Nerve Growth Factor). L’interaction spécifique de Fas avec son ligand, Fas ligand (FasL), conduit au suicide de la cellule qui porte le récepteur Fas à travers le recrutement de molécules de signalisation par la portion intramembranaire de Fas. Chez de nombreux mammifères dont l’Homme, FasL et Fas sont exprimés dans l’épithélium séminifère du testicule. Il est couramment admis que Fas est exprimé à la surface des cellules germinales et que l’expression de FasL est restreinte aux cellules de Sertoli bien que leurs localisations cellulaires exactes soient encore sujettes à controverse [10–12]. La présence de Fas a été rapportée chez l’Homme à la surface des spermatozoïdes éjaculés [13,14]. L’expression de Fas atteignait 10 % des spermatozoïdes de donneurs normospermiques et s’élevait jusqu’à 50 % chez les patients présentant différents degrés d’altérations de leurs paramètres spermatiques [13] suggérant que chez ces patients un processus incomplet d’apoptose (ou apoptose abortive) s’était installé. Cependant, un travail récent contredit les données antérieures puisqu’il ne permet pas de retrouver en cytométrie en flux l’expression de Fas ni à la surface des spermatozoïdes de donneurs ni à la surface de ceux de patients infertiles [15]. Cette différence de résultats illustre l’importance de l’utilisation d’une technique appropriée. En effet, ces données contradictoires semblent résulter plus de l’utilisation d’une méthodologie mal adaptée à l’analyse des spermatozoïdes (analyse par microscopie à fluorescence, anticorps anti-Fas non spécifiques etc.) produisant des faux-positifs que de la sélection de sous-populations de patients différents [15]. À ce jour, l’expression du récepteur Fas à la surface des spermatozoïdes ne représente pas un marqueur suffisamment fiable pour être utilisable en biologie clinique. 1.3. Altérations membranaires associées à l’apoptose dans le sperme éjaculé Une fécondation efficace nécessite la présence de spermatozoïdes dont la membrane plasmique reste intègre et fonctionnelle [16]. Ainsi, par rapport à un échantillon de donneurs, les hommes infertiles présentent plus fréquemment une perte d’intégrité des membranes de spermatozoïdes qui contribue à l’infertilité malgré des paramètres spermatiques normaux [17]. Au moins deux anomalies membranaires des sper-
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matozoïdes ont été décrites : d’une part la perte d’asymétrie des phospholipides de la membrane plasmique et d’autre part, une perméabilisation accrue de la membrane plasmique caractéristique d’une perte de viabilité cellulaire. La membrane plasmique des cellules intactes est une bicouche lipidique composée de phospholipides distribués asymétriquement. Parmi ceux-ci, la phosphatidylsérine (PS) est localisée sur le feuillet interne de la membrane plasmique. La PS possède une forte affinité spécifique pour une protéine de 35 kDa, l’annexine V. La membrane plasmique est naturellement imperméable à l’annexine V, et la fixation de l’annexine V à la membrane des spermatozoïdes traduit une détérioration de celle-ci. Ainsi, la fixation de l’annexine V peut être secondaire soit à la translocation de la PS sur le feuillet externe de la membrane plasmique, une étape précoce du processus apoptotique ; soit à la perméabilisation accrue de la membrane plasmique laissant entrer l’annexine V dans la cellule observée lorsque la cellule est nécrotique (primitivement ou secondairement au stade ultime de l’apoptose). L’analyse en cytométrie en flux de spermatozoïdes après double marquage par l’annexine V couplée à un fluorochrome et par l’iodure de propidium (IP), utilisé comme indicateur de la perméabilité membranaire permet de différencier : • une population de spermatozoïdes viables (annexine V–, IP–) ; • une population de spermatozoïdes nécrotiques (annexine V+, IP+) ; • une population de spermatozoïdes viables mais avec des altérations membranaires apoptotiques (Annexin V+, IP–) [18]. Cette dernière population est plus fréquente dans les éjaculats de patients infertiles que chez des donneurs fertiles [19]. Outre l’iodure de propidium, de nombreux autres fluorochromes ont été utilisés seuls pour déterminer la perte de la viabilité des spermatozoïdes [3]. Cependant, leur utilité reste limitée puisque la viabilité des spermatozoïdes est un paramètre peu sensible pour évaluer la fertilité [18]. L’usage de ces fluorochromes vitaux conserve néanmoins un intérêt en association avec d’autres marqueurs fonctionnels détectant l’intégrité acrosomique ou mitochondriale des spermatozoïdes. 1.4. Altérations mitochondriales associées à l’apoptose dans le sperme éjaculé Dans de nombreux systèmes expérimentaux, l’apoptose nucléaire est précédée de sévères altérations des fonctions mitochondriales qui se traduisent par une chute du potentiel de membrane mitochondrial (Dwm). Cette réduction du Dwm s’accompagne de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et contribue activement à la mort de la cellule. Plusieurs fluorochromes lipophiles cationiques ont été employés pour déterminer le Dwm des spermatozoïdes [6,20– 23]. Ces fluorochromes ont la particularité de s’incorporer dans la matrice mitochondriale de cellules vivantes en fonction de la différence de potentiel de membrane mitochondrial
et l’intensité de la fluorescence accumulée est proportionnelle au Dwm. L’application de ces méthodes fluorométriques en cytométrie en flux permet une mesure reproductible du Dwm dans les éjaculats humains [21]. Cette détermination semble pertinente pour l’étude de la fertilité puisque le Dwm des spermatozoïdes de patients infertiles est significativement plus faible (moyenne de fluorescence 1337,7) que celui des donneurs sains (moyenne de fluorescence 2482,9) [23]. De plus, une réduction du Dwm est corrélée positivement à une faible concentration des spermatozoïdes ainsi qu’à une faible mobilité des spermatozoïdes dans l’éjaculat. De manière intéressante cette corrélation persiste après préparation des spermatozoïdes par gradient [6,21] confirmant ainsi le lien fort entre le statut fonctionnel des mitochondries et la qualité des spermatozoïdes [20,24]. Les spermatozoïdes à faible Dwm présentent également un pourcentage élevé de formes morphologiquement anormales (manuscrit en préparation). De plus, le pourcentage de spermatozoïdes à fort Dwm, avant comme après gradient de densité, est corrélé au taux de fécondation après FIV [6]. Enfin, aucune grossesse n’a pu être observée lorsque le pourcentage de spermatozoïdes à Dwm faible atteignait un seuil de 62 % (manuscrit en préparation). Face à ces résultats encourageants, la détermination du Dwm des spermatozoïdes pourrait s’avérer utile dans l’exploration de l’infertilité masculine. 1.5. Stress oxydatif dans le sperme éjaculé Au niveau des spermatozoïdes, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont principalement produites par les mitochondries et leur production excessive conduit à des altérations membranaires et nucléaires compatibles avec un phénotype apoptotique [25]. De plus, la voie apoptotique dépendante des ROS est totalement fonctionnelle puisque l’induction d’un stress oxydatif conduit à l’apoptose des spermatozoïdes [26]. Les dommages induits par les ROS générés soit par le spermatozoïde lui-même, soit de manière exogène (par les polynucléaires lors d’une inflammation chronique par exemple) représentent un facteur majeur d’infertilité [27]. Il s’est donc avéré primordial de développer des méthodes fiables capables de détecter le stress oxydatif en cas d’infertilité masculine. Le stress oxydatif résulte de la balance entre la production de ROS et le niveau des capacités antioxydantes cellulaires. La production de ROS peut être mesurée précisément sur spermatozoïdes après lavage, soit par chimioluminescence [25] soit en cytométrie en flux [6] et une production excessive de ROS a été détectée dans les spermatozoïdes de patients infertiles [25]. Les capacités antioxydantes sont mesurées par chimioluminescence sur le plasma séminal et celles-ci ont été retrouvées à un niveau faible dans certains cas d’infertilité [25]. Cependant, l’utilisation de formules statistiques tenant compte à la fois de la production de ROS et des capacités antioxydantes présente un pouvoir discriminant entre les donneurs sains et les sujets infertiles supérieurs à la détermination de chaque paramètre mesuré séparément [25]. L’augmentation de la production de ROS est corrélée aux données du spermogramme : une corrélation positive a été
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Tableau 1 Intérêt principal des marqueurs apoptotiques en biologie de la reproduction (voir texte pour détail) Marqueurs associés à l’apoptose Récepteur Fas Fragmentation de l’ADN Mesure du Dwm Détermination des caspases Translocation des phosphatidylsérines au feuillet externe de la membrane plasmique Perméabilité accrue de la membrane plasmique Stress oxydatif
Intérêts potentiels majeurs n.d. Détection de spermatozoïdes néfastes avant ICSI Corrélation aux données du spermogramme-Prédictif d’échec de FIV Corrélation aux données du spermogramme Élimination des spermatozoïdes endommagés après cryopréservation Élimination des spermatozoïdes endommagés (paramètre peu sensible) Test de milieux pour AMP-Traitement anti-oxydants avant AMP
n.d. : non déterminé.
retrouvée entre la production des ROS dans l’éjaculat et une faible concentration, une faible mobilité et une morphologie anormale des spermatozoïdes [28]. Cette immobilisation des spermatozoïdes peut résulter d’un effet du peroxyde d’hydrogène sur le métabolisme glucidique et/ou une diminution de la phosphorylation des protéines de l’axonème [25]. Cependant, aucune corrélation avec les données du spermogramme n’est observée lorsqu’on détermine uniquement la production d’anions superoxydes [6] suggérant que ce type de ROS n’est pas directement impliqué dans les altérations des spermatozoïdes. 1.6. Production des caspases dans le sperme éjaculé Les caspases sont une famille de cystéine protéases impliquées dans les phases d’initiation et d’exécution du processus apoptotique [29]. Bien que les caspases jouent un rôle lors de la spermatogenèse [29], leur implication dans les spermes éjaculés apoptotiques n’a été découverte que très récemment. Les caspases sont absentes des spermes de souris [30] tandis que l’activité enzymatique des caspases-3 a été retrouvée dans une faible proportion de spermatozoïdes humains [31]. La présence de multiples caspases actives (caspases-1, -3, -8, -9) a depuis été détectée dans les spermatozoïdes de patients infertiles à l’aide de dosages enzymatiques fluorimétriques ou adaptés à la cytométrie en flux [32,33] puis confirmée par western-blot et anticorps spécifiques [32]. Les caspases actives -1, -8, -3 sont observées principalement au niveau de la région postacrosomique tandis que la caspase-9, activée par la mitochondrie, est retrouvée au niveau de la pièce intermédiaire [34]. La présence de caspases actives est significativement associée à une faible mobilité des spermatozoïdes [31,32] chez les donneurs comme chez les patients infertiles [35] et à une diminution de la concentration des spermatozoïdes, de leur mobilité et de leur morphologie normale [36]. Après correction des analyses pour chaque paramètre, la présence de caspase-3 active est significativement associée à une asthénospermie dans l’éjaculat avant préparation et à une tératospermie après migration ascendante (swimup) [37]. De plus, nous avons montré que, avant comme après gradient de densité, le pourcentage de spermatozoïdes présentant des caspases actives est inversement corrélé au taux de fécondation après FIV [32]. Il reste cependant à déterminer si la détection des caspases dans les spermatozoïdes peut améliorer les critères de sélection pour l’AMP.
2. Intérêts des marqueurs apoptotiques retrouvés dans les spermatozoïdes éjaculés Les résultats énoncés au chapitre précédent permettent de classer les altérations apoptotiques en fonction de leur utilité potentielle en biologie de la reproduction (Tableau 1). Théoriquement, la mise en évidence des paramètres apoptotiques dans le sperme éjaculé devrait : • contribuer au diagnostic d’infertilité masculine tel qu’il est défini par les données du spermogramme ; • permettre d’évaluer le risque d’échec de la fécondation in vivo ou in vitro ; • permettre l’analyse des dommages induits par des toxiques ou par les préparations des spermatozoïdes réalisés en AMP ; • permettre d’exclure une population de spermatozoïdes non fécondants après tri cellulaire sur la base d’un paramètre apoptotique ; • enfin, l’inhibition de l’apoptose pourrait permettre de maintenir une population de spermatozoïdes fonctionnels. 2.1. Contribution des marqueurs apoptotiques au diagnostic d’infertilité masculine Au laboratoire de biologie de la reproduction, l’analyse conventionnelle des spermatozoïdes est réalisée en microscopie et comporte le comptage des spermatozoïdes, l’évaluation de leur mobilité et de leur morphologie. Cette analyse est considérée comme un indicateur fondamental de la fertilité masculine. Cependant, étant donné l’extrême subjectivité de ces estimations, plusieurs auteurs ont attiré l’attention sur la nécessité de développer des mesures plus objectives. Étant donné leurs corrélations avec les données du spermogramme, la détermination du Dwm et/ou des caspases par des techniques facilement applicables dans un laboratoire de biologie clinique rentrent dans cette catégorie [6,32]. Si l’on compare l’ensemble des techniques de détection de l’apoptose énoncées dans le chapitre précédent, seules les mesures du Dwm [6] et des caspases dans les spermatozoïdes [32] s’avèrent suffisamment sensibles pour être corrélées aux données du spermogramme. Ces résultats encourageants justifient la mise en place d’études prospectives à plus grande échelle. 2.2. Apport d’une valeur pronostique Puisque la détermination du Dwm et des caspases est corrélée aux données du spermogramme, on peut concevoir que
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ces paramètres puissent être également corrélés au taux de fécondation in vivo ou in vitro [6,32]. Les échecs de fécondation représentent 5 à 10 % des cycles de FIV et dans la plupart des cas résultent de spermatozoïdes déficients [38]. Toutefois, les données du spermogramme possèdent une valeur prédictive limitée en FIV puisque dans près de la moitié des échecs de FIV, le spermogramme réalisé avant la tentative s’avérait strictement normal. De manière intéressante, nous avons trouvé qu’un pourcentage important de spermatozoïdes à Dwm bas était synonyme d’absence de grossesse après FIV alors que les données du spermogramme s’avéraient incapables de prédire cet échec (manuscrit en préparation). Ainsi, il est possible que ces paramètres apoptotiques soient capables d’apporter une information plus sensible que celle du spermogramme et de ce fait permettent de prédire des échecs de fécondation in vitro. Comme mentionné précédemment, la détection de la fragmentation de l’ADN dans les spermatozoïdes possède un intérêt supplémentaire par rapport aux marqueurs précédents puisque cette altération à elle seule et indépendamment des résultats du spermogramme est associée à une baisse du pouvoir fécondant des spermatozoïdes. De plus, en ICSI, le risque est grand de transmettre des défauts génétiques aux descendants avec un spermatozoïde à ADN fragmenté [4]. Ainsi, il a été proposé que la détection des altérations nucléaires puisse, au moins théoriquement, trouver sa place en ICSI afin d’éviter de sélectionner des spermatozoïdes potentiellement dangereux. En ce sens, la détection de l’apoptose nucléaire des spermatozoïdes contribue à améliorer les critères de sélection pour l’AMP. 2.3. Evaluation des dommages induits par les techniques de préparation des spermes L’intérêt de la mesure des ROS en AMP découle de l’hypothèse selon laquelle ceux-ci peuvent provoquer des dommages aux spermatozoïdes en particulier au niveau nucléaire compromettant ainsi leurs capacités fécondantes. Les milieux de culture cellulaire peuvent favoriser la production de ROS notamment par la présence de métaux. Or, des taux élevés de ROS dans les cultures affectent négativement le développement des embryons in vitro ainsi que le taux de grossesse après ICSI [25]. Les milieux et composés utilisés en AMP varient largement dans leur capacité d’induire des dommages nucléaires induits par les ROS et cette éventualité devrait être testée sur tout nouveau milieu avant son utilisation en clinique. La congélation suivie de décongélation induit une perte de viabilité cellulaire des spermatozoïdes [18] ainsi que des stigmates compatibles avec un phénotype apoptotique. Récemment, l’activation des caspases-3, -8, -9 ainsi que la réduction du Dwm ont été mesurées sur des spermatozoïdes après décongélation [39]. Le passage ultérieur sur gradient diminue le pourcentage de spermatozoïdes présentant des caspases actives et le choix du milieu cryoprotecteur ainsi que la vitesse de refroidissement conditionnent également l’activa-
tion des caspases lors de la congélation–décongélation [29]. Il est à noter que la décongélation des spermatozoïdes bien qu’elle induise une activation des caspases n’est pas capable de provoquer une fragmentation nucléaire [40] y compris chez l’homme [41,42]. L’intérêt réel de la détermination des caspases et du Dwm n’a cependant pas encore été investigué dans ces conditions. À l’inverse, il est désormais clair que le stress cellulaire induit par la cryoconservation provoque des altérations membranaires des spermatozoïdes [41–44] probablement responsables d’une baisse de la qualité et des capacités fécondantes des spermatozoïdes [42,44]. Ainsi la cryoconservation des spermatozoïdes provoque l’externalisation des PS ainsi que la perte de viabilité des spermatozoïdes. L’externalisation des PS est positivement corrélée à une faible mobilité des spermatozoïdes avant et après cryoconservation ainsi qu’à une faible capacité fécondante [42,44]. De plus ce paramètre est beaucoup plus sensible que la perte de viabilité mesurée par l’incorporation d’iodure de propidium [18]. 2.4. Sélection d’une sous-population de spermatozoïdes en fonction de marqueurs apoptotiques Étant donné l’association entre la présence de marqueurs apoptotiques et le dysfonctionnement des spermatozoïdes, la possibilité d’exclure les spermatozoïdes apoptotiques pourrait présenter un avantage majeur en AMP. Théoriquement, on pourrait concevoir de trier par cytométrie en flux les spermatozoïdes sur la base de leur Dwm et/ou de la présence de caspases. Actuellement, une autre approche a été développée. Il s’agit d’utiliser des billes magnétiques recouvertes d’annexine V pour permettre d’exclure de l’échantillon les spermatozoïdes présentant des altérations membranaires. Cette technique présente l’avantage de ne pas altérer par ellemême les spermatozoïdes et de permettre un tri négatif où la population fonctionnelle qu’il est souhaitable de récupérer, n’est pas marquée excluant ainsi le risque de la présence de marqueurs potentiellement toxiques sur les spermatozoïdes fonctionnels. Le tri sur la base de l’annexine V a été utilisé avec succès pour améliorer considérablement la viabilité et la mobilité après cryoconservation [42]. 2.5. L’apoptose : une cible pour le traitement de l’infertilité ? Si l’on considère que l’apoptose des spermatozoïdes représente une cause et non une conséquence de l’infertilité, ce qu’il reste à démontrer, idéalement, l’utilisation d’inhibiteurs d’apoptose devrait pouvoir améliorer la fonctionnalité des spermatozoïdes. Cependant, l’addition d’inhibiteurs de caspases ne permet pas d’augmenter la mobilité après décongélation [45]. À l’inverse, les résultats les plus remarquables ont été obtenus avec les antioxydants. Plusieurs études in vitro ont montré un effet protecteur des antioxydants sur la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes [46] et il serait envisageable d’utiliser des agents antioxydants pendant les étapes de préparation du sperme avant AMP pour protéger les
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spermatozoïdes. Bien que les résultats de ces traitements sur l’amélioration des paramètres du spermogramme soient contradictoires [46], la démonstration récente que chez des patients infertiles, le pourcentage de spermatozoïdes à ADN fragmenté peut-être efficacement réduit par un traitement antioxydant oral de courte durée relance l’intérêt de cette approche [47]. Cela d’autant plus que le traitement antioxydant oral améliore considérablement le taux de grossesse après ICSI en réduisant le pourcentage de spermatozoïdes endommagés de patients infertiles [48]. À l’avenir, cette étude nécessitera d’être confirmée afin de pouvoir tirer des conclusions définitives sur le bénéfice des antioxydants comme modalité thérapeutique de l’infertilité masculine.
de potentiel de membrane mitochondrial [6], entre le niveau des ROS et les caspases [36], ou entre les spermatozoïdes annexine V positifs et les caspases [52]. L’implication de ces marqueurs dans l’apoptose des spermatozoïdes éjaculés est d’autant plus difficile à démontrer que les spermatozoïdes sont parmi les cellules les plus résistantes à l’induction d’apoptose ([30] et données personnelles non publiées). De plus, les spermatozoïdes éjaculés ne meurent pas spontanément par apoptose in vitro [53]. Cela signifie que si ces marqueurs sont bien le témoin d’un processus apoptotique celui-ci n’a pas pris naissance dans les spermatozoïdes éjaculés mais à un stade précédent de leur différenciation et que celui-ci est probablement incomplet puisqu’il ne permet pas l’élimination des spermatozoïdes.
3. Signification des marqueurs apoptotiques présents dans le sperme éjaculé
3.2. Théorie de l’apoptose abortive des spermatozoïdes
Bien que de nombreux arguments, énoncés précédemment, démontrent clairement l’existence et l’intérêt potentiel de marqueurs apoptotiques dans le sperme éjaculé, à l’inverse leur signification reste majoritairement incomprise. Cela provient du fait que les connaissances actuelles des voies apoptotiques reposent sur des expériences réalisées principalement sur des cellules somatiques et qu’aucune donnée ne permet d’affirmer que les spermatozoïdes subissent un processus apoptotique identique à celui des cellules somatiques. 3.1. Insuffisance de la présence isolée des marqueurs Dans les chapitres précédents, nous avons assimilé, sur la base des connaissances couramment admises, l’externalisation des PS, la production de ROS, de caspases, la fragmentation de l’ADN et la réduction du Dwm à des signes d’apoptose (Fig. 1). Il est cependant nécessaire de rester prudent car aucun de ces signes pris isolément ne signifie la mort des spermatozoïdes par apoptose. À titre d’exemple : • l’externalisation des PS accompagne la capacitation des spermatozoïdes [49] ; • les ROS participent à de nombreuses fonctions des spermatozoïdes différentes de la mort [25] ; • les caspases sont également impliquées dans les processus de différenciation et de maturation cellulaire peut-être même dans les spermatozoïdes ; • la fragmentation de l’ADN peut être le témoin d’une maturation incomplète durant la spermiogenèse [50] ; • les altérations fonctionnelles mitochondriales ont été associées à l’infertilité masculine indépendamment de l’apoptose [51] ; • enfin, même le récepteur de mort Fas ne transmet pas uniquement des signaux apoptotiques. Cependant, plusieurs arguments indirects suggèrent que ces marqueurs pourraient participer à une cascade signalétique apoptotique telle qu’elle est décrite classiquement dans les cellules somatiques. Une corrélation positive a été décrite entre la présence d’ADN fragmenté, de ROS et d’une chute
En accord avec ces constatations, Sakkas et al. ont élaboré une théorie rendant compte de l’origine probable de la fragmentation de l’ADN dans le sperme éjaculé [13,14,50,54]. La spermatogenèse est un processus dynamique de prolifération des cellules germinales suivie d’étapes de différenciation qui conduisent aux spermatozoïdes matures. Chez les mammifères, les cellules germinales testiculaires subissent d’abord une expansion clonale à travers de nombreuses mitoses. Cette expansion clonale excessive est contrôlée par une apoptose sélective des progéniteurs peut-être à travers le récepteur de mort Fas. Chez les patients infertiles, Fas est présent à la surface des spermatozoïdes mais ceux-ci ne meurent pas indiquant que bien qu’ayant enclenché un processus apoptotique, les spermatozoïdes échappent à leur élimination. En conséquence, la production de spermatozoïdes possédant des marqueurs apoptotiques pourrait indiquer l’existence d’une apoptose incomplète ou abortive [13,14,50,54]. L’apoptose abortive permettrait de retrouver dans l’éjaculat des spermatozoïdes anormaux, qui auraient normalement dû être éliminés. Ce processus d’apoptose abortive pourrait être secondaire à un manque de synchronisation entre l’engagement des voies apoptotiques et la spermatogenèse. La découverte des molécules responsables du blocage de la mort des spermatozoïdes éjaculés contribuera largement à la compréhension de ce phénomène. 3.3. Marqueurs apoptotiques : témoins d’anomalies de la différenciation terminale et de la maturation des spermatozoïdes ? Certaines données récentes de la littérature amènent à nous interroger sur une signification « non mortelle » de ces marqueurs. La différenciation terminale de certaines cellules partage de nombreux événements biochimiques et morphologiques avec le processus apoptotique. Par exemple, les cellules épithéliales du cristallin ou les globules rouges perdent leurs noyaux ainsi que d’autres organites pendant la différenciation terminale tout en restant néanmoins métaboliquement actives [55]. De même, la différenciation terminale des sper-
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matozoïdes implique des changements complexes de l’architecture cellulaire dont certains rappellent l’apotose [56]. De plus, les marqueurs apoptotiques (caspases, annexine V) sont restreints à des compartiments cellulaires, les corps résiduels, qui se détachent lors de la maturation des spermatides du rat [56]. Cela est également compatible avec la constatation que les spermatozoïdes immatures présentent un niveau élevé de caspases, et un faible Dwm [57]. Chez l’Homme un défaut de remodelage cytoplasmique est associé à la présence de marqueurs apoptotiques [14]. Un argument de poids provient d’études chez la drosophile indiquant que les caspases et le cytochrome C sont nécessaires à la différenciation des spermatozoïdes [58,59]. Dans ces conditions les marqueurs apoptotiques pourraient témoigner d’anomalies de la différenciation terminale des spermatozoïdes en l’absence de programme de mort à proprement parler. Quelles que soient ces considérations interprétatives non résolues, l’intérêt grandissant des marqueurs apoptotiques en AMP justifie la poursuite d’études clinicobiologiques de qualité afin de fixer la valeur exacte de chaque marqueur.
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