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Quantification virale du virus de l'hépatite C : présent et avenir
Rev MCd Interne 2000 : 2 I : 174-8 I 0 2000 editions scientit’iques et mkdicales
Mise au point
Quantification
virale du virus de l’hkpatite
Elsevier
SAS. Tous droita rCservCs
C : p&sent et avenir
P. Halfon I, P. Cacoub ** ’ Lahorutoire Alphabio, h&pita1 Ambroise-Par&, 23, rue de Frirdlnnd, 13006 Marseille ; ‘service h6pital de la PitiC-Snlp&tri?re, 83. boulelurd de L’Hripitcd, 75651 Paris cede-r 13. Fruncr (Regx le 25 mai 1999 ; accept6 le 3 septembre
de t&decitza
interm.
1999)
R&cum6 Introduction. - Le terme charge virale plasmatique est utilise pour designer la viremie plasmatique, traduction de I’activite replicative du virus de I’hepatite C (VHC), exprimee en copies par millilitre ou en equivalents particules virales par millilitre. Acfua/if& et points fork. - Les techniques visant a mesurer un nombre de particules virales infectieuses (mod&e animal et culture cellulaire) sont encore limitees. La charge virale plasmatique mesuree par les techniques actuelles ne permet pas de differencier les particules virales completes des particules virales defectives. Les differentes methodes de mesure de la replication virale du VHC reposent sur deux principes : la quantification de proteines virales (mesure dune antigenernie circulante au moyen d’anticorps monoclonaux), et surtout la quantification d’acides nucleiques viraux par amplification genique apres transcription inverse (RT-PCR), ou par amplification de signal (ADN branche). II n’y a pas de correlation entre la viremie et I’activite histologique de la maladie. La repetition des charges virales, chez les patients viremiques, en I’absence de traitement est inutile. En pratique clinique, la mesure de la charge virale VHC plasmatique est utile dans le bilan pretherapeutique. Perspectives et projets. - Llutilisation de la viremie quantitative dans un algorithme decisionnel therapeutique incluant d’autres marqueurs dont I’age, le genotype viral, le degre d’heterogeneite genetique et le score de fibrose permettront d’adapter les combinaisons therapeutiques a un patient don& 0 2000 editions scientifiques et medicales Elsevier SAS hepatite
C / charge
virale
C I polymerase
chain
reaction
I ADN
branch6
I viremie
quantitative
Summary - Quantitation of hepatitis C virus RNA: present and future. Introduction. - Hepatitis C virus (HCV) plasmatic load, also called HCV viremia, is expressed in copies per milliliter or viral particle equivalents per milliliteer. Current knowledge and key points. - The methods used to measure HCV viremia are based on two principles: the quantitation of viral proteins (measure of antigenemia using monoclonal antibodies), and the quantitation of viral nucleic acid using PCR after reverse transription (RFPC/?), or signal amplification (branched DNA). There is no relationship between viremia and liver histologic activity Future prospects and projects. - The use of HCV quantitative viremia in a treatment algorithm, including other factors such as age, genotype, degree of viral genetic heterogenity, and liver fibrosis score will help adapt therapeutic associations for each individual. 0 2000 editions scientifiques et medicales Elsevier SAS hepatitis
Torrespondance
C virus
et tire’s ?I part : P. Cacoub.
I viremia
I HCV viral
m&me adresse.
load I PCR I branched
DNA/quantitative
viremia
Quantification
virale du virus de 1’hCpatite C
Depuis la dtcouverte du virus de l’hepatite C (VHC) en 1989 grace aux techniques de biologie moleculaire, la necessitt de detecter, puis de quantifier la presence du VHC chez un patient est rapidement apparue comme indispensable pour les virologues et les cliniciens. Les applications des techniques de quantification virale en virologie clinique humaine se retrouvent essentiellement dans les pathologies likes aux virus responsables d’infections chroniques ou latentes, pour lesquelles une orientation pronostique voire therapeutique existent. D’un point de vue methodologique, de nombreuses techniques de quantification virale se sont developpees avec des seuils de sensibilite ameliorts et une specificit croissante. Cependant, la variabilite des resultats observes like a l’absence de standardisation de ces tests constitue un obstacle a leur utilisation rationnelle. La recente mise au point d’un systeme de propagation cellulaire du VHC sur des cultures d’hepatocytes humains et les nouveaux schemas therapeutiques ouvrent un avenir tres prometteur a la quantification virale du VHC. L’objectif de cet article est de tenter de preciser, dix ans apres la decouverte du virus de l’htpatite C, la place et les limites des techniques actuelles, ainsi que les voies d’avenir de la quantification virale du VHC. DtiFINITIONS La viremie d&nit la concentration de virus ou d’bquivalents viraux presents dans la circulation sanguine. La charge virale definit la quantite totale de virus presente chez un patient. En fait, le terme <> est actuellement utilist pour designer la viremie plasmatique. La mise en evidence de particules virales libres est la traduction de l’activite replicative du virus au sein de l’organisme. Toutefois, les techniques visant a mesurer un nombre de particules virales infectieuses (modele animal et culture cellulaire) sont encore limitees. La charge virale plasmatique mesuree par les techniques actuelles ne permet done pas de differencier les particules virales completes des particules virales dtfectives. La viremie, exprimee en copies par millilitre ou en equivalents particules virales par millilitre ne reflete done qu’imparfaitement le niveau de replication virale chez un sujet don&. DYNAMIQUE ET LOCALISATION DE LA RfiPLICATION VIRALE Les recents travaux de Zeuzem et al. [l], de Lam et al. [2], et surtout de Neumann et al. [3] ont permis, comme pour le VIH [4,5], une meilleure comprehension de la dynamique de la replication virale du VHC. La quantite de virus C presente dans le sang (compartiment sanguin) correspond a la difference entre la production du virus (compartiment de production) a partir du foie et de divers
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sites extrahepatiques, et la degradation du virus (compartiment de degradation) [ 11. La replication du virus C est particulierement ClevCe (lo’* virions par jour), et son turn-over est ClevC (demi-vie de 2,7 heures). La majorite des virions circulants du VHC resultent de cycles continus d’infection d’hepatocytes de novo. Ce turn-over tres rapide de virions infectieux entraine la generation rapide de variants moleculaires et constitue un moyen d’echappement du VHC a la surveillance du systeme immunitaire
[61. Les infections chroniques a VHC sont caracterisees par la presence constante de virus infectieux libres. 11 est clairement demontre que le virus C est responsable d’htpatites et se replique dans le foie. Le virus C est tgalement a l’origine de manifestations extrahepatiques. Bien que l’eventualitt d’une replication virale dans les cellules mononucleees peripheriques et dans la salive ait et6 Cvoqute, le probleme est encore discute. Les difficult& dans l’etude de la replication virale sont d’ordre technique. Un resultat faussement positif dans un tissu ou dans un organe peut Ctre lie a une contamination sanguine. Seule les techniques dites <)permettent de mettre en evidence d’une maniere certaine le brin negatif, done infectieux du virus. La quantification de genomes viraux dans les sites extrahepatiques reste du domaine de la recherche. MkTHODES
DE QUANTIFICATION VIRALE C
La mesure de la replication virale du VHC repose sur deux principes : la quantification de proteines virales et la quantification d’acides nucleiques viraux. La premiere methodologie (HCV Core antigen, Tonen, Japon) est fondee sur la quantification d’antigenes viraux exprimCs lors de la replication du virus, et consiste en la mesure d’une antigenernie circulante au moyen d’anticorps monoclonaux. Le deuxieme groupe de techniques fait appel a la detection des acides nucleiques viraux. Le VHC &ant present a trop faibles quantites dans le serum, il a fallu recourir a des methodes d’amplification pour detecter et/au quantifier le VHC. La methode d’amplification la plus utilisee (et la premiere decouverte) est l’amplification genique en chaine ou PCR (polymerase chain reaction). Le genome du virus C Ctant un ARN, il est indispensable d’effectuer une reverse transcription (RT) avant l’etape d’amplification. Les differentes techniques de mesure de la charge virale plasmatique par quantification des acides nucleiques viraux peuvent &tre classtes selon leur principe genique telle la methodologique : amplification methode PCR ou la methode NASBA (Organon Technika), amplification de signal du type technique de 1’ADN branch6 (bDNA, Chiron Diagnostic).
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P. Halfon,
MCthodes basCes sur la PCR Techniques c( maisons H Les premieres methodes de quantification par RT-PCR, par dilution limite et par PCR competitive souffrent de manque de reproductibilite et de standardisation dans le cadre d’une utilisation a large echelle. Citons comme exemple le test SuperQuantrM tres utilise aux Btats-Unis dans le cadre d’essais cliniques, developpe par le National Genetic Institute et dont la sensibilite avoisine les 100 copies/ml 17, 81. Techniques commercialise’es La seule mtthode commercialisee de RT-PCR quantitative est le test AmplicorrM HCV Monitor (Roche). Elle repose sur une coamplification de la sequence nucleotidique cible (sit&e dans la region S’non codante du genome VHC) et d’un standard interne ARN differencie de la cible (internal quantitution stundurd ou IQS), ajoute d&s l’etape d’extraction dans chaque Cchantillon [9]. La limite de detection est situee a 1 000 copies par millilitre. De nombreuses ameliorations ont Cte apportees dans la nouvelle version automatise du test (Cobas). Dans notre experience, la version 2 constitue un test plus reproductible, plus sensible (100 copies/ml), plus specifique vis-a-vis des genotypes, plus lineaire et automatisable. Cette automatisation semble avoir rdduit le risque de faux positifs par contamination croisee, mais le principe meme de ce test quantitatif, fond6 sur une dilution des produits de PCR, constitue une limite pour une large utilisation. Techniques en cows de de’veloppement : PCR en temps rkel La methode Taqman (Perkin Elmer) est fondee sur une seule &ape de reverse transcription et amplification, utilisant deux primers et une sonde localisee entre ces deux primers. Pendant la reaction d’amplification, les primers et la sonde s’hybrident sur la cible (si le genome viral est present dans le milieu reactionnel), et la polymerase synthetise done des produits de PCR. Le signal obtenu est proportionnel a la concentration de cible presente au depart, et il est possible d’estimer specifiquement la quantite d’ARN present dans l’echantillon a chaque cycle d’amplification [lo]. La quantification s’effectue done en temps reel, en un seul tube et saris aucune manipulation post-PCR, reduisant ainsi considerablement le risque de contaminations. Un des principes methodologiques du LightCycleirM (Roche-Boehringer) est celui utilise avec le SYBR’rM Green I. Cet agent intercalant se lie preferentiellement a I’ADN double brin nouvellement synthetise. I1 donne une fluorescence proportionnelle a la concentration en ADN. Ce signal de fluorescence est mesure en continu tout au long de l’amplification. En utilisant des standard externes
P. Cacoub
de concentration connue d’acides nucleiques, le LightCyclerTM permet de calculer la concentration d’un Cchantillon par comparaison de courbes de fluorescence. Une autre innovation du LightCycleirM est de pouvoir discriminer des produits d’amplification (par exemple une cible et une contamination) en calculant leur temperature de fusion par courbes de fusion. MCthode fondCe sur une amplification ADN branch4
de signal :
II s’agit du test commercialise QuantiplexTM HCV RNA (Chiron Diagnostics) (test bDNA), qui utilise la complementarite entre le genome viral et plusieurs sondes oligonucleotidiques specifiques des regions les plus conservees [ 11, 121. Ces sondes faites d’ADN capturent par hybridation I’ARN viral. De nombreuses copies d’ADN ont une conliguration en branches qui permet la fixation d’un nombre important (jusqu’a 1 755) de molecules de phosphatases alcalines detectees par un substrat chemoluminescent. La lumiere obtenue est directement proportionnelle au nombre de particules virales presentes dans le prelevement. Le resultat est exprime en equivalents particules virales par millilitre, avec un seuil de detection de 350 000 equivalents particules virales par millilitre dans la version 1 et de 200 000 equivalents particules virales par millilitre dans la version 2. De nombreuses ameliorations de cette methodologie sont a prevoir, visant a augmenter d’une part la specificite par l’incorporation de nouveaux nucleotides qui permettent d’eviter les hybridations non specifiques et, d’autre part. la sensibilite (inferieure a 20 000 Eq/mL) grace une &ape supplementaire d’hybridation a un preamplificateur. La methode NASBA (nucleic mid sequence-bused nmpl~fication) (Organon Technika), deja disponible mais non commercialisee en raison d’un probleme de brevet, ne sera pas developpee dans cet article [ 131. CaractCristiques virale
des techniques de quantification
Sensibilite’ et spkcificite’ En l’absence d’etalon mesure avec des techniques independantes, les seuils de sensibilite des deux tests fond& sur leurs seuils inferieurs de detection (1 000 copies/ml pour le test Monitor version 1 et 200 000 Eq/mL pour le test bDNA version 2) ne sont pas cornparables. En pratique clinique, le test Monitor detecte et quantifie un plus grand nombre de patients que le test bDNA. La specificite des deux tests liee a la qualite des amorces ou des sondes est proche de 100 %. Pour le test Monitor, l’incorporation d’un systeme enzymatique anticontaminant (l’uracyl-N-glycosylase) reduit les faux positifs lies B des produits d’amplification provenant de PCR precedentes (amplicons).
Quantification Tableau
I.
kale
du virus de l’hkpatite
C
177
Compacaison de deux testsde quantification de 1’ARN du virus de l’hepatite C dam le s&mm. Test Amplicor Monitor version 2 (Rochej
R&ion amplifi& M&ode Sensibiliti Sptcificite Reproductibilitc! Lin&witrs Noombrede testsI essai Extraction de I’ARN viml Expression des r&&tats D@endance / genotypes
5’ non codante Amplification par PCR de la cible, standard inteme 103
Environ 100 S 2-47 8 103
a 5.10s
12-24 Oui Copies par mL Non
Reproductibilite’ Differents types de reproductibilite peuvent &tre Cvalues: interessais,intraessais,interoperateurs,inter-lots et interlaboratoires.Nous Cvoqueronsuniquementla reproductibilite destestscommercialids, et non destechniques<> dont la reproductibilite n’est validee que par l’auteur de la technique, avec sesreactifs et dansson propre laboratoire. La reproductibilitt interessaisdu test bDNA version2 est superieurea celle du test Monitor version 1. Detmer et al. [21] utilisant deux lots de tests bDNA, et analysant en double un panel de 24 serumsmanipulespar deux optrateurs differents, obtiennent des coefficients de variation compris entre 9 et 21 % (moyennede 14 %). Izopet et al. [22] ont CvaluCla reproductibilite du test Monitor version 1 dans une etude multicentrique et ont retrouve des coefficients de variation interessaisde 2 a 47 % (moyenne de 22 %). Dans non-eexperience[23], la reproductibilite interessaisobtenuepour le testbDNA estde 6 a 12 % (moyenne de 9 %), et pour le test Monitor de 16 a 27 % (moyennede 21 %). La reproductibilite du test Monitor version 2 automatiseesur Cobasest nettementamelioree. Linkarite’ La linearite d’un test est definie par la zone de quantification lineaire de celui-ci. Elle est estimee entre 10” et 5 x 105 copies/ml (test Monitor), et entre 2 x 105 et 1,2 x 108Eq/mL (test bDNA). Les strums trouves positifs au-de18de ces valeurs doivent &tres analysesde nouveau apres une dilution. La zone de linear& du test Monitor version 2 automatisee est plus &endue, entre 200 et 106copies/mL. La linearite des tests de quantification virale en temps reel est de 50 a lo7 copies/ml [24]. AnaIysc cornparkedesm&odes de quantification du VHC Parmi les differents tests commercialises,deux sont les plus utilises : le test Amplicor-MonitorTM et le test Quantiplex branched DNA assay. Une comparaison de ces
Test Quantiplex btzwtched DNA version 2.0 (Chiron) 5’ non codante et 5’ du Core Amplification de signal, garnme exteme 2.105 95-98 % 9-21% 2.105 a 1.2.10’ 42-84 Non IIIquivalents gkomes par mL Non
techniques est presentee dans le tableau I. Bien que differentes etudes montrent une bonne correlation entre les deux methodessur les memesCchantillons[ 14-161,les unites et les Cchellesde valeurs obtenuesentre copies/ml et equivalents gCnomeslmLne sont pas superposables,et aucune relation mathematiqueutilisable en pratique courante n’a pu etre Ctablie entre les deux tests. En revanche, les resultats obtenus avec le test NGI SuperquantTMet le test Quantiplex branchedDNA assay sont comparables,en particulier pour les viremies comprisesentre 1O6et 10sequivalentsgCnomes/mL.Une relation mathematique,quel que soit le genotype a pu &tre realisee par Lau et al. sur 269 patients[ 171: log,, (SuperquantTM)= 2,567 + 0,579 log,, (Quantiplex, bDNA). Ainsi un serum titre a 2,0 x lo6 copies/ml d’HCVRNA par le test NGI SuperQuantpourrait &tre converti en 2,818 x 106equivalents gCnomelmL par le test Quantiplex branched DNA assay. Cette correlation est tres importante en pratique courante, car lesrecommandations proposeespar la derniere conference europeennede consensusreposentsur les resultatsdes etudesde Poynard et al. [18], de MC Hutchinson et al. [19] et de Davis et al. [20], qui ont toutes CtCrealiseesavec le test NGI SuperQuant. 11faut souligner l’importance de l’etape preanalytique, en particulier du maintien de la chaine du froid qui doit imperativement Ctre respecteedepuis le prelevement jusqu’a l’analyse [26]. FACTEURS INFLUENCANT
LA CHARGE VIRALE
La quantite de virus present dans le sang est le resultat d’une dynamique de production virale. D’autres facteurs lies a l’hote, comme le nombre d’hepatocytes infect&, la consommation d’alcool et l’effkacite de la reponse immune, peuvent modifier la charge virale. L’influence precisede cesdifferents facteurs sur la charge virale dans les compartiments (foie, cellules mononucleeesperipheriques, plasma)reste a preciser.
P. Halfon, P. Cacoub
178
aslbLean D[.Relation entreIetitre d’HCVRNA pn%h&apeutique et la r&we f&on et ribavirine (d’aprks Poynard et al. [183et Mc Hutchison et al. [ZOI). IFMpkzcebo 48 semaines
&&es Poynuni et HCV WA HCV RNf$ Me Nut&wm HCV RNA HCVRNA Total HCV RNA HCV RNA
au trnitement chez 1765 patients, ntifs de titer&t%
trait& par i&r-
IFNJriibavirise 24 semdnes
lFN/ribavitine 48 semaims
al.
3 2 miiiiwsl?&mL
64062
EqfuiL
24183 (13 %) 29195 (31 %)
48f169 /28 %)
c 2 IniIliiolls et al, > 2 rni!&ns -c 2 millions
EqhL Eqlmt
1 l/162 (7 96) 1 E/63 (29 7’0)
44’166 (27 ‘7%) 26i62 (42 %)
541152 (36 %j 33m (43 %)
> 2 millions < 2~Wions
EqhL EqhL
35/145 (IO %) 47/m (30 %,)
9U335 (27 I) 74/1;ro@4 %)
). 181314 (38 %) 87/191(46 %)
?0/108144ca))
(40 %)
54/l15(47%,)
IFN : interf&on.
Parmi les facteurs lies au virus, la correlation entre le nombre de mutations dans la region NSSA et la charge virale, demontree initialement par les travaux japonais [27], n’a pas CtCretrouvee dans notre experience [28] ni dansdifferentes etudeseuropeennes[29]. La co-infection par le virus G n’a pas d’influence sur la charge virale C [31]. En revanche, la co-infection par le virus de l’immunodeficience humaine (VIH) augmentela charge virale C [32]. L’influence du genotype sur la quantification virale est d’approche delicate. Les problemes lies aux versions 1 du bDNA et du test Monitor, qui sous-evaluaient les genotypes non 1 133-351,sont resolusavec la version 2 du bDNA qui apparait independantedu genotype viral. I1 ne semblepas y avoir de relation entre la variabilite du VHC (complexite genetique, c’est-a-dire le nombre de quasi-especes)et la charge virale [30]. En Cvaluant chez 44 patients le test Monitor version 2 automatise sur Cobas, et le test bDNA version 2 [23], la charge virale paraissaitindependantedu genotype [36].
IMPLICATIONS CLINIQUES DE LA MESURE DE LA CHARGE VIRALE Charge virale et histoire naturelle de la maladie Les etudesde cinetique aprescontamination par le VHC post-transfusionnelleont montre que la viremie devient detectable entre le 15eet 21’ jour apres le contage [37]. Lors d’une hepatite C chronique, la viremie persistea tous les stadesde la maladie,quel que soit le gradehistologique, a des niveaux variant entre 102a 10’ copies/ml et 107a IO* Eq/mL. 11n’y a aucune correlation entre la charge virale plasmatiqueet l’activite histologiquehepatiquede la maladie [38], sauf a un stade tres avance (cirrhose ou hepatocarcinome)oti la chargevirale plasmatiquediminue. Des fluctuations spontaneesde la viremie (d’un facteur 2,6 a 5,7) peuvent &tre observeeschez certainspatients[39], et sont plus frequenteschez lespatientsayant destransaminasesnormales[40]. Chez le petit nombrede patientsinfect&
par le VHC qui ne developperontpasde maladiehepatique ou extrahepatique(moinsde 20 % descas), la chargevirale reste indetectable alors que les anticorps sont persistants. Aucune correlation n’est retrouvee entre le taux destransaminaseset le niveau de charge virale [40]. Charge virale et reponse au traitement Plusieurstypes de reponsevirologique peuvent &tre d&Iinis pendant le traitement, en fonction des variations de charge virale [39, 401. Le patient <(non repondeur >>est celui dont la charge virale reste positive par PCR (HCV RNA superieur a 100 copies/ml) pendant et a la fin du traitement. Le patient <est celui dont la charge virale decroit de plus de 0,5 log pendant les trois premiersmois du traitement (sansntgativer sa viremie) et qui remonte en fm de traitement. Le patient <kest celui dont la charge virale est negative par PCR (HCV RNA inferieur a 100 copies/ml) pendant le traitement. Ces patients repondeurspeuvent &tre classesen fonction de la duke de l’eradication virale : - pour le patient repondeur <>,la charge virale redevient positive a la fin ou apresla fin du traitement ; - pour le repondeursoutenu,la chargevirale restenegative par PCR au moinssix moisapresla fin du traitement. La charge virale pretherapeutiqueconstitue, en analyse multivariee, un marqueur independant predictif de la reponse au traitement. Les patients ayant une charge virale faible presententun taux de reponseau traitement par interferon superieur Bceux qui ont une charge virale Clevee [42, 431. Bien que seulsles patients qui ont une viremie detectable soient candidats au traitement, le niveau de cette viremie ne doit pas faire r&user un traitement. Les etudes de Poynard et al. [ 181 et de MC Hutchinson et al. [ 191portant sur 1 565 patients ndifs (tableau IZ), et celle de Davis et al. [20] portant sur
Quantification
virale du virus de l’htpatite
345 patients repondeurs-rechuteurs (tableau III), ont permis de preciser la valeur predictive de la charge virale C pretherapeutique. Avec un traitement par interferon seul, seulement 10 % de patients na’ifs et 15 % de rtpondeursrechuteurs ayant une viremie superieure a 2 millions d’equivalents genomes par millilitre ont eu une reponse soutenue, contre respectivement 30 et 15 % de ceux ayant une viremie inferieure a 2 millions d’equivalents genomes par millilitre. Avec un traitement de 24 semaines combinant interferon et ribavirine, seulement 27 % de patients ndifs et 39 % de repondeurs-rechuteurs ayant une viremie suptrieure a 2 millions d’equivalents gtnomes par millilitre ont eu une reponse soutenue, contre respectivement 44 et 67 % de ceux ayant une viremie inferieure a 2 millions d’equivalents genomes par millilitre. La recente conference europeenne de consensus sur le virus C (1999) a ainsi recommande l’utilisation de la viremie quantitative pour moduler la duree du traitement chez les patients na’ifs candidats au traitement combine interferon-ribavirine. Charge virale et terrains
particuliers
11 a Cte d&it que la charge virale diminuait au tours d’une m&me stance de dialyse [44]. Dans notre experience, le suivi virologique d’hemodialysds chroniques a six mois d’intervalle ne montre aucune influence de la dialyse sur la charge virale qui reste relativement faible [451. L’hypothbse la plus seduisante serait que le risque lie a divers modes de transmissions (sexuelle, nosocomiale, etc.) soit lie a un taux Clevd de charge virale. En fait, en l’absence d’etudes prospectives realisees avec des outils standardids, il est impossible de definir a l’echelle individuelle un seuil permettant de quantifier ce risque de transmission. Le risque professionnel maximal a Cte estime a 10 % pour des piqures accidentelles occasion-
179
C
trees par du materiel utilise chez des sujets viremiques. La presence d’une viremie positive, voire la quantification de la viremie, du sujet contact peut permettre d’apprecier le risque de contamination. La recherche de I’ARN du VHC est le test le plus precoce en cas d’infection, indispensable a realiser pour detecter tres precocement une transmission et pour envisager un traitement en phase aigue [46,473. Une charge virale ClevCe pendant la grossesse serait un des facteurs de risque de transmission maternofmtale [48]. Une etude japonaise a montre que trois des 57 enfants nCs de meres anti-VHC positives etaient PCR positifs, un et trois mois apres la naissance. La transmission n’est intervenue que pour les enfants nes de meres viremiques qui presentaient le plus haut niveau de charge virale [48]. La charge virale appreciee par le bDNA est multipliee par un facteur 10 aprbs transplantation hepatique [49], alors que les lesions htpatiques restent initialement modtrees. La charge virale avant la transplantation est en partie predictive de la survie du patient a cinq ans, 87 contre 54 % de survie pour les greffes dont la viremie Ctait superieure ou inferieure a 1 million Eq/mL (bDNA), respectivement. Chez le transplant& l’augmentation precoce de la charge virale serait un marqueur de la reinfection aigue du greffon, constituant un marqueur de rejet aigu de celui-ci [50]. Peu d’etudes ont tentt de correler la viremie plasmatique a la presence du virus dans le foie. Bien que la quantification intrahepatique du VHC (exprimee en nombre de copies par hepatocytes) soit un marqueur possible de reponse au traitement [5 11, les donnees de la litterature ne permettent pas de tirer de conclusion formelle sur la relation viremie plasmatique-charge virale hepatique. TEST QUALITATIF OU QUANTITATIF LEQUEL CHOISIR ET POUR QUELLES INDICATIONS ?
:
Le consensus actuel, du fait de l’absence de correlation Cvidente entre la quantification virale et la prediction de l’tvolution de la maladie, est de rechercher dans le bilan initial des patients anti-VHC positifs une viremie par PCR. Cette recherche permet de differencier une infection virale active (PCR positive) d’une infection virale ancienne ou guerie (PCR negative), voire d’une autre cause d’hdpatopathie chronique. Lors du suivi d’un traitement antiviral par l’interferon et/au la ribavirine, dont le but recherche est la ntgativation de la viremie, il faut utiliser la technique qualitative standardike la plus sensible. Cette recherche sera effectuee au tours du traitement (a trois mois), en tin de traitement et a distance (six mois apres l’arret du traitement). L’avenir sera certainement un test quantitatif et sensible (inferieur a 50 copies/n&), et a un prix moindre que les tests actuels.
P. Halfon.
180 LIMITES
DE LA QUANTIFICATION
VIRALE
C
La validation de l’approche quantitative doit commencer par une standardisation des methodes et des procedures [25]. En depit des agents chimiques anticontaminations, de la separation physiques des pieces, notamment de prtet post-PCR, et des bonnes pratiques de laboratoire, le risque de contaminations lors de la reaction PCR n’est pas nut. Une autre limite est l’absence d’informations sur la nature (infectieuse ou defective) des particules virales quantifiees. Une des voies d’avenir pourrait &tre de quantifier directement (sans reverse transcription) les ARN messagers du VHC, temoins de la transcription du virus lors de la replication de celui-ci. La signification d’une viremie pretherapeutique determince de man&e isolee n’est pas completement Ctablie. Dans notre experience, en plus de l’existence du phenomene de fluctuations spontanees de la viremie (de 2,6 a 5,7 fois), de nombreux facteurs techniques peuvent intervenir (reproductibilite, stabilite, variabilitt biologique de la grandeur mesuree d’un Cchantillon a I’autre), laissant un doute quant a la valeur predictive d’une viremie unique pretherapeutique. Seules des variations de plus de 0,5 log’0 entre deux valeurs doivent &tre considerees comme significatives. Le seuil decisionnel de cette viremie n’est pas Ctabli de man&e consensuelle (2 x 106 Eq/ mL en test bDNA, 105 copies/ml en test Monitor, 20 pg/ mL en HCV Core Antigen). Enfin, a l’echelon individuel, aucun niveau de charge virale n’est predictif d’une reponse virologique complete. CONCLUSION La determination de la charge virale C constitue aujourd’hui un outil performant et disponible pour les cliniciens afin de guider l’utilisation des traitements antiviraux. L’optimisation du choix des tests diagnostiques permet d’eviter des examens inutiles et couteux. L’utilisation de la viremie quantitative dans un algorithme decisionnel therapeutique incluant d’autres marqueurs dont l’age, le genotype viral, le degre d’hCtQogCnCitC genetique et le score de fibrose permettront d’adapter les combinaisons therapeutiques a un patient donne. Du fait de la grande sensibilite des tests en developpement, le debat sur l’utilisation du test qualitatif ou quantitatif deviendra rapidement obsolete au profit de l’utilisation rationnelle d’un seul test quantitatif et ultrasensible. RkFltRENCES I Zeuaem S, Schmidt JM, Lee JH, Riister B, Roth WK. Effect of interferon alfa on the dynamics of hepatitis C virus turnover in vivo. Hepatology 1996 ; 23 : 366-7 1, 2 Lam NP, Neumann AU, Gretch DR, Wiley TE, Perelson AS, Layden TJ. Dose-dependent acute clearance of hepatitis C genotype 1 virus with interferon alpha. Hepatology 1997 ; 26 : 226-3 1.
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virale du virus de l’hepatite
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C
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Mise au point
Quantification
virale du virus de l’hkpatite
Elsevier
SAS. Tous droita rCservCs
C : p&sent et avenir
P. Halfon I, P. Cacoub ** ’ Lahorutoire Alphabio, h&pita1 Ambroise-Par&, 23, rue de Frirdlnnd, 13006 Marseille ; ‘service h6pital de la PitiC-Snlp&tri?re, 83. boulelurd de L’Hripitcd, 75651 Paris cede-r 13. Fruncr (Regx le 25 mai 1999 ; accept6 le 3 septembre
de t&decitza
interm.
1999)
R&cum6 Introduction. - Le terme charge virale plasmatique est utilise pour designer la viremie plasmatique, traduction de I’activite replicative du virus de I’hepatite C (VHC), exprimee en copies par millilitre ou en equivalents particules virales par millilitre. Acfua/if& et points fork. - Les techniques visant a mesurer un nombre de particules virales infectieuses (mod&e animal et culture cellulaire) sont encore limitees. La charge virale plasmatique mesuree par les techniques actuelles ne permet pas de differencier les particules virales completes des particules virales defectives. Les differentes methodes de mesure de la replication virale du VHC reposent sur deux principes : la quantification de proteines virales (mesure dune antigenernie circulante au moyen d’anticorps monoclonaux), et surtout la quantification d’acides nucleiques viraux par amplification genique apres transcription inverse (RT-PCR), ou par amplification de signal (ADN branche). II n’y a pas de correlation entre la viremie et I’activite histologique de la maladie. La repetition des charges virales, chez les patients viremiques, en I’absence de traitement est inutile. En pratique clinique, la mesure de la charge virale VHC plasmatique est utile dans le bilan pretherapeutique. Perspectives et projets. - Llutilisation de la viremie quantitative dans un algorithme decisionnel therapeutique incluant d’autres marqueurs dont I’age, le genotype viral, le degre d’heterogeneite genetique et le score de fibrose permettront d’adapter les combinaisons therapeutiques a un patient don& 0 2000 editions scientifiques et medicales Elsevier SAS hepatite
C / charge
virale
C I polymerase
chain
reaction
I ADN
branch6
I viremie
quantitative
Summary - Quantitation of hepatitis C virus RNA: present and future. Introduction. - Hepatitis C virus (HCV) plasmatic load, also called HCV viremia, is expressed in copies per milliliter or viral particle equivalents per milliliteer. Current knowledge and key points. - The methods used to measure HCV viremia are based on two principles: the quantitation of viral proteins (measure of antigenemia using monoclonal antibodies), and the quantitation of viral nucleic acid using PCR after reverse transription (RFPC/?), or signal amplification (branched DNA). There is no relationship between viremia and liver histologic activity Future prospects and projects. - The use of HCV quantitative viremia in a treatment algorithm, including other factors such as age, genotype, degree of viral genetic heterogenity, and liver fibrosis score will help adapt therapeutic associations for each individual. 0 2000 editions scientifiques et medicales Elsevier SAS hepatitis
Torrespondance
C virus
et tire’s ?I part : P. Cacoub.
I viremia
I HCV viral
m&me adresse.
load I PCR I branched
DNA/quantitative
viremia
Quantification
virale du virus de 1’hCpatite C
Depuis la dtcouverte du virus de l’hepatite C (VHC) en 1989 grace aux techniques de biologie moleculaire, la necessitt de detecter, puis de quantifier la presence du VHC chez un patient est rapidement apparue comme indispensable pour les virologues et les cliniciens. Les applications des techniques de quantification virale en virologie clinique humaine se retrouvent essentiellement dans les pathologies likes aux virus responsables d’infections chroniques ou latentes, pour lesquelles une orientation pronostique voire therapeutique existent. D’un point de vue methodologique, de nombreuses techniques de quantification virale se sont developpees avec des seuils de sensibilite ameliorts et une specificit croissante. Cependant, la variabilite des resultats observes like a l’absence de standardisation de ces tests constitue un obstacle a leur utilisation rationnelle. La recente mise au point d’un systeme de propagation cellulaire du VHC sur des cultures d’hepatocytes humains et les nouveaux schemas therapeutiques ouvrent un avenir tres prometteur a la quantification virale du VHC. L’objectif de cet article est de tenter de preciser, dix ans apres la decouverte du virus de l’htpatite C, la place et les limites des techniques actuelles, ainsi que les voies d’avenir de la quantification virale du VHC. DtiFINITIONS La viremie d&nit la concentration de virus ou d’bquivalents viraux presents dans la circulation sanguine. La charge virale definit la quantite totale de virus presente chez un patient. En fait, le terme <
175
sites extrahepatiques, et la degradation du virus (compartiment de degradation) [ 11. La replication du virus C est particulierement ClevCe (lo’* virions par jour), et son turn-over est ClevC (demi-vie de 2,7 heures). La majorite des virions circulants du VHC resultent de cycles continus d’infection d’hepatocytes de novo. Ce turn-over tres rapide de virions infectieux entraine la generation rapide de variants moleculaires et constitue un moyen d’echappement du VHC a la surveillance du systeme immunitaire
[61. Les infections chroniques a VHC sont caracterisees par la presence constante de virus infectieux libres. 11 est clairement demontre que le virus C est responsable d’htpatites et se replique dans le foie. Le virus C est tgalement a l’origine de manifestations extrahepatiques. Bien que l’eventualitt d’une replication virale dans les cellules mononucleees peripheriques et dans la salive ait et6 Cvoqute, le probleme est encore discute. Les difficult& dans l’etude de la replication virale sont d’ordre technique. Un resultat faussement positif dans un tissu ou dans un organe peut Ctre lie a une contamination sanguine. Seule les techniques dites <
DE QUANTIFICATION VIRALE C
La mesure de la replication virale du VHC repose sur deux principes : la quantification de proteines virales et la quantification d’acides nucleiques viraux. La premiere methodologie (HCV Core antigen, Tonen, Japon) est fondee sur la quantification d’antigenes viraux exprimCs lors de la replication du virus, et consiste en la mesure d’une antigenernie circulante au moyen d’anticorps monoclonaux. Le deuxieme groupe de techniques fait appel a la detection des acides nucleiques viraux. Le VHC &ant present a trop faibles quantites dans le serum, il a fallu recourir a des methodes d’amplification pour detecter et/au quantifier le VHC. La methode d’amplification la plus utilisee (et la premiere decouverte) est l’amplification genique en chaine ou PCR (polymerase chain reaction). Le genome du virus C Ctant un ARN, il est indispensable d’effectuer une reverse transcription (RT) avant l’etape d’amplification. Les differentes techniques de mesure de la charge virale plasmatique par quantification des acides nucleiques viraux peuvent &tre classtes selon leur principe genique telle la methodologique : amplification methode PCR ou la methode NASBA (Organon Technika), amplification de signal du type technique de 1’ADN branch6 (bDNA, Chiron Diagnostic).
176
P. Halfon,
MCthodes basCes sur la PCR Techniques c( maisons H Les premieres methodes de quantification par RT-PCR, par dilution limite et par PCR competitive souffrent de manque de reproductibilite et de standardisation dans le cadre d’une utilisation a large echelle. Citons comme exemple le test SuperQuantrM tres utilise aux Btats-Unis dans le cadre d’essais cliniques, developpe par le National Genetic Institute et dont la sensibilite avoisine les 100 copies/ml 17, 81. Techniques commercialise’es La seule mtthode commercialisee de RT-PCR quantitative est le test AmplicorrM HCV Monitor (Roche). Elle repose sur une coamplification de la sequence nucleotidique cible (sit&e dans la region S’non codante du genome VHC) et d’un standard interne ARN differencie de la cible (internal quantitution stundurd ou IQS), ajoute d&s l’etape d’extraction dans chaque Cchantillon [9]. La limite de detection est situee a 1 000 copies par millilitre. De nombreuses ameliorations ont Cte apportees dans la nouvelle version automatise du test (Cobas). Dans notre experience, la version 2 constitue un test plus reproductible, plus sensible (100 copies/ml), plus specifique vis-a-vis des genotypes, plus lineaire et automatisable. Cette automatisation semble avoir rdduit le risque de faux positifs par contamination croisee, mais le principe meme de ce test quantitatif, fond6 sur une dilution des produits de PCR, constitue une limite pour une large utilisation. Techniques en cows de de’veloppement : PCR en temps rkel La methode Taqman (Perkin Elmer) est fondee sur une seule &ape de reverse transcription et amplification, utilisant deux primers et une sonde localisee entre ces deux primers. Pendant la reaction d’amplification, les primers et la sonde s’hybrident sur la cible (si le genome viral est present dans le milieu reactionnel), et la polymerase synthetise done des produits de PCR. Le signal obtenu est proportionnel a la concentration de cible presente au depart, et il est possible d’estimer specifiquement la quantite d’ARN present dans l’echantillon a chaque cycle d’amplification [lo]. La quantification s’effectue done en temps reel, en un seul tube et saris aucune manipulation post-PCR, reduisant ainsi considerablement le risque de contaminations. Un des principes methodologiques du LightCycleirM (Roche-Boehringer) est celui utilise avec le SYBR’rM Green I. Cet agent intercalant se lie preferentiellement a I’ADN double brin nouvellement synthetise. I1 donne une fluorescence proportionnelle a la concentration en ADN. Ce signal de fluorescence est mesure en continu tout au long de l’amplification. En utilisant des standard externes
P. Cacoub
de concentration connue d’acides nucleiques, le LightCyclerTM permet de calculer la concentration d’un Cchantillon par comparaison de courbes de fluorescence. Une autre innovation du LightCycleirM est de pouvoir discriminer des produits d’amplification (par exemple une cible et une contamination) en calculant leur temperature de fusion par courbes de fusion. MCthode fondCe sur une amplification ADN branch4
de signal :
II s’agit du test commercialise QuantiplexTM HCV RNA (Chiron Diagnostics) (test bDNA), qui utilise la complementarite entre le genome viral et plusieurs sondes oligonucleotidiques specifiques des regions les plus conservees [ 11, 121. Ces sondes faites d’ADN capturent par hybridation I’ARN viral. De nombreuses copies d’ADN ont une conliguration en branches qui permet la fixation d’un nombre important (jusqu’a 1 755) de molecules de phosphatases alcalines detectees par un substrat chemoluminescent. La lumiere obtenue est directement proportionnelle au nombre de particules virales presentes dans le prelevement. Le resultat est exprime en equivalents particules virales par millilitre, avec un seuil de detection de 350 000 equivalents particules virales par millilitre dans la version 1 et de 200 000 equivalents particules virales par millilitre dans la version 2. De nombreuses ameliorations de cette methodologie sont a prevoir, visant a augmenter d’une part la specificite par l’incorporation de nouveaux nucleotides qui permettent d’eviter les hybridations non specifiques et, d’autre part. la sensibilite (inferieure a 20 000 Eq/mL) grace une &ape supplementaire d’hybridation a un preamplificateur. La methode NASBA (nucleic mid sequence-bused nmpl~fication) (Organon Technika), deja disponible mais non commercialisee en raison d’un probleme de brevet, ne sera pas developpee dans cet article [ 131. CaractCristiques virale
des techniques de quantification
Sensibilite’ et spkcificite’ En l’absence d’etalon mesure avec des techniques independantes, les seuils de sensibilite des deux tests fond& sur leurs seuils inferieurs de detection (1 000 copies/ml pour le test Monitor version 1 et 200 000 Eq/mL pour le test bDNA version 2) ne sont pas cornparables. En pratique clinique, le test Monitor detecte et quantifie un plus grand nombre de patients que le test bDNA. La specificite des deux tests liee a la qualite des amorces ou des sondes est proche de 100 %. Pour le test Monitor, l’incorporation d’un systeme enzymatique anticontaminant (l’uracyl-N-glycosylase) reduit les faux positifs lies B des produits d’amplification provenant de PCR precedentes (amplicons).
Quantification Tableau
I.
kale
du virus de l’hkpatite
C
177
Compacaison de deux testsde quantification de 1’ARN du virus de l’hepatite C dam le s&mm. Test Amplicor Monitor version 2 (Rochej
R&ion amplifi& M&ode Sensibiliti Sptcificite Reproductibilitc! Lin&witrs Noombrede testsI essai Extraction de I’ARN viml Expression des r&&tats D@endance / genotypes
5’ non codante Amplification par PCR de la cible, standard inteme 103
Environ 100 S 2-47 8 103
a 5.10s
12-24 Oui Copies par mL Non
Reproductibilite’ Differents types de reproductibilite peuvent &tre Cvalues: interessais,intraessais,interoperateurs,inter-lots et interlaboratoires.Nous Cvoqueronsuniquementla reproductibilite destestscommercialids, et non destechniques<
Test Quantiplex btzwtched DNA version 2.0 (Chiron) 5’ non codante et 5’ du Core Amplification de signal, garnme exteme 2.105 95-98 % 9-21% 2.105 a 1.2.10’ 42-84 Non IIIquivalents gkomes par mL Non
techniques est presentee dans le tableau I. Bien que differentes etudes montrent une bonne correlation entre les deux methodessur les memesCchantillons[ 14-161,les unites et les Cchellesde valeurs obtenuesentre copies/ml et equivalents gCnomeslmLne sont pas superposables,et aucune relation mathematiqueutilisable en pratique courante n’a pu etre Ctablie entre les deux tests. En revanche, les resultats obtenus avec le test NGI SuperquantTMet le test Quantiplex branchedDNA assay sont comparables,en particulier pour les viremies comprisesentre 1O6et 10sequivalentsgCnomes/mL.Une relation mathematique,quel que soit le genotype a pu &tre realisee par Lau et al. sur 269 patients[ 171: log,, (SuperquantTM)= 2,567 + 0,579 log,, (Quantiplex, bDNA). Ainsi un serum titre a 2,0 x lo6 copies/ml d’HCVRNA par le test NGI SuperQuantpourrait &tre converti en 2,818 x 106equivalents gCnomelmL par le test Quantiplex branched DNA assay. Cette correlation est tres importante en pratique courante, car lesrecommandations proposeespar la derniere conference europeennede consensusreposentsur les resultatsdes etudesde Poynard et al. [18], de MC Hutchinson et al. [19] et de Davis et al. [20], qui ont toutes CtCrealiseesavec le test NGI SuperQuant. 11faut souligner l’importance de l’etape preanalytique, en particulier du maintien de la chaine du froid qui doit imperativement Ctre respecteedepuis le prelevement jusqu’a l’analyse [26]. FACTEURS INFLUENCANT
LA CHARGE VIRALE
La quantite de virus present dans le sang est le resultat d’une dynamique de production virale. D’autres facteurs lies a l’hote, comme le nombre d’hepatocytes infect&, la consommation d’alcool et l’effkacite de la reponse immune, peuvent modifier la charge virale. L’influence precisede cesdifferents facteurs sur la charge virale dans les compartiments (foie, cellules mononucleeesperipheriques, plasma)reste a preciser.
P. Halfon, P. Cacoub
178
aslbLean D[.Relation entreIetitre d’HCVRNA pn%h&apeutique et la r&we f&on et ribavirine (d’aprks Poynard et al. [183et Mc Hutchison et al. [ZOI). IFMpkzcebo 48 semaines
&&es Poynuni et HCV WA HCV RNf$ Me Nut&wm HCV RNA HCVRNA Total HCV RNA HCV RNA
au trnitement chez 1765 patients, ntifs de titer&t%
trait& par i&r-
IFNJriibavirise 24 semdnes
lFN/ribavitine 48 semaims
al.
3 2 miiiiwsl?&mL
64062
EqfuiL
24183 (13 %) 29195 (31 %)
48f169 /28 %)
c 2 IniIliiolls et al, > 2 rni!&ns -c 2 millions
EqhL Eqlmt
1 l/162 (7 96) 1 E/63 (29 7’0)
44’166 (27 ‘7%) 26i62 (42 %)
541152 (36 %j 33m (43 %)
> 2 millions < 2~Wions
EqhL EqhL
35/145 (IO %) 47/m (30 %,)
9U335 (27 I) 74/1;ro@4 %)
). 181314 (38 %) 87/191(46 %)
?0/108144ca))
(40 %)
54/l15(47%,)
IFN : interf&on.
Parmi les facteurs lies au virus, la correlation entre le nombre de mutations dans la region NSSA et la charge virale, demontree initialement par les travaux japonais [27], n’a pas CtCretrouvee dans notre experience [28] ni dansdifferentes etudeseuropeennes[29]. La co-infection par le virus G n’a pas d’influence sur la charge virale C [31]. En revanche, la co-infection par le virus de l’immunodeficience humaine (VIH) augmentela charge virale C [32]. L’influence du genotype sur la quantification virale est d’approche delicate. Les problemes lies aux versions 1 du bDNA et du test Monitor, qui sous-evaluaient les genotypes non 1 133-351,sont resolusavec la version 2 du bDNA qui apparait independantedu genotype viral. I1 ne semblepas y avoir de relation entre la variabilite du VHC (complexite genetique, c’est-a-dire le nombre de quasi-especes)et la charge virale [30]. En Cvaluant chez 44 patients le test Monitor version 2 automatise sur Cobas, et le test bDNA version 2 [23], la charge virale paraissaitindependantedu genotype [36].
IMPLICATIONS CLINIQUES DE LA MESURE DE LA CHARGE VIRALE Charge virale et histoire naturelle de la maladie Les etudesde cinetique aprescontamination par le VHC post-transfusionnelleont montre que la viremie devient detectable entre le 15eet 21’ jour apres le contage [37]. Lors d’une hepatite C chronique, la viremie persistea tous les stadesde la maladie,quel que soit le gradehistologique, a des niveaux variant entre 102a 10’ copies/ml et 107a IO* Eq/mL. 11n’y a aucune correlation entre la charge virale plasmatiqueet l’activite histologiquehepatiquede la maladie [38], sauf a un stade tres avance (cirrhose ou hepatocarcinome)oti la chargevirale plasmatiquediminue. Des fluctuations spontaneesde la viremie (d’un facteur 2,6 a 5,7) peuvent &tre observeeschez certainspatients[39], et sont plus frequenteschez lespatientsayant destransaminasesnormales[40]. Chez le petit nombrede patientsinfect&
par le VHC qui ne developperontpasde maladiehepatique ou extrahepatique(moinsde 20 % descas), la chargevirale reste indetectable alors que les anticorps sont persistants. Aucune correlation n’est retrouvee entre le taux destransaminaseset le niveau de charge virale [40]. Charge virale et reponse au traitement Plusieurstypes de reponsevirologique peuvent &tre d&Iinis pendant le traitement, en fonction des variations de charge virale [39, 401. Le patient <(non repondeur >>est celui dont la charge virale reste positive par PCR (HCV RNA superieur a 100 copies/ml) pendant et a la fin du traitement. Le patient <
Quantification
virale du virus de l’htpatite
345 patients repondeurs-rechuteurs (tableau III), ont permis de preciser la valeur predictive de la charge virale C pretherapeutique. Avec un traitement par interferon seul, seulement 10 % de patients na’ifs et 15 % de rtpondeursrechuteurs ayant une viremie superieure a 2 millions d’equivalents genomes par millilitre ont eu une reponse soutenue, contre respectivement 30 et 15 % de ceux ayant une viremie inferieure a 2 millions d’equivalents genomes par millilitre. Avec un traitement de 24 semaines combinant interferon et ribavirine, seulement 27 % de patients ndifs et 39 % de repondeurs-rechuteurs ayant une viremie suptrieure a 2 millions d’equivalents gtnomes par millilitre ont eu une reponse soutenue, contre respectivement 44 et 67 % de ceux ayant une viremie inferieure a 2 millions d’equivalents genomes par millilitre. La recente conference europeenne de consensus sur le virus C (1999) a ainsi recommande l’utilisation de la viremie quantitative pour moduler la duree du traitement chez les patients na’ifs candidats au traitement combine interferon-ribavirine. Charge virale et terrains
particuliers
11 a Cte d&it que la charge virale diminuait au tours d’une m&me stance de dialyse [44]. Dans notre experience, le suivi virologique d’hemodialysds chroniques a six mois d’intervalle ne montre aucune influence de la dialyse sur la charge virale qui reste relativement faible [451. L’hypothbse la plus seduisante serait que le risque lie a divers modes de transmissions (sexuelle, nosocomiale, etc.) soit lie a un taux Clevd de charge virale. En fait, en l’absence d’etudes prospectives realisees avec des outils standardids, il est impossible de definir a l’echelle individuelle un seuil permettant de quantifier ce risque de transmission. Le risque professionnel maximal a Cte estime a 10 % pour des piqures accidentelles occasion-
179
C
trees par du materiel utilise chez des sujets viremiques. La presence d’une viremie positive, voire la quantification de la viremie, du sujet contact peut permettre d’apprecier le risque de contamination. La recherche de I’ARN du VHC est le test le plus precoce en cas d’infection, indispensable a realiser pour detecter tres precocement une transmission et pour envisager un traitement en phase aigue [46,473. Une charge virale ClevCe pendant la grossesse serait un des facteurs de risque de transmission maternofmtale [48]. Une etude japonaise a montre que trois des 57 enfants nCs de meres anti-VHC positives etaient PCR positifs, un et trois mois apres la naissance. La transmission n’est intervenue que pour les enfants nes de meres viremiques qui presentaient le plus haut niveau de charge virale [48]. La charge virale appreciee par le bDNA est multipliee par un facteur 10 aprbs transplantation hepatique [49], alors que les lesions htpatiques restent initialement modtrees. La charge virale avant la transplantation est en partie predictive de la survie du patient a cinq ans, 87 contre 54 % de survie pour les greffes dont la viremie Ctait superieure ou inferieure a 1 million Eq/mL (bDNA), respectivement. Chez le transplant& l’augmentation precoce de la charge virale serait un marqueur de la reinfection aigue du greffon, constituant un marqueur de rejet aigu de celui-ci [50]. Peu d’etudes ont tentt de correler la viremie plasmatique a la presence du virus dans le foie. Bien que la quantification intrahepatique du VHC (exprimee en nombre de copies par hepatocytes) soit un marqueur possible de reponse au traitement [5 11, les donnees de la litterature ne permettent pas de tirer de conclusion formelle sur la relation viremie plasmatique-charge virale hepatique. TEST QUALITATIF OU QUANTITATIF LEQUEL CHOISIR ET POUR QUELLES INDICATIONS ?
:
Le consensus actuel, du fait de l’absence de correlation Cvidente entre la quantification virale et la prediction de l’tvolution de la maladie, est de rechercher dans le bilan initial des patients anti-VHC positifs une viremie par PCR. Cette recherche permet de differencier une infection virale active (PCR positive) d’une infection virale ancienne ou guerie (PCR negative), voire d’une autre cause d’hdpatopathie chronique. Lors du suivi d’un traitement antiviral par l’interferon et/au la ribavirine, dont le but recherche est la ntgativation de la viremie, il faut utiliser la technique qualitative standardike la plus sensible. Cette recherche sera effectuee au tours du traitement (a trois mois), en tin de traitement et a distance (six mois apres l’arret du traitement). L’avenir sera certainement un test quantitatif et sensible (inferieur a 50 copies/n&), et a un prix moindre que les tests actuels.
P. Halfon.
180 LIMITES
DE LA QUANTIFICATION
VIRALE
C
La validation de l’approche quantitative doit commencer par une standardisation des methodes et des procedures [25]. En depit des agents chimiques anticontaminations, de la separation physiques des pieces, notamment de prtet post-PCR, et des bonnes pratiques de laboratoire, le risque de contaminations lors de la reaction PCR n’est pas nut. Une autre limite est l’absence d’informations sur la nature (infectieuse ou defective) des particules virales quantifiees. Une des voies d’avenir pourrait &tre de quantifier directement (sans reverse transcription) les ARN messagers du VHC, temoins de la transcription du virus lors de la replication de celui-ci. La signification d’une viremie pretherapeutique determince de man&e isolee n’est pas completement Ctablie. Dans notre experience, en plus de l’existence du phenomene de fluctuations spontanees de la viremie (de 2,6 a 5,7 fois), de nombreux facteurs techniques peuvent intervenir (reproductibilite, stabilite, variabilitt biologique de la grandeur mesuree d’un Cchantillon a I’autre), laissant un doute quant a la valeur predictive d’une viremie unique pretherapeutique. Seules des variations de plus de 0,5 log’0 entre deux valeurs doivent &tre considerees comme significatives. Le seuil decisionnel de cette viremie n’est pas Ctabli de man&e consensuelle (2 x 106 Eq/ mL en test bDNA, 105 copies/ml en test Monitor, 20 pg/ mL en HCV Core Antigen). Enfin, a l’echelon individuel, aucun niveau de charge virale n’est predictif d’une reponse virologique complete. CONCLUSION La determination de la charge virale C constitue aujourd’hui un outil performant et disponible pour les cliniciens afin de guider l’utilisation des traitements antiviraux. L’optimisation du choix des tests diagnostiques permet d’eviter des examens inutiles et couteux. L’utilisation de la viremie quantitative dans un algorithme decisionnel therapeutique incluant d’autres marqueurs dont l’age, le genotype viral, le degre d’hCtQogCnCitC genetique et le score de fibrose permettront d’adapter les combinaisons therapeutiques a un patient donne. Du fait de la grande sensibilite des tests en developpement, le debat sur l’utilisation du test qualitatif ou quantitatif deviendra rapidement obsolete au profit de l’utilisation rationnelle d’un seul test quantitatif et ultrasensible. RkFltRENCES I Zeuaem S, Schmidt JM, Lee JH, Riister B, Roth WK. Effect of interferon alfa on the dynamics of hepatitis C virus turnover in vivo. Hepatology 1996 ; 23 : 366-7 1, 2 Lam NP, Neumann AU, Gretch DR, Wiley TE, Perelson AS, Layden TJ. Dose-dependent acute clearance of hepatitis C genotype 1 virus with interferon alpha. Hepatology 1997 ; 26 : 226-3 1.
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Quantification
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virale du virus de l’hepatite
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