RESEARCH
NOTE
RECHERCHE QUALITATIVE DE DERIVES INDOLIQUES DANS L’EPITHELIUM PIGMENTAIRE RETINIEN DE LA TRUITE (SALMO IRZDEUS) GEF~~~vI~vE CI&ZE* Laboratoire de Biologie Appliquke. lnstitut Universitaire de Technologie. 29283 Brest cedex. France (Receiced
10 December
1977)
elles sent soumises g la technique d’extraction qui prbcede l’analyse chromatographique.
INTRODUCTION Les facteurs biochimiques susceptibles d’intervenir dans la dynamique photoadaptative qui anime I’tpithtlium pigmentaire et les photorkepteurs rttiniens de certains verttbrb, notamment de nombreux TClkosttens. sont encore mal dkfinis.
Les travaux antkrieurs ont fait apparaitre un ensemble de rksultats qui permettent d’attribuer une part d’activitt B quelques d&iv& indoliques notamment la 5 hydroxytryptamine (skrotonine) et la Na&tyM-mtthoxytryptamine (milatonine). Ainsi Quay (1968) montre que la mtlatonine agit g faible dose (I p/ml) sur les rkponses photomkaniques des &es de la larve de Xenopus lueuis. Par ailleurs. le meme auteur (1965) met en ividence, dans des extraits de rktine de Truite, I’existence d’une enzyme (I’hydroxyindole-o-mCthyl-transfkrase) intervenant dans la synthbe de la mtlatonine dont la recherche fut, par contre. nigative. En outre, chez la Carpe, nous avons ktabli (Chbe, 1974) I’influence de la strotonine et de la mtlatonine sur la dynamique pigmen!aire rktinienne, aprb injection de ces composks dans le globe oculaire. Dans le prksent travail, nous nous sommes propost de rechercher, par la technique de chromatographie sur couches minces, la prksence de composks indoliques endogines, dans les extraits d’tpithtlium pigmentaire rktinien. Cette recherche a ttt rkaliste chez des animaux soumis g diffkrentes conditions d’tclairement.
MATERIEL ET METHODES ExpCiences Chaque lot expkrimental comprend dix truites (Salmo irideus). Avant rtalisation da extraits &Kens, Ie lot est soumis soit P I’hclairement constant (3000 lux) durant 5 jours soit B l’obscurith totale durant le mSme temps. La animaux sent ensuite dtcapit&s puis la yeux sent pr6levis et minutieusement diuCquts dans du Ringer. Les parties de la r&tine correspondant B l’tpithilium pigmentaire sent isoltes et recueillies P 0’. AprQ avoir ttt pesCes,
PrPporation
des extraits
Les fragments d’CpithClium pigmentaire sent broyQ au turrax dans I’acktate de pyridine. Le mClange obtenu est centrifug6 A 0’. Le surnageant at repris plusieun fois par I’ac&tate de pyridine puis &vapor6 sous vide. L’extrait set obtenu est g nouveau repris par I’acetate de pyridine puis pass6 sur une colonne de sephadex G.25 dont les caracteristiques sent la suivantes: hauteur = I3 cm. diamttre = 1.3 cm, volume d’exclusion = 7.5 cm3. Le passage des dCriv6s indoliques test& sur la colonne se situe entre le 20 &me et le 27 bme ml inclus. Ainsi, apres le passage des extraits, seul I’Cluat correspondant B cette fraction est recueilli. Celui-ci subit une nouvelle evaporation qui conduit B I’obtention d’un extrait set purifiC dent la reprise est alors faite avec 0.5 ml d’acttone aqueux. Technique
chromatographique
Les chromatographies sent r6alisbes sur da couches de gel de silice (Merk) a&&s B 1IO’ durant 30 min. Deux systemes de solvants ant CtCsClectionnts aprh de nombreux essais. Syst6me I: isopropanol (45). a&ate d’ethyle (35). ammoniaque (20). Systkme II: chloroforme (95). acide a&ique glacial (5). routes les chromatographies se dCroulent g f 4”, soit B l’&lairement, soit B l’obscuritt en fonction de l’experimentation pr&dant l’extraction. Les dtrivis indoliques de rtftrence qui ont CtC utilisb sent les suivants: le tryptophane et le 5-hydroxytryptophane qui sent des prCcurseurs de la sCrotonine, la sCrotonine, la mtlatonine et l’acide 5-hydroxyindole-3-acCtique qui at un d&iv6 mttabolique de la sirotonine. Ces composis, qui sont des produits de synth&e, sont utilises en solution dans I’acCtone aqueux B raison de I mgi’ml. Le volume de chaque d&p& ttmoin sur la plaque at de 5 ~1. La quantitk d’extrait d&pose varie entre 50 et 200 /Il. La migration se rtalise en 1 hr 30 dans le solvant I qui a et& le plus couramment utilist et en 2 hr dam le solvant II. La rCvClation da taches est obtenue par application du rCactif de Ehrlich (solution Cthanolique g 1% de dimethylamino-benzaldihyde) suivie d’une vaporisation de HCl.
RESULTATS
I Avec la collaboration technique de Francoise Poncin.
Dans les conditions 1587
expkrimentales
pri&Iemment
1588
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d2finies. Ies composes indoliques timoins sent akec les caracterisriques suivantes:
apparais-
stank
Coulrur de DirivCs rest&
la tache
tryptophane S-hydroxytryptophane skotonine mklatonine acide indolacetique
blewvert bleu-vert violacCe blewfonck viola&e
Remarque Ces rksultats
au
mime
niveau
que
la sProtonine
tsmoin
(Rf = 0.50).
Rf (Sol\ant 0.10 0.22 0.50 0.56 0.3
I)
Rf (solvant 11) 0 0 0 0.15 0.40
DISCUSStON
choix de ces deux solvants en particulier pour une bonne identification de Ia milatonine qui migre de facons tr&s diff&rent= dans I’un et l’autre. En outre, si le solvant I a I’avantage de permettre la migration de tous les composes il n’assure pas une bonne Gparation des deux dtrivb que sent le Shydroxytryptophane et l’acide-indolaktique. Le solvant II permet de rboudre ce probltme puisqu’il ne permet pas la migration du Shydroxytryptophane. montrent
I’intdr&t
du
I”-RJsultats ohtenus avec les extraits reiatifs ri des animaux maintenus en hclairement continu (Fig. 1)
Les chromatogrammes obtenus &vent I’existence de plusieurs taches indiquant la prbence de dirivts indoliques. Apparaissent notamment. de facon constante: une tache correspoadant au tryptophane (Rf = 0.30) et une tache correspondant g la sirotonine (Rf = 0.50). Ces taches sont trb nettes pour dip6ts sup&ieurs g 50~1. Aucune tache susceptible de correspondre aux autres d&iv& test& notamment la mClatonine n’apparait quel que soit le solvant utilisC. 2’---RPsultats obtenus acec les extraits relatifs b des animaux maintenus ci i’obscuritP (Fig. 2)
Dans le solvant I, les chromatogrammes obtenus aprts dtp6t d’un extrait issu d’animaux maintenus B l’obscurite sont beaucoup plus difficilcs 21analyscr que dans le cas des animaux maintenus a l%clairement. Les d&iv& sont, en effet. plus nombreux et dans l’ensemble I’aspect des taches obtenues ne revolt pas toujours une grande nettett. L’analyse des chromatogrammes fait neanmoins apparaitre la pr&sence d’une tache nette bleu-vert de Rf voisin de 0.30 que I’on peut attribuer au tryptophane. Se distinguc Cgakment. une tache plus floue. bleu-fond dont le Rf de 0.85 rCvtk la prbence d’une faible quantitC de mCktonine. En outre. quelques autres tactics constantes que nous n’avons pas encore pu identifier avec certitude, appwaissent. l’une bleufonct de Rf = 0.80, l’autrc viola& de Rf = 0.67. Ces deux taches qui se situent au voisinage de la mhlatonine correspondent vraisemblabkment i des precurseurs ou d&iv& mitaboliques he celle-ci dont nous n’avons pas pu now procurer les equivalents de synth2se. Enfin, une tache d’intensite tr&s faible et de limites tr&s diffuses apparait de faGon incon-
L’analyse qualitative sp&cifique que nous avons rCalis& montre que iYpith&um pigmentaire rOtinien de la Truite renferme un certain nombre de dirivis indoliques dont le nombre et la nature varient avec I’intensiti de I’&lairement. Cette etude nous a permis h’identilier avec certitude le tryptophane, la sirotonine et la mblatonine et_ d’isoler deux awes compo& dont la nature reste & prkiser. En outre. elle nous autorise B itablir. que si la prisence de tryptophane est constante quelle que soit I’intensitC de l%clairement, celle des autres d&iv&s dbcelables par les mtthodes que nous awns utili&s semble au contraire li& a l’environnement photique. C’est le cas, en particuiier. pour la Grofonine et la milatonine. L &pithilium rQinien maintenu g l’obscuritt renferme de la metatonine et des traces inconstantes de strotonine. Par contre. lotsqu’il est maintenu g l’iclairement, il renfertne une quantitt notable de sCrotonine mais pas de mtlatonine. Ces rQultats sont en accord avec ceux de Quay (1963. 1964 a, b) qui ont &abli chew ks VertibrQ sup&ieurs I’existence d’une relation entre I’intensitC de l’hclairement et le taux des d&iv& indoliques e@iphysaires et encCpha1iques. Par ailleurs, la p&ewe notable de tirotonine dans 1’Cpithilium rCtinien adapt6 ii l%clairement et celle de traces de melatonine dans I’CpithClium r&inien adapt6 g I’obscuritC apportent un Ument de confirmation g I’hypoth&se que nous avons antCrieurement &se, selon laquelks ces deux indolamines pourraknt participer ti la rialisation des phinom&s photoadaptatifs propres B cet ipithilium (Ch&e. 1974). A propos de la milatonine dont la mise en ividence dans I’tpithtlium pigmentaire rttinien reprtsente un fait nouveau, il y a lieu de remarquer que le taux en parait toujours tr& faible. Cette faibksse peut Gtre en relation avec le caracttre actif de cc compose qui agit B tr&s faible dose. en particulier sur ks mbianocytes (Lerner, Case, Takahashi. Lee and Mot% 1958: Lerner and Wright, 1960). Elk peut aussi CventueUement s’expliquer par les pert& i&itabks occasion&s par l&traction. En efkt. la s&bitit+ de la milatonine dans l’ac&tate de pyri&e utilisi pour l’extraction n’est pas entitrement sathhbmte. Pour parer & cet invonvtnient nous avolts tent& une extraction au chloroforme puis a l’acitone. Lcs- r&ultats d&cevants que nous avons obtenus dans ce cas, dOs g la presence alors inivitabk des lipides dans les extraits, n’ont pas permis de risoudre ce probkme.
Fig. I. Chromatogramme mettant en evidence la prissnce de s~roronirrr et de rrytophcrr~ dans un cxtrait relatif g des itnimaux adapt& ii I’~clairement. iChromatographie rklisie dans Ie solvant 1.) AbrCviations utiliskes: e: Extrait relatif i des animaux adapt& i I’Cclairement. e’: Extrait rrlntif k des animaux adapt& i I’obscuritk h: 5h)droxytryptophane. i: Acids indolx&ique. m: MSlatonins. s: SCrotonine. t : Tr) ptophane. Fig. 1. Chromstogramme mettunt zn kvidsncc la prCsencr de &law~ir~r (1) et de rr~~tc~~k~t~ (4) dam un extrait issu d’animaux adapt& B I’obscuritk Les taches 2 et 3 n’ont pas encore pu Ptre identifiks. (Chromatographie r2alistk dans Ie solvant I li + -1’.k
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Quant a I’otigine de la mtlatonine que nous avons isolee de I’tpithelium pigmentaire, elle reste a preciser. L-existence dans la retine de Truite d’une des enzymes intervenant dans la synthese de la melatonine permet certes d’ivoquer la possibilite d’une origine retinienne. Mais. par ailleurs, I’influence de I’tpiphysectomie sur les reactions pigmentaires photoadaptatives dans lesquelles la mtlatonine est soupconnee d’intervenir permet egalement d’envisager une origine epiphysaire (Cheze. 1974). D’autres analyses realisies chez des animaux Cpiphysectomises devraient permettre de progresser vers la solution de ce problime. BIBLIOCRAPHIE
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