Recherches sur le métabolisme bactérien des cytochromes et des porphyrines

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RECHERCHES

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

VOL. 9 (1952)

SUR LE Mt~TABOLISME BACTERIEN

DES

CYTOCHROMES

II.

EXCRI~TION DE

ET DES PORPHYRINES

PORPHYRINES

PAR

CULTURE

ANAt~ROBIE CHEZ

CERTAINES BACTI~RIES At~ROBIES FACULTNI'IVES par PIERRE SCFIAEFFER Service de Physiologie microbienne, Institut Pasteur, Paris (France)

INTRODUCTION S u i v a n t que l ' o n cultive B a c i l l u s cereus en a6robiose ou en ana6robiose, le spectre d ' a b s o r p t i o n des cytochromes s u b i t des v a r i a t i o n s notables : les b a n d e s des cytochromes a et c disparaissent lors de la c u l t u r e ana6robie et celle du cytochrome b perd de son intensit6 (SCHAEFFER1). Des v a r i a t i o n s assez semblables o n t 6t6 dfcrites chez les levures (EPHRUSSI ET SLONIMSKI2, CHINa). Le spectre d ' a b s o r p t i o n des cytochromes d ' E s c h e r i c h i a coli est, au contraire, tr~s peu modifi6 p a r le mode de c u l t u r e (FUJITA ET KODAMA4, FREI et coll. s, GALE~, SCHAEFFER1). Or, a v a n t ces observations, on connaissait u n a u t r e m o y e n de faire disparattre les cytochromes dans u n m i c r o o r g a n i s m e : la carence en fer (ELVEHJEM7; WARING ET WERKMAN8; PAPPENHEIMERg). PAPPENHEIMER, t r a v a i l l a n t sur le bacille dipht6rique, a reli6 de la fagon que l ' o n salt la disparition des cytochromes et l'excr6tion de p o r p h y r i n e s et de toxine. O b s e r v a n t k n o t r e t o u r u n e semblable disparition, mais provoqu6e p a r la croissance ana6robie, nous avons 6t6 n a t u r e l l e m e n t c o n d u i t rechercher si elle s ' a c c o m p a g n a i t aussi d'excr6tion de porphyrines. Ce sont les r6sultats de cette 6tude, effectu6e parall61ement sur B . cereus et sur E . coli qui font l ' o b j e t de ce travail. Les exp6riences ici d6crites sont celles m~mes au cours desquelles f u r e n t constat6es les modifications du syst6me cytochromique. MI~THODES EXP]~RIMENTALES Souches, milieux, conditions de culture et rdcoltes des bactdries

On trouvera dans un pr6c6dent article 1 les d6tails exp6rimentaux. Extraction et dosage des porphyrines A. Extraction. Apr~s centrifugation des cultures et 6rude spectroscopique des culots bact6riens

(voir I), les liquides surnageant 6taient filtr6s sur bougie pour 6liminer avec certitude tousles corps bactdriens. Puis ~tait appliqu6e la m6thode classique d'extraction par l'6ther d'un milieu ac6tique, suivie d'une r6extraction par l'aeide chlorhydrique de la solution 6th6r6e lav6e (voir bibliographie dans LEMBERGET LEGGE10). Si des uroporphyrines sont excr6t6es, leur pr6sence n'est pas r6v616e par cette m6thode: elles sont en effet insohbles dans l'6ther. La technique A laquelle nous sommes arriv6 tient compte des observations de PAPPENHEIMER 9, ZEILE 11, et LEMBERG 1°, p. 87). La voici: 4° m l de filtrat de culture, additionn6s d'un volume 6gal de HC1 concentr6, sont port6s au bailx-marie Bibliographie p. 368.

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MI~T:\BOLISME BACTt~RIEN DES CYTOCHROMES ET PORPHYRINES II

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bouillant p e n d a n t IO m i n u t e s . Apr~s refroidissement, de la lessive de soude est ajout6e, p a r fraction et en refroidissant, j u s q u ' ~ p H 7-7.5. On ajoute alors 8 ml d'acide ac6tique glacial; ensuite v i e n n e n t 3 e x t r a c t i o n s successives ~ l'6ther (60, 2o et 20 ml), puis 4 lavages des solutions 6th6r6es rassembl6es p a r l'ac6tate de soude M / i o (4 lois io ml). La solution 6th6r6e lav6e est 6vapor6e au q u a r t de son v o l u m e puis e x t r a i t e 4 fois p a r 1. 7 ml chaque fois de I N HC1 satur6 d'6ther. On ajuste le v o l u m e 8 ml p a r a d d i t i o n de quelques g o u t t e s d'HC1. Une telle e x t r a c t i o n concentre 5 fois les p o r p h y r i n e s 6th6ro-solubles. Parfois nous a v o n s el1 e x t r a y a n t voulu a t t e i n d r e une c o n c e n t r a t i o n de io lois: l ' 6 v a p o r a t i o n de l'6ther 6tait alors pouss6e j u s q u ' ~ u u volume de 15 ml e n v i r o n et le v o l u m e d'HC1 chaque e x t r a c t i o n 616mentaire 6tait de o.8 ml, le v o l u m e t e r m i n a l 6tant ajust6 ~ 4 ml. L o r s q u e n o u s a v o n s v o u l u 6tudier le " h o m b r e H C I " des p o r p h y r i n e s extraites, nous a v o n s utilis6 successivem e n t des c o n c e n t r a t i o n s en HC1 de o.I, 0.6, 3.6, et 50/0 . D a n s ce cas, l ' e x t r a c t i o n p a r HC1 o . I % , p a r exemple, c o m p r e n d 6 v i d e m m e n t les 4 e x t r a c t i o n s 616mentaires successives d6crites ci-dessus. B. Dosage. Le dosage s p e c t r o p b o t o m 6 t r i q u e a 6t6 pr6f6r6 au dosage fluorim6trique p o u r des raisons de facilit6. I1 6tait effectu6 avec un s p e e t r o p h o t o m ~ t r e de B e c k m a n (cures de silice de I cm, l a m p e ~ hydrog~ne) r6g16 p o u r q u ' u n e t r a n s m i s s i o n de lOO°/0 corresponde ~ la t r a n s m i s s i o n d ' u n e c u r e t 6 m o i n c o n t e n a u t du I N HC1 satur6 d'6ther*. La r6gion spectrale la plus 6tudi6e allait de 385 420 m/~ de fa~on ~ e n c a d r e r le m a x i m u m d ' a b s o r p t i o n trouv6 ~ 403 m/u (bande de SORET). C. Expression des r~s~dtats. C o m m e n t e x p r i m e r le r 6 s u l t a t d ' u n dosage de p o r p h y r i n e s , alors q u ' o n ignore la n a t u r e et le n o m b r e des p o r p h y r i n e s dos6es. PAPPENHEIMER9 a proc6d6 de la fa~on s u i v a n t e : s' 6taut assur6 que la courbe d ' a b s o r p t i o n des p o r p h y r i n e s qu'il dosait 6tait identique celle de l ' h d m a t o p o r p h y r i n e pure, il a d6termin6 l ' a b s o r p t i o n sp6cifique de ce corps et exprim6 ses r 6 s u l t a t s en c o n c e n t r a t i o n d ' h 6 m a t o p o r p h y r i n e . I1 s'agit 1~ d ' u n mode d'expression conventionnel, ne prg]ugean/ pas de la nalure des porphyrines excrdtdes. (D'une fa~on analogue on a d m e t c o m m u n 6 m e n t l ' e x p r e s s i o n du p o u v o i r r6ducteur d ' u n e solution en c o n c e n t r a t i o n de glucose, sans pr6juger de la n a t u r e des s u b s t a n c e s r6ductrices effectivement pr6sentes). Certains a u t e u r s out c e p e n d a n t interpr6t6 cette fa~on de faire c o m m e signifiant que PAPPENHEIMER croyait avoir affaire ~ l ' h 6 m a t o p o r p h y r i n e . N o u s n o u s s o m m e s 6tendu sur ce p o i n t p o u r 6viter semblable m6prise. N o u s a v o n s en effet adopt6 le proc6d6 de PAPPENHEIMER, le c o m p l 6 t a n t seulement sur un p o i n t : lorsque l'on e x t r a i t u n milieu s u f f i s a m m e n t riche en p o r p h y r i n e s (de l'ordre de ioo/~g p a r litre et au-dessus) la solution chlorh y d r i q u e o b t e n u e est assez pure, avec les m i l i e u x que nous a v o n s employ6s, p o u r qu'il ne soit pas n6cessaire de r e t r a n c h e r de la densit6 o p t i q u e lue au m a x i m u m d ' a b s o r p t i o n (Da03) celle due a u x i m p u r e t 6 s ; a u t r e m e n t dit, si P40s est l'absorptioi1 propre des porphyxines ~ 4o3 m/~, nous a v o n s p r a t i q u e m e n t : Pa0s = Da0u- I1 n ' e n allait pas ainsi c e p e n d a n t dans nos filtrats de cultures a6robies, tr~s p a u v r e s en porphyTines: le ealcul direct de la c o n c e n t r a t i o n en p o r p h y r i n e s ~ p a r t i r de Da0~ a u r a i t c o n d u i t ~ des valeurs prbs de deux fois t r o p fortes. D a n s ces cas, nous averts appliqu6 une formule de correction que n o u s a v o n s 6tablie sur de l ' h 6 m a t o p o r p h y r i n e pure**, e x a c t e m e n t c o m m e l ' a v a i t fait RI~INGXON TM,~ la p u b l i c a t i o n duquel nous r e n v o y o n s p o u r la justification de ce t y p e de correction. Voici n o t r e formule, qui s ' a p p l i q u e ~ l ' h 6 m a t o p o r p h y r i n e en solution dans I'HC1 n o r m a l :

P~t03 =

2 D403 - - (D395 + 1.O83

D410)

(D repr6sente la densit6 optique, lue sous i cm d'6paisseur, ~ la l o n g u e u r d'onde indiqu6e en m/z p a r l'indice et P403 la c o n t r i b u t i o n des p o r p h y r i n e s ~ l ' a b s o r p t i o n ~ 403 m#). Si nous n ' a v o n s pas fait usage de la formule m~me de RIMINGTON, c'est que nous n ' e n a v o n s eu connaissance qu'~ la fin de notre t r a v a i l et q u ' i l nous m a n q u a i t , clans plusieurs exp6riences, les valeurs exp6rimentales Da80 et D4s0 q u ' u t i l i s e cet auteur. N o u s s o m m e s enfin en mesure d'exposer c o m m e n t s e n t calcul6s nos r6sultats: I. Cas des cultures anadrobies de B. cereus. Les p o r p h y r i n e s s e n t abondantes, la f o r m u l e de correction inutile. Du coefficient d ' e x t i n c t i o n molaire de l ' h 6 m a t o p o r p h y r i n e donn6 p a r PAPPENHEIMER (loc. Cit.), E M = 3.46. IO~, il r6sulte q u ' u n e solution c o n t e n a n t 1.73 /~g d ' h 6 m a t o p o r p h y r i n e p a r litre a une densit6 o p t i q u e ~403 n l c m = o.ooi. (Cette correspondance est valable, d'apr~s le graphique de PAPPENHEIMER, p o u r des e x t i n c t i o n s lues comprises entre 0.050 et 0.4o0, valeurs extr6mes que nous a v o n s respect6es). De la valeur lue D403, on calcule d i r e c t e m e n t la concentration en " h 6 m a t o p o r p h y r i n e " : c o n c e n t r a t i o n que l'on corrige: i. p o u r la c o n c e n t r a t i o n apport6e p a r la m6thode * Le t6moin repr6sent6 p a r l ' e x t r a i t c h l o r h y d r i q u e du milieu neuf risque d'6tre t r o m p e u r , s u r t o u t en milieu complexe (peptone), des s u b s t a n c e s a u t r e s que des p o r p h y r i n e s et a b s o r b a n t vers 400 m/~, p o u v a n t 6tre consomm6es ou excr6t6es p a r les bact6ries. L ' u t i l i s a t i o n de N HC1 c o m m e t6moin fair 6 v i d e m m e n t a p p a r a i t r e une a b s o r p t i o n de base plus 61ev6e, mais nous verrons que l'emploi que n o u s raisons d ' u n e formule de correction nous p e r m e t d'61iminer l ' i n t e r v e n t i o n de cette base dans le r6sultat final. ** Produit synth6tis6 par Mr PARROD, Institut de Biologie physico-chimique, Paris, sur la demande de P. SLONIMSKI, qui nous en a c6d6 une partie. Nous les remercions tous deux bien vivement.

Bibliographie p. 368.

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d ' e x t r a c t i o n ; 2. p o u r tenir c o m p t e de la richesse de la culture lots de son prelevement. Le r6sultat s ' e x p r i m e finalement en /2g d ' h 6 m a t o p o r p h y r i n e p a r litre de filtrat d ' u n e culture de densit6 optique iooo (61ectrophotometre de MEUNIER 6cran bleu, cuve de I em. Une telle densit6 o p t i q u e correspond e n v i r o n £ io 9 bacteries viables, soit u n poids sec de l'ordre de i /zg, p a r ml). 2. Cas o?* seules des traces de porphyrines sont pr~sentes (3 a 25 #g/l). Le calcul est le m4me, mais s ' a p p l i q u e ~t la valeur corrigee Pa03 donn6e p a r la formule indiquee ci-dessus.

RESULTATS

I. B a c i l l u s cereus I . C u l t u r e s a&obies. Lorsqu'apr~s extraction des filtrats de cultures aerobies on

--A~A-

CXT~AIT DE f lLTR4T L2~ CULTURE A~ROS/E D~ FIZTRAT D E CULTURE ~A~R081£

,.~r.EXTR41F

0.300

0.200

0.100

380

390

400

4 I'0

4~'0

mp,

43'0

Fig. I. E x c r e t i o n de P o r p h y r i n e p a r B. cereus cultiv6 en ana6robiose.

cherche h d6celer la presence de porphyrines par spectrophotom6trie, on ne trouve en general aucun maximum aux alentours de 400 m/~. Parfois cependant, surtout semblet-il lorsque la densit6 optiqne terminale de la culture est 6levee, et que donc l'oxyg~ne disponible par bact6rie peut n'~tre plus en exc~s, des traces de porphyrines sont identifiables. Au cours de 12 experiences de ce genre, 9 fois la courbe d'absorption de l'extrait a 6t6 r6guli~rement decroissante entre 380 et 420 m~ (voir Fig. I) les trois autres fois on pouvait calculer que la concentration en porphyrines exprimee en h6matoporphyrine, 6tait de 3, 5 et 5/zg par litre de filtrat d'une culture de d.o. = iooo. 2. C u l t u r e s ana~robies. Lorsque la culture 6tait anaerobie les extraits, d'ailleurs visiblement color6s, montraient un maximum d'absorption extr~mement net ~ 402Bibliogmphie p. 368.

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4o3 mt~. Nous avons compar6 la courbe d'absorption obtenue avec celle de l'h6matoporphyrine pure dont la concentration 6tait calcul6e pour que les absorptions maxima fussent tr6s voisines (Fig. I). Les deux courbes sont superposables. Au cours de 12 exp6riences, les valeurs extr6mes des concentrations en porphyrines ont 6t6 97 et 193 pg/1 et la valeur moyenne I4o/zg/1. Au cours de 4 de ces exp6riences nous avons proc6d6, en plus de l'extraction habituelle par HC1 h 3.6%, h des extractions successives de la solution 6th6r6e de porphyrines par des solutions de HC1 de concentrations croissantes (o.i, o.6, 3.6 et 5%) afin de fixer le "nombre HCI" de la porphyrine excr6t6e. On salt en effet que cette caract6ristique fournit une indication quant ~ la nature des porphyrines. Dans les 4 cas les porphyrines se sont partag6es entre les extraits k o.I et o.6% d'HCI, les extractions ult6rieures n ' e x t r a y a n t plus rien. L'une de ces exp6riences est repr6sent6e, Fig. 2. Le rapport des porphyrines extraites par HC1 h o.1% aux porphyrines extraites par HC1 ~ 0.6% n'a pas 6t6 constant d'une exp6rience ~ l'autre. Ce point n ' a y a n t pas

°'°°I Fig. 2. " N o m b r e HCI" de la porphyrine excr6t6e par B . c e r e u s ana6robie,

fait l'objet d'une 6tude solgneuse, il est possible que l'absence de fixit6 de ce rapport soit due au fait que l'extraction par HC1 ~ o.I % n'6tait pas complete lorsque commen~ait l'extraetion par HC1 ~t 0.6%. On trouvera discutfe plus loin l'interpr6tation de ces donn6es expfrimentales. Des autres maxima d'absorption des h6mato et coproporphyrines (550, 594 et 575 m/~) seul 6tait dfcelable dans nos extraits, le maximum 55 ° m/z; pour les autres la concentration 6tait trop faible. En rfsum~, l' excr~tion de porphyrines, nulle ou insignifiant~ dans les cultures a~robies est constante et ~lev~e dans les cultures anadrobies de B. cereus. Cette excr6tion a subsist6 inchang6e au cours de 3 repiquages successifs en l'absence d'oxyg~ne. I1 s'agit doric d'une caract6ristique permanente du m6tabolisme ana6robie de certaines bact6ries a6robies facultatives et non d'un trouble m6tabolique transitoire associ6 au passage de l'a6robiose l'ana6robiose. I I . Escherichia coli I. Cultures a~robies. Dans les cultures a6robies de cet organisme, nous n'avons pas Bibliographie p. 368.

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d6cel6 la pr6sence de porphyrines (3 exp6riences) et ce, malgr6 une concentration de 12 fois apport6e par la m6thode d'extraction. E. coli se comporte donc ici comme B. cereus. 2. Cultures anadrobies. Les deux esp~ces different cependant dans leur comportement ana6robie. Dans 3 cultures s'6tant d6velopp6es en ana6robiose aucune trace de porphyrine n'a pu 8tre d6cel6e au spectrophotomStre, malgr~ un traitement correspondant h une concentration 6ventuelle de 12 lois; dans 3 autres exp6riences, des porphyrines ~taient pr~sentes, mais en faibles quantit6s: I I , 20 et 24 Ixg/1. La lib6ration de porphyrines par culture ana~robie est donc, chez E. coli, un ph~nom~ne contingent et de toute fa~on discret. Ici encore les repiquages successifs en ana6robiose ne changent rien aux r6sultats obtenus. La difference entre m~tabolismes a6robie et ana~robie semble, du point de vue qui nous int6resse ici, bien moindre chez E. coli que chez B. cereus. Ce r6sultat prend toute sa valeur lorsqu'on le rapproche de ceux des dosages de protoh~me intraeellulaire. I I I . Autres organismes Nous avons h peine amorc6 le travail consistant h rechercher parmi les a6robies facultatives, quelles esp~ces bact6riennes, partagent le comportement de B. cereus et quelles celui de E. coli. Nous savons seulement que la souche Oxford de Staphylococcus n'excr~te pas de porphyrines en a6robiose; dans une unique exp6rience ana~robie, cette souche a excr6t6 44 t*g d"'h6matoporphyrine" par litre de filtrat. Ajoutons enfin que chez la levure de boulangerie, SLONIMSKI(communication verbale) a retrouv6 l'excr6tion de porphyrines par culture ana&obie. DISCUSSION Queile peut ~tre la nature des porphyrines excr~t~es par B. cereus? Nous savons qu'elles sont pr~sentes en totalit6 dans les extraits ~t o.I et o.6 % d'HC1; nous ne pouvons en toute rigueur parler de "nombre HCI", notre technique d'extraction ne correspondant pas h celle incluse dans la dSfinition de cette constante (WILSTATTER,cit~ in LEMBERGl~l, p. 59). Mais il subsiste qu'au moins une fraction importante de cette porphyrine dolt avoir un nombre HC1 inf~rieur ou ~gal ~ o.I et donc ~tre soit de la copro- soit de l'h~matoporphyrine (LEMBERG p. 69). CeUe-ci cependant ne semble jouer aucun role physiologique; elle n'a d'ailleurs, jusqu'~ present, jamais ~t6 trouv6e dans des produits naturels (LEIvIBERGp. 6I). La maieure partie, sinon la totalitd, de la porphyrine libdrde doit donc ~tre une eoproporphyrine. Rappelons que la porphyrine excr6t6e par C. diphteriae carenc6 en fer est principalement la coproporphyrine III, identifi6e par GRAY ET HOLT13. En ce qui concerne la porphyrine de B. cereus une certitude sur sa nature et l'identification de son type (I ou III) devront attendre l'isolement et la caractfrisation de la substance. Si la nature exacte de cette porphyrine pr6te pour l'instant ~ discussion, un fait par contre semble acquis : il ne s'agit pas de protoporphyrines, puisque leur extraction de l'6ther par HC1 ne commence que lorsque la concentration de cet acide d@asse 2% et que l'extraction de la porphyrine qui nous occupe est complete d6j~ avec HC1 ~t 0.6% (Fig. 2). Ces r6sultats se pr6tent sans doute h l'6vocation des discussions sur le m6tabolisme des porphyrines, l'ant6riorit6 dans la biosynth~se de telle ou telle d'entre elles ou leur derivation ~ partir d'un pr6curseur commun (LEMBERG1°, p. 627-645; HALE et col., la, GRANICK15). En particulier mention peut-~tre faite des travaux de GRANICKET GILDERTM Bibliographie p. 368.

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sur la n6cessit6 des groupements vinyl pour l'introduction du fer dans les porphyrines et donc, indirectenlent, pour leur fixation sur l'apoenzyme; on peut aussi rappeler l'antagonisme comp6titif entre diff6rentes porphyrines dont ces auteurs ont montr6 l'existence. Ces faits sugg~rent des m~canismes possibles du ph6nom~ne expos6 dans cet article. Mais comme d'une part les faits d6crits ici ne nous paraissent clairement r~soudre dans l'imm6diat aucune des questions depuis longtemps pos6es, eomme d'autre part, nos i6sultats peuvent a priori s'interpr6ter aussi bien comme une perturbation dans la synth~se des parties prot6iques des cytochromes que comme un trouble du m6tabolisme de leur groupement prosth6tique, les hypotheses possibles sont trop nombreuses, notre ignorance trop grande, et nous pr6f6rons laisser ~ nos r6sultats leur allure de fait brut. Nous avons constat6 au cours de ce travail que B . cereus (qui active l'oxyg~ne) ne synth6tise pas certains cytochromes (SCHAEFFER 1) et lib~re des porphyrines au cours de sa croissanee ana6robie; au eontraire E . coli, d@ourvu de cytochrome-oxydase ( K E I L I N ET HARPLEY 17) et qui d'apr~s AUBEL ET SZULMAJSTER TM, n'active pas l'oxyg~ne, synth~tise ses eytochromes (as, al, bl) en ana6robiose et n'excr~te pas de porphyrines. On est donc en droit de se demander, mais c'est I~ une simple question, s'il existe une relation entre la pr6sence de tel ou tel pigment respiratoire h6matique et la synth~se ana6robie des eytochromes. II est vrai qu'il pourrait aussi bien s'agir d'une diff6renee entre deux esp~ces dont la nature nous 6ehappe. De toute fa~on la question se pose de savoir si l'exer6tion de porphyrines est l'effet d'un trouble du m6tabolisme des cytochromes ou si au contraire le d6faut de synth~se de ces pigments est secondaire ~ un trouble de la synth~se du protoh~me. R]~SUMt~ I. Cultivd en ana6robiose, Bacillus cereus excrete une p o r p h y r i n e dans le milieu de culture; cette excr6tion est a b s e n t e lorsque la croissance est a6robie. 2. Le " n o m b r e HCI" de la p o r p h y r i n e excr6t6e indique qu'il s'agit p r i n c i p a l e m e n t , sinon u n i q u e ment, de c o p r o p o r p h y r i n e . 3. MSme en ana6robiose Escherichia coli n'exer~te pas ou tr~s peu de p o r p h y r i n e s . 4- Ces r6sultats p r e n n e n t r o u t e leur signification p a r c o n f r o n t a t i o n avec ceux de l'6tude du syst~me c y t o c h r o m i q u e ~ l'int6rieur des bact~ries.

SUMMARY I. G r o w n u n d e r anaerobic conditions, Bacillus cereus releases a p o r p h y r i n in the culture m e d i u m ; no such release takes place d u r i n g aerobic growth. 2. According to its "HC1 n u m b e r " , this p o r p h y r i n seems to be principally, if not exclusively, coproporphyrin. 3- E v e n w h e n g r o w n anaerobically, Escherichia coli does not release, or h a r d l y releases, a n y p o r p h y r i n in the medium. 4. These results have their whole m e a n i n g w h e n c o m p a r e d w i t h those of the s t u d y of the cytoc h r o m e - s y s t e m inside the cells.

ZUSAMMENFASSUNG I. Bei a n a e r o b e m W a c h s t u m scheidet Bacillus cereus ein P o r p h y r i n in das K u l t u r m e d i u m a b ; keine A b s c h e i d u n g ist festzustellen bei a e r o b e m W a c h s t u m . 2. Die Chlorwasserstoffzahl dieses P o r p h y r i n s zeigt, dass es sich hauptsS.chlich, oder ausschliesslich, u m K o p r o p o r p h y r i n h a n d e l t . 3. Selbst in Anaerobiose s o n d e r t Escherichia coli keine oder sehr wenig P o r p h y r i n e ab. 4. Die volle B e d e u t u n g dieser Ergebnisse zeigt sich, w e n n m a n sie m i t dem S t u d i u m des Zytoc h r o m s y s t e m s im I n n e r n der Zelle vergleicht. Bibliographie p. 368.

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v. SCHAEFFER

V0L. 9 (1952)

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Re~u le 2o d6cembre 1951