Reduzierung der Histaminwirkung durch onkolytisch und nicht onkolytisch wirksame Clostridienstämme

Zbl. Bakt. Hyg., LAbt. Orig. A 246, 541-549 (1980) Aus dem H ygiene-Institut der Universitat Graz (Vorstand: Prof. Dr. ]. R. Mose)

Reduzierung der Histaminwirkung durch onkolytisch und nicht onkolytisch wirksame Clostridienstamme Histamine Reduction by Means of Oncolytically Active and Oncolytically Non-active Clostridial Strains JOSEF RICHARD MOSE, MARIANNE MOSER und GERALD FISCHER

Mit 2 Abbildungen . Eingegangen am 3. Mai 1979

Abstract Spores and vegetative forms of oncolytically active and oncolytically non-active clostridial strains were tested for histamine reducing activity (isolated ileum of guinea pig used for testing, waterbath method ace. to Magnus, Fig. 1). Culture media and the washed intact material did not show any or only very little effectiveness. On the other hand the fractionated, charges diminished histamine standard solutions except for very little remaining activity in the case of all strains. This effect was stronger in vegetative forms than in spores (Fig. 2). The histamine effect on the isolated organ was generally increased by means of culture media as well as by the washed intact material. In this respect, preparations of non-lytic strains showed a slightly higher effectiveness than preparations of lytic clostridial strains (Fig. 2). It was shown in earlier investigations (d. bibliography) that the charges of clostridial strains decompose plasmakinin (synthetic bradykinin) at varying rates. Reduction of histamine activi ty by means of clostridia could lead to a decrease of the microcirculation and capillary-permeability in the tumor tissue (as hypothesized for bradykinin) and thereby favour its disintegration .

Zusammenfassung Sporen und Stiibchen onkolytisch und nicht onkolytisch wirksamer Clostridienstamme wurden auf eine, die Histamineffektivitat herabsetzende Wirksamkeit untersucht (Testorgan isoliertes Meerschweinchenileum, Wasserbadmethode nach Magnus, Abb. 1). Wahrend die Nahrmedien bzw. das intakte gewaschene Bakterienmaterial keine oder nur eine geringfiigige Reduzierung der Histaminaktivi tat aufwiesen, verringerten bei allen Stammen die fraktionierten, aufgebrochenen Chargen der Bakterien Histamin-Standardlosungen bis auf eine geringe Restwi rksamkeit . Dieser Effekt war bei den Stabchen starker ausgepragt als bei den Sporen (Abb. 2). 35

Zbl. Bakt., 1. Abt. Orig. A 246

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].R.Mose, M.Moser und G.Fischer

Sowohl durch Nahrmedien, als auch durch das intakte gewaschene Bakterienmaterial wurde die Histaminaktivitat am isolierten Organ zumeist erhoht. Die Aufbereitungen nicht lytischer Stamme wirkten diesbeziiglich geringfiigig starker als jene von lytisch aktiven Clostridienstammen (Abb. 2). In vorangegangenen Arbeiten (s. Literaturverzeichnis) zeigten wir auf, daB genannte Chargen von Clostridienstammen Plasmakinin (synthetisches Bradykinin) unterschiedlich rasch abbauen. Die Verringerung der Aktivitat von Histamin durch Clostridien konnte, wie bereits fiir Bradykinin gefordert, eine Herabsetzung der Mikrozirkulation und Kapillarpermeabilitat im Tumorgewebe bewirken und damit des sen Zerfall begiinstigen.

Einleitung Aus biochemischer Sicht gibt es bislang noch keine genaueren und eindeutig objektivierbaren Hinweise tiber die Ursachen des Onkolysephanomens durch bestimmte apathogene Clostridienstamme, insbesondere Clostridium oncolyticum M 55 • Auf Grund der starken Plasmakinin-abbauenden Aktivitat und der Abgabe der Enzyme in das Kulturmedium bei onkolytisch wirksamen Clostridienstammen wurden Zusammenhange zwischen der Onkolyse und der Kininasewirkung durch eine Anderung der Durchblutung des Tumors angenommen (Mose et al., 1972a, 1972b; Brantner u. Fischer, 1973; Fischer et al., 1975). Mitte1s Ellagsaure, die Kininogen entspeichert, konnten diese Oberlegungen im Tierversuch in Form verbesserter Lyseergebnisse auch praktisch bestatigt werden (Mose u. Fischer, 1974). Eine Substanz deren Wirkungsspektrum auf das Kapillarsystem demjenigen von Bradykinin gleicht ist Histamin. Ein eventueller Histaminabbau durch die Clostridien konnte, ebenso wie fur Bradykinin gefordert, eine Herabsetzung der Mikrozirkulation und Kapillarpermeabilitat im Tumorgewebe bewirken und damit dessen Zerfall weitgehend begiinstigen. Daher sollten in orientierenden Versuchen in vitro onkolytisch und nicht onkolytisch wirksame Clostridienstamme auf ihre Histamininaktivierende Wirkung getestet werden. Die Fahigkeit Diamine zu oxydieren konnte u. a. in folgenden Bakteriengattungen nachgewiesen werden: Achromobacter, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Mycobacterium, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas (Zeller, 1963). Auch die Decarboxylierung von Histidin zu Histamin durch verschiedene Clostridien- und Proteus-Stamme (Gale, 1941) und Stamme von E. coli (Gale, 1940) ist bekannt.

Material und Methoden Tiermateriat: Meerschweinchen (isoliertes Ileum als Testobjekt). Ctostridienstiimme, die auf eine die Histaminaktivitat reduzierende Wirkung untersucht wurden: ct. oncotyticum, Stamm M 55 , ct. acetobutylicum, Stamm T 10 a, ct. flabelliferum, Stamm 692, Cl. pectinovorum, Stamm 17, Cl. bifermentans, Stamm 19229, ct. centrosporogenes, Stamm 638, ct. tentoputrescens, Stamm M.a. Anzucht der Stiimme: Die Parameter, weiche fUr die verschiedenen Ziichtungsbedingungen der genannten Stamme erforderlich waren, sind in der Tabelle 1 dargestellt.

Histaminwirkung durch Clostridienstamme

543

TabeIIe 1. Ziiehtungsbedingungen der versehiedenen Clostridienstamme Teststamme

Nahrmedium

pH-Wert des Mediums

optimale Waehstumstemperatur

Ernte von Stabehen nach Stun den

Ernte von Sporen naeh Tagen

M55 TlOa 692 17 19229 638 M63

Zn-BouiIIon

7,4 7,4 7,3 7,2 7,3 6,6 7,4

37°C 37°C 37"C 30°C 37"C 37°C 37°C

24 18 24 18 16 16 18

12 10 10 10 8 10 9

Tryptiease Soy Broth Zn-BouiIIon

Aufbereitung des Materials zur biologischen Untersuchung: Zur Testung gelangten die gewasehenen intakten Stabehen und Sporen, die gewasehenen aufgebroehenen Stabehen und Sporen und die jeweiligen Dberstande (= Nahrmedien). Gewaschene intakte Bakteriensuspensionen: Die entweder Stabehen oder Sporen enthaltenden Clostridien-Kulturen wurden 40 Min. lang bei 3500 U/min zentrifugiert und die Dberstande abgesaugt. Die hierbei gewonnenen Sedimente sehiittelte man mit Phosphatpuffer auf, zentrifugierte 20 Min. und verwarf den Dberstand. Das Wasehen erfolgte insgesamt dreimal. AnsehlieBend wurden die Sedimente noeh einmal mit ea. 5 ml Phosphatpuffer versetzt und im Photometer (Zeiss PMQ II) bei 680 nm auf eine optisehe Diehte von e = 1,62 eingesteIIt. Gewaschene aufgebrochene Bakteriensuspensionen: Das auf eine optisehe Diehte von e = 1,62 gebraehte Bakterienmaterial zertriimmerten wir mittels des "Ribi-eell"-Zellfraktionators meehanisch. Uberstiinde: Die dureh Zentrifugieren gewonnenen, abgesaugten Dberstande wurden sterilfiltriert. Testansiitze: Von den oben besehriebenen Aufbereitungen eines jeden ClostridienStammes wurden 0,9 ml von dies en mit 0,1 ml Histaminstammlosung (= 100 pg Histamin) versetzt. Als Kontrolle diente eine Standardlosung von 10 pg/ml NaCI. Untersuchung der Aufbereitungen auf Histaminabbau: Die Priifung der Chargen auf eine die Histaminaktivitat verringernde Tatigkeit erfolgte am isolierten Meerschweinchenileum mittels der Wasserbadmethode nach Magnus. Als Nahrlosung wurde Tyrodelosung verwendet, die Temperatur im 14 ml fassenden Organbad betrug 37°C. Die Registrierung der naeh Zugabe von Histamin auftretenden Kontraktionen der Langsmuskulatur erfolgte mittels Stirnsehreiber auf einem Kymographen. Das Hebeliibersetzungsverhaltnis setzten wir mit 1:4 fest. Es wurde in 5-Minutenlntervallen alternierend die Kontrolldosis (Histamin-Standard) und Testdosis (mit Histamin versetzte und bei 37°C inkubierte Bakterienchargen) verabreicht. 1m Dosierungsbereich von 0,2-0,8 pi (i. e.: 0,2-0,8 pg Histamin) erhalt man am Ileum submaximale, bis zu 10 em hohe Kontrakturen. Naeh einer zweiminutigen Einwirkungsphase, wahrend der Darm sieh kontrahierte, wurde das Organbad dreimal gewaschen. Der Test dauerte 70 Min.

Ergebnisse Das Resultat im Einzelversuch iiber eine die Histaminwirkung reduzierende Kapazitiit durch ct. oncolyticum M55 zeigt Abb. 1.

544

].R.Mose, M.Moser und G.Fischer

0 . 0 . 0 . 0 . 0. 0 . 0 . 0

5

15

25 35 45 55

65 Min.

Abb. 1. Inaktivierung von Histamin durch die aufgebrochenen Stabchen von Clostridium oncolyticum M.5 • = Kontrolldosis: Kontraktionen des isolierten Meerschweinchenileums auf Zusatze von 0,5 ,Ill (0,5 ,ug) Histamin . • = Testdosis: Kontraktionen auf 0,5,u1 von Verabreichungen des Gemisches: 0,9 ml vom fraktionierten Material + 0,1 ml Histaminstammlosung (0,5,ug Histamin). Zahlenangaben: 5-65 Min.: Termine zur Prtifung des auf 37 DC gehaltenen Inkubates auf Histamin-zerstorende Aktivitat. Fig. 1. Reduction of histamine activity by means of fractionated vegetative forms of Clostridium oncolyticum M 55 • o = control dosis: contractions of the isolated guinea pig ileum to additions of 0.5,u1 (0.5 flg) histamine . • = test dosis: contractions to administration of 0.5 ,Ill of the mixture: 0.9 ml of fractionated material + 0.1 ml solution of histamine standard (0.5 flg histamine). Numerical data: 5-65 min: times for testing in the incubate kept at 37 °C for histamine reducing activity.

o

Innerhalb der festgesetzten Inkubationszeit wird die im Inkubat enthaltene Histaminaktivitat bis auf eine minimale Restwirksamkeit verringert. Die folgende graphische Darstellung (Abb. 2) zeigt das Gesamtresultat iiber die Herabsetzung der Effektivitat von Histamin durch die Oberstande, die gewaschenen intakten sowie die gewaschenen aufgebrochenen Sporen und Stabchen von 5 onkolytisch und 2 nicht onkolytisch wirksamen Clostridienstammen. Von jeder Aufbereitungsart wurden 5 Versuche durchgefiihrt, wofiir jeweils eine frische Anzucht verwendet wurde (= 30 Tests pro Stamm). Zur Auswertung wurden die Langen von jeweils zwei die Darmkontrakturen auf mit Histamin-versetzte Clostridien-Aufbereitungen (Testdosen) einschlielSende Kon-

Histaminwirkung durch Clostridienstamme

1 SPOREN:

CI. oncolyticum M55

545

1 STAsCHEN

Hi 140

[%]

120 100

80 60

400~Q 20 5

15

25

35

45

55

65-; t [min]

5

15

25

35

45

55

65---.

t [min]

Abb.2,1

Hi

[%]

1 140

SPOREN: CI. acetobutylicum,

STAsCHEN

Stamm: T 10a

120 100

80 60 40 20

~~o O--~-r--~~I--4--0 5

15

25

35

45

55 65---> t [min]

5

15

25

35

45 ,55 65t [min]

Abb. 2,2 Abb. 2. Reduktion der Histaminaktivitat durch verschiedene Aufbereitungen onkolytisch und nicht onkolytisch wirksamer Clostridienstamme. Die Stiimme M 55, T lOa, 692, 17 und 19229 sind onkolytisch wirksam, 638 und M 63 haben keinen nennenswerten Onkolyseeffekt. Linke Seiten eines jeden Diagrammabschnittes: Aktivitaten der Sporen; rechte Seiten: Aktivitiiten der Stabchen. Eine genaue Beschreibung der Ergebnisse erfolgt im Rahmen der Diskussion. Fig. 2. Reduction of histamine activity by means of various preparations of oncolyticaIIy active and oncolyticaIIy non-active clostridial strains. Strains M 55, T lOa, 692, 17 and 19229 are oncolyticaIIy active; 638 and M 63 show no significant effect of oncolysis. Left part of each diagram: spore activities; right sides: activities of vegetative forms. A detailed description of the results will be given in the course of the discussion. N = je 5 6 Oberstande (Nahrmedium) D intaktes, gewaschenes Material o fraktioniertes, aufgebrochenes Material

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].R.Mose, M.Moser und G.Fischer SPOREN: CI. flabelliferum

t

Hi

STiBCHEN

Stamm: 692

140

['Ib]

120

"'-'-I- _l--r-I- '---~

100

0---_-1:__________

Q

80 60 40

o~

-~o

~

.l

20 5

15

25

35

45

55

65 _

5

15

25

35

45

55

t [min]

65 _ t [min]

Abb. 2, 3 SPOREN: CI. pectinovorum Hi

140

['Ib]

STiBCHEN

Stamm: 17

120

o

20 5

152.53545

55

65~

~o

5

15

25

35

45

55

t [min]

65t [min]

Abb. 2, 4 STABCHEN

SPOREN CI. bifermentans Hi

[%]

r

Stamm. 19229

140 120

-. -,_._.-

100 80

::o~~ 20 O~r-~--~~--~~---r-

5

15 25

35

45

55

65-

t [min]

Abb. 2, 5

5

15

25

35

45

55

65 t [min]

Histaminwirkung durch Clostridienstamme SPOREN; Hi

[%]

140 120

9- _

CI. centrosporogenes (nicht Iytisch)

547

STABCHEN

Stamm, 638

1" - ' L -

-t --r --1" . .

f-·-r-· -J-.- 1- '- 1-· -I/>~

100

80 60 40

Q~o

20 5

15

25

35

45

55

65 -

5

15

25 .35

45

t [min]

55 t

65[min]

Abb. 2, 6

Hi

[%]

f

140 120 100

SPOREN: CI. lentoputrescens (nichl Iytisch) Stamm: M 63

ST)(BCHEN

0, .J.

' r-----I-1---0 ~ . . . . . .I-.- I-. I -~I-;-I-_t. .-

--

80

O~~~--~~--~~~-r-

5

15

25

35

45 55

65 -

t [min]

5

15

25

35

45

55

65 -

t

[min]

Abb. 2, 7

traktionen durch Histamin-Standard (Kontrolldosen) in mm-Einheiten gemessen, daraus das arithmetische Mittel gebildet und dieses gleich 100% gesetzt; auf diesen Wert der Kontrolldosierungen bezogen wir die Abweichungen der Testdosen. Zu jenen Megdaten, die nennenswert streuten, wurden die dazugehorigen S.E.M.Balken aufgetragen. DiskussioD Wie bereits einleitend erwahnt, sind manche Mikroorganismen in der Lage, Aminosauren zu decarboxylieren bzw. Diamine und Polyamine oxydativ zu des amiDieren. Falls dies auch fur Clostridienstamme zutrifft, wurde das Ergebnis jene

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J.R.Mose, M.Moser und G.Fischer

Hypothese erharten, welche die Herabsetzung der Mikrozirkulation und damit eine verminderte Nahrstoffversorgung des Tumorgewebes als eine der Ursachen des Onkolysephanomens annimmt. Das intakte gewaschene Material der Sporen und Stabchen der getesteten Stamme besitzt mit Ausnahme von Cl. pectinovorum (Verlust der vorgegebenen Histaminmenge etwa 20%), kein die Histaminwirkung am isolierten Meerschweinchenileum verringerndes Prinzip. Ahnliches gilt auch fur die entsprechenden Dberstande: BloB die Nahrmedien der Sporen fur ct. acetobutyticum bzw. jene der Stabchen von ct. pectinovorum reduzieren die Aktivitat von Histamin bis zu ungefahr 20 bzw. 10%. In einigen Fallen wird die Histaminwirkung geringfugig potenziert: Dies gilt bei den Sporen fur das intakte gewaschene Material von ct. oncotyticum M 55 , ct. acetobutyticum, ct. flabelliferum, ct. centrosporogenes sowie Ct.tentoputrescens. Bei den Stab chen trifft dies zu fur ct. oncolyticum M 55 , Cl. acetobutylicum, ct. bifermentans sowie ct. lentoputrescens. Die aufgezeigte Verstarkung der Histamineffektivitat in den genannten Aufbereitungen der verschiedenen Clostridienstamme fuhren wir in Ermangelung einer diesbezuglichen Analyse vorlaufig rein theoretisch auf eine Zytotoxinwirkung auf das Testorgan (Meerschweinchenileum) oder aber auch auf eine Freisetzung von Histamin zuruck. So wurde in letzterer Hinsicht durch die Stabchen von Cl. bifermentans eine Histaminbildung nachgewiesen (Gale, 1941). Allerdings durfte bei diesem Stamm im Faile einer tatsachlichen Entstehung von Histamin das Angebot an Substrat bereits nach 15 Min. erschopft sein, da nach diesem Zeitpunkt bei unseren Untersuchungen keine Potenzierungen der Darmkontraktionen mehr zu beobachten waren. Ein bezuglich der Steigerung der Histaminwirkung geringfugig vermehrter Effekt im Vergleich mit den anderen Clostridienstammen wurde durch das intakte gewaschene Material der Sporen von Cl. centrosporogenes (ca. 40%), ein etwas schwacherer durch die Sporen von Ct.tentoputrescens (ca. 20%) gefunden. Die beiden zuletzt genannten Clostridien sind nicht onkolytisch wirksam. 1m aufgebrochenen Zustand reduzieren aile Stamme die Aktivitaten von Histamin, dieser Effekt ist generell bei den Stab chen starker ausgepragt als bei den Sporen. Wie Zeller 1963 am Mycobacterium smegmatis zeigte, bleibt die enzymatische Wirksamkeit der Diaminoxidase im Veri auf des Wachstums nicht konstant, sondern nimmt semilogarithmisch wahrend der ersten 10 Tage abo Dies ware auch eine Erklarung dafur, weshalb die aufgebrochenen Sporen weniger Aktivitat aufweisen, da sie erst nach ihrer Vermehrung und Ruckversporung zu den Tests herangezogen wurden. Bekanntlich sind einige Clostridienstamme in der Lage, neben Histamin noch andere Stoffwechselmetaboliten wie z.B. Tyramin, die Diamine Putrescin und Cadaverin und die y-Aminobuttersaure zu produzieren (Gale, 1941). Hierbei ist zu erwahnen, daB die zuletzt angefuhrte Substanz als Antagonist zu Histamin auf das Meerschweinchenileum wirkt (Hobbiger, 1957). Ihre eventuelle Bildung konnte rein theoretisch als Gegenspieler des Histamin im Zusammenwirken mit Histaminabbauenden Enzymen die Kontraktionen am Ileum zusatzlich verringern. Dies betrafe vor allem jene Clostridienaufbereitungen, die in den ersten 15 Min. ca. 40-60% einer Inaktivierung zeigen und bis zum Versuchsende nahezu unverandert auf dies em Niveau bleiben. Der Nachweis der y-Aminobuttersaure (Gale, 1941) erfolgte allerdings aus gewaschenen intakten Suspensionen von Bakterien, wahrend in den vorliegenden Untersuchungen die Abschwachung der Aktivitat von Histamin durch Clostridienstamme

Histaminwirkung durch Clostridienstamme

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im aufgebrochenen fraktionierten Zustand erreicht werden konnte. Diese Fakten deuten dar auf hin, dag die Verminderung des Histamineffektes am isolierten Meerschweinchendarm wahrscheinlich weniger auf einer Hemmfunktion beruht, sondern eher auf einen enzymatisch bewirkten Histaminabbau zuriickzufiihren ist. Dariiber hinaus ware ins Treffen zu fiihren, dag die von uns monierte Restaktivitat auch das Ergebnis einer vorzeitigen Erschopfung von Histamin-inaktivierenden Enzymen darstell en kann. Ausgenommen von den postulierten moglicherweise interferierenden Nebenwirkungen durch o. e. Blockereffekte ist offen bar der Histaminabbau durch die Stab chen von Cl. oncolyticum M 55 , Cl. flabelliferum und Cl. pectinovorum. Anders als bei den iibrigen Clostridienaufbereitungen zeichnete sich durch diese Chargen in der Tendenz ein zeitabhangiger Abfall der Histaminaktivitat abo Zusammenfassend wei sen die Ergebnisse darauf hin, dap bei den untersuchten Clostridien-Stammen die die Histaminwirksamkeit reduzierenden Prinzipien als Endoenzyme vorliegen. Wenn die Sporen zu Stab chen auskeimen, bricht die Zellwand auf und die Enzyme gelangen in die Umgebung. Da weiterhin die Sporen weniger Aktivitat auf die Histamineffektivitat aufweisen als die Stab chen, konnte die Verringerung der Histaminwirkung durch Clostridien (im Sinne der genannten Onkolysetheorie), rein theoretisch, wenigstens als Sekundareffekt eine Rolle spielen. Literatur Brantner, H. und G. Fischer: Untersuchungen der Kininasen des onkolytisch wirksamen Clostridienstammes M55 ATCC 13.732 mittels Chelatbildnern. Path. Mikrobio!. 39 (1973) 99-106 Fischer, G., H.Brantner, and P.Platzer: The Kininase Activity of Ehrlichs' Ascites Solid Tumor after Treatment with Oncolytic Clostridia. Z. Krebsforsch. 84 (1975) 203-206 Gale, E. F.: The production of Amines by Bacteria. I. The Decarboxylation of Aminoacids by Strains of Bacterium coli. Biochem. ]. 34 (1940) 392-413 Gale, E. F.: The Production of Amines by Bacteria. 4. The Decarboxylation of Aminoacids by Organisms of the Groups Clostridium and Proteus. Biochem. J. 35 (1941) 66-80 Hobbiger, F.: Effects of y-Aminobutyric. Acid on the Isolated Mammalian Ileum. ]. Physio!' 142 (1957) 147-164 Mose, ]. R., G. Fischer und T. B. Mobascherie: Ober Bakterienkininasen und deren physiologische Bedeutung. 1. Mitteilung: Untersuchungen an Clostridienstammen. Zb!. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 219 (1972a) 530-541 Mose, J. R., G. Fischer und C. Briefs: Die Wirkung von Clostridium butyricum (Stamm M 55 ) auf menschliches Kininogen und ihre Bedeutung fur den OnkolyseprozeK Zb!. Bakt. Hyg., I.Abt. Orig. A 221 (1972b) 474-491 Mose, ]. R. und G. Fischer: Einflu15 von Ellagsaure auf die Onkolysewirkung des Clostridienstammes M 55 • Z. Krebsforsch. 82 (1974) 143-152 Zeller, E.A.: Diamine Oxidases, Enzymes, Vo!' 8: 2nd ed. (1963) 313-335

Professor Dr. Josef Richard Mose, Hygiene-Institut der Universitat Graz, Universitatsplatz 4, A-80lO Graz, Osterreich