Bestimmung der pregnandiolausscheidung durch dünnschichtchromatographie und photodensitometrische auswertung

CLINICA

CHIMICA

BESTIMMUNG

341

ACTA

DER

PREGNANDIOLAUSSCHEIDUNG

D~:‘NNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE

UND

DURCH

PHOTODENSITOMETRISCHE

AUSWERTUNG

R. ABRAHAM,

Abtrilung Frankfuvt

K-F.

GOTTE,

fiiv gyniikologische a.M.

(Eingegangen

E. HILD

Endokrinologie,

UND H.-D.

TAUBERT

Ulzivevsitiits-Fvauenklinih,

(Dcutschlandj

am

rg.

Januar,

1970)

SUMMARY

Determination of Prepanediol densitometric Estimation Urinary

pregnanediol

Excretion

by Thia-Luyer

was isolated by acid hydrolysis

Chromatography and thin-layer

and Photochromato-

graphy on silica gel chromatopIates. Treatment of the plates with SbCI, resulted in a stable colour reaction of the pregnanediol spots, the intensity of which was estimated densitometrically by means of a Turner photometer with a chromatoplate scanner and integrating recorder. The results were calculated from a 6-point chromatogram comprised of 3 concentrations of pregnanediol standard and 3 of the unknown. The reproducibility was found to be &So/” in the range of 0.5-6.0 mg/aq-h urine specimen. The clinical application of this method is discussed on the basis of results obtained from the study of 41 biphasic cycles of healthy women.

EINLEITUNG

Bei der Bestimmung der Pregnandiolausscheidung im Urin haben sich diinnschichtchromatographische Systeme zur Isolierung von Pregnandiol aus Urinextrakten ausgezeichnet bewahrtl-6. Die photometrische Messung von Pregnandiol nach der D~nnschichtchromatograpllie kann jedoch nicht als optimal angesehen werden, weil zur Darstellung des Chromogens auf den D~nnschichtplatten oder mit dem Eluat der Pregnandiolfraktion ausschliesslich Schwefelsaure verwendet wird. Die Schwefels%urereaktion der Steroide ist ein komplexes System von Reaktionen mit mehreren Angriffspunkten am Steroidgeriist und ihre Reproduzierbarkeit von mehreren schwer kontrollierbaren Reaktionsbedingungen abh&ngig7. Weiterhin ist zu bedenken, dass semiquantitative Bestimmungen von Pregnandiol durch Vergleich der Fleckengrosse hohe Anforderungen an die Auftragetechnik stellen, die sich im klinischen Routinelaboratorium kaum realisieren lassen. So ergab eine ~berpr~fung des semiquantitativen Verfahrens von Waldil mit einer exakten %aschromatographiscl~en

342

ABRAHAM

id al.

Methode durch Hammerstein und Zielske* ungentigende Korrelationen bei den Parallelbestimmungen. Nach unseren Erfahrungen ist jedoch die cllr~~matograpl~iscllt~ Abtrennung von Pregnandiol aus Urinextrakten mit dem System van Waldi sehr gut. Daher dtirften die Diskrepanzen im wesentlichen auf Mange1 in der Endbestimmung-wie Gegensatz

Auftragetechnik und Schwefelsaurereaktion-zuriickzuftihren sein. Im zur Schwefelsaure bildet Antimontrichlorid nach Aufspriihen einer

konzentrierten Losung in Chloroform und Erhitzen der Platten stabile Chromogcne, sodass eine pllotodensitometrisclle Auswertung dieser Ptatten moglich ist, Antimontrichlorid wurde als Steroidreagenz erstmalig vm Pincusg verwendet. Dieses im folgenden beschriebene photodensitometrische Verfahren sol1 die ausgezeichneten Trennmiiglichkeiten der Dtinnschicl~tcl~romatographie mit einer schncllen und ausreichend genauen

Endbestimnlung

verbinden.

METHODIK

Reagenticlz Salzsaure, rauchend, mind. 37O.b zur Analyse (Merck), Cyclohexan zur Analyse (Merck). Natriumsulfat, wasserfrei, zur Analyse (Merck). Chloroform zur Analyse, mit r”[, .‘ithanol (Merck). Aceton zur Analyse (Merck). ~ssigs~ure~thylester zur Analyse (Merck). Antimon (III) chlorid zur Analyse (Merck). Natriumhydroxid zur Analyse (Merck). Pregnandiol ftir biochemische Zwecke, LAB

(Merck).

DC-Fertigplatt~n

cm (Merck).

Kieselgel

I?,,,, 20 cm s

20

Gerite Fluorimeter

Model1

I II

(Turner

Assoc.,

Palo Alto, Calif.) mit Plattenabtaster

(Camag, Muttenz, Schweiz) und intergrierendem UR 400 (Vitatron, Pulheim b. Kiiln). Fiir die spektroskopische Identifizierung

Kompensationsschreiber der

Preglla~~diolfrakt~on

Model1 wurden

folgende Gerate verwendet : Infrarotspektrometer Jlodell Infracord mit KBr-Linsen-Mikroillurninator und Ultramikro-Pressform (Bodenseewerk Perkin-Elmer, Uberlingen). Aminco-Bovtman-Doppelgitter-Fluoreszenzspektrometer mit Schreiber (American Instruments Inc., Silver Springs, Md.). Prismenspektrometer Model1 PMQ II mit roe-Punkt-Automatik (Zeiss, Oberkochen).

20 ml des z4-Std-Urins werden mit 2 ml rauchender Salzsaure versetzt und im Wasserbad erwarmt, bis die Temperatur 90’ erreicht hat. Anschliessencl wird noch genau IO Min weitererwarmt und das Reaktionsgemisch unter fliessendem Wasser abgekiihlt. Nun extrahiert man dreimal mit 25 ml Cyclohexan, wascht die vereinigten Extrakte mit zo ml I N NaOH und 30 ml Wasser, trocknet iiber wasserfreiem Natriumsulfat und dampft das Losungsmittel im Rotationsverdampfer vollstandig ab. Der Rtickstand wird in 0.5 ml Chloroform aufgenommen.

343

PREGNANDIOLAUSSCHEIDLJNG

Auf der D~nnschichtplatte, die ohne weitere Vorbereitung verwendet wird, markiert man im Abstand von jeweils z cm die Punkte 1-6 und tragt folgende Mengen von Extrakt und Standardlosung (I mg Pregnandiol pro ml) auf : Punkt Punkt Punkt Punkt Punkt Punkt

I : 2: 3: 4: 5: 6:

2.5 5 IO 0.1 0.05 0.025

pugPregnandiol pg Pregnandiol pg Pregnandiol ml Extrakt ml Extrakt ml Extrakt

Anschliessend wird das Chromatogramm auf einer Laufstrecke von 16 cm mit einer ~ischung von C~lloroform, Aceton und Ess~gs~ure~thylester im Verhaltnis 80 : 20 : IO (v/v iv) in einer aquilibrierten, an den Wanden mit Fliesspapier ausgeiegten Kammer entwickelt, nach dem Trocknen unter dem Abzug mit einer zu c,o% gesattigten Losung von Antimontrichlorid in Chloroform bis zur Transparenz besprtiht und 30 Min auf IZOO in einem M’armeschrank erhitzt. Die Pregnandiolfraktionen des Urinextraktes erscheinen in Hohe der Standardwerte als violette Flecke (Abb. I). Sie sind von den anderen mit Ant~~llontrichlorid darstellbaren Fraktionen gut abgetrennt. Qttantitative Kmtimmmg Zur photodensitometrischen Auswertung legt man die Platte in die Kassette des Chromatogrammabtasters und stellt die Hohe der Fraktionen parallel zur Startlinie ein. Nach Einsetzen des Primarfilters Nr. 7-60 und des Sekund~rfilters Nr. 827 und Einstellen einer Spaltbreite von z mm und einer Gerateblende von 30 Skalenteilen wird das Photometer an einer Leerstelle der Platte auf Mimimalausschlag eingestellt

Abb. I. O-Punkt-niirtnschichtchrcmatogramm

einer T’rah’nandiolbestimmunfi.

344

ABRAHAM

et at.

und an dieser Stelle mit der Registrierung parallel zur Startlinie begonnen. Nach Auszahlen der Integratorspur fiir die Punkte 1-6 prtift man zun~chst, ob sich die Integralwerte wie die Konzentrationen des Standards 132~. des Extrakts verhalten. Wenn einzelne Standard- oder Urinextraktwerte aus dieser Relation herausfallen und dies nicht durch eine erneute Registrierung dieser Fraktion mit veranderter HKheneinstellung des Abtasters korrigiert werden kann, so bleibt dieser Wert bei der Rerechnung der Pregnandiolauss~l~eidung in der nacllstebenden Formei un~~r~cksi~l~tigt. Berechnung der Pregnandiolauss~ileidung : fig Pregnandiol

(I,+-I,-kI,) - ._“.._ x (2.5+5.0+10.0) --.... .__ pro 24 Std = ...-..-- -(I,---t_I,_il;,) x (o.r-~o.05~o.025)X

?-e o.5 x 20

Es bedeuten: II: Integralwert fiir den Pregnandiolstandard, 2.5 ,ug; I,: Integralwert fur den Pregnandiolstandard, fiir den Pregnandiolstandard, 5 (ug; I,: Integralwert IO ,ug ; I,, Intregralwert fur die Pregnadiolfraktion in 0.1 ml Extrakt ; I,, Integralwert fur die Pregnandiolfraktion in 0.05 ml Extrakt ; f 6t Integralwert fur die Pregnandiolfraktion in 0.025 ml Extrakt ; Tg, Tagesmenge des Crins in ml. S#ektrosko#ische Methoden fiir dir: Identi$zierzmng der Pregnandiolfraktiofz Infrarots$ektroskopie. Der Extrakt von roe ml Urin (1.1 mg Pregnandiol pro 24 Std) des 8. Cyclustages einer Probandin mit biphasischem Cyclus wurde auf der gesamten Startlinie einer D~nnscl~ichtplatte aufgetragen und chromatographiert. Nach Abdecken von 415 der Platte wurde die Pregnandiolfraktion mit Antimontrichloridreagenz lokalisiert und anschliessend auf dem abgedeckten Teil der Platte die Sorptionsmittelzone in der gleichen Hiihe gesammelt und mit einer minimalen Menge Dichlormethan (Uvasol, Merck) eluiert. Ans~lll~essendwurde das Eluat auf diegefrorene LBsung von 8 mg Kaliumbromid (zur Infrarotspektroskopie, Merck) in 0.5 ml Wasser aufgebracht und die Probe 24 Std gefriergetrocknet. Aus demTrockenpulver wurde mit Hilfe der KBr-Mikropressform ein Pressling von 1.5 mm Durchmesser angefertigt, zur Aufnahme des Spektrums in den ~~ikroilluminator eingesetzt und justiert. In der gleiL

A

L-

c

500 hfnm) 450 400 Abb. 2. Absorptionsspektrum des Schwefeltiurechromogens einer authentischen Probe von Pregnandial (untere Kurve) und der diinnschichtchromatographischen Fraktion ans eincm Urinextrakt (obere Kurve) .

Clin. Chim. Acta, 28 (rg7o) 34r-317

345

DREGNANDIOLAUSSCHEIDUNG

WAVENU~ER

I

(CM-‘)

WELLENZAHL

Abb. 3. Infrarotspektrum mit einem KBr-Mikropressling der diinnschichtchromatographischen Pregnandiolfraktion aus Urinextrakt (untere Kurve) und einer authentischen Probe van Pregnandiol (obere Kurve).

200

300

400

500

600 h(nm)

Abb. 4. Anregungs- und Fluoreszenzspektrum des Schwefels%urechromogens der dtinnschichtchromatographischen Pregnandiolfraktion aus Urinextrakt (obere Kurve) und einer authentischen Probe van Pregnandiol (untere Kurve).

then Weise wurde ein Pressling mit 50 ,ug einer authentischen Probe von Pregnandiol vorbereitet.DieRegistrierungdesSpektrumserfolgteunterBet~tigungeinesVergleichsstrahlabschwachers bei maximaler Spaltbreite und minimaler Vorschubgeschwindigkeit. Absorptions- und Fluoreszenzspektvoskopie des SchwefeGwechyomogem. Der Extrakt von weiteren IOO ml des gleichen Urins wurde in der vorstehend beschriebenen Weise chromatographiert, eluiert und das Eluat sowie 50 ,~g einer authentischen Probe von Pregnandiol zur Darstellung der Schwefelsaurechromogene mit 3 ml konz. Schwefelsaure (zur Analyse, Merck) IO Min auf 100’ im Wasserbad erw%rmt und sofort abgekiihlt. Mit dieser Losung wurden anschliessend bei konstanter Anregungswellenlange die Fluoreszenzspektren und bei konstanter Fluoreszenzwellen1Hngedie Anregungsspektren mit dem Fluoreszenzspektrometer registriert. Die Proben Clin.

Chim.

Acta, 28 (1970) 347-317

346

ABRAHAM

konnten dann sofort zur Aufnahme trometer weiter verwendet werden.

der Absorptionsspektren

t?t d.

mit dem Prismenspek-

ERGEBNISSE

Methodologische

lidersuchungela

ES hat sich gezeigt, dass bei der chromatographischen nach Klopper et aLlo Verunreinigungen in die photometrische

Pregnandiolbestimmung Endbestimmung gelan-

gen, wenn die Urinextrakte iiberwiegend Pregnandiol adrenalen Ursprungs enthalten (Nebennierenrindencarcinom, Follikelphase des Cyclu~S~~*~~2).Zur Prtifung der Spezifitat unserer Methode haben wir daher Urin des 5. Cyclustages mit niedrigem Pregnandiolgehalt in der gleichen Weise wie unsere Urinanalysen aufgearbeitet und mit dem Eluat die Infrarotspektren sowie die Absorptions-, Anregungs- und Fluoreszenzspektren des Schwefelsaurechromogens aufgenommen. Nach der Elution der Pregnandiolfraktion wurden keine analytischen Operationen mit reinigender Wirkung wie Kristallisation oder Rechromatographie vorgenommen. Die Identitat aller Spektren mit denjenigen der mitgeftihrten authentischen Proben von Pregnandiol (Abb. z-4) lasst den Schluss zu, dass mit dem von uns verwendeten dtinnschichtchromatographschen System weitgehend reine Pregnandiolfraktionen erhalten werden. Es bestellen daher keine Bedenken, fur die Endbestimmung die wenig spezifische Antimontrichloridreaktion anzuwenden. Refwoduzierbarkeit Vierfachbestimmungen von Urinproben mit niedrigen (0.8 und 1.34 mg/24 Std) und hohem (4.72 und 6.85 mg/24 Std) Pregnandiolgehalt ergaben einen mittleren bei Fehler der Einzelmessung von ,clSq{l. W?e wir aus weiteren Doppelbestimmungen Routineanalysen entnehmen konnten, gilt dieser Messfehler fur den Bereich o.j-6 mg Pregnandiol pro 24 Std. Unterhalb und oberhalb dieser Grenzen ist mit grosseren Messfehlern zu rechnen. Dies ist wahrscheinlich dadurch bedingt, dass bei der photometrischen Messung im Reflexionsverfahren bei zu geringer l~lacl~enbelegung mit dem Chromogen die Messung geringer Intensitatsunterschiede durch die Absorption eines nur kleinen Teils der eingestrahlten Lichtintensitat mit einem grosseren Fehler behaftet ist oder bei zu dichter Flachenbelegung der Messwert zu stark von der Auftragetechnik abhangig wird. Dabei werden einzelne Chromogenmolektile in wechselndem Masse von anderen tiberschichtet und vom eingestrahlten Licht nicht erreicht. Ausserhalb der Grenzen dieses optimalen Messbereiches lasst sich eine WTiederholung der Analyse mit grosseren oder kleineren Extraktmengen meist vermeiden, wenn man die Integralwerte der kleinsten oder grossten Extraktmenge unberiicksichtigt l&t und die entsprechend korrigierte Formel bei der Bercchnung anwendet. Der griisste Teil der von uns untersuchten Urinproben wurde unmittelbar nach dem Sammeln eingefroren. Nach Waldir3 wird freies Pregnandiol durch Einwirkung von Salzsaure bei der Hydrolyse zerstort. Er schlagt deshalb ein kombiniertes Saurehydrolyseverfahren mit Essigsaure, Trichloressigsaure und Schwefelsaure vor, das bei [Jrinproben, die langere Zeit bei Zimmertemperatur gelagert wurden, bessere Resultate als die Salzsaurehydrolyse bringt. Da in unserem Untersuchungsmaterial Lagerungsprobleme keine Rolle spielten, haben wir aus Grtinden der Ein-

347

PREGNANDIOLAGSSCHEIDUNG

heitlichkeit

das kombinierte

Verfahren

neben

der Salzsaurehydrolyse

nicht

ange-

wandt. Bei 41 biphasischen Cyclen gesunder Probandinnen mit 6-10 Pregnandiolbestimmungen pro Cyclus ergaben sic11 fur den Pregnandiolgehalt im z4-Std-Urin folgende ~Iittel~~erte und Standardab~eichungen: Follikelphase 1.04 & 0.67; Lutealphase 2.051 +_ 1.33 mg. Der Unterschied in den Nttelwerten fiir die beiden Phasen Bei der Verwertung des Cyclus ist hochsignifikant (t-Test, I O&Vertrauensgrenze). unserer Ergebnisse in der Cyclusdiagnostik als zusatzliches Kriterium der Ovulation hat sic11 gezeigt, dass eine Entscheidung anhand dieser Mittelwerte mit einer grossen ~nsicllerl~eit behaftet ist, da der charakteristiscl-le Anstieg der Pre~andiolausscl~eidung bei den einzelnen Frauen auf sehr unterschiedlichem Konzentrationsniveau stattfindet. iihnliche Beobachtungen wurden such von anderen Autoren mitgeteilt1a-17. Wir haben daher fur die Beurteilung der mit unserer Methode erhaltenenen Pregnandiolwerte im Zusammenhang mit der Ovulation neue Kriterien erkennen kijnnen, iiber die an anderer Stelle ausf~llrlicl~ berichtet werden ~0111~. ZUSAMMENFASSUNG

Nach Salzs~urehydrolyse, Extraktion und d~nnschichtcl~romatograpl~ischer Isoherung van Pregnandiol aus Urin erhalt man durch Bespriihen der Diinnschichtplatten mit SbCl,-Reagenz stabile Chromogene, welche direkt auf dem Chromatogramm photodensitometrisch in einem Turner-Photometer mit Plattenabtaster und integrierendem Schreiber ausgewertet werden konnen. Die Berechnung des Pregnandiolgehaltes erfolgt mit (6-Punkt-Chromatogramm). fur den Bereich anhand

0.5-6

einem System von Standardwerten und Extraktmengen Der mittlerer Fehler der Einzelmessung liegt bei If89a

mg Pregnandiol

der Ergebnisse

pro 24 Std. Die Anwendung

von 41 biphasischen

Cyclen gesunder Frauen

der Methode wird diskutiert.

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