Sensibilité aux rayons x et ultraviolets d'un acide désoxyribonucléique transformant sous formes unifilaire et bifilaire

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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 8319

SENSIBILITI~ AUX RAYONS X ET ULTRAVIOLETS ACIDE DI~SOXYRIBONUCLI~IQUE TRANSFORMANT UNIFILAIRE

D'UN

SOUS F O R M E S

ET BIFILAIRE

NICOLE REBEYROTTE Laboratoire Pasteur Institut du Radium, Paris 5e (France) (iRe~u le 13 mai, 1963) SUMMARY Sensibility to X rays and ultraviolet rays o / a trans/orming deoxyribonucleic acid in single- and double-stranded /orms

Transforming DNA from Pneumococcus in its natural state (double stranded) and in a denatured state (single stranded) has been irradiated with X-rays and ultraviolet light. The survival of the genetic marker, "resistance to streptomycin", has been determined as a function of irradiation dose in three different experimental procecedures: (a) denaturation, irradiation, condensation; (b) denaturation, condensation, irradiation; (c) irradiation, denaturation, condensation. The action of X-rays has been studied under conditions of indirect effect (dilute aqueous solution) and semi-direct effect (sample frozen in 1 % yeast extract). The results obtained in each case are compared and discussed. In particular, the focus rests on their significance in regard to the biologically active structure of the selected marker and the respective mode of action of X-rays and ultraviolet light on this structure. INTRODUCTION La d6naturation du DNA correspond 5, la destruction de la structure h~licoidale par rupture de liaisons hydrog~nes entre les deux fibres constituant l'h~lice rigide. Cette d~naturation peut ~tre obtenue de diff~rentes mani~res, notamment par chauffage du DNA en solution. En ~tudiant l'action de la chaleur sur des solutions de DNA de thymus de veau, RICE ET I)OTY 1 ont montr~, qu'au-dessus d'une certaine temp6rature, on observe une chute rapide de la viscositS. La temperature/~ laquelle se produit la d~naturation du I)NA dfipend de sa composition en bases. Les liaisons guanine-cytosine sont plus stables que les liaisons ad6nine-thymine. MARMUR ET I)OTY2 ont montr~ qu'il y a une relation lin~aire entre la temperature de transition (Tin) et le taux de: guanine+cytosine contenu dans le DNA. Ce ph~nom~ne a ~galement ~t~ 6tudifi biologiquement sur le syst~me de la transformation bact~rienne. LERMAN ET TOLMACH 3 ont observ6, au-dessus d'une certaine temperature, une chute tr~s rapide ~ la fois du nombre de cellules transform~es et de la capacit~ du DNA ~ ~tre incorpor6. ROGER ET HOTCHKISS4 ont montr6 qu'il y a deux processus d'inactivation par la chaleur suivant que le DNA est chauff6 au-dessus ou au-dessous de cette temp&ature critique. Au-dessous de cette Bi~chim. B4ophys. Acta, 76 (1963) 234-246

IRRADIATION D'UN DNA UNIFILAIRE ET BIFILAIRE

235

temp6rature, l'inactivation est pr6sum6e ~tre due ~ une dfpurination. Au-dessus, il se produit une alt6ration de la mol6cule enti6re avec destruction de la double h61ice. Chaque marqueur biologique a sa temp6rature critique (Tm) particuli6re. L'hypoth6se selon laquelle les fibres constituant l'h61iee double de la mol6cule de I)NA seraient s6parfes par dfnaturation thermique est appuyde par les r6sultats de MARMUR ET LANE5 et DE I)OTY et al. 6. I1 est maintenant courant d'utiliser le terme de DNA "unifilaire" pour le DNA d6natur6. Cet 4tat unifilaire peut ~tre conserv6 lorsqu'apr6s chauffage au-dessus de la temp~rature critique, on reffoidit rapidement la solution de DNA. Par contre, si la solution de I)NA est reffoidie lentement, les deux fibresde I)NA peuvent se recondenser et il y a "renaturation" de la mol6cule. Ce DNA "renatur6" ou condens6 retrouve en partie ses proprifitds physico-chimiques et biologiques. Ayant dfj~ 6tudi6 la radiosensibilit6 aux rayons X et aux rayons ultraviolets d'un marqueur du pneumocoque (r6sistance ~ la streptomycine) lorsque le DNA est irradi6 sous forme de double h61ice (bifilaire)7, s, nous avons suivi, dans ce travail, la radiosensibilit6 de ce m~me marqueur lorsque le DNA est irradi6 ~ l'6tat d6natur6 (unifilaire). MATI~RIEL ET MI~THODES

Souches bact&iennes Pour les transformations, nous avons utilis6 la souche de "Diplococcus pneumoniae R36A" comme souche r6ceptrice, et le m u t a n t r6sistant ~ la streptomycine (IOOO/~g/ml) comme souche donnatrice. La s61ection des bact6ries transform6es a ~t6 faite dans un milieu contenant 2oo/~g/ml de streptomycine.

Prdparation du DNA Le DNA transformant a 6t4 extrait de la souche r6sistante ~ la streptomycine selon la technique d6crite par MARMURg: des bact6ries en fin de croissance, sont centrifug6es, lav6es, puis lys6es par du dod6cylsulfate de sodium. L'extrait est ensuite d6prot6inis6 plusieurs fois par le chlorofoime, trait6 par la ribonucl6ase, et nouveau d6prot6inis6. Entre chaque d@rotdinisation, le DNA est pr6cipit6 par addition de 2 voI. d'6thanol, et remis en solution dans du chlorure de sodium o.15 Mcitrate de sodium O.Ol5 M. La derni6re pr6cipitation est faite par addition de o.54 vol. d'alcool isopropylique pour 61iminer les polysaccharides. I,e DNA est conserv6 en solution saline (chlorure de sodium o.15 M-citrate de sodium O.Ol5 M) ~ des concentrations de o.5/t I mg/ml. La concentration en DNA est d6termin6e par un dosage colorim6trique /t l'indol selon la m6thode de KECK1°, et aussi par mesure de l'absorption de l'~chantillon 260 m/~.

Milieu de /rans]ormation Nous utilisons le milieu de transformation ddcrit par EPHRUSSI--TAYLOR11 sans addition de s6rum de boeuf: N6opeptone I)ifco, IO g; KC1, R.P., 3 g; CAC12"2 Iff20, 0.046 g; Na~HPO a. 12 H20 , R.P., 4.73 g; eau distill6e q.s.p., IOOOml. Ce milieu est trait6 par du charbon animal en milieu acide puis st6rilis6 apr6s Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

236

N. REBEYROTTE

avoir ajust6 le p H ~t 7.6; enfin avant utilisation il est compl6t~ de mani~re ~ avoir en concentration finale: extrait de levure Difco (pr6alablement trait6 par du charbon animal), 0. 4 %; glucose, 0.025 %; s6rum albumine de boeuf, Fraction V (Armour), 0.2 %; pyrophosphate de sodium, M/3ooo.

Technique de trans/ormation La technique de transformation utilis~e est bas6e sur celle de F o x ET HOTCHKISS1~. Les bact6ries r6ceptrices sont incub6es A 37 ° clans le milieu de transformation jusqu'~ I'apparition du m a x i m u m de comp6tence (9O-lOO mill), puis imm~diatement refroidies au bain de glace, additionn6es de o.Io volume de glyc6rol et congeldes. Ces bact6ries comp6tentes sont conserv6es A --7 o°. Pour les exp6riences de transformation, les 6chantillons de bact6ries comp6tentes sont d6congel6s au bain de glace, diluds aussit6t IO fois dans du milieu de transformation frais, pr6alablement maintenu 37 °, puis additionn6s aux diff~rents 6chantillons de I)NA dont on veut mesurer l'activit6. On laisse en contact 30 min ~ 37°; puis des portions aliquotes de chaque tube sont p%levdes et 6tal6es dans de la g61ose au sang. Apr~s 2 h d'incubation 37 °, temps permettant l'expression ph6notypique, on coule une couche de g61ose contenant de la streptomycine pour s6lectionner les bact6ries transformdes. On d6nombre les colonies apr~s 36 h d'incubation ~ 37 °. I)ans toutes les exp6riences de mesure de l'activitfi transformante du DNA, la concentration de celui-ci, au moment du contact avec les bact6ries comp~tentes, est 6gale ou inf6rieure ~ 0.02 #g/ml. I)ans ces conditions, il y a lin6arit6 entre le nombre de transformations obtenu et la concentration en I)NA.

Irradiations Ultraviolet: Les irradiations ont 6t6 faites avec une lampe germicide dont 98 % du rayonnement ultraviolet est fourni par la radiation 2537 A. Le DNA, Ala concentration de 15-4 °/~g/ml, dans une "solution saline concent%e" (chlorure de sodium 0.3 M-citrate de sodium 0.03 M) est irradi6 dans des boltes de p6tri, en couche de I m m d'6paisseur. I)ans ces conditions, l'absorption est au m a x i m u m de 18 %. Les 6chantillons sont 16g~rement agi%s au cours de l'irradiation. Rayons X: La source de rayons X est un tube Holweck ~ anticathode de molybd~ne, ddbitant sous 37 kV un rayonnement filtr6 par 0.04 m m d'aluminium, de longueur d'onde moyenne 0. 9 A. L'intensit6 d'alimentation du filament (30-40 mA) et la distance 6taient choisies pour avoir, suivant les doses d6sir6es, des ddbits de 500 ou 15oo R/sec. Les 6chantillons de Z)NA (15-4 ° #g en solution saline concentr6e) 6taient places dans des cupules de plexiglass circulaires. Les volumes choisis 6talent tels que l'6paisseur de liquide rut de l'ordre du millim~tre. Les irradiations ont 6td faites dans deux sortes de conditions: (a) Irradiation en milieu salin liquide: chlorure de sodium 0.3 M-citrate de sodium 0.03 M. Ce sont les conditions que nous appelons "effet indirect". Cette concentration saline entraine une certaine stabilisation de la mol6cule de DNA en comparaison avec des irradiations faites dans un milieu de force ionique 2 fois moins grande, probablement en agissant sur la structure tertiaire du DNA en solution. Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

IRRADIATION D'UN DNA UNIFILAIRE ET BIFILAIRE

237

(b) Irradiation en milieu salin concentr6, additionn6 d'extrait de levure (I °/o) et congel6. Ce sont les conditions que nous appelons "effet semi-direct". Avec une concentration d'extrait de levure de I °/o, nous trouvons 50 % de la protection totaleL Nous avons choisi ces conditions, car elles ne modifient ni la d6naturation du DNA, ni sa recondensation. Elles nous ont donc permis de faire des exp6riences comparables en irradiant des 6chantillons sous forme unifilaire ou bifilaire.

Ddnaturation-- condensation Nous avons utilis6 les conditions exp6rimentales donn6es par 1V[ARMUR ET DOTY g.

Des 6chantillons de DNA, en solution saline concentrde, contenant de 15 ~ 40 fig, sont chauff6s IO rain au bain-marie bouillant puis refroidis aussit6t au bain de glace. I)ans ces conditions, le DNA est d6natur6. I1 reste sous forme unifilaire et son activit6 transformante r6siduelle est 6gale A 1- 3 % de son activit6 initiale. Ces solutions de DNA d6natur6 sont alors utilis6es imm6diatement ou conserv~es au froid suivant les besoins de l'exp6rience. Pour la "renaturation" ou condensation, nous avons 6galement utilis6 les conditions donn6es par ces m6mes auteurs. Les 6chantillons d6natur6s sont maintenus 2-3 h ~ 67 °. Dans ces conditions, les 6chantillons inactiv6s par le chauffage retrouvent 45-6o % de leur activit6 transformante initiale. RI~SULTATS

Irradiation X--effect indirect Inactivation de la [raction d'activitd trans/ormante rdsistant au traitement de chau[[age de IO minutes ~ IOO°: Du DNA, mis en solution saline concentr6e, est d6natur6 IO min & IOO°, puis refroidi aussit6t au bain de glace. Ce DNA, sous forme Irradiation 10 rain 100°

DNA natif

/

DNA

test d'act~/it~ biologique

d@natur@

unifilaire, est irradi6 ~ des doses variables selon les conditions d'irradiation en effet indirect d6crites pr6c6demment. Apr~s l'irradiation, les 6chantillons de DNA sont convenablement dilu6s. On mesure alors leur activit6 transformante. Les r6sultats obtenus sont port6s sur la Fig. i, Courbe a. On volt que la courbe d'inactivation obtenue est parall~le A la Courbe t correspondant ~ l'inactivation du m~me DNA dans des conditions d'irradiation identiques mais ~ l'6tat natif.

Irradiation du DNA sous ]orme "uni/ilaire"-ddtermination de l'activitd biologique apr~s recondensation: Le processus exp6rimental est le m~me que celui d6crit dans le paragraphe pr6c6dent. Les 6chantillons de DNA d6natur6 sont irradi6s ~tdes Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

238

N. REBEYROTTE Irradiation 10min 100 ° ~_.

DNA natif

& 67 °

DNA condens~

DNA d~natur6

test d'activit~

doses variables. Mais apr+s l'irradiation ces 6chantillons sont recondensds avant d'6tre control6s pour leur activit6 transformante. Pour cela, on les laisse pendant 2 h dans un bain ~ 67 °. Ensuite on effectue les exp6riences de transformation avec les diff6rents DNA. Un contr61e avec du I)NA natif irradi6 dans les m~mes conditions, conserv6 le m~me temps A 67 °, nous permet de tenir compte du "post-effet". Les courbes obtenues dans ces deux cas sont parall~les (Fig. I, Courbes b e t t'). 0

20

IX

J

40

60

80

100

120

E

I

~

I

I

xlO3R I

~\\ XX k\

(b)

N %

" (a)

Fig. I. I r r a d i a t i o n X: effet indirect. D N A en solution saline concentr~e, 20 ffg/ml, t, D N A natif; t', D N A natif, dchantillons conservds 2 h &67 ° apr~s l'irradiation; a, irradiation du D N A d6natur~ zo mill a IOO°; b, 6chantillons trait6s c o m m e p o u r (a) mais condens6s 2 h a 67 ° a v a n t d'etre testds.

Ce r6sultat montre que: (a) l'irradiation respecte la condensation; (b) la sensibilit6 aux rayons X indirects du I)NA transformant unifilaire ne diff~re pas de celle du DNA bifilaire. Dans ces exp6riences, le DNA tdmoin n'a subi aucun traitement pr~alable & l'irradiation. Pour ~liminer la possibilit6 de deux ph6nom~nes pouvant se compenser, nous avons fait les contr61es suivants: Irradiation d'un D N A prgalablement ddnaturd et condensd: Avant l'irradiation, le DNA a 6t~ chauff6 IO rain & IOO° puis condens6 2 h & 67 °. Biochim. Biophys. Acta, 76 (I963) 234-246

IRRADIATION D'UN

DNA

UNIFILAIRE ET BIFILAIRE

239

Irradiation

lOmin & 100 °

2h & 67 °

DNA natff

DNA cor~en~

DNA denatur~

test d'activit6

Dans ce cas aussi, la courbe obtenue est parall~le & celle du DNA natif (Fig. 2, Courbe c). Donc le processus de fusion suivi de condensation ne modifie pas la sensibilit6 du DNA 6tudi6 aux rayons X. 0

20 t

40 I

60 I

80 I

100 L

xlO3R

120 I

R\\\ ,,-.,~ ,, \ \\

\\ o

A\\ 'l

\\\ \

xa

o

(t)

3

"\ , No'%(~) \\~(t')

(c') 4

N

No Fig. 2. I r r a d i a t i o n X: effet indirect. DlqA en solution saline concentr~e, 20 #g/ml. t, D N A natif; t', D N A natif conserv~ 2 h & 67 ° apr~s l'irradiation; c, D N A d6natur~ puis condens~ a v a n t Firradiation; c', 6chantillons trait~s c o m m e p o u r (c) mais laiss6 & n o u v e a u 2 h & 67 °.

Irradiation du D N A su4vie de ]usion et condensation: Dans une quatri6me s6rie d'exp6riences, nous avons 6tudi6 l'effet d'un pr6traitement aux rayons X sur la fusion et la condensation du D N A . Les solutions de D N A pr6par6es comme pr6c6demment sont irradi6es, puis chauff6s IO rain k IOO°, et condens6es en les laissant 2 h ~ 67 °. Irradiation 2h & 67 °

100"ID DNA natif

r

DNA d~natur~

IL

DNA condens~

test d'activit~

Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

240

N. REBEYROTTE

Nous avons fait les d6terminations d'activit6 transformante suivantes (Fig. 3): (a) 6chantillons irradi6s (t); (b) 6chantillons irradi6s maintenus 2 h & 67 ° (t'); (c) 6chantillons irradi6s, chauff6s IO min & IOO° (d); (d) 6chantillons irradi6s, chauff6s IO rain ~ IOO°, puis condens6s 2 h A 67 ° (e). 0

20 I

40 I

-3 ~

60 I

80 I

100 I

120 I

x 103R

'\\\~\ \'\\\\,NX ' ~t,x) ( X

\'',

\~(t')

\\\\\\ P]

No

\~ (d)

,\, (e)

Fig. 3. I r r a d i a t i o n X: effet indirect. D N A en solution saline concentr6e, 2o/~g/ml. t, D N A natif; t', D N A n a t i f conserv~ 2 h & 67 ° apr~s l'irradiation; d, D N A irradi6 p u i s d 6 n a t u r 6 To m i n A IOO°; e, D N A irradi6, d 6 n a t u r 6 p u i s condens~ 2 h A 67 °.

Le DNA irradi6 perd son activit6 biologique par chauffage de IO minutes ~ IOO° un taux plus grand que le I)NA natif. La courbe obtenue, en fonction de la dose, pour les dchantillons irradi6s, puis chauff6s (Courbe d) a une pente 2,5 fois plus grande que celle obtenue pour le DNA natif et aussi, de celle obtenue pour la fraction r6siduelle dans le cas oh l'irradiation est faite apr+s le traitement de d6naturation (fig. I, Courbe a). Les 6chantillons condens6s 2 h ~ 67 ° (Courbe e) donnent une courbe de pente 1,3 lois celle du t6moin irradi6, conserv6 2 h A 67 ° (Courbe t'). Selon ce processus exp6rimental, il apparait une augmentation de la sensibilit6 intrins~que du marqueur 6tudi6.

Irradiation X--e]/et semi-direct Les m~mes exp6riences ont 6t6 r6alis~es dans les conditions d'irradiation en effet semi-direct. La solution saline concentr6e contenant le DNA (20 fig) est additionn6e d'extrait de levure (I ~o en concentration finale). Des 6chantillons de 0.3 ml sont plac6s dans des cupules en plexiglass, puis congel6s sur un m61ange: glace carboniqueBiochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

IRRADIATION D'UN DNA UNIFILAIRE ET BIFILAIRE

241

6thanol. L'6paisseur de la couche irradi6e est de I mm. La temp6rature est maintenue & environ --4 o° pendant toute l'irradiation.

Irradiation de la [faction d'activitd trans/ormante rdsistante au traitement de ddnaturation: La pente de la courbe obtenue (Fig. 4, Courbe a) en fonction de ]a dose est peu diff6rente du t6moin. La diff6rence n'est pas significative. 0

1

2

3

4

5

6

i

i

i

i

I

r

xlO6R

\

Fig. 4. I r r a d i a t i o n X: effet semi-direct. D N A en solution saline concentr~e, 20 ~ g / m l . t, D N A natit; t', D N A n a t i f conserv~ 2 h & 67 ° apr~s l'irradiation; a, i r r a d i a t i o n d u D N A d~natur~; b, D N A a y a n t 6t~ d~natur6, irradi6 p u i s c o n d e n s e .

Inactivation du DNA sous /orme "uni/ilaire"--ddtermination de l'activitd apr~s condensation: La courbe d'inactivation en fonction de la dose (Fig. 4, Courbe b) a la m~me pente finale que le t6moin. Dans ces exp6riences, avec irradiation en effet semi-direct, les dchantillons conserv6s 2 h & 67 ° ne different pas du t~moin normal. Inactivation du DNA prdalablement ddnaturd et condensd: La courbe d'inactivation de ces 6chantillons est parall61e &celle des 6chantillons de DNA natif (Fig. 5). Le DNA recondens6 ne cliff,re pas du DNA natif quant ~ sa sensibilit6 aux rayons X en effet semi-direct. Ddnaturation et recondensation d'un DNA prdalablement irradid: Nous avons effectu6 les m~mes mesures d'activit6 transformante que dans le cas d'irradiation en "effet indirect". La Fig. 6 montre les diff6rents rdsultats obtenus. On voit que, au cours de ces irradiations, la fusion n'est pas modifi~e. La condensation se fait 6galement normalement. En consid6rant les pentes finales des courbes, c'est-~-dire la portion correspondant & l'inactivation du marqueur lui-m6me, on voit que sa radiosensibilit6 n'est pas modifi6e quel que soit l'ordre dans lequel on effectue les diff6rents traitements.

Rayons ultraviolets Les diff~rentes exp6riences ont 6galement 6t6 r6alis6es avec des irradiations ultraviolettes, dans les conditions d6j& d6crites. Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

242

N. R E B E Y R O T T E

~

0

1 1

2 I

3 I

4 I

5 I

6 I

x'lOe R

N

No Fig. 5. I r r a d i a t i o n X: effet semi-direct. D N A en solution saline concentrde, 20/zg/ml. t, D N A natit; t', D N A natif conserv4 2 h & 67 ° apr~s l'irradiation; c, D N A d4naturd puis condens4 a v a n t Firradiation; c', 4chantillons trait4s c o m m e p o u r (c) mais laiss4 a n o u v e a u 2 h & 67 °. 1

2

3

4

5

6

]

I

~

I

I

;

xlO6R

\o \ \

°~o

uo Fig. 6. Irradiation X: effet semi-direct. D N A en solution saline concentrde, 2o/~g/ml. t, D N A natif; t', D N A natif conserv4 2 h ~ 67 ° apr~s l'irradiation; d, D N A irradi4 puis d4naturd IO mill & IOO°; e, D N A irradi4, ddnatur4 puis condens4 2 h ~ 67 °.

Irradiation du D N A ddnaturd: La courbe d'inactivation de la fraction r4sistante & ]a d6naturation est peu diffdrente de celle du DNA natif. (Fig. 7, Courbes a et t'). La diff6rence peut ~tre due & une variation du poids mol4culaire apr&s la d4naturation la. Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

IRRADIATION D'UN

DNA UNIFILAIRE ET BIFILAIRE

243

Temps (rain) 0

4

8

12

20

I

I

I

\o " ' ' - ~ . (c)

+

~

×'--...×

Fig. 7. Irradiation ultraviolette: dose incidente moyenne 8000 ergs]min/mm*. DNA en solution saline concentrde, 24 $*g]ml. t, DNA natif; a, irradiation du DNA d6natur~; b, DNA ayant 6t6 ddnatur6, irradi6, puis condensd; c, DNA ddnatur6 puis condensd avant l'irradiation; c', 6chantillon (c) conserv6 & 67 ° pendant 2 h apr~s irradiation.

Irradiation du DNA ddnaturd--activitd mesurde apr~s recondensation: Les r6sultats de ces expdriences sont rapport6s en Fig. 7, Courbes b et t'. On foit que, lorsque le DNA est irradi6 sous la forme unifilaire, il apparait une inhibition de la condensation. Cette inhibition augmente avec la dose jusqu'~ 6tre totale, n n'y a, alors, plus de recondensation; la courbe obtenue (b) se confond avec celle de la fraction thermostable (a). Irradiation d'un DNA prdalablement ddnaturd puis condensd: Le DNA, ayant 6t6 d6natur6 puis condens6, montre la m6me sensibilit6 que leDN'A, natif (Fig. 7, Courbe c). Ddnaturation puis condensation d'un DNA prdalablement irradid: Le DNA pr~alablement irradi6 aux rayons ultraviolets, se montre moins sensible &la d6naturation. Son activit6 r6siduelle reste presque constante jusqu'& ce que la dose ultraviolette atteigne 80 ooo-Ioo ooo ergs/mm~; au-del&, cette activit6 baisse. Par ailleurs, la fraction du DNA renatur6e apr&s irradiation et d6naturation donne une courbe parall~le & celle obtenue pour le DNA t6moin et superposable A celle de l'~chantillon d6natur6 et condens6 avant irradiation (Fig. 8, Courbe c). DISCUSSION

Des expdriences d'irradiation avec les rayons X, il nous semble possible de tirer les conclusions suivantes: (a) la fusion ~uivie de condensation ne modifie pas la sensibilit~ aux rayons X du marqueur; (b) la fusion n'est pas emp~ch~e par une irradiation pr~alable; Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

244

N. REBEYROTTE

O

4 I

8 I

Temps (min) 12 I

;

•

20

-

(t)

-(d)

N NO

Fig. 8. Irradiation ultraviolette: dose incidente m o y e n n e 8ooo e r g s / m i n / m m 2. DNA en solution saline concentr~e, 24/~g/ml. t, D N A natif; d, D N A irradi~ puis d~natur~ io min & IOO°; e, DNA irradi6, dgnatur6 puis condens6 2 h ~t 67 °.

(c) 1'irradiation respecte 6galement la recondensation. En effet, si l'on consid~re les r6sultats correspondant aux m~mes opdrations, c'est ~t dire pour des 6chantillons de DNA qui ont 6t6 irradi~s, d~natur6s, condens6s, quel que soit le stade og l'on fasse l'irradiation X, les courbes obtenues ont des pentes finales parall6les. Une diff6rence importante est cependant observfie clans le cas d'irradiation en "effet indirect" avant d~naturation. Dans ce cas, le DNA pr6alablement irradi6 semble beaucoup plus sensible ~t ]a d6naturation. Dans ce type d'irradiatio~., il y aurait formation de l~sions par les rayons X qui seraient r~v~l~es au cours de la d~naturation (modifications chimiques des bases, coupure de liaisons phosphodiesters). Cette sensibilisation n'est pas emp6ch~e par addition de substances organiques (extrait de levure ~ I °/o) avant la d6naturation, ni observ~ en d~naturant du DNA dans du milieu irradi6. Elle n'est donc pas due a un post-effet. Par irradiation ultraviolette, le DNA devient plus r6sistant ~ la d6naturation. C'est ce que l'on voit en Fig. 8, Courbe d. Ce r6sultat a d~j~t 6t~ observ6 par plusieurs auteurs 14,15. Cette r6sistance s'explique par dim~risation de bases (thymine 16) entre les deux chaines. Apr~s condensation de ce DNA irradi6 puis d6natur~, l'on retrouve une courbe en fonction de la dose de rayonnement, parall~le ~ celle du DNA t6moin (Courbe e). Par contre, lorsque le DNA est irradi~ apr~s d6naturation, donc sous forme "unifilaire", puis dont l'activit6 est mesur6e apr~s condensation, on obtient une courbe d'inactivation ~ pente initiale rapide (Fig. 7, Courbe b). Lorsque la dose augmente, cette courbe rejoint la courbe correspondant ~t la "survie" de la fraction r6sistant ~t la d~naturation, puis lui devient parall61e. I1 semble donc que sous la forme unifilaire l'irradiation emp~che la condensation. Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

IRRADIATION D'UN DNA UNIFILAIRE ET BIFILAIRE

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CABRERA-JUAREZ ET HERRIOTT17 ont 6tudi6 l'inactivation par les rayons ultraviolets du DNA transformant d'H~mophilus influenzae natif et d6natur6. Pour deux marqueurs, ils ont obtenus pour le DNA d6natur6 au moment de l'irradiation, des courbes peu diff6rentes de celle obtenue avec le DNA natif. Cette divergence avec nos r6sultats peut 8tre expliqu6e par des diff6rences de sensibilit6s des marqueurs d'Hemophilus influenzae par rapport ~ ceux de Pneumocoque. Le marqueur que nous avons ~tudi6 est plus radior6sistant que ceux d'H6mophilus. Un autre r6sultat concerne la fraction r6sistante Ala d6naturation (environ 1 % de de l'activit6 initiale du I)NA). La nature de cette fraction est encore imprecise. Correspond-eUe ~ une fraction de I)NA bifilaire ou ~ du DNA unifilaire? (a) D'apr~s GINOZA ET ZIMM18 et aussi ROWND et al. 19 cette fraction serait unifilaire. Les transformations ob~erv6es seraient dues/~ une propri6t6 intrins~que de la fibre unique. Dans l'6tat unifilaire, le DNA aurait une probabilit6 de transformation d'environ lO -2 fois celle du DNA natif. D'apr~s nos r6sultats, la radiosensibilitd de cet ADN unifilaire serait la m~me que celle du DNA bifilaire. (b) Apr~s la d6naturation par la chaleur, il resterait une quantit6 de DNA, de l'ordre de I °/o, sous la forme bifilaire, seule forme active pour la transformation. I1 n'est, alors, pas surprenant que cette fraction pr6sente la mSme radiosensibilit~ aux rayons X et ultraviolet que le DNA natif. Cette deuxi&me hypoth~se a 6t6 appuy6e par un travail de BARNHART et al. 2°. Cette fraction r6siduelle ne serait pas sensible au traitement par la phosphodiesterase de Lehman. Des r6sultats que nous avons obtenus avec le peroxyde de dissuccinoyle sont aussi en accord avec cette hypoth~se .1. Les courbes obtenues par irradiation ultraviolette du DNA unifilaire nous semblent aussi plus en faveur de cette possibilit6. Nos r6sultats ne permettent pas un choix cat6gorique entre les deux hypotheses. Nous pensons n6anmoins que le DNA, pour avoir son activit6 biologique doit 8tre sous forme d'h61ice double. Probablement, une seule fibre est incorpor6e, comme l'a montr~ LACKS2~, mais, avant la p~n~tration et peut-~tre pendant, la forme bifilaire dolt 8tre n6cessaire.

R~SU~ Le DNA transformant du pneumocoque ~ l'6tat natif (bifilaire) et ~ l'6tat ddnaturd (uDifilaire) a 6t6 irradi6 avec des rayons X et ultraviolets. La survie du marqueur "r6sistance ~t la streptomycine" a dt6 ddtermin6e en fonction de la dose de rayonnement ~ chacune des trois 6tapes des trois schemas suivants: (a) ddnaturation, irradiation, condensation; (b) d6naturation, condensation, irradiation; (c) irradiation, d6naturation, condensation. L'action des rayons X a 6t6 dtudi6e dans les conditions d'effet indirect (solution aqueuse dilu6e) et d'effet semi-direct (solution £ 1 % d'extrait de levure congel6e). Les r6sultats obtenus dans chaque cas sont compards et discutds. On consid~re en particulier leur signification/~ l'6gard de: (a) la structure biologiquement active du marqueur; (b) les modes d'action des rayons X et des rayons ultraviolets sur cette structure. REMERCIEMENTS

Ce travail a ~t6 effectu6 dans le cadre du contrat oo5-61-1 , B I A F pass6 entre EURATOM et le professeur LATARJET. I1 a en outre b6n6fici6 d'une subvention du Commissariat A l'Energie Atomique. Biochim. Biophys. Acta, 76 (1963) 234-246

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N. REBEYROTTE

Je tiens ~ remercier tr~s sincbrement Monsieur le Dr. LATARJET pour tous les conseils qu'il m'a donn~s au cours de ce travail. Je remercie 6galement M. A. PALAYSI qui a effectu6 les irradiations aux rayons X et M. G. MASSON pour son assistance technique. BIBLIOGRAPHIE I 2 3 4 5 8 7 8 9 10 11 13 13 14 xs 16 1~ is

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