Signification structurale et fonctionnelle des enveloppes chloroplastiques d'Euglena: Etude immunocytologique et en cryofracture

JOURNAL OF ULTRASTRUCTURE RESEARCH 73, 44-63 (1980)

Signification structurale et fonctionnelle des enveloppes chloroplastiques d'Euglena: Etude immunocytologique et en cryofracture M. L E F O R T - T R A N , M. P O U P H I L E , G. FREYSSINET,* ET B. P I N E A U Laboratoire de Cytophysiologie de la Photosynthkse, CNRS F-91190 Gif sur Yvette, et *D~partement de Biologie G~n~rale et Appliqude, LA 90, Universitg Claude Bernard, Lyon 1, 43 Boulevard du 11 Novernbre 1918, F-69621 Villeurbanne, France Received March 27, 1980 L'rtude par cryodrcapage de l'enveloppe des chloroplastes d'eugl6ne apparait composre de trois feuillets; les deux plus internes, comparables/~ ceux des plantes suprrieures, diffbrent entre eux par la densit6 des particules, le feuillet externe 6rant le plus pauvre en particules. Le 36me feuillet externe prrichloroplastique a une densit6 particulaire et un coefficient de partition qui le font assirniler h une membrane ergastoplasmique. Les conditions de culture et de verdissement ne semblent pas induire de modifications dans l'organisation particulaire de ces membranes qui parait par ailleurs sensible ~ la fixation chimique, au glycrrol et/~ la rapidit6 de congrlation. Par immunocytologie avec un srrum anti proteines ribosomales 89 S une relation parait exister entre le feuillet perichloroplastique et des cytoribosomes. I1 est discut6 de la signification de cette triple enveloppe autour des chloroplastes de l'eugl~ne et de ses consrquences pour les m6canismes de transfert, dans le chloroplaste, des protrines d'origine cytoplasmique. By freeze-fracture technique Euglena chloroplast envelopes appear as a triple-membrane structure. The most external perichloroplastic membrane displays a density of particles and a partition coefficient which permit comparison to an ergastoplasmic membrane. The intermediate membrane, compared to the most internal one, is very poor in particles. Nutritional and greening conditions have no influence on the density or the size of the particles in these membranes. However, the type of freezing and glutaraldehyde or glycerol treatments can modify their organization. A relation between cytoribosomes and the external membrane is shown by immunocytology. The meaning of the third perichloroplastic envelope in Euglena and the consequences for the transfer of cytoplasmic proteins into the chloroplast are discussed.

rappeler celui analys6 pour les deux membranes des mitochondries (Levy et al., 1969). Cette dualit6 fonctionnelle s'accompagne d'une dualit6 morphologique que de rares 6tudes en cryod6capage ont surtout drmontrre sur l'enveloppe des chloroplastes d ' r p i n a r d (Sprey et L a e t s c h , 1976) et d'orge (Simpson, 1978). Ces auteurs ont pu montrer que les faces complrmentaires de la membrane externe (PFt et EFt) sont lisses ou trrs pauvres en particules tandis que la membrane interne (PF2 et EF2) drpasse une densit6 de 2800 particules au /zmz. C'est environ ce chiffre qu'avaient donnd Miller et Staehelin (1973) pour la membrane chloroplastique la plus interne chez

L'enveloppe des chloroplastes, composre chez les organismes sup6rieurs de deux feuillets membranaires et chez les algues de 2, 3 ou m~me 4 feuillets (Gibbs, 1962, 1978; Dodge, 1973; Taylor, 1976; Buetow, 1976), constitue une barrirre entre le cytoplasme et le milieu chloroplastique. Heldt et Rapley (1970) ont montr6 que le feuillet le plus externe est, sans sprcificitr, permrable aux mrtabolites de faible poids molrculaire <10000 daltons (d) chargrs ou non. Le feuillet interne au contraire est permrable srlectivement h u n nombre limit6 d'anions, il laisse passer des molrcules non chargres et de faible poids mol6culaire <150 d. Le r61e diffrrentiel des deux membranes de l'enveloppe chloroplastique n'est pas sans 44 0022-5320/80/100044-20502.00/0 Copyright c~) 1980 by Academic Press, Inc. All rights of reproduction in any form reserved.

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l'euglbne. Ce feuillet interne, caractrris6 saire. Dans le cadre de cette hypoth~se, les par une densit6 particulaire 61evre, para~t prot6ines destin6es h &re import6es dans avoir un r61e privilrgi6 dans la sprcificit6 les organites cellulaires (chloroplastes et de la synthkse (Douce et Joyard, 1978) et mitochondries) pourraient ~tre synth6tis6es du transport de certaines molrcules (Heldt sur des ribosomes libres, puis reconna~tre et Rapley, 1970; Strotman et Berger, 1969; des r6cepteurs sp6cifiques sur les enveChua et Schmidt, 1979) et constituerait une loppes membranaires de ces organites qui membrane " a c t i v e " (Sprey et Laetsch, faciliteraient leur transport (Dobberstein et al., 1977; Ellis, 1977). 1976). Outre son rrle mrcanique dans le mainEn relation avec nos travaux sur la tien des enzymes solubles du stroma (cycle synthbse et le transfert de la petite sousde Benson Calvin), l'enveloppe contr61e les unit6 de la RubPcase/~ travers l'enveloppe mouvements des m&abolites entre le cy- des chloroplastes d'Euglena et d'6pinard toplasme et le chloroplaste. Elle intervient (Pineau et Douce, 1974; Pineau et al., dans le transport de nombreuses protrines 1979), nous avons 6t6 amen6s ~t tester ces chloroplastiques, codres sur le grnome nu- deux hypotheses et en particulier ~t d6terclraire et traduites sur les ribosomes cyto- miner si des ribosomes cytoplasmiques sont ou non associ6s ~t l'enveloppe des plasmiques. Deux hypotheses prrvalent pour expli- chloroplastes par cytologie conventionnelle quer le transfert des protrines h travers les et par cytoimmunofluorescence et ~t v6rifier membranes: (1) celle du "signal" de B16bel l'organisation structurale des membranes et Sabatini (1971) selon laquelle, les pro- limitantes des chloroplastes chez l'eugl~ne trines seraient synthrtisres sous forme de par la m6thode de cryofracture. prrcurseur dont l'extrrmit6 N terminal se Les observations en cryofracture sur des lierait h des rrcepteurs sprcifiques condui- cellules entibres apr~s cryofixation rapide sant ~ l'attachement des polysomes ~t la par des m6thodes de spray-freezing (Bachmembrane. I1 y aurait synth~se et transfert mann et Schmitt, 1971; Bachmann et al., simultanrs. Dans le cas des chloroplastes, 1972) et de sandwich-freezing (Gulik-Krzyselon cette hypoth~se, il devrait y avoir as- wicki et Costello, 1977), ont permis de clasociation entre certains ribosomes cyto- rifler et de compl6ter les notions acquises plasmiques et l'enveloppe externe du chlo- sur l ' o r g a n i s a t i o n des m e m b r a n e s de roplaste et un transfert accompagnant la l'enveloppe du chloroplaste de l'eugl~ne. synth~se; ce qui a 6t6 sugg~r6 mais non en- Elles drmontrent clairement l'existence, core drmontr6 dans certains cas (Stocking autour de l'enveloppe, d'un troisi~me feuilet al., 1978) et infirm6 dans d'autres cas let cytoplasmique dont nous proposons (Chepko et al., 1979); (2) celle du "trans- l'origine ergastoplasmique. porteur sprcifique" capable de reconnaitre Cette 6tude apporte au probl~me du une protrine sous sa forme de prrcurseur transfert des protrines ou de leurs prrcuret d'effectuer sa maturation, puis d'assurer seurs, dans le chloroplaste, des vues nouson transport ~t travers la membrane. Cette velles sur les mrcanismes qui pourraient inhypoth~se a 6t6 avanc6e pour la p6n6tra- tervenir chez l'eugl~ne par comparaison tion de certaines toxines bact6- avec ceux rencontr6s chez d'autres orgariennes (toxine dipht6rique) ~t travers la nismes. membrane plasmique (Pappenheimer et Gill, 1973; Boquet et al., 1976; Neville et MATERIELS ET TECHNIQUES Chang, 1978). Selon ce m6canisme, la l. Extraction des chloroplastes pour synth~se et le transport sont ind6pendants. dtude en cryoddcapage Une relation entre la membrane et des riLes cellules d'Euglena gracilis Z, (souche 1224-5 D bosomes cytoplasmiques n'est pas n6ces- Cambridge) sont cultivees sur milieu avec glutamate-

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malate (Greenblatt et Schiff, 1959) sous un 6clairage continu de 2000 lx. Des cultures ont aussi 6t6 utilis6es en cours de verdissements effectu6s sur "resting-medium" (Stern et al., 1964), soit pendant 72 hr en lumitre continue, suit en lumi6re intermittente h raison de 400 6clairs de 15 sec s6par6s par 15 rain d'obscurit6 (Dubertret et Lefort-Tran, 1978). Les chloroplastes sont obtenus, par centrifugation diff6rentielle apr6s broyage des cellules ~t la presse de French ~t 2000 psi dans un tampon tricine 0,05 M pH 7,6 additionn6 de 0,2 h 0,4 M de saccharose et de 10 mM NaCI (m6thode 1). Les cellules d'eugl~nes sont: (a) soit trait6es selon les m6thodes de cong61ation rapide dites "spray-freezing" et "sandwich-freezing"; (b) soit trait6es selon la m6thode " c o n v e n t i o n n e l l e " (Lefort-Tran et al., 1980). Les chloroplastes extraits sont soit: (a) congel6s directement par cong61ation rapide, (b) suspendus dans le tampon d'extraction sans saccharose additionnb de glyc6rol, ou fix6s pr6alablement dans le tampon d'extraction additionn6 de I% de glutarald6hyde, puis apr6s lavage, remis en suspension darts le m~me tampon sans saccharose avec glyc6rol. Darts ces deux cas, le culot de chloroplastes est trait6 selon la m6thode "conventionnelle." Les cryofractures sont r6alis6es avec un appareil Balzers BA 360 M h -100°C, avec ou sans sublimation selon le traitement pr6alable au glyc6rol. Les r6pliques sont observ6es au microscope 61ectronique (Hitachi HU 12 A). Les comptages de particules par unit6 de surface membranaire sont effectu6s h l'aide d'un analyseur d'image Kontron MOP AM 02 sur les micrographies (grandissement final /> 100 000). 2. Extraction de chloroplastes pour dtude ultrastructurale sur coupes ultra fines Les cellules, cultiv6es sur milieu mixotrophe avec glutamate-malate sont broy6es selon la m6thode de Salisbury et al. (1975) darts un tampon 16g6rement modifi6, compos6 de saccharose 150 raM, sorbitol 150 raM, Ficoll (P/V) 1%, NaC1 15 raM, H6pbs-NaOH pH 6,8 5 mM, BSA (P/V) 1%, fl-mercapto6thanol 5 mM. (m6thode 2). Apr6s centrifugation diff6rentielle, les chloroplastes sont purifi6s par flottaison selon Eisenstadt et Brawerman (1967). La fraction du gradient renfermant les chloroplastes purifi6s est trait6e selon la m6thode "conventionnelle" ant6rieurement d6crite (Lefort-Tran et al., 1980). 3. Immunocytologie 3.1. Preparation des anticorps Les lign6es sauvage et mutante (W3 BUL) d'Euglena ont 6t6 utilis6es, les premieres cultiv6es la lumibre sur milieu NC (Freyssinet et al., 1972), d6-

ficient en vitamine B~2 et les secondes sur milieu de Hutner (Greenblatt et Schiff, 1959). Les chloroplastes sont extraits et purifi6s selon Salisbury et al. (1975). Les ribosomes cytoplasmiques et leurs sous-unit6s, apr~s extraction selon la m6thode de Freyssinet et Schiff (1974), sont purifi6s sur gradient de saccharose 10 ~ 45% (Freyssinet, 1977). Les s6rums anti-prot6ines ribosomales sont pr6par6s selon la m6thode d6ja d6crite (Freyssinet et al., 1976). Le taux de r6action crois6e primitivement observ6 a 6t6 61imin6 par 6puisement du s6rum anti 89 S par des protNnes ribosomales chloroplastiques. 3.2. Extraction des chloroplastes Euglena gracilis Z e s t cultiv6e sur milieu NC d6ficient en vitamine B~ (Freyssinet et al., 1972). Les chloroplastes sont extraits selon la m6thode de Salisbury et al. (1975), et sont lav6s une fois avant de proc6der aux exp6riences d'immunofluorescence, dans le milieu d'isolement: saccharose 150 raM, sorbitol 150 raM, Ficoll (P/V) 2,5%, Mg ac6tate I raM, H6p~sNaOH pH 7,6 5 raM, BSA (P/V) 0,1%, fi-mercapto6thanol 14 raM, spermidine 0,5 mM (m6thode 3). 3.3. Immunofluorescence Le sdrum immun anti 89 S e t le s6rum t6moin non immun sont test6s pour des concentrations de 1/16 1/2 contre une fraction aliquote de suspension chloroplastique connue dont la teneur en chlorophylle est de 0,176 mg/ml. Les globulines de mouton antiglobulines de lapin marqu6es g l'isothiocyanate de fluoresc6ine (Pasteur 74561) sont utilis6es comme marqueur fluorescent. Les observations sont effectu6es sur un microscope Leitz Ortholux-Orthomat 6quip6 d'un boitier d'6clairage 250 avec lampe /~ vapeur de mercure haute pression. RESULTATS 1. E n v e l o p p e s c h l o r o p l a s t i q u e s o b s e r v d e s d a n s les cellules entidres A i n s i q u ' i l a d6j~ 6t6 o b s e r v 6 ( G i b b s , 1962, 1970; D o d g e , 1973), les c h l o r o p l a s t e s d'Euglena poss~dent, ext~rieurement au double feuillet constituant Fenveloppe de l'organite, un troisi~me feuillet p6richloroplastique (fp), qui cerne ~troitement l ' e n s e m b l e et a p p a r a f t s o u v e n t e n j u x t a p o s i t i o n a v e c la p r e m i e r e m e m b r a n e e x t e r n e a v e c l a q u e l l e il p o s s ~ d e d e n o m b r e u x p o i n t s d e c o n t a c t s ( F i g s . 1 e t 2). L e c o n tact entre ces feuillets paralt d'autant plus g r a n d q u e le c h l o r o p l a s t e e s t p l u s d i f f e r e n c i 6 ( F i g s . 1 e t 2) p a r c o m p a r a i s o n a v e c

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ENVELOPPES CHLOROPLASTIQUES D'EUGLENA TABLEAU I TYPES DE MODALITI~SCOMPARI~ES

Cultures Modalit6s I

II III IV V VI

Milieu RM RM RM RM GM GM

Lumi~re

Origine Cellules

INT CONT INT INT V V

Traitement

Cong61ation

Chl. isol6s

Gluta.

Glyc6rol

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Spray ou sandwich

Convent.

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Note. RM, Resting medium; GM, glutamate-malate; INT, verdissement sous lumibre intermittente (400 6clairs, 15 sec de lumi~re s6par6es par 15 rain d'obscurit6); CONT, verdissement sous lumi6re continue (72 hr); V, culture verte; CONVENT, cong61ationlente en goutte avec ou sans pr6fixation ald6hydique. un fragment de jeune plaste au d6but du verdissement (Fig. 3) off les trois feuillets de l'enveloppe apparaissent plus distinctement. A ce stade pr6coce, les i-ibosomes cytoplasmiques paraissent en contiguit6 avec le feuillet externe sans qu'il soit possible d'affirmer qu'il s'agit d ' u n e liaison sp6cifique (Fig. 3), il en est de m~me, bien que moins fr6quemment, pour les stades plus avanc6s du d6veloppement du chloroplaste (Fig. 2). Les ribosomes cytoplasmiques, qui se distinguent bien des ribosomes chloroplastiques par leur taille, s'observent parfois sur des c o u p e s tangentielles f a v o r a b l e s quand la section est rest6e parall~le au feuillet (r, Fig. 4).

2. Enveloppes chloroplastiques observ~es sur chloroplastes isolds 2.1. Expdriences de caractdrisation de ribosomes cytoplasmiques sur les enveloppes externes des chloroplastes isolds d' Euglena gracilis Les chloroplastes d'Euglena extraits selon la m6thode (2) d6crite dans le chapitre (Mat6riel et Techniques), pr6par6s selon la m6thode classique pour l'6tude en sections fournissent des images off l'int6grit6 des enveloppes est pr6serv6e, m~me si un gonftement osmotique est observ6. Dans ces conditions, une frange plus ou moins continue de structures particulaires contrast6es est pr6sente (Fig. 5).

Afin de d6terminer s'il s'agit de ribosomes cytoplasmiques, nous avons effectu6 des exp6riences en immunofluorescence.

2.2. Experiences de cytoirnmunofluorescence sur des chloroplastes isolds d' Euglena Les exp6rimentations ont 6t6 r6alis6es selon la m 6 t h o d e du double marquage avec du s6rum de mouton antiglobuline de lapin marqu6 ~ l'isothiocyanate de fluoresc6ine. Les chloroplastes, extraits et purifi6s selon la m6thode (3) sont laiss6s en contact avec des concentrations d6croissantes d'anticorps (1/2 ~ 1/16). Les t6moins habituels sont pr6par6s. L a comparaison des figures 6a et b respectivement pour des chloroplastes isol6s, mis en contact avec du s6rum antiprot6ines ribosomales (a) et du s6rum non immun (b) pour la m~me concentration de 1/8e, semble permettre de conclure ~ une r6activit6 des structures particulaires associ6es aux enveloppes d'Euglena vis-a-vis des s6rums antiprot6ines ribosomales cytoplasmiques 89 S.

3. Cryofracture 3.1. Cryofixation (Spray freezing et sandwich freezing) (Traitement V, tableaux I et II) 3.1.1. Sur cellules entikres Faces convexes. Les fractures des envel-

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Fio. 6. Cytoimrnufluorescence de chloroplastes isol6s d'eugl~ne. (a) S~rum irnmun antiprot~ines ribosomales 89 S. (b) Serum non imrnun. × 800.

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FIG. 7. (a) Sch6ma des faces fractur6es des trois membranes constituant l'enveloppe des chloroplastes de l'eugl&m. En adoptant la nomenclature de Branton et al. (1975) les faces compl6rnentaires EF2 et PF2 correspondent au feuillet interne; EF1 et PF1 au feuillet interm6diaire; PF et EF au feuillet externe. (b) Interprdtation de la membrane p6richloroplastique consid6r~e soit cornme un feuillet ergastoplasrnique (ER) ou une membrane vacuolaire (V); la face PF, la plus riche en particules, est proche du cytoplasme (CY) et porte 6ventuellement des ribosomes (r). (c) Membrane p6richloroplastique interpr6t6e cornme une membrane plasmique (MP) qui ne porte pas de ribosomes. La face convexe, la plus proche du cytoplasme du symbionte (CY) serait de type PF et serait pauvre en particules.

FIGS. 1-19. CHL, Chloroplaste; CY, cytoplasme; MI, mitochondrie; PEL, pellicule; PL, plastejeune; THY, thylacoides; fp, feuillet p6richloroplastique; r, ribosome. FIGS. 1 ET 2. Coupes de chloroplastes diff6renci6s dans une cellule d'eugl~ne en milieu mixotrophe. Fig. 1. Remarquer le cerne dense a la p6riph6rie correspondant h u n d6p6t de compos6s lipophiles (fl6ches) au niveau de l'enveloppe. Encercl6e, une zone off se distinguent les trois feuillets de l'enveloppe. × 27 000. Fig. 2. Le decollement des feuillets de l'enveloppe laisse apparaitre sa triple structure tandis que le d6pft dense parait se faire entre les 2 feuillets chloroplastiques internes. × 33 700. FIG. 3. Jeune plaste avec une triple enveloppe. Rernarquer les ribosomes (r) en 6troite association avec la membrane externe. × 60 000. FIG. 4. Coupe tangentielle ~t l'enveloppe laissant voir les ribosomes cytoplasrniques (r) en superposition avec le chloroplaste (fl6ches). × 75 000. Fro. 5. Chloroplaste isol6 avec l'enveloppe intacte et une flange de particules contrast6es (fl~ches). × 19 400.

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FIa. 9. Faces convexes. Chloroplaste permettant de voir successivement la face EF du feuillet "p6richloroplastique," la face EF1 et la face PFz du feuillet interne, x 33 700. FIG. 10. Faces concaves. La face PF~ compl6mentaire de EF1 est 6galement lisse. La face PF poss6de une densit6 particulaire sup6rieure fi celle de la face compl6mentaire EF (Fig. 9). x 30 000.

oppes des chloropiastes dans ies cellules d'eugl~nes r6v~lent six types de surfaces complementaires (Sch6ma, Fig. 7a).

Lorsque la fracture d6couvre des faces convexes (Figs. 8 et 9), il est g6n~ralement possible de discerner de l'int6rieur vers

FIGS, 8-11. Chloroplastes in situ. FIG. 12. Chloroplaste isol6. Cryofixation rapide. FIG. 8. Faces convexes. EF, lis6r6 du feuillet "p6richloroplastique"; EF1, feuillet interm6diaire presque lisse saul pr6sence de petites structures allong6es (fl~ches); PF2, petites fen6tres laissant voir la face riche en particules. × 33 700.

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l'ext6rieur, trois types de surfaces: la plus interne PF2 qui n'apparaR souvent que sous forme d'6chancrures (PF2, Figs. 8 et 9) est riche (2246 _+ 89 au /xm2) en particules de taille m o y e n n e de 9 nm. L a recouvrant, apparait la surface convexe EF~ qui corresp o n d ~ la d e m i m e m b r a n e e x t e r n e de l ' e n v e l o p p e p r e s q u e enti6rement lisse ~t l'exception de trbs rares particules regroup6es ou align6es (fl~ches, Fig. 8) (15 particules au/zm2). Enfin, sur des fractures favorables (Fig. 9), il est possible d'apercevoir une derni~re face E F pourvue d'une population de 455 _+ 40 particules au /xm2 qui n'apparait sur la figure 8 que sous forme d'un fin liser6 et constitue le troisi~me feuillet de l ' e n v e l o p p e des c h l o r o p l a s t e s d'Euglena qui n'avait encore jamais pu 6tre mis en 6vidence par cryod6capage et qui est absent autour des chloroplastes des plantes sup6rieures. Faces concaves. Les figures suivantes (Figs. 10-12), sont des fractures compl6mentaires concaves. Sur la figure 10, nous d6couvrons la face PF1 compl6mentaire de EF~ (Fig. 9) presque aussi lisse que la pr6c6dente puisque dans le meilleur des cas, nous d6nombrons environ une centaine de particules au/xm 2 (tableau II); sous celle-ci, de larges fen6tres laissent appara~tre dans la figure 10, une face particulaire PF avec 1480 + 340 particules a u / x m 2. L a figure 11 p e r m e t de c o m p r e n d r e l'organisation des feuillets de l'enveloppe quand ils se pr6sentent sous un aspect convexe ou concave. On peut distinguer autour du r6seau des thylacoides (THY), la face concave plus ou moins lisse PFt bord6e par un feuillet externe dont on aper~oit la face PF; sur PF1 persistent quelques lambeaux de E F 2, t a n d i s que du c6t6 c o n v e x e , s'observent, en partant de l'ext6rieur: la face E F particulaire, la face EF1 plus ou moins lisse, enfin la frange de la membrane la plus interne, PFz.

3.1.2. Sur chloroplastes isolgs (Modalitds VI, tableaux I e t II). Lorsque les chloroplastes sont extraits selon la m6thode (1) et

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trait6s par cryofixation rapide, les r6sultats sont comparables ~t ceux de la planche pr6c6dente h ceci pros que (a) le feuillet externe, quand il existe, ne se distingue que par un fin liser6 (PF, Fig. 12) sans que nous ayons pu obtenir une surface observable; (b) que les faces d6couvertes du feuillet interm6diaire, bien que pauvres en particules comme sur les chloroplastes des ceUules entibres ne sont pas tout-h-fait lisses: elles atteignent des densit6s de 50 ~t 125 particules a u / z m 2 pour la face EF1 et de 160 + 70 pour la face PF1; en outre, des structures a l l o n g 6 e s , f o r m 6 e s de p a r t i c u l e s align6es, se retrouvent sur cette face rappelant celles observ6es sur la face EF1 (Fig. 8). Sur les fragments du feuillet membranaire interne EF2 restant adh6rents sur PF~ (Fig. 12), il est possible de d6nombrer jusqu'~t 1000 particules a u / x m z (tableau II).

3.2. Mgthode conventionnelle (glycdrol + glutaralddhyde) 3.2.1. Sur chloroplastes isol~s (ModalitO I, tableaux I e t II). Les figures 13, 14 regroupent les images obtenues sur des chloroplastes isol6s d'eugl~nes verdies sous un r6gime de 400 flashes en resting-medium (voir techniques). La m6thode d'extraction permet de garder les trois feuillets que nous avons pr6c6demment mis en 6vidence. L e plus e x t e r n e (Fig. 13) n ' a p p a r a i t q u ' e n fracture transversale sans que ses surfaces internes soient r6v616es. I1 semble avoir de nombreux points de contact avec le feuillet interm6diaire (fl6ches). Lorsque les fractures sont convexes, sur la face EF1 la densit6 des particules atteint environ 500. L a pr6sence de petites zones d'exclusion (z), d 6 p o u r v u e s de particules, p e u t f a u s s e r l'appr6ciation de la densit6. L a face PF2 du feuillet le plus interne poss~de aussi de larges z o n e s d ' e x c l u s i o n r e c o u v e r t e s , comme dans la figure 13, d'art6facts de condensation qui ne doivent pas 6tre confondus avec des particules intramembranaires. L a densit6 des particules de cette face PF2 est de 1250 + 109 par ~m z. Sur la face con-

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c a v e c o m p l 6 m e n t a i r e EF.~ (Fig. 14) la densit6 des p a r t i c u l e s varie de 1000 h 1300 au /xm 2. D a n s c e r t a i n s cas, la f r a c t u r e d6c o u v r e s u r EF2 de larges z o n e s d ' e x c l u s i o n ( n o n visibles s u r la Fig. 14). L a face cryof r a c t u r 6 e P F , est c a r a c t 6 r i s 6 e p a r de n o m b r e u s e s p u s t u l e s (art6facts ou p a r t i c u l e s real d6gag6es?) et des crat6res, tandis que la d e n s i t 6 des p a r t i c u l e s c a r a c t 6 r i s t i q u e s n ' e x c b d e pas 100 a u / z m 2. 3.2.2. Sur cellules entikres. L a c o m p a r a i s o n des p r 6 p a r a t i o n s fix6es o b t e n u e s a v e c des cellules enti6res d ' u n e p a r t (Modalit6 III), et a v e c des c h l o r o p l a s t e s isol6s (Modalit6 I) d ' a u t r e p a r t , m o n t r e q u e seule cette d e r n i ~ r e m o d a l i t 6 p e r m e t de r6v~ler le feuillet e x t e r n e p 6 r i c h l o r o p l a s t i q u e qui, trop i m b r i q u 6 a v e c la m e m b r a n e e x t e r n e de l ' e n v e l o p p e E F t , appara~t mal sur les cellules enti6res (Fig. 15). L e feuillet le plus interne PF2, lui-m6me, n'est d6couvert q u ' e n des z o n e s r 6 d u i t e s (d61imit6es sur la m i c r o g r a p h i e p a r u n pointill6) c o m m e si les deux m e m b r a n e s , trop accol6es l ' u n e l ' a u t r e , n e p e r m e t t a i e n t pas ~t la f r a c t u r e

d ' i n t e r v e n i r sur une grande surface. La densit6 est de 1830 p a r t i c u l e s a u / ~ m " .

3.3. MOthode de congdlation sans prOfixation alddhydique + glycdrol sur chloroplastes isolds (Modalitds H et IV, tableaux I e t I1) S u r des p r 6 p a r a t i o n s de c h l o r o p l a s t e s isol6s qui o n t subi l ' i n f i l t r a t i o n au glyc6rol sans pr6fixation a l d d h y d i q u e ( M o d a l i t e s II et IV), les m 6 m e s z o n e s d ' e x c l u s i o n (z) (Fig. 16) se r e t r o u v e n t s u r les faces c o m p l 6 m e n t a i r e s PF2 et EF2 qui p o s s 6 d e n t resp e c t i v e m e n t (IV) 1718 _+ 118 et 1034 __+ 270 p a r t i c u l e s a u / z m 2. S u r la face PF2 (Fig. 16), les z o n e s d ' e x c l u s i o n s o n t a c c o m p a g n 6 e s de r6gions de r e g r o u p e m e n t de p a r t i c u l e s de m 6 m e taille qui p e u v e n t parfois 6tre align6es (fl6ches, Fig. 16). Ces m o d i f i c a t i o n s de la r 6 p a r t i t i o n p a r t i c u l a i r e s e m b l e n t d o n c i n d u i t e s p a r le seul t r a i t e m e n t au glyc6rol. P a r ailleurs les tailles des p a r t i c u l e s de cette face p r 6 s e n t e n t u n e tr6s g r a n d e h6t6rog~n6it6 (de 7,5 ~t 17,5 nm). L e s d e u x faces c o m p l 6 m e n t a i r e s EF~ et PF1 d u f e u i l l e t

FIG. 11. La fracture favorable d6couvre simultan6ment les faces convexes EF et EF1 et trois faces concaves: PF, PF, et de petits fragments de EF 2. x 33 700. FJG. 12. Faces concaves. Sur la face tr~s lisse PF1, se d&achent des ~lots de la face EFt. PF, liser6 correspondant au feuillet "p6richloroplastique." x 40 500 FIGS. 13-15. Pr6fixation ald6hydique + glyc6rol, cong61ationlente. Verdissement sous 400 6clairs. FIGS. 13 et 14. Chloroplastes isol6s. Fic. 13. Faces convexes. Les 3 feuillets sont nettement visibles. Le plus externe paralt avoir des points de contact (fl6ches) avec le feuillet interm6diaire dont la fracture d6couvre la face EF, qui poss~de de petites zones d'exclusion (z); la face PF2 est fiche en particules et comprend des zones d'exclusion (z) recouvertes &artefacts de condensation, x 54 000. FIG. 14. Faces concaves. La face PF, apparait toujours moins riche en particules que la face EF2 du feuillet le plus interne, mais cependant moins lisse qu'avec les m6thodes de cong61ation rapide (Fig. 12). x 40 500. FIG. 15. Chloroplaste in situ. Les deux feuillets internes sont 6troitement imbriqu6s. La face EF~ laisse apercevoir en des zones irr6guli~res (soolign6es par un pointill6), la face particulaire PF2. Le feuillet p6richloroplastique n'est pas d6celable, x 54 000. FIGS. 16-18. Cong61ationlente, infiltration au glyc6rol sans prefixation ald6hydique. Chloroplastes isol6s. FIG. 16. Faces convexes: EFt, persistante en quelques flots, et PF2 avec regroupement organis6 de particules (fl~ches) (Modalit~ IV). z, zone d'exclusion sur PF.,. x 48 600, FIG. 17. Faces convexes: EF avec des particules de 12 nm; EF, lisse h l'exclusion de zones de particules regroup6es (flBches); PFz pourvue d'une population dense de petites particules (8 nm). x 48 600. FI6. 18. Faces concaves. Le feuillet "p6richloroplastique" apparait en coupe (fp) et sa face est fracturee sur une faible surface (PF). Sur le fond lisse de PF~ s'observent des structures allong6es (fl~ches). EF._,est moins fiche en particules que PF2. x 48 600. FIG. 19. La face concave PF, comporte des zones organis~es d'empreintes (fl6ches) qui correspondent aux zones de particules de la face EF,. x 67 500.

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moyen (Figs. 17 et 18) apparaissent, comme dans les traitements prOcOdents, pauvres en particules n'excOdant pas la centaine au /zm 2 (tableau II). Sur certains clichOs les faces EF1 et PF~ prOsentent, sur un fond homogOne, des zones isolOes complOmentaires de particules ou d'empreintes organis6es (flOches, Figs. 17 et 19). Le feuillet externe pOrichloroplastique est r4v616 par la face cryofractur6e E F sur laquelle est d~nombr6e 410 particules au /zm z ce qui est du m6me ordre de grandeur que pour les autres traitements (tableau II). La face PF compl6mentaire (Fig. 18) ne s'observe jamais sur une grande surface. I1 est h remarquer sur la figure 17, l'importance de la taille de la population de particules du feuillet E F (12 nm environ) par rapport h celle, moiti4 moindre, des particules de la face PF.,. DISCUSSION Dans le tableau I, sont indiqu6es les diff~rentes modalit6s d'origine et de pr6paration des chloroplastes d'eugl6ne 6tudi6es. Dans le tableau II sont regroup6es les donn6es quantitatives obtenues pour chacune de ces modalit6s. I1 est donc possible de comparer (a) l'influence du type de verdissernent, (b) celle de l'isolement des chloroplastes, (c) le rSle des traitements (fixation et rapidit6 de cong41ation), sur l'organisation des enveloppes de chloroplastes d'eugl6nes.

1. ROle des diffgrentes modalitds 1.1. Type de verdissernent Deux fractions de chloroplastes isol6s ont subi la m~me mOthodologie de pr6paration et de cryofracture (IV) et (II) (tableaux I e t II) mais les premiers sont extraits de cellules soumises ~t 400 6clairs tandis que les seconds (II) ont verdi sous lumi~re continue. Les rOsultats ne montrent pas de diffOrence significative ni pour le hombre de particules darts la membrane la plus interne (PF.~ + EF2 = 2752 + 388) pour (IV) et 3046 + 37 pour (II), non plus

que pour le coefficient de partition (K, = nombre particules PF/nombre particules EF) qui reste 6gal ou supOrieur h 1. I1 en est de m~me pour la membrane interne (PF1 + E G ) off le nombre de particules reste voisin de 220. Le mode de verdissem e n t p a r a i t sans effet, au n i v e a u d'observation auquel nous accbdons par cryofracture, sur l'architecture membranaire des deux feuillets de l'enveloppe du chloroplaste alors qu'il modifie profondOment la taille des particules dans les thylacoides et le mode d'organisation de ces thylacoi'des entre eux (Dubertret et LefortTran, 1978; Dubertret, 1979).

1.2. Type de chloroplastes Avec la m6thode conventionnelle appliqu~e ~t des cellules enti~res (III), les deux feuillets internes de l'enveloppe sont si imbriquOs l'un dans l'autre que les fractures apparaissent rarement. Ce sont ces conditions qui n'avaient permis ~t Miller et Staehelin (1973), que de d6crire le feuillet le plus interne (PF2 + EF2). I1 semble donc que pour permettre l ' o b s e r v a t i o n des diffOrentes membranes de l'enveloppe, il faille de prOfOrence utiliser des chloroplastes isol6s (I), h moins d'utiliser les mOtbodes de cryofixation rapide indiffOremment sur des ceUules entibres ou sur des chloroplastes isolOs (V et VI).

1.3. Influences respectives du glutaralddhyde et du glycdrol et de la rapiditd de cong~lation Les deux couples de comparaisons suivantes permettent d'analyser l'influence de la fixation aldOhydique et/ou du glycOrol: (I) (gluta. + glyc6rol) et (IV) (glycOrol seul) sur chloroplastes isol6s h partir d'une culture verdie en resting medium. Les faces PFz et EFz prOsentent les m~mes zones d'exclusion d6pourvues de particules qu'il y ait eu ou non pr4fixation, celles-ci ne se retrouvent jamais sur les rOpliques obtenues h partir de cryofixation rapide ( V e t VI). Nous en concluons que, seul, le glyc6rol est susceptible d'induire ces regroupe-

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ments de particules que nous consid6rons comme art&actuels. Ces observations sont en accord avec celles faites par Plattner (1970, 1971, 1978; Plattner et al., 1973) et par McIntyre et al. (1974) sur des membranes d'origine biologique diff6rente. Nous noterons que (PF2 + EF2) semblent totaliser moins de particules quand le glycfirol et le glutarald6hyde sont utilis6s conjointement (2267 _+ 389) que lorsque le glyc6rol est seul pr6sent dans la pr6paration, il pourrait donc y avoir une influence d6sorganisatrice du glutarald6hyde sur les particules elles-m~mes que nous avons d6jh not6e sur d'autres membranes (Lefort-Tran et al., 1978). Si nous comparons les r6sultats obtenus par la " m 6 t h o d e c o n v e n t i o n n e l l e " en goutte avec ou sans pr6fixation ald6hydique mais avec glyc6rol, ~ la m6thode de cryofixation, nous constatons que si la densit6 particulaire de la membrane chloroplastique interne (PF2 + EFz) est en moyenne du m~me ordre de grandeur (2600 _+ 250 particules//xm2) la r~partition entre les deux h6mifaces est diff6rente: tandis qu'elle est peu pros 6quivalente par la m6thode conventionnelle, 1506 _+ 27 et 1540 + 10 respectivement pour EFz et PF2, il y a un arrachement pr6f6rentiel des particules sur la face PF 2, respectivement 2250 et 1718 selon qu'il s'agit de chloroplastes "in situ" ou isol6s contre 230 et 1000 particules pour EFz, quand est utilis6e une cryofixation rapide. Le r61e du glutarald6hyde sur le coefficient du partition a 6t6 signal6 pour d'autres types membranaires (Lefort-Tran et al., 1978) et pourrait refl6ter des liaisons pr6f6rentielles d'un certain type de particules avec l'un ou l'autre demi feuillet ou une extension diff6rente de la prot6ine dans l'6paisseur de la membrane. Nous avons la conviction, /a l'observation de nombreuses images, que dans les donn6es fournies sur l'eugl~ne par Miller et Staehelin (1973) une inversion a dfi intervenir entre les faces PFz et EF.~ (voir tableau II) car la face PF~ reste toujours la plus fiche en particules ainsi que le d6montrent aussi les observations de

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Sprey et Laetsch (1976) sur l'6pinard (1820 +_ 167 particules//~m2) (tableau II), et de Simpson (1978) sur l'orge. Le feuillet interm6diaire est particuli~rement pauvre en particules (EF1 + PF, 250) mais du marne ordre de grandeur que celui observ6 sur l'6pinard (tableau II). Cette pauvret~ en particules s'accompagne d'un rapport lipides/prot6ines 61ev6 tel que le r6v~lent les dosages globaux (1200 ~g/mg de proteines sur les enveloppes de chloroplastes d'6pinard, Douce et Joyard, 1978). Parmi ces lipides, les galactolipides sont les mieux repr6sent6s (700 /xg/mg de prot6ines). Le marquage par des anticorps antigalactosyldiglyc6rides (Billecocq, 1974) a permis de montrer chez l'6pinard que ces mol6cules sont uniform6ment distribuaes au niveau du feuillet externe, le p61e galactose orient6 vers l'ext6rieur. Ainsi, ce feuillet interm6diaire sans sp6cificit6 perm6able aux m6tabolites de faible poids mol~culaire apparait pauvre en prot6ines. Les rares particules observ6es pourraient repr6senter des prot6ines soit de transit soit enzymatiques impliqu6es dans la synth~se de certaines mol6cules sp6cifiques. Le feuillet interne au contraire, riche en particules de nature prot6ique est associ6 ~t l'existence d'au moins trois transporteurs sp6cifiques: celui du phosphate et de l'acide dicarboxylique (Heldt et Rapley, 1970) celui de I'ATP (Heldt, 1969; Strotman et Berger, 1969). I1 n'est pas inutile de remarquer, chez l'eugl~ne, l'existence fr~quente d'un d6p6t dense entre les deux feuillets chloroplastiques de l'enveloppe (Figs. 1 et 2) et de rapprocher cette observation du r61e conf6r6 ~ ces membranes dans la synth6se des galactolipides et des carot6no,des (Joyard et Douce, 1976). 2. Prdsence et signification de la membrane pdrichloroplastique chez Euglena

Chez les plantes sup6rieures, les algues vertes et rouges, le chloroplaste est entour6 d'un double feuillet membranaire dont l'6tude en cryod6capage n'a fait l'objet que

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d'un petit nombre de travaux, Bisalputra et Bailey sur Bangia (Rhodophycre) (1973); Miller et Staehelin sur Euglena (1973); Sprey et Laetsch sur l'rpinard (1976); Simpson sur l'orge (1978). Or, les Euglenophycae auxquelles appartient l'eugl~ne, partagent avec le groupe des Dinoflagel16es, la particularit6 de poss~der, outre ce double feuillet chloroplastique, un troisiSme feuillet externe que nous appellerons "p~richloroplastique" qui n'avait encore pas 6t6 6tudi6 par cryofracture. L'existence de ce feuillet supplrmentaire avait 6t6 notre sur coupes par Gibbs (1962, 1970), Dodge (1973), Buetow (1976) ainsi que par Taylor (1976). Plus rbcemment, Gibbs (1978) a repris cette ~tude et, s'appuyant sur des comparaisons avec les autres groupes d'algues, propose l'hypoth~se d'une origine endosymbiotique des chloroplastes d'Euglena. Le 36me feuillet reprrsenterait le plasmalemme du symbionte. Si srduisante que soit cette hypoth~se, elle para~t trrs contestable. D'abord, parce que contrairement aux arguments donnrs par Gibbs (1978), de nombreux exemples de symbiose algale endocellulaire sont caractrrisrs par la prrsence d'une membrane vacuolaire d'origine ergastoplasmique. Tel est le cas de la membrane p6rialgale autour des chlorelles symbiotiques dans Paramecium bursaria off la chlorelle a gard6 sa paroi et sa membrane plasmique (Karakashian et al., 1968; Vivier et al., 1967) e t n o s observations personnelles non publires (1979). C'est aussi le cas autour des cyanelles du Glaucocystis nostochinearun (Lefort, 1965) off la cyanophycre originale a perdu sa paroi mais conserve sa membrane plasmique. De plus, il nous semble difficile, h la seule observation sur coupes de cette m e m b r a n e , d ' e n d r t e r m i n e r l'origine. La technique de cryofracture permet de montrerque ce feuillet perichloroplastique poss~de des densit6s particulaires nettement diffrrentes, tant du feuillet chloroplastique externe pratiquement lisse, que du feuillet interne. L'examen critique des faces cryofracturres apporte des informa-

tions nouvelles. Dans l ' h y p o t h 6 s e de Gibbs, selon laquelle la membrane prrichloroplastique chez l'euglrne reprrsenterait le vestige de la membrane plasmique de l'h6te, les surfaces cryofracturres PF et EF devraient respectivement correspondre aux faces convexe et concave de la membrane (voir schrma, Fig. 7c). La surface convexe supposre PF apparait alors toujours la plus pauvre en particules (410 h 430//~m2) tandis que la surface concave supposre EF est toujours beaucoup plus riche (1000 h 1480 particules au/~m2). Selon cette hypothrse, le coefficient de partition de cette membrane Kp = PF/EF serait alors < 1. Parmi toutes les membranes plasmiques &udires des protozoaires aux mammif~res, une valeur de K , < 1 pour une membrane plasmique est exceptionnelle (Dempsey et al., 1973; Lefort-Tran et al., 1978). La plupart ont des Kp qui varient entre 1 et 5 et peuvent atteindre des valeurs de 30 (Satir et Satir, 1974). Si au contraire, on admet que le chloroplaste de l'euglbne est entour6 par une membrane vacuolaire drrivre de l'ergastoplasme (Fig. 7b), la surface fractur6e convexe est une face exoplasmique EF tandis que l'autre demi-membrane concave, la plus proche du cytoplasme est une face PF. Nous retrouvons drs lors un coefficient de partition Kp = (1480 _+ 340)/(455 ___40) = - 3 , valeur qui se situe dans la limite des Kp connus. Ces observations tendraient h prouver que le feuillet prrichloroplastique aurait chez l'eugl~ne, une origine ergastoplasmique et ne serait pas un plasmalemme. Indrpendamment nous avons vu que, dans certaines prrparations "in situ," il 6tait possible d'observer sur coupes transversales et tangentielles des populations de ribosomes cytoplasmiques en 6troite relation avec le feuillet prrichloroplastique (Figs. 3 et 4). Par ailleurs, pour des conditions d'extraction m6nagres, nous r6ussissons h obtenir frrquemment, comme Font montr6 des clich6s de cryofracture, des chloroplastes avec le 36me feuillet. Sur ce feuillet il semble possible de stabiliser des

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Dans le cas des chloroplastes de l'eugl~ne, cette hypoth~se trouverait trois confirmations morphologiques--(1) les trois membranes de l'enveloppe du chloroplaste de l'eugl~ne sont tr~s souvent 6troitement imbriqu6es (Figs. 1-3) et ce n'est que dans des cas exceptionnels qu'elles sont ais6ment distinguables. On remarque, par ailleurs, sur la figure 13 des points de jonction entre le feuillet p6richloroplastique et la membrane interm6diaire saisis par la cong61ation et qui ne peuvent ~tre attribu6s ~t des art6facts de fixation--(2) les cryofractures pr6sentent fr6quemment des fen&res sur la membrane sous-jacente ou des ]lots (Fig. 12) comme s'il s'agissait de zones qui sont plus intimement soud6es et dont la fracture enl~ve le demi-feuillet int6rieur. Ces figures ont 6t~ ~galement observ6es ind6pendamment du type de fixation chimique ou cryog6nique. Elles se retrouvent aussi dans d'autres chloroplastes, plantes sup6rieures et algues (observations personnelles non publi6es)--(3) en liaison avec ces notations, l'existence dans le feuillet externe de zones organis6es qui apparaissent sur EF1, comme des particules, sur PF1 comme des empreintes (Fig. 19) et qui sont la premiere indication d'une sp6cificit6 de certaines r6gions de l'enveloppe dont le r61e fonctionnel reste ~t d6terminer. L'existence chez l'euglbne de quatre compartiments chloroplastiques (espace sous-p6richloroplastique, espace intermembranaire de l'enveloppe, matrix, lumen), ~t la diff6rence des chloroplastes de 3. Synth~se et transport des protdines plantes sup6rieures et des algues vertes qui d travers les enveloppes membranaires n'en poss~dent g6n~ralement que trois, des chloroplastes--cas de l'euglOne pose le probl6me de la signification de cette Dans le cas g6n6ral, les prot6ines chlo- organisation retrouv6e chez de nombreux roplastiques traduites sur des cytoribo- protistes. Ce particularisme ne doit pas somes (libres ou li6s) auraient ~t traverser faire oublier que la double enveloppe chlodeux membranes de l'enveloppe et de- roplastique de l'eugl~ne est conforme au vraient donc reconnaRre deux r6gions sp6- modble g6n6ral avec un feuillet interne cifiques. Chua et Schmidt (1979) sugg~rent riche en prot6ines et dou6 probablement de que ces deux r6gions soient restreintes ~t propri6t6s sp6cifiques de synth~se et de des zones o/1 les 2 membranes, exterue et transport m6taboliques tandis que le feuillet interne, entrent en contact et sont 6ven- externe fiche en lipides, fortement 61ectrotuellement capables de fusionner. n6gatif (Douce et Joyard, 1978; marquage

structures particulaires qui ressemblent par leur taille et leur contraste ~t des ribosomes cytoplasmiques (Fig. 5). Les tests d'immunocytologie, r6alis6s avec des s6rums antiprot6ines de la grande sous-unit6 ribosomale confirment leur sp6cificit6 cytoribosomale. Ces observations morphologiques et immunologiques sont en accord avec les notations de Freyssinet (1977) qui constate que darts les pr6parations de chloroplastes isol6s d'eugl~ne, il persiste des ribosomes m~me apr~s plusieurs lavages, capables par ailleurs d'61iminer les cytoribosomes libres. En particulier, des d&ergents comme le desoxycholate et le Triton X-100 ne r6ussissent pas ~t 61iminer la grande sous-unit6 cytoribosomale dos6e par le rapport des ARN 25 S/20 S (Freyssinet, observations non publi6es). Pas plus que dans le travail de Laulh6re et Dome (1977) nous ne pouvons d6cider s'il s'agit de ribosomes fonctionnellement attach6s ou de contaminants cytoplasmiques adsorb6s. M~me si la nature ergastoplasmique du feuillet p6richloroplastique est d6finitivement prouv6e, le r61e de cytoribosomes fonctionnellement li6s /~ cette membrane s'il existe, pourrait ~tre restreint ~t la synth~se des prot6ines de l'enveloppe. Ce feuillet suppl6mentaire pourrait m~me ne jouer qu'un r61e passif en diminuant la diffusion des prot6ines nouvellement synth6tis6es et destin6es au chloroplaste.

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/t la ferritine cationisGe, Lefort-Tran, observations non publiGes), n'est permGable qu'aux mGtabolites de faible poids molGculaire (Heldt et Rapley, 1970; Heldt et Sauer, 1971). S'il en est bien ainsi, les sites de reconnaissance, pour la p6nGtration des prot6ines spGcifiquement chloroplastiques, pourraient 6tre restreints aux zones de contact entre les deux membranes interne et externe que matGrialiseraient, sur le feuillet externe, les r6gions organisGes de particules ou d'empreintes. BIBLIOGRAPHIE BACHMANN, L., ET SCHMITT, W. W. (1971) Proc. Nat. Acad. Sci, USA 68, 2149-2162. BACItMANN, L., WERNER, W., SCHMITT, W. W., ET PLATTNER, H. (1972) in COSLETT,V. E. (Ed.), Proceedings, 5th European Regional Congress on Electron Microscopy, pp. 244-245, Inst. of Physics, London/Bristol. BILLECOCQ, A. (1974) Biochim. Biophys. Acta 352, 245-251. BISALPUTRA, T., ET BAILEY, A. (1973) Protoplasma 76, 443-454. BLGBEL, G., EX DOBBERSTEIN,B. (1975) J. Cell Biol. 67, 835-862. BLGBEL, G., ET SABATIN1, D. D. (1971) in MANSON, L. A. (Ed.), Biomembranes, Vol. 2, pp. 193-195, Plenum, New York. BOQUET, P. M., SILVERMAN, S., PAPPENHEIMER, A. M., JR., ET VERNON, W. B. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 44494453. BRANTON, D., BULLIVANT, S., GILULA, N. n., KARNOVSKY, M. J., MOOR, H., MI]HLETHALER,K., NORTHCOTE, D. H., PACKER, L., SATIR, P., SATIR, P., SPETH, V., STAEHELIN, L. A., STEERE, R. L., ET WEINSTEIN, R. S. (1975) Science, 190, 54-56. BUETOW, D. E. (1976) J. Protozool. 23 (1), 41-47. BUTOW, R. A., BENNET, W. F., FINKELSTEIN, D. B., ET KELLEMS, R. E. (1975) in TZAGALOFF, A. (Ed.), Membrane Biogenesis, pp. 155-199, Plenum, New York. CHEPKO, G., WEISTROP, J., ET MARGULIES, M. (1979) Protoplasma 100, 385-392. CHUA, S. H., ET SCHMIDT, G. W. (1978) in SIEGELMAY, H. W., ET HIND, G. (Eds.), Photosynthetic Carbon Assimilation, pp. 325-347, Plenum, New York. CHUA, N. H., ET SCHMIDT, G. W. (1979) J. CellBiol.

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