Studium der Diffusion im Knorpel mit der „PFG” (pulsed-field-gradient)-NMR-Technik

ORIGINALARBEIT

Studium der Diffusion im Knorpel mit der "PFG" (pulsed-field-gradient)-NMR-Technik L. Naji , R. Trampel, W. Ngwa, R. Knauss, J. Schiller und K. Arnold Institut fOr Medizinische Physik und Biophysik, Univsrs ltat Leipzig

Zusammenfassung

Das Fehlen WJI1 Blutgefdfl en im Knorp el macht die Diffu sion zum wichtigsten Transportmechanismus fu r die Versorgung des Knorp els. Obwohl unterschiedl iche Methoden Z1/r Messun g von Diffu sionsprozessen eingesettt werden kiinnen, beschriinken wir uns hier ausschliefilicli auf NMR-Methoden. Neben der .iklass ischen " Wasserdiffu sion werden auch die Diffusion von Ionen und die Polymerdiffusion in Knorp el beschrieben. In allen Fiillen gilt, daj3 tiber kurze Beoba chtun gszeiten das Diffusionsverhalt en im wesentlichen dutch den Wassergehalt bestimmt wird. Jedoch werd en durch Variation der Beoba chtun gszeit auch Information en iiber die innere Struktur des Knorpels erhalten. Es wird aufserdem darg elegt, inwi eweit die einze lnen Techniken Riickschliisse auf degenerative Gelenkv erdnderung en zulassen und wie sie unter ln-vivo-Bedingungen genutzt werden konnten. Sc hl usselwo rter: Knorpc l, PFG - MR , Polymerdiffusion. Behinderte Diffusion A bs tract

Since cartilage does not contain any blood vessels. diffu sion is the most important transport mechanism for its supply. Although several methods are available for the measurement of diffu sion, this study focuses exclusively on NMR methods. Besides the" classic " water diffu sion. the diffusion behaviour of ions and polymers in cartilage is also describ ed. In all cases, and at short obser vation times, diffusion is mostly determin ed by the water content oj the sample. However; the variation of the observation time allo ws to obtain information also on the internal structure oj cartilage. In addition. it is discuss ed to which extent the indi vidua l techniques allo w conclusions with respect to degenerati ve joint diseases, and under which in vivo conditions they can be applied. Keywords: Cartilage, PFG NMR, diffu sion of polymers, restricted diffusion

Einleitung KnorpeI ist ein kornplcxcs. hcicrogcn aufgebautes Gewebe aus Protcinen (hauptsachlich Co llagen Typ II) und sauren , Nacctylicrtcn Pol ysacchariden, dessen biomechan ische Eigen schafte n von groBer Bedeutung fur den Bewegungsapparat und den Formcrhalt von Geweben sind [ I]. Die innere Struktur de s Knorpels wird en tscheidend durch die Anordnung der CollagenmolekUle zu Collagenfibrillen bzw . Collagenfasem und der A usfUllung de s Ra umes zwische n den Collagenfibrillen durch die Proteogl ycan-Aggregate [2] be stimmt. Die physikochemi schen Eigenschaften die ser be iden Arten von mikroskopisc hen Kompartimenten

Z. Med. Phys. 11 (200 I) 179-186 © Urban & Fischer Verlag hllp:/lwww.urbanfischer.de/joumalslzmedphys

sind schr ver sc hiedcn, insbesondere in bezug auf den relati v nicdrigen Was sergehalt des Co llagens und den viet hoheren Ge halt der Proteoglycan-Aggregate. Knorpel enthalt keine Bl utg efalie zur Versorgung der Knorpelzellen mit Nahrstoffen , d. h., es handelt sich urn ein bradytrophes Gewebe [3]. Das hat zur Folge, daB die fur die Ze llernahrung und zur Synthesc der cinzelnen Knorpelbestandteile bc noiigtcn S ubstanzen nur durch Diffusion infolge Brownscher Molekularbewegung in den Knorpel gelangen konnen. Es wird auch angenommen, daB bei der Ent stehung von degenerativen Gelenkerkrankungen [4] Storungcn in den Transportcigcnschaften eine Rolle spielen. Die genauere Aufklarung dieser Zusarnmenhange erfordert jedoch urnfangrei-

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Studium de r Diffusion im Knorpsl mit der

. PFG" (pulsed-fieldilradicnt)·NM R-Technik

chere Einsichte n in di e biophysikalisch e n Eigensch aft en des Kno rpels, insb esondere in di e Zu sammcnhan ge zwisc he n inneren Strukturen und Tra ns po rtproz essen [3,5). In dieser A rbcit we rde n die auf de r Brownschen M oleku larbewegung beruhenden Selbstdiffusion skoeffi zicntcn von Wasser. lonen und Pol ymeren in zwei ve rsc hiede nen Knorpelarten (arti ku larer Schweineknorpel und nasaler Rinderknorpel) ge messen [ 1.6 1. W ahrend ar tikularer Sch weineknor pel in se ine r Funktio n wie auc h in sei ne r Zusam me nsetz ung mi t de m humane n Gelenkknorpcl fas t identisc h ist. untersc hei de t sic h nasaler Rin de rkn orpel in de r c hem isc he n Zusa m me nse tzu ng und St ruktur sig nifi ka nt. Dieser Vergleich so li dariiber A ufs chl uB ge be n, ob U nterschie de in der Knorpelstru ktur auc h Vera nde ru nge n im Diffusion sverhalten bedin gen . Ai s MeBm ethode w urde die PFG-NMR-Technik (pulse dfield g radient nuclear magn eti c resonance) (7) ge wa hlt, da sie weder radi oakti ve Marki erungen noch Kon zentrati on sg radi e nte n er fordert (8). Dariiber hin au s laBt sich die PFG- NMRMessung am Knorpel als nicht-in vas ives Verfahren nach hinrei ch e nd er Erprobung gegebene nfa lls auc h in de r klinisc he n Diagn ost ik ei nse tze n: Vorw ieg end am Hi m [9]. aber auc h zunchmen d am Knorp el [5.10- 12) wi rd heute bereits ve r tarkt m it diffusion sge wi chteter N M R- Bi ldgebung gcar beitet, wobei im Kno rpe l di e Anderungen des Wassergeh altes bei Kornpression svorgan gcn und Abbauprozesse bei rheumati schen Erkran kungen eine besonders hoh e Rc lcv anz besit zen (4). Fiir aile dargestellte n Untersuc hunge n wurde Knorpelmateri al benutzt, das Schl achttier en unm ittelbar nach der T otun g en tnom me n wurde . ln folge der Abhangigkcit de r Di ffu sion seigenschaften im Knorpel vom Wassergeh alt m uB siche rgestellt werden , daB die Unters uc hungen unte r defi nie rte n, reprodu zierbaren Bed ingungen d urc hgefuhrt we rde n [5). Dariiber hinaus so il auch die Komprcssibilitat des Knorpel s, di e im Zusamme nhang mil me ch an isch er Bel astung des Gelenks vo n Interesse ist, ex perime nte ll unt ersu cht werden kon nen. Diese Forderungen werden vo n der osmotischen St reBtechnik [5.13) erfullt, di e inz w isc hen zu einer e tablierte n Methode e ntwickelt worde n ist. e be n de r Wasser-S elbstdiffu sion werden in der vo rliegende n Ar bei t auc h da. Scl bstdiffus ionsverha lten vo n Polymer en und lo nen im Knorpel untersuc ht. Hier sollen die ci nzel ne n Bewegungsch arakteristika ermittelt und auBerde m ge pruft wc rde n, ob di e Fes tlad unge n an de n Kno rpelkomponen ten zu sig nifi ka nte n Verandcru nge n des Diffu sion sverhal ten s vo n ge lad ene n MolekiiIen und lon en in der Knorpelmatrix filhr en . Es wurde we iterhin die Sch ad igung de s Knorpclge webes, wie sie im Verlauf rheumatisch bedingt er Gelenkerkrankunge n e ntstehe n kann [4], in Anlehnung an die Vorgehen sweise ande rer A uto ren ( 14) du rch enzy ma tisc he Beh andlung in vitro induziert, urn die Au sw irkung gezielte r Sch adigungen auf das Diffu sion sver halt en zu unt er su ch en . Es wird gezeigt wc rdc n, daB die Selbstdi ffusion der Molekul e und lon en wie erwartet sta rk vo m Wassergeh alt und

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vo n de r Kompart irnen tierun g bestirnmt wird. Die tran slatorisc he Be wegl ichkeit des Wasser s als Medium fur aile in ihm ge losten Sto ffe ste llt so m it ei ne obere Abschatzung der unter den jeweiligen Bedingungen im Knorpel moglichen Tr an sportprozesse dar [ 1,3).

Material und Methoden a ) Chemikalicn A ile C hemi kal ien zur Prob e np raparation sowie als .Di ffu sionssonden" ( aC I, CaCI 2, und Po lyethylcn glycol [PEG) unt er schiedlich er Mol ekulargew ichte sowie Tet ram eth yl [TMA) und Tetraethylammoniumch lo rid [TEA )) und zu r NMR-Spektroskopie (0 20) wurden vo n der Fluka Feinchemik alien GmbH (Ne u- Ulm) in der ho ch ste n Reinhcit sstu fe be zogen und o hne wei tere Reinigung ve rwendet. Ail e zum selektiven Abbau des Knorpels eingesetzte n Enzyme (Co llage nase. Tryp sin und Hya luronidase ) und at riu rnhypochlorit ( aO CI) wa ren ebe nfalls komm erz iell vo n Fluka er ha ltlich.

b) Probenpraparation A rtikulare r Sch weineknorpel und nasale r Rind erknorpel vo n ju ven ilen (und in a usgewiihlten Fall en au ch vo n adultcn) Tieren wurde von eine m Schl acht er eibetrieb be zog en . Unm ittelba r nach der Schl achtung wurde der Knorpel vo m Knoch en und dcrn um geb enden Geweb e getrcnnt und in klein e Stucke geschni tte n. Zur Einste llung eines defin ierten Wassergeh altes in den einzelne n Knorpelpro be n wurde die .Dsmotische St re Btec hnik" a ngewende t [5. 13]. Hie rzu wurde n die Knorpelpro ben in Dialyseschl auch c (Spec tral-or, Ausschlu Bgre nzc 1000 Da) gcp ack t. Di ese Proben wurde n dan n in untcrschi edl ich kon zentrierten, waBrigen Polyeth ylengl ycol (PE G)- Losungen fur 4 8 Stunden inkubiert, um auf osm ot isch em Weg den Wasserge ha lt des Knorpels einz us te lle n [ 13). Gegebenen fall s cnthielt die PEG -L osung auc h die entspreche nde n Zusatzc vo n Molekiilen und Ione n, deren Diffu sio n gemessen werde n so llte (PEG. CaCI 2 bzw. TM A ode r TEA). Zur Erfassung der Pol ym erdiffusion wurde der Knorpel direkt (d. h. o hne DiaIyseschlauc h) in de n entsprec he nden Polyrnerlosungen inkubiert. Fiir Untersuc hungen, in den en nieh t die Wasserdiffusio n gemessen we rde n so llte, wurden aile Losun gen mit 0 20 (a nste lle vo n H 20 ) hergestellt. Fur die NMR-Messun gen wurden die Knorpelproben aus dcrn Dialysesehlauch entnomme n, in 7.5 -mm-NMR-R ohrche n ge fu llt und luftdicht verschloss e n. D iese Pr ob cnprap aration bri ngt cs mit sic h, daB die einze lnen Knorpel stiick e ohne jede Ordnun g isot rop ve rte ilt s ind. So mit spielt die in frilheren Arbeite n beo bac htete Knorpelan isotropie [15) kei nerlei Roll e. Un m itte lba r nach der NM R- Messung wurden die jeweiligen Kno rpel prob en in eine r Vaku um zentrifuge bei 60 °C ge troc knet und der Wassergeh alt durch Di fferen zwagung bestimmt.

Sludium der Dill usion im Knorpel mil der

oPFGo (pulsed-field -gradienl}-NM R·Tecnnik

BekanntennaBen wei se n aile biologischen Materialien cine betrachtliche Streubreite auf. Dies gilt aufgrund der oben beschrieb en en Veranderungcn im Wassergehalt auch fur da s cingcsetzte Knorpelgewebe, wenn ohne .Dsmotische StreBtechnik " gearbeitet wird. Wird der Wassergehal t jedoch gcnau eingestellt. so konncn aile Messungen mit extrem hoher Reproduzierbarkeit durchgefiihrt werden: Da in allen Abbildungen die MeBungenauigkeit in der GroBe der verwendeten Symbole liegt, wird auf deren Angabe generell verzichtet.

c) PFG-NMR-Messungen Da s Selbstdiffusionsverhaltcn von Wasser, Polymeren und lonen in Knorpel wurdc mittcls " Pulsed-Field Gradient" (PFG) - MR bestimmt. Die cigcntliche Melsgrobe in der PFG-NMR ist.die Dampfung der Spin-Echo-Amplitude '¥ bei anliegenden Feldgradienten lI6]: 'i J = exp (_ q2D (.6. -

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q = yoG ist der generalisiertc Strcuvektor [ 16], wobei y fur da s gyromagnetische Verhaltnis de s Protons, 0 fur die Breite und G fur die Amplitude der angelegten Feldgradientenpulse und .6. Iiir die Diffusionszeit stehen, Gleichung ( I) kann unter der Annahme, daB 0 « .6. ist , zu Gl eichung 2 ve reinfac ht werden [ 16]:

(2) 1m Faile Freier. unbehinderter Diffusio n kann der Diffusionskoeffi zient 0 unmittelbar aus der Dampfung der Spin-EchoAmplitude 'P gemaB den Gleichungen (I) und (2) bestimmt werden. Ocr D iffus io nskoeffizie nt ist mit dem mittleren Verschiebungsquadrat der diffundicrenden Spins < Z2 > wahrend der Diffusionszeit .6. und in der Richtung der an liegenden Feldgradienten tiber die Einstein-Gleichung ve rkntipft [ 16):

(3) Existieren jedoch N unterschiedliche Spezies mit unterschiedlichem Diffusionsverhalten, die aile zur beobachteten Spin-Echo-Darnpfung beitragen, dann resultieren mehrere Diffusionskoeffizienten OJ. Fur den Fall de s .schnelle n Au stau sches" innerhalb der gegebenen Diffu sionszeit .6. erhalt man einen mittleren Selbstdiffusionskoeffizienten 0 : N

D = L fJ;D; ;= I

(4)

Pi entspricht in die sem Zu sammenhang dem Molverhaltnis, mit welchem die jeweiligen Spins zum Diffusionskoeffizienten OJ beitragen. Ein groBer Vortcil der PFG-N M R ist , daB die Diffusionszei t A zwischen we nigen Milliseku nden bis zu Sekunden verandert werden kann [16]. Wenn eine Abhangigkeit de s Diffusionskoeffizienten von der Diffusionszeit .6. beobachtet wird, so spricht man von " behinderter" Diffusion . Die Spin-Echo-

Dampfungskurve enthalt so m it Infonnationen tiber die innere Struktur de s Gewebes [5 ]. In Gegenwart vo n Diffusionsb ar rieren gilt die folgende Gl eichung:

< Z2 > - .6.>: mit

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(5)

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Irn Faile vo llstandigcr Behinderung, d . h. fur K 0, ist < Z2 > kon stant. Der Selbstdiffusionskoeffizient nimmt mit zuneh mender Beobachtungszeit ab: D - L\-I. Aile PFG-NMR-Selbstdiffusionsmessungen wurden an einem Eigenbaugcrat der Fakultat fur Phy sik und Geowissenschaften der Universitat Leipzig bei einer Protonenresonanzfrequenz von 400 MHz durchgcfuhrt [ 16]. Die Starke de s Fe ldgradienten G lag zwi schen 0 und 25 Tim bei einer festen Pulsbreite 0 (zw isc he n 0 ,2 und 2 ms). Die verwendete Diffusionszeit .6. lag zwi schen lund 600 ms. Ftir.6. :$ 13 ms wurde Gleichung [I) zur Bestimmung de s scheinbaren Diffusionskoeffizienten verwe ndet, wahrend bei g rollere n Diffusionszeiten .6. » 0 erfiillt war und deshalb mit der vere infac hte n Gleichung [2) gcrechnet wurde. Fiir .6. < 10 ms wurde mit der Hahn-Spin-Echo-Sequenz (rc/2 - < - It - <- echo) an stelle de s stimulierten Ech o (rc/2<) - rc/2 - « 2-<\) - 1tI2 -
Ergebnisse und Diskussion a) Selbstdiffusion des Wasse rs Der Wassergehalt von Gewebeproben spielt fur Relaxatio ns[ 14 ] und Diffusionsuntersuchungen [5] eine extrem wichtige Rolle [10] . Leider ist aber die genaue Bestimmung de s Wasserge haltes in biologischem Material nicht einfach. weil der Wassergehalt von unterschiedlichsten Pararnetern. wie z. B. der osmotischen Akti vitat de s Gewebes. abhangt [17). Sofern man den osmotischen Druck e iner Knorpelprobe bei definiertern Wassergehalt nicht direkt bestimmen kann. gibt cs jedoch einen anderen Weg . In waBrigen Pol yethyl englycol (PEG )Lo sungen mit 10 bis 40 Gew.- % Polymer herrschcn osmotisc he Driicke zwi schen 0,13 und 4 .24 MPa [18]. Dialysiert man cine Probe in di esen Polyrncrlosungen. so wird s ich der Wassergehalt - als der einzige freie Parameter - so ein stellen, daB Probe und umgebende Lo sung den gleichen osmotischcn Druck besitzen. Wir hab en die "Os motisc he Strcfltcchnik" angewendet, urn aile Proben unter definierten Bedingungen untersuchcn zu konncn und um einen phy siologisch-relevanten Druck auf den Knorpel auszuuben . In Abbildung list der osmotische Druck von drei untersc hiedlichen Knorpelarten tiber dcm jcweiligen Was sergehalt (Verhal tni s de s Gesamtgewichtes des Knorpels zur Masse des unter Gleichgewichtsbedingungen enthaltcnen Was sers) auf-

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Studium oe r Diffusion im Knorpel mit der .PFG" (pulsed·field·gradienl)·NMR·Te<:hnik

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Abbiklung I Osm otis cher Druck unterschi edlicher Knorpelarten in Abhiing igkeit VOI/I Wassergehalt (Yerhaltnis der Knorp eltnasse zur Masse des enthaltenen Wassers).

getrage n, Die bcidcn untcrsuchtcn Knorpelarten zei gen typische Unterschicdc: Knorp el aus dem nasalen Septum des Rindcs hat bei gle ichem Wassergehalt den hoheren os motischen Druc k, bedin gt durch den hoheren Gehalt an Proteoglyca nen, die os motisc h aktiver sind als das Coll agengeru st . Weni ger ausge prag t, aber noch immer deut lich zu erkenncn, sind die Untcrs chicdc zw ischen j uvenilern, d. h. ca. ein Jahr altem und ad ultem, d. h. ca . drei Jahre altern Knorpel. Der adulte Knorp el zeigt bei gleichem Wassergehalt einen geringeren Schw ellu ngsdru ck als der ju venil e Knorp el , d. h., de r adu lte Knorpel enthalt bei gle icher auBerer Belastung weniger Wasser als der j uve nile . Dies ist in Einklang mit der Liter atur [3] und deu tet auf eine - mit zunehmende m Lebensalter voran schreitend e - Calcifizierun g des Knorpcls, was einer Absatti gun g der Festladun gen der Proteoglycane dur ch die Calc ium ionen entspricht r13]. Die Kompression des Knorpel s bei auflerer Belastung wird im wesen tlichen durch den osmoti schen Druck der Proteoglycane im Knorpel kompensiert [3]. Ohn e auBere Belastung wirkt dem Sch wellun gsdru ck der Proteoglycan e die elastische Dchnung des Collagennetzwerkes cntg egcn . Schrumpft das Volum en der Knorpelmatrix (z. B. durch Veriu st von Proteoglycanen oder Wasser), wird der Schwellungsdruck des Knorpels ausschli eBlich durch den osmotischen Druck 1t der enthaltenen Protcogl ycane bcs timmt [20] . Art ikularer Knorpcl hat unter In-vivo-Bedingun gen einen Wassergeh alt von etwa 75 %. Dies wurd e einer os motischen Kompression durch eine 25 %ige PEG -Losung entsprechen [ 13]. In Abbildung 2 sind die mittels PI-G-NMR bestimmten Wasser (SDK)-Selbstdiffusionskoeffizi enten der unter schiedlichen Knorp elproben in Abhangigkeit vom anliegenden os-

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Osmotischer Druck 11: [MPa] A M i/dung 2 WasserselbstdijJusiollskoejJizient untersch iedlicher Knorpelarten in Abhiingig keit VOl ' der angewandten osmo tischen Kompression (Diff usionszeit = / 3 I/1s).

motischen Dru ck dargestellt. Offenb ar verhalten sich die SDK des Wassers ga nz analog zu den Wassergehalten. d. h. mit zun ehmend er os mot ischer Kompression und so mit sinkend em Wassergehalt sinkt auch der Wasser-SDK. Die untersc hiedlichen Knorp elarten Iolgen da be i ge nau de n bcrc its in Abbi ldung I diskuticrten Gcsctzrn alligkcit cn. Wir konnten in einer fruheren Arbeit zeige n [5]. daBin Knorpel die Wasser-SDK nahezu ausschlieBlich durch den Wassergehalt bestimmt werden. Diese Abhan gigkeit ist von hohem praktischem Wert, da sie die Bestimmun g des Wassergehaltes durch Messung der Wasser-SDK unter In-vivo-Bedingungen ermogl icht. Bei arthroti schen Erkrankungen wird z. B. die Calcifizicrung des Knorpels - die zur Verm inderung des Wassergehaltes fiihrt - als wesentliches Merkm al diskutiert [13 J. In Abbildung 3 ist der EinfIuB vo n Ca-r-Ionen wie auch des pH-Wertes auf den Wasser-SDK in KnorpeI dargeste llt. Man erke nnt den entgege ngesetzten EintluB zun ehmender Ca 2+-Kon zentrati onen und steige nde r pH-Werte. Die hoch sten SDK werde n in Abwesenh eit von Ca2+-Ionen und bei hohen pH -Werren gefunde n, da unter diesen Bedin gun gen die ncgati ven Ladungcn dcr Knorp elpolymerc nicht kompcnsiert werden und ein hohes Wasseraufnahrnevermogen bed inge n (13]. Dies unter strei cht ei nmal mehr den extre men Einflu B des Wassergehaltes auf den SDK. Enz yme und reakti vc Sauerstoffvcrbindungen werden haufig zur gezie lten In-vitro-M od ifizierung des Knorpe ls verwendet , urn die path oIogischen Proz esse bei arthrotischen Erkrankungen zu simulieren [2 1]. In der Literatur lind en sich in diesem Zusammenhang Hin weise, daB das Wasser-Selbstdiffusionsverhalten im Knorpe l zur Bestimmung von arth rotischen Knorp el verand erun gen genutzt werden kann, da es ZlI

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Abbildung 3 Einjlufi der Cal ciumion enk on zentration (a) biw. des pllWertes (b ) auf da s Selbstdiffusionsverhalten von Wasser ill Knor pel bei einer [este n Diffusionszeit von .:1 = JLms.

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pH-Wert

einer - je nach Art der Einwirkung - charakteristischen Veran derung der Wasserdiffusion kommt [14). Aile genannten Experim ente wurden jedoch in der Regel ohne gen aue Kontrolle des Wassergehalt es durchgefUhrt. Deshalb wurden diese Untersuchungen unter dcfinierteren Bedingungen wiederholt. Wir behandelten so wohl artikularen Schweineknorpel als auch nasalen Rind erknorpel mit testikularer Hyaluronidase (Fragmentierung der Glycosaminoglycane ), Trypsin (Spaltung der Link- und der Core-Proteine in den Proteoglycanen ) sowie mit Natriumhypochlorit (zur selektiven Abspaltung der N-Acetylseitenkette der Glycosam inoglycane) [4,2 1]. Nach den entsprechende n Inkubationsexperimenten wurde sowohl de r Wassergehalt in den einzelnen Proben ermittelt wie auch die Wasser-SDK mittels PFG-NMR bestimmt. Die Auftragun g des Selbstdiffusionskocffizientcn iiber dem jeweiligen Wassergehalt in Abhangigkeit von der voran gegangenen Vorbehandlung ist in Abbildung 4 dargestellt. Obwohl hier in allen Fallen ganz unterschiedliche Schadigungen des Knorpel s induziert werden, zeigen die durch enzymatischc Behandlung gewonnenen Knorpelproben die gleiche Abhan gigkeit wie einfach osmotisch komprimierter Knorpcl: Der Wasser-SDK hangt aussch liel3lich vom Wassergehalt abo Es ist dabei irrelevant. wie dieser zustand e gek ommen ist und wie die chemische Zusammensetzung der Probe ist [5). In quantitati ver Hinsicht lassen sich die Daten in Abbildun g 4 dur ch das Modell von Macki e und Meares [22) beschreiben: D

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Abbildung 4 Wasser-SDK (.:1 = J3 ms ) in enzym atisch bzw: mit Natriumhypochlorit behandelt em Knorpel, aufgetragen iiber de", Ma ssen verhiiltnis (M Polyme/ Mlli/.,ser)'

dem Polymer-Volumenbruch und kann sehr einfach iiber die Messung von NaB- und Trockengewicht der Knorpelprobe crmi ttelt werden , wenn die Dichte des Knorp els als bekannt vorau sge setzt wird [23]. Aile Messungen wurd en bei relati v kurzen Diffusionszeiten durchgefuhrt, In ein er friiheren Arbei t haben wir geze igt, daB eine Abhangigkeit des SDK von der jeweiligen Diffusio nszeit f:j, auftritt [5]. Bei lange rc n Diffusionszeiten werden durch das Collagengeriist verur sacht e Emiedrigungen der Wasser-SDK beob achtet [24) . Diese .B ehinderte Diffusion"

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Sludium de' Diffusion im Knorpe l m ~ de,

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ist bci ge ringe re n Wassergehalten besonder s g ut dctck ticrb ar, we il die Abstande der einze lnen Col lagenfascrn vcrri ngert worden, was ihren ..beh ind ernden " Ei nfl uf noeh weiter versta rkt.

b) Selbstdift'usion von Polymeren

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Wir habe n un s weiterhin mit de r Frage beschaft igt. welche n Einflu f di e Knorpelstruktur auf die Diffu sion von Polymcren hat und ob di ese Di ffusion sk ocffizient en ze itabhangig si nd (A bb . 5) . Diese Fragestellun g hat ei ne e nge Beziehung zu den physiologi se h wichti gen Tran sportprozessen von Mak rom olckiil cn im Knorpel. In Abbildung 5a sind die Diffu sion skocffiz ien ten vo n Pol yeth ylen glycol (PE G) in Knorpel dargeste llt. PEG besitzt kein e physiol ogi sche Rclevan z. Es w urde aber als mak ro molekulare Mod ell su bstan z fur das Diffu sionsverha lLen von Ab bauprodukte n der Kohl enhydrate des Knorp cl s ausgewahlt, weil es fUr d ie Durch fiihrun g ers ter Experime nte zu r Diffusion vo n Pol ym eren im Knorpel met3techni sch e Vort ei le hat: PEG besi tzt (we nn man vo n de n tcrminalen -O H-G rup pen absieht) keine mit Wasser aust ausc hfahigen Gruppen . Dies crle ichter t die Mcssung der SD K, da Problem c mit dem Restwassersign al ausgeschlossen we rde n kon nen, wenn in deut e riertem Wasser gearbe itet w ird. Es ist aus Abbildung 5a offensichtlic h, daB fur PEG ci ne ausgepragte Abha ng igkc it sowohl vo m Moleku largewicht des Po lym ers wie auch vom Wassergeh alt des Kn orpels vorliegt. In e rster Na he ru ng wird die folgen de, ex po nentielle Abhan gigkeit gemessc n: 0 - M-o·9, d . h.• bei g leiehem Wasser ge ha lL findc t sich ei n fas t lineare r Zusamme nha ng zw ische n D iffusion skoeffizient und de m Molekulargewicht des Polyme rs. Bernerk e nswe rt ist jedoc h, daB sic h PEG ahnlich wie in fre ier, waliriger Losung ve rha lt und de r SDK im Knorp el nur unwese ntlich kleine r ist (nicht gezeigt). Es kommt also nur zu einer ve rgleichsweise ge ringe n Einsch ra nkung der Scl bstd iffusio n des Polym e rs durch die innere Struktur des Knorpels. D ie Abha ngig keit der Wasser-S elbstd iffusion vom Wassergehalt ist im Vergleich da zu wei taus starke r ausgepragt, In A bbildung 5 b sind d ie E infl tisse der Di ffu sionszei t auf di e Selbstdiffu sion vo n PEG m it den M olekul argewichten 600, 6000 und 40000 g/ mo l bei ei ne m Wassergehalt des Knorpels vo n 60 % darges te llt. Beso nder s stark ist die Reduktion des Di ffusi on sk oeffiz ie nten im Fa ile des PEG 40000 ausgepragt. In eine m Ber ei ch der D iffusion szeit zwischen 10 und 20 ms tre te n starke Be hind erungen der Dif fusio n durch die inneren Struktu ren a uf. Andere Mc ss un gcn (hier nicht dargest ellt) hab en gczcigt, daB PEG 40000 se hr gut vo n Kn orpel au fgenommen wi rd , a ber Molekulargewichte tibe r 10000 0 g/ mo l ausgcsc hlossen we rde n [25\, was du rch die Kn auel st ruktu r des Pol ym er s und die Poren struktu r des Kn orpel s be d ing t ist , Es ist bem e rken s wert, da B be i langer er Ink ub ation des Knorpel s in PEG -L osungen g lei ch e r Kon zentrat ion , ab e r unt crschi cdl ich er Mol ekulargewic hte. gle iche Mengen an PEG aufge no m me n we rde n. Dies ist m it de r Fa higkeit de r PEG -Molekiil e zu .Repta-

184

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70 Gew.-% 61 Gew.-% 54 Gew.-% 43 Gew.-%

H20 H20 H2 0 H2 0

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1000

Diffusionszeit [ms] Abhildung 5 Polym ers elbstdiffusion 1'011 Polyethylenglyc ol ill nasalem Rinderknorpel in Abhiingigkeit I'om Wassergehalt und vom Mo leku largew icht (Diffusionsze it .1 = 13 ms) (a ) und (b) ill Abhiingigkeit 1'011 de l' Diffusionszeit fi ir PEG 600. PEG 6000 lind PEG 40000 bei einem Wassergehalt VO Il 60 %.

tion sbewegungen " zu er k lare n. Das Makr orn ol eku l "schla ngelt" sic h d urch die Knorpel matrix, wo be i die Bewegung des .Kopfes" nah ezu un abhangig vo n der des "Schwanzes" ist [26] . Das von un s verwende te PEG ist elek trisc h neut ral. Oa es sic h bei den Polysacchariden des Knorpel sjed och urn negativ geladene Molek tile han delt , wo llten wir auc h die Di ffusion dafiir rclcvantcr Mol ckulc unt cr such cn. Es gc lang uns j ed och nicht, ausreiche nde Men gen an sa urc n Polysaceh arid en in

Studium der Diffusion im Knorpcl mit der .PFG" (pulsed·field·gradienl )·NMR.Tcchnik

den Knorpel zu bringen. Dies ist cine Folge des negativen ele ktr ischen Potent ials der Proteoglycane im Knorp el (Do nnan-Pote ntial) , das zurn A ussc hluf ncgati v ge lade ner Molekule filhrt [1.31.

8.0 7.0 ~

N

c) Selbstdiffusion von Kationen im Knorpel

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0

Aile bislang angesprochenen .Diffusionssonden" (H20 und PEG) sind elektrisch neutral. Da Knorpel allerdings eine negative Ubcrschulsladung bes itzt, ware jedoch zu erwarten , daB sic h ge lade ne Molekiile im Inneren des Knorpel s ande rs verhalLen als in freier Los ung, In diesem Zusa mmenhang wu rde n auch bereits erstc NM R-U ntersuchunge n zur Diffusion von Anio nen (CF )COO') [ 101 und Kationen vorge legt (Na", Lit ) [ 10]. Obwohl Natri um und Lithiu m grundsatzlich meBbar sind, besitzen sie einigc grav ierende Nac hteile. Vor allem beim Natrium crweist sich das hohe Quadrupolm oment (und die daraus resulLierenden kurzen Relaxationszeiten) als unvorteilh aft. Wir haben uns des halb entsc hlossen, die Protonen-NMR beizubehalLen . Als ge lade ne Verbindun gen haben wir uns ftlr das Tctramcthyl- und das Tetrae thylammo nium entschieden, die einfac h positiv ge lade ne Kationen mit den Molekul argew ichten 74, 15 bzw. 130,25 g/ mol sind . Beide Vcrbindungcn sind gut wassc rlos lich und besitze n zusa tzlich den Vorteil, daB sie keine austausch fahigen Protonen besitzen , so daB bei Verwendung von D20 ohne storc ndes Restwassersignal gea rbeitet we rde n kann. In de n Ex perime nten mit den genannten Kationen (Abb. 6) we rden wiederu m die gleichen Gesetzmafligkeiten wie bei dcr Diffusion von Wasser bz w. von ungeladen en Polym eren gefunde n: Der angcwcndctc osmotische Druck bzw. der daraus res ulLierende Wassergeh alt (vgl. Abb. I) hat den wei taus gro tsten EinfluB auf das Diffusion sverhalten der beiden lon en (Abb. 6a), und die Ab hangigkeit vom Wassergeh alt ist qualitativ fiir TM A und TEA verg leic hbar. Der EinfluB des Mo lekulargewichtes der beide n verwe ndeten Ammoniumsalze ist dc utlic h, und die Diffusionskoeftizi enten im Knorpel sind gegcnii bcr reine m Wasse r (TMA: l Ox 10.10 m-s' und TEA 6.2 x IO·I O rn-s f) deut lich em iedrigt. Dies kann als Beleg fur die hohc Genauigkcit der PFG-N MR -Techn ik gewertet werden. Ob woh l aile Experi mente mit einer groBen Parameterbreite durchgcfiihrt wurden, konnten keine signifikanten Einflusse der Festlad unge n des Knorpel s auf das Diffusionsvcrh alLcn der Kationen gefunde n werden. Wir waren in unserem Ansatz davon ausgegange n, daB erst unterh alb einer bcstimmtcn Kationcnkonzc ntration merkl iehe Effe kte zu erwarten sind, da erst dan n keine Uberkom pensation der Ladun gen der Knorpclpolymere mehr exis tiert. Alle rdings konnt e dies nicht bestatigt werden. Wir gehen dcs halb davon aus, daB uber Diffusionsmessungen keine Untersc heid ung zwischen gebundencn und freie n Ionen moglic h ist. Fiir die Messungen sind immer relativ hohe Ionenk onzentrationcn notwendig. Deshalb ist der Be itrag des relativ geringen Ante ils der geb unde nen lonen

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• Tetramethylammonium v Tetraethylamm onium

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Osmotischer Druck 7t [MPa]

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Diffusionszeit [ms] Abbi ldung 6 Diffusions verhalten VOII Tet ram ethylammo nium- lind Tetraethylamm oni um -lonen ill nasalem Rinderknorp el in Abhiing igke it valli an liege nden osmotischen Druck (a ) und Abhiingigke it des Diffusionskoeffizlenten VO II Tetra methylamm onium-Ionen Vo/ l del' Diffusionszeit bei zwei H~lS ­ se rgeha lten (59 bzw: 73 %) (b).

zum NMR-Sig nal nicht nachweisbar. Ein zusa tzliches Problem liegt in der starke n Verkurzung der Relaxationszeiten von TM A und T EA bei Bindung an den Knorpel. Auch aus diesem Grunde diirftc der Signalbeitrag der ge bundcnen Spezies nur se hr gering sein. AuBerdem ist der Austausch mit ungcbundenen lonen schnell genug, so daB rnittlcrc Diffusionskoeffizienten ents tehen, die wesen tlich durch die grofseren Popu lationen freier Ionen und den zugehorigen hoheren Diffusionskoeffizientcn bestimmt werden. In Abbildung 6b ist sc hlieBlich die Abha ngig ke it der DifIusio nskocffizicntcn von der Diffusion szeit Itir TMA in nasalem Rinderknorpe l be i untcrschi ed lichen Wassergehalten da r-

185

Sludium dar Diffusion im Knorpel mil der . PFG· (pu lsed- field-g radient )-NMR-Technik

gcstell t. Bei Em iedrigung des Wassergehaltes tritt eine deu tliche Verringerung der Diffu sion skoeffi zienten bei langercn Beob achtun gszeiten auf, die sehr gut mit den bereits im Faile des Wassers beobachteten Werten iibereinstimmen . Dies besta tigt einma l rnchr, daB der Barrierenabstand im Knorpel (z. B. zwei Collagenfibrillen ) im wesentlichen durch den Wasserge ha lt bestimmt wird und sich fur Wasser wie auch fur lonen in ungefahr glcichem MaBe auswirkt.

Schlu6folgerungen Obw ohl Diffusionsmessungen auch in der MRT miulcrwcilc sehr gut etabliert sind, ist ihre Spezifi tat vcrgleichsweise ger ing und kann kaum zur Gewebedifferenzierung eingese tzt werden . Ocr weitaus wichtigs te Parameter ist der Wassergehalt der untcrsuchten Proben. Dies gilt sowo hl fur die Wasserdiffusion als auch fur die Diffusion von Polymeren wie auch von lonen innerh alb des Gewebes. Zur direkten Beobachtung eincr z, B. durch Enzyme verursachten Knorpel schadigung sind Diffusionsmcssungen nur sehr bedingt geeignet, da sie weniger die Knorpclschadigung , sondem vielmehr die damit verbundene Anderu ng des Wassergeh altes widcrspiegeln. Auf der anderen Seite konncn tiber die Variation der Diffusionszeit ("Behinderte' Diffusion) wertvolle Aussagen iiber die innere Struktur des Knorpel s erhalten werden. Wir haben gcfundcn, daB teilweise dras tische Redukti onen der Diffusion skoeffizienten iiber langerc DilTu. ionszeiten auftreten. Bezogen auf die Transportprozesse im Knorpe I. bedeutet dies. daB bei Transporten iiber langere Distanzen die Geschwindigkeiten verringert sind.

Danksagung Die Autoren bedanken sich bei Herro Prof. Dr. Jorg Karge r (Institut fiir Experimentelle Physik I) filr die Gcwahrung von MeBzeit am FEG RIS 400 und fiir viele niitzliche Anreg ungen und Diskussionen. Dicsc Arbcitcn wu rden d urch Mittel der Deutschcn Forsc hungsgemeinschaft geforde rt (So nderforschungs bereiche 294/G5 und 197/A 10).

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