Sulfate de dermatane et sulfate d'heparitine du foie de boeuf

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BIOCHIMICA ET B I O P H Y S I t A ACTA

UBA 26913

SULFATE DE DERMATANE ET SULFATE D ' H E P A R I T I N E DU F()It~; Die BOEUF

P A U L F.. G R E G O I R E ,

CI.AI;DINE

DICT15S-VERMEULEN

ET JEAN

P. A M E R Y C K X

Laboratoire de Chi,,~ie pathologique, FacMtd de 3Iddecine, Universitd de Bruxelles, Brua'elles (Be(g,ium) ( R e g u le 9 m a r s , 1972)

SUMMARY

Dermatan sulfate and heparitin sulfate from beef liver Beef liver dermatan sulfate can be separated into two distinct fractions by electrophoresis on cellulose acetate. The faster moving Fraction II contains more sulfate. Both fractions are digested by chondroitinase ABC. Fraction I thereby liberates only Suzuki's ~IDi-4S disaccharide (J. Biol. Chem., 235 (1968) 3580) which is digestible with chondro-4-sulfatase. The same disaccharide is set free from Fraction II which yields moreover a saccharide which should be sulfated at position 6 of its hexosamine since it is digestible with chondro-6-sulfatase but differs from all known split products liberated by chondroitinase ABC. Dermatan sulfates isolated from beef lung and from rabbit skin contain only sulfated polysaccharide molecules similar to those of Fraction I. On digestion none of the dermatan sulfates examined gave rise to Suzuki's ~/IDi-6S saceharide (J. Biol. Chem., 235 (1968) 358o). Beef liver heparitin sulfate differs in several respects from beef lung heparitin sulfate described by Dietrich el al. (Biochim. Biop~vs. A eta, 237 (1971) 430). Fractions obtained by column chromatography from beef liver heparitin sulfate show a continuously varying composition. While one at least of these fractions differs from the others by its electrophoretic mobility on cellulose acetate, beef liver heparitin sulfate does not yield distinct fractions when submitted to electrophoresis on an agarose gel.

INTRODUCTION

Le sulfate de dermatane a ~t6 isol~ de la peau du porc 1 et du lapinL des tendons et des valvules cardiaques d'esp~ces diversesa-s, du poumon 6 et de la scl6rotique du boeuff. Le sulfate d'h@aritine, isold d'abord du foie et du poumon du boeuf s, de l'aorte bovine et de l'aorte humaineg, 10, a 6t6 6galement dScel6, en m~me temps que le sulfate de dermatane, dans l'urineIt, ~2et dans le foie ~2de patients atteints de maladies diverses group6es sous le nom de gargoylisme. Nous nous int&essons A ces glycosaminoglycanes pathologiques, qui ont dt6 caract6ris~s en tant que classes de polysaccharides, mais n'ont pas 6t~ 6tudids en d~tail. Impressionn6s par leur hdt&og6ndit6, nous avons voulu nous rendre compte jusqu'/~ Biochi~n. Biophys. Acta, 279 (1972) lO2 I I 7

SULFATES DE DERMATANE ET D'HEPARITINE

lO3

quel point la variabilit6 de leur composition se retrouverait dans des 6chantillons repr6sentatifs obtenus ~ partir d'un organe normal. Le foie de boeuf nous a paru ~tre une source abondante et facilement accessible de mat6riel de comparaison; il nous a aussi paru int6ressant parce qu'il n'existe pas de donn6es quantitatives concernant son sulfate de dermatane et que le travail de Jorpes et GardelP au sujet de son sulfate d'h6paritine est d6j~ ancien. Les recherches portant sur l'isolement et la caract6risation des deux substances nous ont conduit ~ des observations nouvelles. MATERIEL ET METHODES

Extraction des glvcosaminogl3,canes Le foie de bceuf, pr6lev6 aussit6t apr~s l'abattage, est homogfn6isd dans l'ac~tone et soumis/~ des ddgraissages successifs dans l'ac6tone et l'dther. La poudre s~che ainsi obtenue est soumise A une digestion par la papaine, suivie d'un traitement par NaOH 0.5 M (Schiller et al.la). Apr~s neutralisation et dialyse, le produit est soumis ~ l'action de la trypsine ~ pH 8. Apr~s de nouvelles dialyses et une filtration sur Hyflo supercel, la solution, concentrde sous vide, est amenfe ~ une concentration de 5 % en ac6tate de sodium et 0.5 M en acide ae6tique. L'addition de 4 vol. d'alcool produit un prfcipit6 qui, apr~s lavage et s~chage, est redissous dans de l'acide ac~tique 0.5 M contenant 5% d'ac6tate de sodium. La nouvelle solution obtenue est purifi6e par plusieurs extractions avec un m61ange chloroforme-alcool amylique 3 : I selon Sevag u. Les glyeosaminoglycanes sont pr~cipit6s par 4 vol. d'alcool, remis en solution dans le milieu acide ac6tique-ac~tate et trait6s par le rfiactif de Lloyd (Meyer et al.7). Ils sont pr6cipitds cette fois par addition de 5 vol. d'acide ac~tique glacial, ce qui laisse en solution des pigments qui ne seraient pas s@ar6s par l'acool. Le produit est redissous, reprdcipit6 une deuxi~me fois comme il vient d'etre dit, et sfch6 par traitement ~ l'alcool et /~ l'fither. La solution du produit dans l'ac6tate de sodium, amen6e ~ pH 6. 9, additionnfie de quelques cristaux de NaC1, est soumise ~ une incubation avee de l'~-amylase, dans le but d'6liminer le glycog~ne. Les glycosaminoglycanes sont prfcipit~s par 5 vol. d'acide ac6tique glacial, l'amylase restant en solution. Le pr6cipit6, lav~ et s6ch6, est redissous dans l'eau et la solution est amen6e ~ pH 5.6 avec Na2CO3. Ce traitement, emprunt6 ~ Strandberg t~, suivi d'une centrifugation ~ 7500 × g, clarifie la solution. Les glycosaminoglycanes sont s@arfs par pr6cipitation au moyen de 4 vol. d'~thanol contenant I °/o d'acdtate de sodium et I vol. °/o d'acide ac6tique glacial. On les remet en solution dans l'eau distill6e. La solution est pass6e sur une colonne de Dowex 5oW-X8, forme acide, suivant Cifonelli et al. 1~. On concentre l'~luat et on prfcipite les glycosaminoglycanes par 4 vol. d'6thanol en pr6sence d'ac6tate de sodium et d'acide ac6tique. Fractiosnemest des glycosaminoglycanes L'ensemble des glycosaminoglycanes, purifi~s comme il vient d'etre dit, est s6par6 en trois fractions, par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex A25: les fractions sont obtenues par 61ution avec NaC1 aqueux 0.35 M, NaC1 aqueux 0.50 M et NaC1 2.00 M dans HC1 o.oi M. Apr~s concentration des 61uats sous vide et dialyse, les glycosaminoglycanes sont prfcipit6s comme pr6c~demment par l'alcool-ac6tate de sodium-acide acftique. Biochim. Biophys. dcta, 2 7 9 (1972) I O 2 - I I 7

IO4

p.F.

GREGOIRI.[ d t a [ .

La fraction o.35 M est composde presque enti6rement de glycogbne. Elle cornporte peut-~tre de petites quantit6s de glycosaininoglycanes non d6finissables. La fraction 0.50 M, peu abondante, se compose principalement d'acide hyaluronique. La fraction 2.00 M est celle qui nous intdresse. Elle comprend le sulfate de dermatane, les sulfates de chondroitine A et C, l'hdparine et le sulfate d'h6paritine. Malgr6 certaines indications contraires de la litt6rature 17 ces composds ne sont pas s6parables par une chromatographie suivie d'61utions avec des solutions de NaC1 de molarit6s croissantes. Nous les avons s6pards par les techniques mentionndes ci-apr6s. Les glycosaminoglycanes de l'61uat 2.oo M, pr6cipit4s par l'alcool-ac6tate de sodium-acide ac6tique, lav6s, s6ch6s, sont remis en solution dans l'eau (2o mg par ml). L'addition de r6actif de Benedict, suivant Cifonelli et al. 1~ pr4cipite du sulfate de dermatane qui est sdpar6 et chromatographi6 sur une colonne de Dowex 5oW-X8 (Hq) selon les m~mes auteurs ~". Dans l'61uat final le sulfate de dermatane est pr6cipit6 au moyen de 4 vol. d'6thanol-ac6tate de sodium-acide ac6tique. Le surnageant de la pr6cipitation au r4actif de Benedict est neutralis6, dialys6 apr6s addition de quelques gouttes de HC1 6 M, concentr6, chromatographi6 sur une colonne de Dowex 5oW-X8 (H ~) et 61u6 avec de l'eau. Les glycosaminoglycanes de l'61uat sont pr&ipit6s par addition de 4 vol. d'6thanol-ac6tate de sodium acide ac6tique. Ils sont redissous dans l'eau et l'h6parine est pr6eipit6e sous forme de sels de baryum, selon Charles et Scott TM. On peut purifier l'h6parine et la convertir en sel de sodium par une nouvelle chromatographie sur Dowex 5oW-X8 (H q) en 61uant avec de l'eau et en pr6cipitant l'61uat par l'6thanol-ac6tate de sodium-acide ac6tique. Le surnageant obtenu lors de l'isolement de l'h6parine contient les sulfates de chondroitine A e t C ainsi que le sulfate d'h6paritine. On rechromatographie ce surnageant sur une colonne de Dowex 5oW-X8 (H~). Dans l'61uat les glycosaminoglycanes sont pr6cipit6s par l'addition de 4 vol. d'alcool-ac6tate de sodium-acide ac6tique. Ils sont ainsi convertis en sels de sodium. On les redissout dans un tampon d'ac6tare de sodium o.I M, de pH 5, o.I5 Men NaC1, ~ raison de 2o mg de polysaccharide par ml, et on ajoute i vol. d'une solution contenant, par ml, IO mg d'hyaluronidase testiculaire (Serva, ~ 5o0 U.I. par rag). Une incubation de 4 8 h/i 37 °C, avec une seconde addition d'enzyme apr6s 24 h, 61imine les sulfates de chondroitine A et C Les mucopolysaccharides qui ont rdsist6 /t l'hyaluronidase sont prdcipit6s ensuite par l'addition de 2 vol. d'alcool. Apr6s s6paration, lavage ~ l'alcool et s6chage, on les redissout dans un peu d'eau. On 61imine l'hyaluronidase par l'addition d'un tiers du volume d'acide trichlorac6tique ~ 4o%. Ce dernier 6tant 61imin6 par dialyse, on pr6cipite le sulfate d'hdparitine par addition de 4 vol. d'6thanol acdtate de sodiumacide ac6tique. Les quantit6s de glycosaminoglycanes obtenues dans deux isolements sont indiqu6es dans le Tableau I. Si l'on fait abstraction du glycogbne, la distribution des polysaccharides dans les deux foies est comparable, la seule diff6rence marqu6e portant sur l'hdparine.

Techniques analytiques (~) Substances de rdf&ence Nous disposions de quatre pr6parations de nmcopolysaccharides. La firme Hoffmann-La Roche nous a fourni un 6ehantillon de sulfate de dermatane, extrait de poumon de bceuf, d6crit sous le nora de "fl-hdparine" par Marbet et Winterstein 6.

Biochim. Biophys. Acta, 279 (x972) lO2-117

SULFATES DE DERMATANE ET D ' H E P A R I T I N E

105

TABLEAU I QUANTITES, EN nlg, DE GLYCOSAMINOGLYCANES OBTENUES A PARTIR DE DEUX FOIES DE BOEUF

G l y c o s a m i n o g l y c a n e s b r u t s (mg) Utilisd p o u r les f r a c t i o n n e m e n t s (mg)

Foie No. z

Foie No. 2

7024 3649

2238 2238

Quantitds (rag) pour le foie No. z recalculdes pour 7024 mg de glycosaminoglycanes bruts F r a c t i o n 0.35 M (glycog6ne) F r a c t i o n 0.50 M (acide h y a l u r o n i q u e ) F r a c t i o n 2.00 M D a n s la f r a c t i o n 2.0o M: s u l f a t e de d e r m a t a n e h 6parine sulfate d'hdparitine

4125 54 1449

413 52 1172

331 218 706

377 106 54 °

Nous poss6dions d'autre part du sulfate de dermatane isol6 par nous ~t partir de peau de lapin. L'h@arine, simplement utilis6e comme substance de r6fdrence lors des 61ectrophor6ses, a 6t6 obtenue ~t partir du sel de sodium U.S.P. de la firme Sigma. Nous l'avons purifid par chromatographie sur une colonne de DEAE-Sephadex A25; nous avons rejet6 les filuats obtenus avec NaC1 1.25 M e t conserv6 seulement l'61uat obtenu avec NaC1 2.o M k partir duquel nous avons prdcipit6 l'hdparine par l'alcool-acdtate de sodium-acide aedtique, comme d4crit plus haut. Une prdparation que nous appellerons sulfate de chondroitine "standard" nous a servi d'dtalon lors des essais de digestion enzymatique. Nous sommes partis du sulfate de chondroitine de septum nasal de bceuf de la firme Sigma. Le produit commercial a 6t6 chromatographi6 sur une colonne de DEAE-Sephadex A25, en 61uant d'abord par NaC1 aqueux o. 5 M, et ensuite par des solutions de NaC1 o.8 M, 1.25 M e t 2.o M dans HC1 o.oi M. On n'a retenu et isol6 que la fraction filude par NaC1 ~.25 M. D'apr6s nos analyses cette fraction se compose d'environ 6o% de sulfate de chondroitine A e t de 4o% de sulfate de chondroitine C. Elle convient pour l'identification de certains produits des digestions enzymatiques.

(2) Dosages Tousles dosages se rapportent aux substances s4chdes k 65 °C, sous vide, sur

P20~. Le dosage de l'azote a 6t6 effectu6 par la m6thode de Pregl Dumas adapt4e l'Elemental Analyser Model 24° de Perkin-Elmer. Le soufre a 6t6 dos6, sur I mg de substance, par pr6cipitation ~t la benzidine selon Lees et Folch 19 suivie de la mesure spectrophotom6trique selon Andersen 2°. Les acides uroniques ont 6t6 estim6s par les r6actions au carbazole selon Dische 21 et ~ l'orcinol selon Brown ~2. Les hexosamines ont 6t6 lib6r6es par hydrolyse en chauffant dans HC1 4 M pendant 2 h, en tubes scell6s, IO8 °C; l'acide a 6t6 61imin6 par des 6vaporations sous vide facilit6es par quelques additions d'eau et le r6sidu repris dans une quantit6 connue d'eau; sur une partie aliquote, les hexosamines totales ont 6t6 dos6es par la m6thode de Blix ~3. Le restant de l'hydrolysat a servi ~ dtablir les proportions de chacune des hexosamines, apr6s s4paration sur colonne de Dowex 5oW-XI2 selon Oardel124. On a dos6 les hexosamines Biochi~n. Biophys. dcta, 279 (I972) lO2-117

lO6

P . E . GREGOII{I.~ C[ a].

sulfat6es selon Lagunoff et Warren '25et les groupements N-ac6tyles selon Ludowieg et Dorfman "26en prenant toutefois comme standard de la N-ac6tylglucosamine, qualit~ A de Calbiochem, 6talonn6e elle-m6me par un dosage d'azote selon Dumas.

(3) Electrophorbses Les 61ectrophor6ses sur papier ont 6t6 effectu6es sur papier \Vtmtman No. I dans du tampon au formiate o.I M, de pH 3. Les 61ectrophorbses sur ac6tate de cellulose ont 6t~ effectu6es sur bandes de sepraphore III, dans de l'acide ae~tique i M additionn6 de pyridine jusqu'A pH 3.5, sous IO V/cm pendant 80 rain, ou sur bandes de sepraphore III, dans l'ac6tate de calcium o.3 M, sous i mA/cm pendant 3 h. Toutes les bandes ont 6t4 color6es par le bleu de toluidine. On a effectu6 des 61ectrophor6ses en gel d'agarose, selon une teclmique trbs proche de celle de Jaques et al.2L L'agarose, provenant des Koch-Light Laboratories, 6tait dissous dans du tampon au barbiturate-HC1 A pH 8.6 et coul6 sur des plaques de verre de IO cm de large, en couche de 1.5 mm d'@aisseur. L'61ectrophorbse a 6t6 conduite dans un appareil Gelman, A 4 °C, pendant I h sous 3oo V, le contact de la plaque avec le tampon des r6servoirs dtant assur6 au moyen de m6ches de papier Whatman 3 MM, appliqu6es au moment oh on coulait l'agarose. On a fix6 les mueopolysaccharides au cetavlon, color6 au bleu de toluidine et ~clairci dans l'acide ac6tique dilu6 comme indiqu6 dans la r6f. 2 7. L'61ectrophor6se a toujours comport6 une application d'h@arine servant de rep6re.

(4) Digestio~s enzvmatiques Pour identifier des fractions de sulfate de dermatane nous avons eu recours leur digestion par les ehondroitinases et chondrosulfatases isoldes de Proteus vulgaris (NCTC 4636) par Yamagata et al. ~-8. Les digestions ont 6t6 effeetu6es sur IOO Fg de substrat, dans du tampon Tris, recommand~ par Saito et al. 29, dans un volume final de 75/~1, pendant I h ~t 37 °C, en utilisant, seuls ou en m61ange, o.I unitd de chondroitinase ABC, 0.05 unit6 de chondro-4-sulfatase et 0.05 unit6 de chondro-6-sulfatase. Les enzymes et les saccharides-6talons correspondant aux produits finaux provenaient de la firme Seikazaku Kogyo Co. Ltd, Tokyo. I.'identification des produits de digestion a 6t6 effectu6e par chromatographie descendante, sur papier Whatman I, essentiellement selon les directives de Suzuki ~° et de Suzuki et al.3~: d6salage au moven du m61ange n-butanol 6thanol-eau (52:32:16, v/v/v) pendant 24 h, s6chage, chromatographie descendante pendant 24 h au moyen d'un mdlange aeide mbutyrique NHaOH 0.5 M (5:3, v/v), s6chage de io min ~t IiO °C, coloration au spray de phtalate d'aniline Merck No. 1266 suivi d'un ehauffage 5~ IiO °C pendant IO min.

(5) Spectres infrarouges Les spectres infrarouges ont 6t6 obtenus sur des substances incluses dans des pastilles de KBr, au moyen d'un spectrophotom6tre de Perkin Elmer, Modble 21 ~t double faiseeau et prisme de NaC1.

(6) Mesures polarimdtriques Les mesures de pouvoir rotatoire ont 6t6 obtenues au moyen d'un micropolarim~tre photo61ectrique de C. Zeisz dans des tubes de I dm de longueur, ~t 20 °C, en solution aqueuse,/t 546 et 578 nm. Les valeurs des rotations sp6cifiques pour la raie D du sodium ont 6t~ calcul6es par extrapolation ~t partir des valeurs expdrimentales.

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SULFATES DE DERMATANE ET D'HEPARITINE RESULTATS

L e s r 6 s u l t a t s d e s d o s a g e s c h i m i q u e s e f f e c t u 6 s s u r le s u l f a t e d e d e r m a t a n e e t le s u l f a t e d ' h 6 p a r i t i n e , isol6s d e l'61uat 2.0 M, s o n t r f s u m 6 s d a n s le T a b l e a u I I . O n y a i n c l u s d e s a n a l y s e s d e c o m p a r a i s o n a v e c d e s s u b s t a n c e s d e r f f 6 r e n c e : le s u l f a t e d e d e r m a t a n e isol6 d e la p e a u d e l a p i n e t la " f l - h 6 p a r i n e " H o f f m a n n - L a R o c h e . L e s a u t r e s t e c h n i q u e s raises e n o e u v r e 6 t a b l i s s e n t l ' e x i s t e n c e d ' u n e h 6 t f r o g 6 n 6 i t 6 s p 6 c i f i q u e d u s u l f a t e d e d e r m a t a n e e t d u s u l f a t e d ' h 6 p a r i t i n e d u foie d e boeuf. T A B L E A U II ANALYSES DES FRACTIONS ISOLEES DE L'ELUAT 2.00 ~[ ET DES SUBSTANCES DE REFERENCE Les deux valeurs indiqudes pour chaque dosage de la premi6re colonne correspondent aux analyses faites sur les fractions provenant de deux foies de boeuf diffdrents. Si on n'a donn6 qu'une seule valeur pour chaque analyse de la deuxiame colonne effectude sur le sulfate d'hdparitine, c'est parce que le second dchantillon de ee polysaccharide a servi ~t un sous-fractionnement dont les ddtails sont donn6s dans le Tableau IV. ,Substances de l'dluat 2.00 M Sulfate de Sulfate dermatane d'hdparitine Acide uronique* : par r~action au carbazole par rdaction ~ l'orcinol Rapport carbazole/orcinol Hexosamines* Distribution des hexosaulines: pourcentage de glucosamine pourcentage de galactosarnine Hexosamines N-sulfatds* Azote* Soufre* N-Acdtyle* *

iQ.o i6.o 36.1 -34. I o.53- o.47 23.7--24.2

44.2 22.9 1.93 24.9

7.o o 93.0 -ioo.o 2.6 -o. 7 2.30 2.31 6.25 5.15 6.95 7.64

ioo.o o 19.4 2.82 5.5 ° 5.38

Substances de rdfdrence Sulfate de dermatane Peau de fi-Hdparine lapin I5.Z 34-0 o.43 23.o o ioo.o --

2.38 5.4 ° 7.88

I5,8 4°.4 o.39 28.9 o ioo.o i.z 2.45 5.81 7.58

* en g / i o o g de substance. ** en g CH3.CO-per/Ioo g de substance. (S) S u l f a t e de d e r m a t a n e A l ' 6 1 e c t r o p h o r ~ s e s u r p a p i e r W h a t m a n No. I le s u l f a t e d e d e r m a t a n e d u foie d o n n e u n e b a n d e u n i q u e . P a r c o n t r e ~ l ' ~ l e c t r o p h o r ~ s e s u r a c d t a t e d e c e l l u l o s e d a n s le t a m p o n a c i d e a c 6 t i q u e p y r i d i n e , il se sfipare n e t t e m e n t e n d e u x b a n d e s a l o r s q u e le s u l f a t e d e d e r m a t a n e d u p o u m o n d e b c e u f (fl-hfiparine) e t le s u l f a t e d e d e r m a t a n e d e la p e a u d e l a p i n n ' e n d o n n e n t q u ' u n e (Fig. I). E t a n t d o n n ~ ce r 6 s u l t a t i n a t t e n d u , n o u s a v o n s r e c h r o m a t o g r a p h i 6 55 m g d e s u l f a t e d e d e r m a t a n e h 6 p a t i q u e s u r u n e c o l o n n e d e D E A E - S e p h a d e x A 2 5 d e 2 c m × 20 c m . C o m m e 6 1 u a n t s n o u s a v o n s utilis6 s u c c e s s i v e m e n t d e s s o l u t i o n s o . o i M e n HC1 e t r e s p e c t i v e m e n t 0. 9 M, i . o o M, I.IO M, 1.25 M, 1.5o M e t 2.00 M e n NaC1. L e s u l f a t e d e d e r m a t a n e c o m m e n c e / ~ 6 t r e 61u6 a v e c la s o l u t i o n d e NaC1 I.IO M, d o n n e u n p r e m i e r m a x i m u m a v e c NaC1 1.25 M, d i m i n u e e n s u i t e e t d o n n e u n s e c o n d m a x i m u m a v e c NaC1 2.0o M. L e T a b l e a u I I I r 6 s u m e les r f s u l t a t s d e s a n a l y s e s d e ces f r a c t i o n s . L a f r a c t i o n I . i O M, tr~s p e u a b o n d a n t e , e s t i m p u r e . O n c o n s t a t e q u e la t e n e u r e n s u l f a t e a u g m e n t e n e t t e m e n t a v e c la m o l a r i t 6 e n NaC1 d e l ' 6 1 u a n t . A l ' d l e c t r o p h o r ~ s e l a f r a c t i o n 1.25 M a la m ~ m e m o b i l i t 6 q u e le s u l f a t e d e d e r m a t a n e d e la p e a u d e l a p i n e t q u e Biochim. Biophys. Acta, 279 (I972) lO2-117

io8

P . E . GREGO1R1.; Cl al.

iiiii ii iiii~i:ii+¸¸¸

Fig. I. Electrophor~ses s u r acdtate de cellulose (sepraphore I I I ) dans l'acide acdtique pyridine, p H 3-5. (I) Sulfate de d e r m a t a n e isold d ' u n premier foie de boeuf. (2) Sulfate de dernlatane isold d ' u n deuxi~me foie de boeuf. (3) "fl-H6parine" H o f f m a n n - L a Roche. (4) Acide h y a l u r o n i q u e et sulfate de d e r m a t a n e isolds de la peau de lapin. L'acide h y a l u r o n i q u e migre moins vite que le sulfate de dermatane. Fig. 2. Electrophorbses du sulfate de d e r m a t a n e sur acdtate de cellulose (sepraphore l i l ) dans l'acide acdtique-pyridine, p H 3.5. (i) Sulfate de d e r m a t a n e global du foie de boeuE (2) Fraction dlu6e p a r NaC1 1.25 M. (3) F r a c t i o n dlude p a r NaC1 2.oo M. P o u r les sous-fractionnenlents, voir Tableau Ill. TABLEAU IfI CHROMATOGRAPHIE

DE

55

nlg

DE

SULFATE

DE

DERMATANE

SUR

DEAE-SEPHADEX

A25

Molaritd de la fraction

Q u a n t i t 6 o b t e n u e (mg) Acide u r o n i q u e * : p a r r6action au carbazole p a r r6action 5, l'orcinol R a p p o r t carbazole/orcinol Hexosamines* D i s t r i b u t i o n des hexosamines: p o u r c e n t a g e de glucosamine p o u r c e n t a g e de galactosamine Azote* Soufre*

0. 9 M

I.O 3 I

o

o

---------

--

------

1.1o M

1.25 M

1.5o ,VI

2.00 M

3.0

22. 4

io.o

14.o

22.0 31.9 o.69 25.6

15.6 38.3 o.41 26.6

14. i 34.3 o.41 25.o

15.8 34 .1 o.46 24.2

22. 4 77.6 4-7 °

3.0 97.0 :'-39 4.85

o.o IOO.O 2.28 5.15

o.o ioo.o 2.22 5.95

* en g / t o o g de substance. la " f l - h ~ p a r i n e " ;

la f r a c t i o n 2.00 M m i g r e p l u s v i t e ( v o i r F i g . 2). L a c h r o m a t o g r a p h i e

f r a c t i o n n 6 e c o n f i r m e d o n c l ' e x i s t e n c e d e d e u x f r a c t i o n s p r i n c i p a l e s d o n t la f r a c t i o n 1.50 M e s t u n m 6 1 a n g e . Les deux fractions different ~ peine dans leurs pouvoirs rotatoires. Les valeurs Biochim. Biophys. Acta, 279 (1972) i o 2 - i i 7

SULFATES

DE DERMATANE

lO9

ET D'HEPARITINE

observ6es sont les suivantes" •

20 ° '~1.~8. fr. 1.25 M:--66.50°; fr. 2.0 3I:--67.26 ° 20 o [~578. fr. 1.25 M"--58.25°; fr. 2.0 M:--58.15 ° Ic~l~° calcul6:fr. 1.25 M:--55.67 °. fr. 2.0 M"--55.35 °

Pour comparaison, valeurs pour la fl-h@arine: E~]

20o _

5~8 - -

_79.750; ic~] 578 2o° =

--70'75

°;

[~]

200 D calcu16:--67.89 °

La Fig. 6 donne les spectres infrarouges des mucopolysaccharides des fractions 1.25 M e t 2.00 M. On a utilis6 80o/~g de substance de la premi6re de ces fractions et 600 #g de la seconde. Les spectres ne sont donc pas comparables entre eux. Ils pr6sentent toutefois une diff6rence nette en ce qui concerne l'intensit6 relative de la bande eentr6e sur 1355 cm -x, attribuable, selon Orr 33 (voir aussi Barker et al. 34) au sulfate est6rifi6. I1 suffit de comparer l'intensit6 de cette bande avec celles des bandes voisines, ~t 162o cm -x (vibration C = O des groupes carboxyle et ac6tamido) et ~ lO5 ° cm -1. I1 est manifeste que la fraction 2.00 M contient plus de sulfate que la fraction 1.25 M. Ce r4sultat est confirm6 par les dosages de soufre mentionn6s au Tableau h i : alors que dans la fraction 1.25 M le rapport molaire soufre/hexosamine est 6gal ~ I, ce rapport atteint 1.38 dans la fraction 2.00 M. La distinction entre les deux fractions est 6tablie tout aussi nettement par les r6sultats des digestions enzymatiques suivies de la s6paration chromatographique des produits obtenus. Chacun des mucopolysaccharides mentionn6s ci-apr6s a 6t6 trait6 par la chondroitinase ABC seule et par cette chondroitinase additionn6e de chondro4-sulfatase ou de chondro-6-sulfatase ou des deux chondrosulfatases simultandment. Les saccharides r6sultant des actions enzymatiques sont d6sign6s par les symboles utilis6s par SuzukP ° et par d'autres auteurs28,"-9,2x du m~me groupe : zlDi-oS reprdsente le/3-D-gluco-4-6ne-pyranosyluronido-(I -~ 3)-2-d6soxy-2-ac6tamido-D-galactopyranose, non sulfat6 ; ee compos6, sulfat6 au carbone 4 de la N-ac6tylgalactosamine, devient le ADi-4S ; le ADi-6S est le compos6 ADi-oS sulfat4 au carbone 6 de la N-acdtylgalactosamine. Les r6sultats des digestions enzymatiques sont prdsent6s dans la Fig. 3 et peuvent 6tre r4sum6s comme suit. (A) Le sulfate de chondroitine "standard" est scind6 par la chondroitinase en deux saccharides, le ADi-6S (Tache 3) et le dDi-4S (Tache 4). En pr6sence de chondro4-sulfatase le ADi-6S reste inalt6r6, alors que le ADi-4S est remplac6 par les trois produits qui correspondent aux trois Taehes 5, dont la sup6rieure s'identifie au disaccharide ADi-oS. La chondro-6-sulfatase d6truit par contre le ADi-6S et le remplace par des produits d6sulfat6s. (B) Le sulfate de dermatane isol6 de la peau de lapin donne, avec la chondroitinase, un saccharide non identifi6 (Taches I) qui n'est digestible par aucune des deux chondrosulfatases, ainsi que du ADi-4S, digestible par la chondro-4-sulfatase et quelque peu (contre toute attente!) par la chondro-6-sulfatase. (C) La ~-h6parine se comporte comme le pr6c6dent. On a appliqu6 simultan6ment un m61ange de ADi-4 S, de ADi-6S et de ADi-oS pour d6terminer leurs migrations respectives. (D) Le sulfate de dermatane global, tel qu'il est isol6 du foie de bceuf, est scind6 Biochim. Biophys. Acta,

279 (1972) I O 2 - I I 7

Fig. 3. Chromatographies sur papier des produits de digestion de glycosaminoglycanes. Digestiom : ABC : par la chondroitinase ARC. ABC + 4 : chondroitinasc AU<‘ + chondro-+sulfatase. ABC - 6: chondroitinase ABC + chondro-6-sulfatasc. ABC ~14 L 6 : chondroitinase ABC + les deux chondrosulfatases. Substrats: (A) Sulfate de chondroitine standard. (B) Sulfate dc dermatane de la peau de lapin. (C) Sulfate de dermatane du poumon de boeuf (/3-heparine). (D) Sulfate de dermatane global du foie de boeuf. (E) Sulfate de dermatane du foie de hocuf, fraction BluCe par NaCl 1.25 RI. (F) Sulfate de dermatane du foie dc boeuf, fraction CluCe par NaCl 2.00 M. Saccharidrs te’n?oi?s: Essai C, derniere colonnc. Taches: I : Saccharide inconnu. z : Saccharide polysulfate. 3 : /lDi-6S. 4: dDi-qS. j : I’roduits dc degradation par lcs chondrosulfatases; la tache superieure est du .,lDi-oS.

par la chondroi’tinase

(Tache

2)

qui

disparait

en donnant

le saccharide

compltitement

en

(Tache

I), un

de la chondro-h-sulfatase

saccharide mais

(Tache 4) qui disparait entierement par l’action de la chondro-4-sulfatase et seulement en partie par l’action de la chondro-hsulfatase. I1 est a remarquer que l’on ne decele aucune formation de saccharide 4D-6s. Le saccharide de la Tache z possede Cvidemment un reste sulfate sur le carhone 6 de son hexosamine. D’apres les caracteres analytiques mentionnes plus loin il ne s’identifie avec aucun des disaccharides issus de l’action de la chondro‘itinase ABC d&rite par SuzukiZO et par Suzuki et al.“‘. (E) et (I;) se rapportent aux fractions du sulfate de dermatane du foie eluees respectivement par NaCl 1.25 M et 2.0 31 dent les analyses figurent au Tableau III. rirsiste

B la chondro-4-sulfatase,

et du dDi-&

non identifie

prksence

SULFATES DE DERMATANE ET D'HEPARITINE

III

L a fraction 1.25 -~']se distingue de l ' a u t r e p a r l ' a b s e n c e de p r o d u c t i o n du saccharide de la T a c h e 2 ~ la suite de l ' a c t i o n de la c h o n d r o i t i n a s e ABC.

(2) CaractOres analytiques du saccharide de la Tache 2 Nous n ' a v o n s pas pu isoler le saccharide de la Taehe 2 en q u a n t i t ~ suffisante p o u r en faire une 6tude approfondie. Mais nous avons recherch6 ses earact~res a n a l y t i ques en les c o m p a r a n t 5~ceux que S u z u k P ° a d~crits p o u r les saccharides monosulfat6s et disulfat~s p r o v e n a n t de F a c t i o n de la chondroitinase ABC. Nos o b s e r v a t i o n s conc e r n a n t n o t r e saccharide p e u v e n t ~tre r~sumfies c o m m e suit. L a fluorescence aux r a y o n s u l t r a v i o l e t s s ' a c c o r d e avec l ' h y p o t h ~ s e d ' u n acide insatur6 en ~, /~. A la c h r o m a t o g r a p h i e d e s c e n d a n t e sur papier, avec d u t i o n p a r le mdlange acide n - b u t y r i q u e - a m m o n i a q u e o. 5 M (5:3, v/v), nous t r o u v o n s un RF inf~rieur /~ ceux des disaceharides monosulfat6s. Nos valeurs sont: o.48 p o u r le d D i - o S , o.34 p o u r le 4 D i 4 S, o.29 pour le d D i - 6 S , o.2o p o u r le saccharide de la Tache 2. Selon SuzukP ° une v a l e u r aussi basse du R~ indique un disaccharide disulfatd ( d D i - d i S ~ ou ,dDi-diS,). Nous ne croyons c e p e n d a n t pas p o u v o i r conclure en ce sens car nos valeurs t~moins p o u r les .dDi non sulfatfis et monosulfat6s ne c o n c o r d e n t pas avec celles de Suzuki 3°, d o n t la t e c h n i q u e diffbre peut-fitre de la n6tre ( l ' a u t e u r a utilis6 l'acide isobutyrique). Nos essais de mobilit6 61ectrophordtique sur p a p i e r ( t a m p o n ~ l ' a c 6 t a t e o.o5 M, p H 5.o, appareil L K B ) ne p e r m e t t e n t pas de conclusion. L a Tache 2 sur p a p i e r donne une coloration j a u n e apr~s IO rain de chauffage 13o °C (comme les d D i disulfat6s selon SuzukP°). L a t a c h e sur p a p i e r trait6e p a r l ' h y d r o g 6 n o p h t a l a t e d ' a n i l i n e donne une couleur brune, c o m m e le :~lDi-diSD (SuzukP°). Le compos6 de la Tache 2 c o n t i e n t de l'acide uronique (r6action de Disehe) mais ne donne pas de r6action ~ l ' a n t h r o n e et ne donne pas de couleur ~ la rdaction de Morgan Elson. L ' h y d r o l y s e acide en lib6re une hexosamine. Le clivage exclusif p a r la chondro-6-sulfatase 61imine le dDi-diSB qui ne r6agit q u ' a v e c la 4-sulfatase et le .d Di-diS ~ qui r6agit avec les d e u x (SuzukP °, Suzuki et aI.:~). A u t o t a l le saccharide de la Tache 2 ne s'identifie /~ aucun p r o d u i t de clivage COBHU.

(3) Sulfate d'h@aritine P o u r caract~riser plus en d6tail le sulfate d ' h @ a r i t i n e , on l ' a scind~ en plusieurs fractions p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur D E A E - S e p h a d e x A25 avec ~lutions successives au m o y e n de solutions de NaC1 de molarit6s croissantes, ainsi qu'il est indiqud d a n s le T a b l e a u IV. Le r a p p o r t c a r b a z o l e / o r c i n o l et la t e n e u r en sulfate a u g m e n t e n t alors que la t e n e u r en N - a c 6 t y l e d i m i n u e lorsque la molarit6 d u sel augmente. Ces sous-fractionn e m e n t s m o n t r e n t que des impuret6s (environ 7%) c o n t e n a n t de la g a l a c t o s a m i n e p e u v e n t ~tre "limin6es. Si on lc soumet ~ l'61ectrophor~se dans le t a m p o n acide a c 6 t i q u e - p y r i d i n e et sur ac6tate de cellulose, le sulfate d ' h ~ p a r i t i n e migre un peu moins vite que l ' h @ a r i n e . Dans l ' a c 6 t a t e de calcium o.3 M, t o u i o u r s sur a c d t a t e de cellulose, les fractions d'6lud o n o.7o M, I.IO M e t 2.o M (voir T a b l e a u IV) ne sont pas i d e n t i q u e s : la fraction o.7o M migre n e t t e m e n t moins vite que les d e u x a u t r e s (Fig. 4)- L a fraction 2.o M contient, en faible quantit6, une impuret~ qui t e n d ~ se d6tacher en a v a n t de la fraction Biochim. Biophys. Acta, 2 7 9 (1972) i o 2 - i t 7

.,q

vo ,...i va

a~

,g

IV

* en g/Ioo g de substance. ** e n g C H a . C O - p e r / t o o g d e s u b s t a n c e .

Q u a n t i t 6 o b t e n u e (mg) Acide uronique* : par r~action au carbazole par r6action k l'orcinol Rapport carbazole/orcinol Hexosamines* Distribution des hexosamines: pourcentage de glucosamine pourcentage de galaetosanline Hexosamines N-sulfat6s* Azote* Soufre* N-Acdtyle* * 49.2 25.3 1-95 28. 7 92.0 8.0 22.o 2.92 4,26 4.6o

96.0 4.0 14.3 3.36 2.55 5,16

202.6

41.6 29.0 1.47 26.4

30.2

90.0 lO.O 25. 9 2.42 6.1 3.7 o

45-5 20.3 2.24 27.2

87.8

F r a c t i o n n e m e n t de 350 m g de sulfate d'h@aritine ~/Iolaritd de la f r a c t i o n 0.70 i.io 2.00

--2"50

67.3 32"7

3°.8 25.2 1.22 19.2

4 .0

0.70 3I

2.61 4 .0 ,5.25

93-3 6.7

45.6 26. 4 1.73 21.5

8.9

0.80 M

2.74 4.35 4.80

95.3 4.7

49.6 26.2 1.89 24.2

lO.5

0.00 2VI

2.66 4.66 4.48

97.0 3.0

46.6 24. 4 1.91 25.0

I7.i

2.00 34

S o u s - f r a c t i o n n e m e n t de 61 m g de la f r a c t i o n r.IO M 3Iolaritd de la f r a c t i o n

CHROMATOGRAPHIE SUR D E A E - S E P H A D E X A 2 5 DU SULFATE D'HEPARITINE

TABLEAU

2.72 4.8o 4.24

IOO.O o.o

44.4 21. 4 2.12 23. 3

16.o

1 .I0 M

--

-5.72

too.o o.o

42,8 21.2 2.02 22. 5

3.5

1.25 M

2.65 4.7.5 4.50

IOO.O o.o

45 .8 22.4 2"04 21.8

lO.5

I.IO M

2.59 5.95 3.72

96.0 4 .0

45.8 20.5 2,23 22.2

14.5

r.25 M

-6.95

80. 4 19.6

36.8 18.9 1.95 19.8

3.8

1.5o M

--

40.2 59.8

23. 4 25.2 0.93 --

I.I

2.00 34

S o u s - f r a c t i o n n e m e n t de 30 m g de la f r a c t i o n 2.00 5 I i~1olaritd de la f r a c t i o n

©

to

SULFATES DE DERMATANE ET D'HEPARITINE

113

Fig. 4. Electrophor~se de sulfate d'hdparitine sur ac6tate de cellulose (sepraphore III) dans l'acdtate de calcium o. 3 M. (I) Fraction ~lu6e par NaC1 0. 7 M. (2) Fraction 61u6epar NaCI i.io M. (3) Fraction 61ude par NaC1 2.oo M. Pour les sous-fractionnements, voir Tableau III. Fig. 5. Electrophor~se en gel d'agarose. (i) Sulfate d'h6paritine global (3 #g). (2) H6parine standard (2 #g). (3) Fraction de sulfate d'h@aritine ~lude par NaC1 0. 7 M (3 ~g). (4) Idem, 61u~e par NaC1 1.1o M (3/~g). (5) Idem, 61u6e par NaC1 2.oo M (3 #g). Pour les sous-fractionnements, voir Tableau III. principale. La coloration au bleu de toluidine m o n t r e u n virage au violet croissant de la fraction o. 7 M/~ la fraction 2.o M, ce qui est en accord avec les teneurs croissantes en sulfate m e n t i o n n 6 e s au T a b l e a u IV. Les r6sultats de l'61ectrophor~se en gel d'agarose du sulfate d ' h @ a r i t i n e sont repr6sent6s dans la Fig. 5- La substance globale ne se scinde pas en fractions distinctes; son h~t6rog6nfiit6 se t r a d u i t t o u t au plus par la coloration de la b a n d e de m i g r a t i o n qui c o n t i e n t u n e zone qui se rapproche du bleu et u n e zone qui se rapproche d u pourpre. Les mobilit6s des trois fractions (o.7 ° M, i . i 0 M e t 2.o M) isol6es au pr~alable par chromatographie, se d i s t i n g u e n t par de petites diff6rences, qui sont loin d'etre aussi marqu6es que lors de l'61ectrophor~se sur ac6tate de cellulose. On r e m a r q u e r a que, sur agarose, n o t r e h6parine-t6moin se scinde en deux b a n d e s ; la plus rapide coincide dans sa localisation avec u n e sous-fraction qui pr6c~de le sulfate d ' h 6 p a r i t i n e 61u6 par NaC1 2.o M; l ' u n e et l ' a u t r e se colorent en pourpre. DISCUSSION La m6thode que nous avons utilis6e pour isoler le sulfate de d e r m a t a n e et le sulfate d ' h 6 p a r i t i n e r6sulte de n o m b r e u x essais et contr61es. Elle eomporte u n isolem e n t pr6alable de l'ensemble des glycosaminoglycanes, u n e chromatographie sur D E A E - S e p h a d e x A25 avec deux 61utions pr6alables (NaC1 0.35 M e t 0.50 M) s e r v a n t 61iminer r e s p e c t i v e m e n t le glycog6ne et l'acide h y a l u r o n i q u e . Nous avons v6rifi6 Biochim. Biophys. Acta, 279 (1972) lO2-117

P. I~. (;Rt{(iO1RE c/~ (t/.

114

wmEkEh~r~ ( I,~RO~ )

Fig. 6. Spectres infrarouges des fractions de sulfate de dermatane. E n h a u t : fraction ~lu~e p a r NaC1 1.25 M. E n bas: fraction dlude p a r NaC1 2.oo M.

qu'en proc6dant ainsi on ne perd ni sulfate de dermatane, ni h@arine, ni sulfate d'hdparitine, ces trois polysaccharides passant enti6rement dans l'61uat final (2.o M en NaC1 dans HC1 o.oi M). Cet 61uat ne se prate pas &l'isolement de substances d6finies par un fractionnement chromatographique plus pouss6. La sdparation des glycosaminoglycanes qu'il contient n'est possible que par les pr6cipitations que nous avons d6crites. La scission en deux fractions, obtenue par 61ectrophor6se, du sulfate de dermatane du foie de boeuf n'a pas fit6 signal6e jusqu'/i pr6sent. Dans des travaux ant6rieurs (non publi~s) nous avons isol6 le sulfate de dermatane de la peau de lapin par chromatographie des mucopolysaccharides bruts sur colonne de DEAE-Sephadex A25. Nous avons constat~ que ce sulfate de dermatane commence X~tre ~lu~ d~s que l'on traite la colonne par du NaC1 o. 9 Met que la majeure partie passe dans la fraction I.O M. L'ensemble de l'61uat ne donne qu'une seule bande ~ l'dlectrophor~se. Le sulfate de dermatane h@atique se comporte autrement : son 6lution ne commence qu'~ la concentration I.IO M e n NaC1; la fraction 1.25 M a la m~me mobilitd 61ectrophor6tique que le sulfate de dermatane de la peau de lapin et la "~-h@arine" qui provient du poumon de boeuf; la fraction 2.oo M, moins abondante, migre plus vite. Biochim. Biophys. dcta, 279 (1972) lO2-117

SULFATE~ DE DERMATANE ET D'HEPARITINE

115

L'existence de deux variantes distinctes du sulfate de dermatane h@atique est confirm6e par les diff6rences analytiques des fractions 1.25 Met 2.00 M indiqu~es dans le Tableau I I I , par les spectres infrarouges (Fig. 6) et par les r6sultats des digestions enzymatiques. Alors que dans la fraction 1.25 M le rapport molaire soufre/hexosamine est 6gal g I, ce rapport atteint 1.38 dans la fraction 2.0 M. I1 en r6sulte que dans cette fraction 2.0 M deux unitds disaccharidiques sur sept doivent 8tre disulfat6es. La chondroitinase ABC lib~re de la fraction 2.0 M un saccharide qui n'apparait pas lors de la digestion de la fraction 1.25 M. Ce saccharide n'a pas 6t6 identifi6. S'il 6tait disulfat6 il rendrait compte de la mobilit6 61ectrophor6tique plus grande de la fraction 2.0 M. Le saccharide correspondant aux Taches I de la Fig. 3 reste ~t identifier. La chondroitinase le lib~re des deux sulfates de dermatane du foie de bceuf, du sulfate de dermatane de la peau de lapin et du sulfate de dermatane du poumon de bceuf (t% h@arine). I1 r6siste (au moins partiellement) ~ l'action des deux chondrosulfatases. Le sulfate d'h6paritine du foie de bceuf ne se comporte pas comme une substance unique. A l'61ectrophor~se sur papier et sur sepraphore I I I il migre comrne une tache diffuse. A la chromatographie sur DEAE-Sephadex A25 il commence g ~tre 61u6 par du NaC1 0.70 M e t nous en trouvons dans toutes les fractions jusqu'g 1.5o M NaCl (Tableau IV). A l'61ectrophor~se sur sepraphore I I I , dans l'ac6tate de calcium 0.3 M, les fractions 0.7o M, I. IO Met 2.o M, s6pardes au pr6alable sur DEAE-Sephadex, migrent de fa~on diffdrente (Fig. 4): la fraction 0.7 ° M est nettement plus lente que les deux autres. Par contre, l'~lectrophor~se des m~mes fractions sur agarose ne r~v~le que des diff~rences minimes. Le sulfate d'h@aritine du poumon de bceuf a 6t6 6tudi6 par Dietrich et al. 32, dans un travail r6cent. D'apr~s ces auteurs une 61ectrophor~se pr61iminaire en gel d'agarose r6v~le une h6t6rog6n6it6 de la substance qui migre sous forme d'une trainee diffuse. Si on d6coupe cette train~e par des incisions transversales, les fractions polysaccharidiques de chaque tranche se diff~rencient par leur mobilit6 dans l'agarose. Les auteurs s6parent ainsi quatre fractions auxquelles ils estiment pouvoir donner des noms sp6cifiques. L'isolement de ces fractions n'est pas possible par chromatographie. D'apr~s nos r6sultats le sulfate d'h@aritine du foie de bceuf se comporte de mani~re tr~s diff6rente. La chromatographie en sdpare une fraction qui se distingue de deux autres par sa mobilit6 ~lectrophor~tique sur ac6tate de cellulose. Par contre, l'filectrophor~se en agarose du produit global donne une bande assez compacte dans laquelle il ne serait pas possible de d6couper des zones de mobilit~s distinctes. D'autre part il n ' y a pas de diff6rence notable dans la mobilit6 des fractions obtenues par chromatographie. D'apr~s nos analyses le sulfate d'h@aritine du foie de bceuf est une substance polydisperse compos6e de moldcules dont le rapport N - a c 6 t y l e / N - s u l f a t e varie de mani~re continue. D'autre part, Dietrich et al. a~ signalent l'existence, dans le poumon du b~euf, d'un sulfate d'h6paritine presque d@ourvu de sulfate et d'un autre sans ac6tyle. Nous n'avons pas trouv~ de telles fractions dans nos pr@arations. Nous avons d6montr6 que des diff~rences nettes s@arent le sulfate de dermatane du foie et du poumon de bceuf (ainsi que celui de la peau de lapin). La comparaison de nos r6sultats avec ceux de Dietrich et al. ~ montre que des distinctions non moins nettes s'imposent entre les sulfates d'h@aritine pulmonaire et h@atique du bceuf. I1 Biochim. Biophys. Acta, 279 (t972) lO2-117

116

I'. E. Gt{I[¢lt,II~.E ~'l 6i[,

faut en conclure que les glycosaminoglycanes de m6me nom comportent un choix d~. macromol6cules qui d@end de l'organe dont ils proviennent. R~SUM~ Le sulfate de dermatane isol6 du foie de bceuf peut ~tre scind6 en deux fractions distinctes par 61ectrophor6se sur ac6tate de cellulose. La Fraction II, plus mobile, est plus riche en sulfate. Les deux fractions sont dig6r6es par la chondroitinase ABC. Lors de cette digestion la Fraction I ne lib6re que le disaccharide ~ Di-4S de Suzuki (J. Biol. Chem., 235 (1968) 358o) qui est scind6 par la chondro-4-sulfatase. Le m~me disaccharide est lib6r6 ~ partir de la Fraction I I qui fournit en outre un saccharide qui doit ~tre sulfat6 ~ la position 6 de son hexosamine puisqu'il est digestible par la chondro-6sulfatase, mais qui diff6re n6anmoins de tous les saccharides ddcrits jusqu'5, prdsent comme produits de l'action de la chondroitinase ABC. Les sulfates de dermatane isol6s ~ partir du poumon de bceuf ou de peau de lapin ne contiennent que des composantes polysaccharidiques semblables 5. celles de la Fraction I. Aucun des sulfates de dermatane examinds ne produit, par digestion, le disaccharide ,JDi-6S de Suzuki (J. Biol. Chem., 235 (1968) 358o). Le sulfate d'h6paritine du foie de b~euf diff6re 5. plusieurs points de vue de celui du poumon de bceuf d6crit par Dietrich el al. ~. Par chromatographie sur colonne le produit h6patique donne des fractions dont la composition varie de mani6re continue. Au moins une de ces fractions se distingue des autres par sa mobilit6 61ectrophordtique sur ac6tate de cellulose dans l'ac6tate de calcium o.3 M. Par contre, l'dlectrophor6se en gel d'agarose ne scinde pas le sulfate d'h6paritine h6patique bovin en fractions distinctes. REMERCIEMENTS

Nous remercions Monsieur le Professeur R. Lontie de l'Universit6 de Louvain qui a eu l'amabilit6 d'effectuer les mesures micropolarimdtriques. Nous remercions la firme Hoffmann-La Roche qui nous a fourni gracieusement, par l'interm6diaire de sa filiale 5 Bruxelles, un 6chantillon de sulfate de dermatane (fi-h6parine). BIBLIOGRAPHIE I K. Meyer et E. Chaffee, J. Biol. Chem., 138 (1941) 491. 2 S. Schiller, M. B. Matthews, H. Jefferson, L. Ludowieg et A. Dorfman, J. Biol. Chem., 211 (I954) 717 • 3 I~. Meyer et M. M. R a p p o r t , Science, 113 (1951) 596. 4 W. P. Deiss et A. S. Leon, J. Biol. Chem., 206 (1954) 375. 5 ~V. P. Deiss et A. S. Leon, J. Biol. Chem., 215 (1955) 685. 6 R. Marbet et A. W*interstein, Helv. Chim, Acta, 34 (1951) 2311. 7 I4. Meyer, A, Linker, E, D a v i d s o n et B. Weissmann, J. Biol. Chem., 205 (1953) 611. 8 J. E. J o r p e s et S. Gardell, J. Biol. Chem., 176 (1948) 267. 9 K. Meyer, E. Davidson, A. Linker et P. Hoffman, Biochim. Biophys. Acta, 21 (1956) 506. IO A. Linker, P. Hoffman, P. S a m p s o n et IZ. Meyer, Biochim. Biophys. Aela, 29 (1958) 443. i i A. D o r f m a n et A. E. Lorincz, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 43 (1957) 443. 12 K. Meyer, M. M. G r u m b a c h , A. Linker et P. Hoffman, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 97 (1958) 275. 13 S. Schiller, G. A. Slover et A. Dorfnlan, J. Biol. Chem. 236 (1961) 983. 14 M. G. Sevag, Biochem. Z., 273 (1934) 419 . 15 L. Strandberg, Acta Physiol. Scan&, 21 (195 o) 222.

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SULFATES DE DERMATANE ET D ' H E P A R I T I N E 16 17 18 19 20 21 :22 23 24 25 26 27 28 29 3° 31 32 33 34

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