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Technique de dosage des immunoglobulines par une méthode radio-immunologique en phase solide
Revue Fran~aise de Transfusion. T. XIII. N° 2. -- 1970
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Technique de dosage des immunoglobulines par une mdthode radio-immunologique en phase solide p a r P.-J. AMOUCH, J. D R O U E T et J.-M. FINE avec la collaboration technique de A. D R O U E T (Centre National de Transflrsion Sanguine Paris) I L ~pparait de ptlns en plus importan.t dans le domaine de la re zherche irnmunologique de disposer de techniques ~ la ,fois pr6cises et sensi.b~les pour le dosage des immuno,globulines. La g6n&atlisation de l'utilisation des techniques de diffusion radiale, salon MANCINI [1], a d6j.~ permis de frarmhir une ~t~pe importante clans ce type de dosage ; cependant cette techni.que a ses limites et pe~d de s a pr&ision quand ~es concentrations en immunoglo,bulines sont inLf6rieures ~ 1,25 microgrammes par ,millilitre. Par ailleurs, eette tezhnique de dosage donne sou~vent des r&ultats moins pr&is quand on l'ap~plliqne au dosage non plus des mol6cules enti~res, mais des fragments ant ig6niques de ~faib~e poids mo~6cnlaire. De 1960 ~ 1969, diff6rentes techniques de d~sage radio-im~nunologique ont 6t$ d&rites, par WEILER [~2] et FAHEY [3] entre autres, toutes ces techniques dfaisaient intervenir des r&ctions d'in,hibition. El'les 6taient certes particuli~re,ment fines, mais semblaient devoir rester du domaine de laboratoires h a u t e m e n t sp&iMi~s6s. C'est en 1966 et 1967 q u ' o n t &6 introdnites les m~thodes de radioManuscrit reSu le 1-7-1970.
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P..J. A M O U C H
et coll.
i m m u n o l o g i e en .phase soli.de, c'es.t-&-dire ,par fixation sur des i~mmunoa,dsor,b,an~s, m&thodes ~qui ont a~nen& un.e grancle simpli,ficat.ion ~de .ee t y p e de dosage. C'est CATT e~ TRI~GEAR [4, 5] c[ui d6cri.vent en 1967 u n e p r e m i e r e m6tho,de radio-immuno~ogique, r&a,lisa,ble .sans grandes di,fficult6s en p h a s e soli.cle et a~pplicable ~vec une ,pr6cision satisfaisante au ,dosage des immunoglo,bulines. La m $ t h o d e d6.crite p a r ces auteurs est 'bas,6e sur tia possi,bilit& que g a r d e u n e i m m u n o g ] o b u l i n e a,dsorb.&e sur une m a t i ~ r e p l a s d q u e s u p p o r t , de fixer 1'antigOne sp&cifique c o r r e s p o n d a n t . L.es p r e m i e r s i m m u n o - a d s o r b a n t s e~ploy&s o n t ~t& des p o l y m ~ r e s su'bsti.tu'~s, en ~partieulier des isothio,cyanates c o m m e le #o~lyprop.yl~ne isothio,cyan~te o u le S e p h a d e x i.sothiocyanate, et les .auteurs les utilisaient alors en ,batch sous ,for~e de p o u d r e . I1 ,de,vint r~pi,dement a p p a r e n t .que clans certaines .conditions i] .6tait ~possible de ,faire s'adsor,ber ,d'une m a n i ~ r e solide des anti,corps sur des mati~re.s p]as.t~ques n o n subs:titu'&es c o m m e le ,po}ypropyl~ne ou le ,polyEthylene 'par exem~ple, et q u e cet ensemble m a t i ~ r e ,pbastique/anticorps g a r d a i t ,la ,propri&~& de fixer sp&ciil, quem e n t ,l'antig6ne corres~pondant, .ceici en utilisant .ees pol~m~res solides sous f o r m e de disques ou m i e u x encore .de tubes. C'es.t sur ces ,bases ,qu'une p r e m i e r e .techni.que a &t'6 d6crite p a r CATT et TRE6EAR en 1967.
Albumine\
ili::
...i Tube polystyrene
!~ii':! ?',L
c;~:.
Tube
, , t ~, j F
2
FI~. 1 . - 1: tubes pr~-trait~s selon la technique du sandwich antiggne puis anticorps. 2 : tubes pr6-trait6s par simple adsorption de ranticorps.
DOSAGE DES 1MMUNOGLOGULINES
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Cette technique consiste h fixer p a r adsorption sur des ,patois d ' u n tube plastique (~polystyr~ne) u n anticorps en solution dilu6 dans des conditions pr~cises de p H de ~nani~re ~ r~a'liser une surface t~piss6e d'ant~corps sur laquelle viendra se fixer 'l'anti~g~ne sp$ci,fi~que corresp o n d a n t ~ doser. Cette tec~hnique p e r m e t t M t d6jh d'am~'liorer la sensibi'lit~ des dosages et 6tait capable de rester ~pr6eise p o u r de ,faibles concentrations d ' i m m u n o glo,bu'lines. La technique q u e nous avons ernp'loy6e m a r q u e une ~tape de ~p'lus dans 'l'utilisation des dosages radio-immuno'lo,g~ques en phase solide ; e'lle a ~t~ d~crite p a r SALMON et FUD~BE~G en 1969 sous le qualifi,catif de <> [6]. La ~phase solide destin~e au ~dosage est prSpar6e d ' u n e mani~re diff6rente ,par r~allsation de deux couches successives ~ ~la surf.ace de la mati~re ~p'lastique. Une p r e m i e r e couche est constit~6e ,par u n antigone identique ce'lui ~ doser, adsorb~ sur le plastique ; sur cette couche est fixSe p a r 'liaison i m m u n o c h i m i q u e une couche d'anti,co~ps sp~c~fique de cet ar~tig~ne (Fig. 1).
A, - P r 6 p a r a t i o n de la p h a s e solide
Le ~node op6ratoire p o u r la pr6paration de cet,te phase so~lide en t u b e est le sui+ant : 1 °) Dans chaque tube (en polystyrene) on d6pose : 1 m l ,d'une solution d'antig~ne (immunoglobu~ine purifi6e) h 41a concentration de 0,5 m g / m l en ta.nrpon bicarbonate p H 8 ; on laisse incuber une nuit ]a tem~p~ra~nre du ~iaboratolreo 2 °) Le lendemain, on vide le tube (la solution d'antig~ne qui reste est gard6e pour une prochaine pr6paration) et celui-ci est lay6 3 fois a.vec du chlorure de sodium 0,15 M. 3 °) 'On r e m p l i t alors les tubes a+ec une solution d ' a l b u m i n e bovine ~ 1 % et on lalsse incuber 12 heures h la temp6rature du laboratoire. Ce temps de la pr6paration a p o u r h u t de recouvrir route la surface encore libre de la paroi plasti, que a+ec de ]'alburnine de manibre Sviter dans la suite du dosage la fixation directe non immuuo'logique d'une immunog'lobu'line sur la ~paroi.
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Apr6s 12 'heures, les tubes sont rin.c'~s 3 foils avee du zhlorure de sodium 0,15 M. 4 °) ,On ,proc6de d o t s h la r6al~sadon de la derni6re .cuuc'he du << sandwich >> en ajout.ant darts chaque tube 1 ml de solution d'anti.corps dilu6 en C,l?qa ta~a'ponn6 (ave.c 0 , 1 % d'azide de sodium). 3~pr6s 24 heures d'in,cubation ~ la .tem'p6rature du la,boratoire, les tubes sont v~d6s et rine6s 3 fois avec d u C1Na 0,15 M.
B.
-
Dosage
'Les tubes ainsi ,pr6par6s. sont ,pr4ts ~ &tre utilis.6s p o u r le dosage p r o p r e m e n t dit. Ce dosage comporte ,l'6tablissement d'une .courbe standard ,clans un temps pr61~minaire. P o u r ,ce faire, on ajoute clans une s6rie de tubes ,pr6trait6s un m61ange sons volume constan.t, d'une quandt6 .eroissante d'IgG purifi6e et de 10 ~,1 d'une solution d'I,gG purifi6e radio-iod6e dont l'acti~dt6 sp6cifique est de l'ordre de 10 TCi p a r m i .cro.gramme (iodation a l'Iude 125 selon la m6thode de HUNTER, GREENWOOD et GLOWR [7]. Ce m61an~ge de quandt6 croissante d'IgG puri~i6e (25, 50, 100, 150, 200, 250, 300 et 400 nanogrammes) et d'I, gG marqu:6e est ajont.6 dans un milieu albumineux (1 ml d'albumine bo,eine en solution .a 1%). Ges tubes sont 'plac6s a l'6tuve ~ 37°~C duran.t 24 heures. Les lois de la dilution isotopique s'appliquent ~ la comp6tition qui s'6tablit a~u .cours de cette incubation entre les I,gG non radio-iod.6es ~. 'la quantit6 fixe d'IgG marqu6es pr6sentes clans le m61an,ge au cunts de la fixation immunochimique sur ,l'anticorps fi:~6 h la paroi du tube. E n cons6quence, il y aura d'autant moins ,d'IgG marqu6e fix6e sur l e tube en firi d'incubation qu'il y a plus d',IgG non marqu6e dans le m61ange d'incubation. Apr6s incubation, les tubes sont vid6s, rinc6s et la radioa,ctivi~6 compt6e dans un ensemble de d6tection h passeur d',6eh.antiHons liquides. Les r6sultats sont exprim6s en pourcentage.s ,par ra~p~port gl l'activit6 initiale de 'l'IgG marqu6e (traceur). La courbe standard peut ainsi 6tre .6ta.blie, la s6rie de tubes contenant des cfuant.it6s connues croissantes d'IgG (Fig. 2). P o u r le dosage des IgG dans un 6chantillon, il su~ffira de pro,c6der
DOSAGE DES IMMUNOGLOGULINES
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de la m61ne mani6re et de ra,pporter les r6sultats du .compta.ge des tubes ~ la eourbe standard pour d6duire la teneur en IgG de l'6ehanti~llou 6tudi6.
Radioactivit6 en %
COURBE
STANDARD
Anti IgG
1/lOOe
75 \
\
\
\\ \\
"\ o'\
\
5C
"e
\
nanoc~rammes IgG
s'o
~do
1~0
200--
300
F~u. 2
Sen~ibili~6 La sensibilit6 de la m$thode est fonction de la m6thode utilis6e .polar le pr6-traitement des tubes et, en particulier, elle d6pend du choix d'.une dilution o.ptimale de l'anticorps, lots de la r6alisation du sandwich. Aussi, afin d'obten.ir la meil~leure sensibilit6, est.il n6cessaire de faire une 6tude pr$alab~e de la recherche de cette dilution optimale. Dans un temps pr6alab'le, pour un syst&me antig&ne anticorps bien d6termin6, on rgalisera une s6rie de tubes pr6trait6s avec des
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s6ries de dilutions de l'anticorps choisi. C h a c u n e de ces dilutions servira an pr6-traitement de 2 tubes. Au premier, nous ajoutons 10 nanogrammes d ' I g G radio-iod6e, au second 10 n a n o g r a m m e s d ' I g G radioiod6e associ6e h 200 n a n o g r a m m e s d ' I g G non marqu6e. La dilution optimale de l'anticorps h retenir p o u r de p r 6 t r a i t e m e n t des tubes destin,6s au dosage est c~lle qui donne pour les deux tu~bes de plus grand 6cart de comptage. Dans notre exp6rience personnelle, la dilution o ptimale retenue a 6t6 celle de 1/100 ° (Fig. 3).
10( i i
RadJo-Activlt~ en %
Dilution de Anti IgG
+
Incubation en tube plastique avec : • IgG 1125 10 ng
I
• IgG 1125 10 ng + tgG 200 ng
/
25
Dilution Anticorps
1/~ 1/~0 1/20 1/40
1/80
1/360
1/320
FIG. 3. - - Choix de l a dilution o p t i m a l e de l'anticorps. (Dilution retenue 1/100~).
R6sultats Nous avons appliqu6 cette m6thode ~ des ,pools de .Flasma h des .dilutions du 1/500 e ou de 1/1000 ¢ et ~ des solutions d'IgG. Les r6su]tats du dosa,ge ont 6t6 corn,parables h eeux des techniques d'immuno.diffusion radiale. Sur le s6rum cependant, le fait qu'avec des solutions au 1/10003 les r6suhats se soient montr6s r6guli~rement utilisables souligne bien le progr~s que cette technique repr6sente quan¢ ~ sa sensibilit6. Elle permet, en effet, ,de d6tecter et de mesurer avec pr6cision des concentrations d'immunoglobulines de l'ordre de 10 ~ 20 n a n o g r a m m e s / m i l l i l i t r e .
DOSAGE DES 1MMUNOGLOGULINES
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Conclusions
Nous avons re,pris la technique d4crite par Sydney SALMON et coll. et mis au point les d6tails de la pr6paration d'un 616'ment solide (tube) pr6trait6 uti:lisable pour le dosage des immuno~lobulines G selon une m6thode qui permet d'ap,pr6cier des concentrations de l'ordre de 10 20 nanogrammes/millilitre de ,~6tte prot'6ine. Une telle m6thode A la fols sensible, ,pr6cise et reproductible .parait ouvrir une vole nouvelle clans le dosage des antig6n.es ou des anticor,ps ~pr6sents h de tr~s faibles con.centrations. De p'lus, compte tenu de la possi'biltt6 de pr6,parer ~t l'~vanee des s6ries de tubes d'examens pr6trait6s p o u r un syst6me antig6ne anticorps particulier, elle permet d'effe,ctuer des dosages rapides, ~ condition toutefois de disposer d'un laboratoire de radio:acti,vit6 bien 6qui~p6.
RESUM~ Une technique radio-immunol.ogique utilisant comme support solide des tubes de mati6re plastique a 6t6 utflis6e pour le dosage des immunoglobulines G. L'utilisation de la +forme << Sandwich >> a permis d'atteindre darts ce dosage une tr~s grande sensibfli,t6 rendant possible ~le dosage de concentration de 10 nanogrammes d'IgG par ml. La recherche des conditions o,ptimales de la r6alisation de cette technique a 6t6 pr6cis6e.
SUMMA R ¥ A radioimmuno assay technic in solid phase using plastic it, bcs .is used for the qualltitative determination o'f IgG. The << sandwich >> 'form of the coated tubes ¢~ve a very high sensitivity and make possible the detection o'f concentration as ~ow as 10 nanogrammes per milliliter of IgG. The conditions o|" the preparation of the precoated tubes are studied. P. AMOUCH,
Centre National de Transfusion Sanguine 6, rue A. Cabanel~ Paris 15'e.
P..J. AMOUCH et coll.
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BIBLIOGRAPHIE [1] MANCINI G., CARBONARA A. D., and HEREMANS J. F. - - Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry, 2, 235, 1965. [2] WEILER R. J., HOFSTllA D., SZENTIVANYL A . , BLAII)SELL R. and TALMAGE D. W. - - The inhibition of labelled antigen ,precipitation as a ,measure of serum y-globulin. J. Immunol., 85, 130, 1960. [3] FAHEy J. L. and LAWRENCE "M. - - Quantitative determination of 6,6 S "/-globulins, fi2A.globulins and "/1-Macroglobulins in h u m a n serum. J. lmmnnol., 91, 597, .196!3. [4] C.~TT K. and TREGEAR G. W. - - Solid phase radioimmunoassay in antibody coated tubes. Science, 158, t.570, I~67. [5] CATT K., TREGEAR G. W. and NIALL H. D. - - A solid phase disc radioinmmnoassay for h u m a n growth hormone. J. Lab. Clin. Med., 70, 820, 1967. [6] SALMON S. E., ~A,CKEY G. and FUDENBERG H. - - Sandwich solid phase radioimmunoassay for the quantitative determination of 1)uman immunoglobulins. J. immunol., 103, 129, 1969. [73 HUNTER W. M., GREEI~WOOD F. C. and GLOVE~ J. S. - - The preparation of I 131 labelled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochemistry, 89, 114, 1963.
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Technique de dosage des immunoglobulines par une mdthode radio-immunologique en phase solide p a r P.-J. AMOUCH, J. D R O U E T et J.-M. FINE avec la collaboration technique de A. D R O U E T (Centre National de Transflrsion Sanguine Paris) I L ~pparait de ptlns en plus importan.t dans le domaine de la re zherche irnmunologique de disposer de techniques ~ la ,fois pr6cises et sensi.b~les pour le dosage des immuno,globulines. La g6n&atlisation de l'utilisation des techniques de diffusion radiale, salon MANCINI [1], a d6j.~ permis de frarmhir une ~t~pe importante clans ce type de dosage ; cependant cette techni.que a ses limites et pe~d de s a pr&ision quand ~es concentrations en immunoglo,bulines sont inLf6rieures ~ 1,25 microgrammes par ,millilitre. Par ailleurs, eette tezhnique de dosage donne sou~vent des r&ultats moins pr&is quand on l'ap~plliqne au dosage non plus des mol6cules enti~res, mais des fragments ant ig6niques de ~faib~e poids mo~6cnlaire. De 1960 ~ 1969, diff6rentes techniques de d~sage radio-im~nunologique ont 6t$ d&rites, par WEILER [~2] et FAHEY [3] entre autres, toutes ces techniques dfaisaient intervenir des r&ctions d'in,hibition. El'les 6taient certes particuli~re,ment fines, mais semblaient devoir rester du domaine de laboratoires h a u t e m e n t sp&iMi~s6s. C'est en 1966 et 1967 q u ' o n t &6 introdnites les m~thodes de radioManuscrit reSu le 1-7-1970.
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i m m u n o l o g i e en .phase soli.de, c'es.t-&-dire ,par fixation sur des i~mmunoa,dsor,b,an~s, m&thodes ~qui ont a~nen& un.e grancle simpli,ficat.ion ~de .ee t y p e de dosage. C'est CATT e~ TRI~GEAR [4, 5] c[ui d6cri.vent en 1967 u n e p r e m i e r e m6tho,de radio-immuno~ogique, r&a,lisa,ble .sans grandes di,fficult6s en p h a s e soli.cle et a~pplicable ~vec une ,pr6cision satisfaisante au ,dosage des immunoglo,bulines. La m $ t h o d e d6.crite p a r ces auteurs est 'bas,6e sur tia possi,bilit& que g a r d e u n e i m m u n o g ] o b u l i n e a,dsorb.&e sur une m a t i ~ r e p l a s d q u e s u p p o r t , de fixer 1'antigOne sp&cifique c o r r e s p o n d a n t . L.es p r e m i e r s i m m u n o - a d s o r b a n t s e~ploy&s o n t ~t& des p o l y m ~ r e s su'bsti.tu'~s, en ~partieulier des isothio,cyanates c o m m e le #o~lyprop.yl~ne isothio,cyan~te o u le S e p h a d e x i.sothiocyanate, et les .auteurs les utilisaient alors en ,batch sous ,for~e de p o u d r e . I1 ,de,vint r~pi,dement a p p a r e n t .que clans certaines .conditions i] .6tait ~possible de ,faire s'adsor,ber ,d'une m a n i ~ r e solide des anti,corps sur des mati~re.s p]as.t~ques n o n subs:titu'&es c o m m e le ,po}ypropyl~ne ou le ,polyEthylene 'par exem~ple, et q u e cet ensemble m a t i ~ r e ,pbastique/anticorps g a r d a i t ,la ,propri&~& de fixer sp&ciil, quem e n t ,l'antig6ne corres~pondant, .ceici en utilisant .ees pol~m~res solides sous f o r m e de disques ou m i e u x encore .de tubes. C'es.t sur ces ,bases ,qu'une p r e m i e r e .techni.que a &t'6 d6crite p a r CATT et TRE6EAR en 1967.
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FI~. 1 . - 1: tubes pr~-trait~s selon la technique du sandwich antiggne puis anticorps. 2 : tubes pr6-trait6s par simple adsorption de ranticorps.
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Cette technique consiste h fixer p a r adsorption sur des ,patois d ' u n tube plastique (~polystyr~ne) u n anticorps en solution dilu6 dans des conditions pr~cises de p H de ~nani~re ~ r~a'liser une surface t~piss6e d'ant~corps sur laquelle viendra se fixer 'l'anti~g~ne sp$ci,fi~que corresp o n d a n t ~ doser. Cette tec~hnique p e r m e t t M t d6jh d'am~'liorer la sensibi'lit~ des dosages et 6tait capable de rester ~pr6eise p o u r de ,faibles concentrations d ' i m m u n o glo,bu'lines. La technique q u e nous avons ernp'loy6e m a r q u e une ~tape de ~p'lus dans 'l'utilisation des dosages radio-immuno'lo,g~ques en phase solide ; e'lle a ~t~ d~crite p a r SALMON et FUD~BE~G en 1969 sous le qualifi,catif de <
A, - P r 6 p a r a t i o n de la p h a s e solide
Le ~node op6ratoire p o u r la pr6paration de cet,te phase so~lide en t u b e est le sui+ant : 1 °) Dans chaque tube (en polystyrene) on d6pose : 1 m l ,d'une solution d'antig~ne (immunoglobu~ine purifi6e) h 41a concentration de 0,5 m g / m l en ta.nrpon bicarbonate p H 8 ; on laisse incuber une nuit ]a tem~p~ra~nre du ~iaboratolreo 2 °) Le lendemain, on vide le tube (la solution d'antig~ne qui reste est gard6e pour une prochaine pr6paration) et celui-ci est lay6 3 fois a.vec du chlorure de sodium 0,15 M. 3 °) 'On r e m p l i t alors les tubes a+ec une solution d ' a l b u m i n e bovine ~ 1 % et on lalsse incuber 12 heures h la temp6rature du laboratoire. Ce temps de la pr6paration a p o u r h u t de recouvrir route la surface encore libre de la paroi plasti, que a+ec de ]'alburnine de manibre Sviter dans la suite du dosage la fixation directe non immuuo'logique d'une immunog'lobu'line sur la ~paroi.
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Apr6s 12 'heures, les tubes sont rin.c'~s 3 foils avee du zhlorure de sodium 0,15 M. 4 °) ,On ,proc6de d o t s h la r6al~sadon de la derni6re .cuuc'he du << sandwich >> en ajout.ant darts chaque tube 1 ml de solution d'anti.corps dilu6 en C,l?qa ta~a'ponn6 (ave.c 0 , 1 % d'azide de sodium). 3~pr6s 24 heures d'in,cubation ~ la .tem'p6rature du la,boratoire, les tubes sont v~d6s et rine6s 3 fois avec d u C1Na 0,15 M.
B.
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Dosage
'Les tubes ainsi ,pr6par6s. sont ,pr4ts ~ &tre utilis.6s p o u r le dosage p r o p r e m e n t dit. Ce dosage comporte ,l'6tablissement d'une .courbe standard ,clans un temps pr61~minaire. P o u r ,ce faire, on ajoute clans une s6rie de tubes ,pr6trait6s un m61ange sons volume constan.t, d'une quandt6 .eroissante d'IgG purifi6e et de 10 ~,1 d'une solution d'I,gG purifi6e radio-iod6e dont l'acti~dt6 sp6cifique est de l'ordre de 10 TCi p a r m i .cro.gramme (iodation a l'Iude 125 selon la m6thode de HUNTER, GREENWOOD et GLOWR [7]. Ce m61an~ge de quandt6 croissante d'IgG puri~i6e (25, 50, 100, 150, 200, 250, 300 et 400 nanogrammes) et d'I, gG marqu:6e est ajont.6 dans un milieu albumineux (1 ml d'albumine bo,eine en solution .a 1%). Ges tubes sont 'plac6s a l'6tuve ~ 37°~C duran.t 24 heures. Les lois de la dilution isotopique s'appliquent ~ la comp6tition qui s'6tablit a~u .cours de cette incubation entre les I,gG non radio-iod.6es ~. 'la quantit6 fixe d'IgG marqu6es pr6sentes clans le m61an,ge au cunts de la fixation immunochimique sur ,l'anticorps fi:~6 h la paroi du tube. E n cons6quence, il y aura d'autant moins ,d'IgG marqu6e fix6e sur l e tube en firi d'incubation qu'il y a plus d',IgG non marqu6e dans le m61ange d'incubation. Apr6s incubation, les tubes sont vid6s, rinc6s et la radioa,ctivi~6 compt6e dans un ensemble de d6tection h passeur d',6eh.antiHons liquides. Les r6sultats sont exprim6s en pourcentage.s ,par ra~p~port gl l'activit6 initiale de 'l'IgG marqu6e (traceur). La courbe standard peut ainsi 6tre .6ta.blie, la s6rie de tubes contenant des cfuant.it6s connues croissantes d'IgG (Fig. 2). P o u r le dosage des IgG dans un 6chantillon, il su~ffira de pro,c6der
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de la m61ne mani6re et de ra,pporter les r6sultats du .compta.ge des tubes ~ la eourbe standard pour d6duire la teneur en IgG de l'6ehanti~llou 6tudi6.
Radioactivit6 en %
COURBE
STANDARD
Anti IgG
1/lOOe
75 \
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5C
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nanoc~rammes IgG
s'o
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Sen~ibili~6 La sensibilit6 de la m$thode est fonction de la m6thode utilis6e .polar le pr6-traitement des tubes et, en particulier, elle d6pend du choix d'.une dilution o.ptimale de l'anticorps, lots de la r6alisation du sandwich. Aussi, afin d'obten.ir la meil~leure sensibilit6, est.il n6cessaire de faire une 6tude pr$alab~e de la recherche de cette dilution optimale. Dans un temps pr6alab'le, pour un syst&me antig&ne anticorps bien d6termin6, on rgalisera une s6rie de tubes pr6trait6s avec des
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s6ries de dilutions de l'anticorps choisi. C h a c u n e de ces dilutions servira an pr6-traitement de 2 tubes. Au premier, nous ajoutons 10 nanogrammes d ' I g G radio-iod6e, au second 10 n a n o g r a m m e s d ' I g G radioiod6e associ6e h 200 n a n o g r a m m e s d ' I g G non marqu6e. La dilution optimale de l'anticorps h retenir p o u r de p r 6 t r a i t e m e n t des tubes destin,6s au dosage est c~lle qui donne pour les deux tu~bes de plus grand 6cart de comptage. Dans notre exp6rience personnelle, la dilution o ptimale retenue a 6t6 celle de 1/100 ° (Fig. 3).
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RadJo-Activlt~ en %
Dilution de Anti IgG
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Incubation en tube plastique avec : • IgG 1125 10 ng
I
• IgG 1125 10 ng + tgG 200 ng
/
25
Dilution Anticorps
1/~ 1/~0 1/20 1/40
1/80
1/360
1/320
FIG. 3. - - Choix de l a dilution o p t i m a l e de l'anticorps. (Dilution retenue 1/100~).
R6sultats Nous avons appliqu6 cette m6thode ~ des ,pools de .Flasma h des .dilutions du 1/500 e ou de 1/1000 ¢ et ~ des solutions d'IgG. Les r6su]tats du dosa,ge ont 6t6 corn,parables h eeux des techniques d'immuno.diffusion radiale. Sur le s6rum cependant, le fait qu'avec des solutions au 1/10003 les r6suhats se soient montr6s r6guli~rement utilisables souligne bien le progr~s que cette technique repr6sente quan¢ ~ sa sensibilit6. Elle permet, en effet, ,de d6tecter et de mesurer avec pr6cision des concentrations d'immunoglobulines de l'ordre de 10 ~ 20 n a n o g r a m m e s / m i l l i l i t r e .
DOSAGE DES 1MMUNOGLOGULINES
171
Conclusions
Nous avons re,pris la technique d4crite par Sydney SALMON et coll. et mis au point les d6tails de la pr6paration d'un 616'ment solide (tube) pr6trait6 uti:lisable pour le dosage des immuno~lobulines G selon une m6thode qui permet d'ap,pr6cier des concentrations de l'ordre de 10 20 nanogrammes/millilitre de ,~6tte prot'6ine. Une telle m6thode A la fols sensible, ,pr6cise et reproductible .parait ouvrir une vole nouvelle clans le dosage des antig6n.es ou des anticor,ps ~pr6sents h de tr~s faibles con.centrations. De p'lus, compte tenu de la possi'biltt6 de pr6,parer ~t l'~vanee des s6ries de tubes d'examens pr6trait6s p o u r un syst6me antig6ne anticorps particulier, elle permet d'effe,ctuer des dosages rapides, ~ condition toutefois de disposer d'un laboratoire de radio:acti,vit6 bien 6qui~p6.
RESUM~ Une technique radio-immunol.ogique utilisant comme support solide des tubes de mati6re plastique a 6t6 utflis6e pour le dosage des immunoglobulines G. L'utilisation de la +forme << Sandwich >> a permis d'atteindre darts ce dosage une tr~s grande sensibfli,t6 rendant possible ~le dosage de concentration de 10 nanogrammes d'IgG par ml. La recherche des conditions o,ptimales de la r6alisation de cette technique a 6t6 pr6cis6e.
SUMMA R ¥ A radioimmuno assay technic in solid phase using plastic it, bcs .is used for the qualltitative determination o'f IgG. The << sandwich >> 'form of the coated tubes ¢~ve a very high sensitivity and make possible the detection o'f concentration as ~ow as 10 nanogrammes per milliliter of IgG. The conditions o|" the preparation of the precoated tubes are studied. P. AMOUCH,
Centre National de Transfusion Sanguine 6, rue A. Cabanel~ Paris 15'e.
P..J. AMOUCH et coll.
172
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