- Email: [email protected]
Thermochromatographie sur papier—XIII
Talanu, 1970.Vol. 17,pp. 1115to 1124.PcrmmmiPKSS. Printedin NorthernIreland
THERMOCHROMATOGRAPHIE
SUR PAPIER-XIII
CONSIDfiRATIONS SUR L’EFFICACITR DE LA SfiPARATION EN CHROMATOGRAPHIE A GRADIENT DE TEMP&ATURE C. LITEANUet S. GOCAN Chaire de Chimie analytique, Universit6 de Cluj, dluj, Roumanie (Recu le 23 fhrier 1970. AcceptP le 1 mai 1970) R&nun&On a ttudik quelques probkmes concernant l’e&aciM de la chromatographie a gradient de tempkrature compar6e A celle de la chromatographie isotherme. On a d6duit I’expression suivante pour la chromatographie it gradient de tempbature: d
eh /I est le coefficient de ¶tion, a1 et aisont les coefficients de partage de deux substances il &parer, RQ est le facteur de ralentissement pour la substance de coefficient aI, v est le volume de l’tluant dans la colonne, Auest le volume suppl&mentaire d’&umt passant il travers la colorme par suite de l’kvaporation cau& par le gradient de temp&ature, AYIest la surface de la section droite de la phase mobile et d est la distance entre les centres des taches sur le chromatogramme. On a montrk que sous l’influence du gradient de tempkrature Au peut &KIsufiisamment grand pour la @ration de deux substances avec un rapport al/as t&s voisin de 1. Pour c&e raison la chromatographie il gradient de tempkrature avec une colonne ouverte est le moyen de skparation le plus efficace jusqu’8 prt%ent connu.
DANS une s&e de travaux antkrieurs,1-12 nous avons &udi& pour la premiere fois l’action du gradient de tempkature associk au gradient de la tension de vapeur de la phase mobile sur la siparation chromatographique sur papier de diffkrentes substances minCrales et organiques. Le dt5veloppement en gradient de tempkature a Ctt5fait a l’aide des installations d&rites par nous dans les mkmoires. 14*7*9*11La Fig. 1 repksente une chambre chromatographiquell ayant la capacitb des chambres usuelles. Cette chambre est un prisme carrC a doubles parois latkrales en Plexiglas. Les faces infkieure et supkieure sont constituQs par deux couvercles d&achables (Fig. l* et lb). L’Bluant E est contenu dans un rkipient en verre B, muni d’un serpentin S,, dont la vue en plan est donnde par la Fig. le, et a travers lequel circule l’eau d’un thermostat T,; la temperature de Muant (approx. 20”) est mesurQ & l’aide du thermom&tre t, . La tempkrature de la partie supkieure a M obtenue dans un cas (Fig. la) 81l’aide d’un systkme thermostatb, comprenant un thermomhtre g contact T,, un relais kctromagn~tique RE et un corps de chauffage R. Le corps de chauffage est form6 par 6 r&istances en sCrie, introduites chacune dans un tube en verre rempli d’alumine. Le couvercle supkieur de la chambre chromatographique est pr&+entt sur la Fig. 1”. La tempkrature de la zone supkieure est mesuke a l’aide du thermombtre t,. Dans un autre cas (Fig. lb), cette temperature a Btb obtenue au moyen d’un serpentin S,, traversC par un courant d’eau provenant d’un thermostat T,. Ix couvercle 1115
1116
C. LITMNU
et S. GOCAN
(b)
Fko. l.-L’apparate pour chromatographie A gradient de tempkture (dkription dans la texte). sup6rieur de la chambre chromatographique est represent6 sur la Fig. Id. La temperature de la zone superieure est mesuree a l’aide du thermometre t,. Dans les deux cas, deux tiges T, k&s dans le couvercle supkieur, sont pourvues a l’extr&nM plongeant dans la chambre chromatograpbique dune piece de Plexiglas P, dune longueur d’environ 130 mm, dans laquelle est pratiquee une fente pour fixer le papier chromatographique H A l’aide des clous en verre C (Fig. lf). La chambre chromatographique est munie d’un agitateur A en verre. Dans le prkent travail, on examine quelques problemes relatifs B l’efficacite de la separation en c~o~to~ap~e a gradient de temperature par comparaison a la chromatographie isotherme. Le problbme de l’efficacite de la separation en chromatographie isotherme sur papier et en couche mince a et6 aborde dans quelques travaux13-ls par de Ligny et collaborateurs, qui ont etabli une relation permettant d’analyser l’efficacite de la
Themwchromatographiesur papier-XIII
1117
tiparation de plusieurs acides amink sur diffkrentes sortes de papier chromatographique Whatman et sur plusieurs sortes de poudres de cellulose, l’6luant employ6 Ctant le butanol-acide ac&ique-eau (v/v 4: 1: 5). Duncan” donne aussi une relation pour la chromatographie en couche mince et montre que la separation de deux substances peut avoir lieu si la valeur de r dans la formule (1) est supkieure a l’unitk:
a &ant la valeur Ri de la substance migrant le plus vite, b la valeur Rt de la substance migrant le plus lentement sur la couche mince. Nous considkrons que, pour donner des indications pr6cises concernant la ¶tion de deux substances, la valeur de r doit &tre absolument associQ ZIla hauteur de la colonne. Considkons les deux exemples suivants: Ri, = 0,13 et Rf, = O,lO, soit r = 1,15; R,* = 0,90 et Rf, = 0,69, r = 1,15. Dans le premier cas, ARi = 0,03 et, dans le dew&me cas, ARt = 0,21. Si l’on admet que la sbparation de deux substances est r&lide quand leurs spots sont tangents, et en admettant que la distance de leurs centres soit d = 10 mm, conform6ment a la relation,n ARi = d/Z, la hauteur de la colonne nkcessaire, dans le premier cas, sera I = 333 mm et, dans le dew&me cas, 47 mm. La diffdrence des valeurs R, peut meme Ctre plus petite, la valeur de r restant cependant supkieure a l’unitk, par exemple: A& = 0,10-0,08, r = 1,ll; dans ce cas, pour que la sbparation soit possible, il faudrait une colonne chromatographique d’une hauteur 1 = 0,50 m. Des exemples citks, il rksulte que le fait que r soit supkieur & l’unit6 ne suffit pas pour caractkiser les conditions de separation de deux substances. Dans la chromatographie de partage sur papier, Consden, Gordon et Martini’ ont d6fini le paramhtre Ri par la relation
a &ant le coefficient de partage et k le rapport entre le volume de la phase stationnaire et la volume de la phase mobile. Cette relation a &tBvtkifitk avec de bons rkltats dans le cas des substances minkles .l* Le coefficient de partage a est d&ini en thermodynamique comme &ant le rapport entre les activitt% de la substance dans la phase mobile, aM, et dans la phase stationnaire, as, c’est-h-dire: dc- aM _ &,s-roarVBT as hueset bOM&ant les potentiels chimiques standard, R la constante des gaz parfaits et T la tempkature absolue. Pour pouvoir &parer deux substances en chromatographie de partage sur papier, il faut avoir a1 # Q. Mais, comme il s’ensuit de la relation (3), les potentiels chimiques standard sont difftkents pour des substances diffbrentes et done aI # Q. Ceci signifie que, dans ks m6mes conditions (phase mobile-phase stationnaire), il n’y a pas deux substances de meme R,, car si aI # Q, Ri, # R,,. On admet que deux substances sont &par&s lorsque leurs spots sont tangents;
1118
C. Lrnwu
et S. Gocm
la distance des centres de ceux-ci peut done &re consid&e comme un param&re cara&risant leur s6paration. La di&ence AR, = Rf, - Rt, n’indique pas la skparation complkte des deux substances, ce que l’on montrera par la suite. La diff&ence entre les vafeurs R,, n6cessairee pour la Gparation de deux substances, est : AR, = R,, - Rf, = -p d &ant la distance entre les centres des spots et I la distance entre le point de ddpart et le front de IWuant. En reprCsentant graphiquement la relation (4) sur la Fig. 2, on remarque que, pour la m&me distance d entre les centres des spots, la diffkmce AR, nkoessaire varie beaucoup avec la hauteur I. r
oosoooso-
oom 0060.
2
0050-
0040-
0030-
0020-
0
I
IO
I
1
I
20
30
40
1,
I
50
I
60
cm
DC+. 2.-Valeurs de A& en fonction de i et d.
Ainsi, plus la hauteur I est grande, plus est facilitee la s6paration de substances rS.propri&& voisines, c’est-k-dire ayant des valeurs de Rf proches ou un rapport a&, diffdrant trbs peu de l’unitk. Mais, en chromatographie isotherme, la hauteur de la colonne est limit6.e par les conditions de travail. Examinons les conditions th6oriques n&essaires pour que la Gparation de deux substances soit possible. Soient 1 Rf,= et Rf, = (5)
’
1 + qk
les valeurs R_tpour les deux substances g &parer.
1 + a&
Thermoehromatographie5ur pap&-XIII
1119
En Ccrivant les relations (5) sous la forme: (5’) et en les divisant l’une par l’autre, on a:
(6) On appelle @le coefficient de separation. Mais il resulte de (4) que Ri,= Rr,+ ARi et, en portant cette expression en (6), on a: p =
(1 --Rr,)@r,+ AR3 (1 - Rf, - ARJRi, ’
(7)
Pour Studier la relation (7), prenons une des variables pour constante, soit AR, = constante. En prenant la d&ivCe de premier ordre par rapport a Rf, et en Cgalant ii zero, done d/I/dRfl = 0, ainsi que la deride de second ordre, on remarque que la fonction (6) admet un minimum pour:
=1-A&
R
fl
2
= 0,500 - T.
09
On obtient la valeur minimale de #I en substituant la valeur du Rf, tir6e de (8) en (7) done: AR: + 2ARt + 1 Bmin = AR,z - 2AR, + 1 En substituant dans (7) la valeur du AR, don&e par (4), on a:
ou d
’ = ’ + (R,, - R1,2)l - Rfld ’
uw
Mais I est justement la distance du point de depart au front de l’eluant, et en designant par v le volume de l’eluant dans la colonne et par AM la section de la phase mobile, I = v/AN; en portant ceci dans (lo’), on a:
p=1+
d (RI, - R,:) -& - &,d
(11)
Les Figs. 3 et 4 ont ete realis& a l’aide des relations (4) et (10’). Examinons maintenant les consequences pratiques qui en decoulent. admet un minimum. Done, pour la separOn a demontre que /I = f(Ril)ARi=const ation de deux substances, il est preferable de choisir le systeme phase mobile-phase
1120
C. LITEANUet
S.
GOCAN
d -lcm
I IO
20
30
40
50
1,
FIG. 3.-Vafews
ho. 4.-Valeurs
60
80
100
cm
de ,8 en for&ion de Kc, et I.
de @ en fonction & &, et A&,
staticmnaire de telle mani&e que les valeurs Ri atteignent enviroa 0,500, puisque le coefficient de stsparation @est minimal, done l’eflkacit6 de la st+ration maximak dans ce domaine. En examinant les Figs. 2, ,3 et 4, on remarque un aplatissement des courbes avec i’augmentation de Ia Iongueur de la colonne, de sorte que pour 2 =: O,!X? m, et d = 10 mm, c’est-&dire pour A& - 0,20 = d/I = l/SO et Rt, entre 0,ZO et O,?O, Ie coefficient de skparation ,5 varie trks peu. Done, dans un intervalle des valeurs
Thermochrematographicsur papier-XIII
1121
& compris entre 0,20 et 0,70, on peut conclure que la colonne a pratiquement la mGme e&wit6 concernant la separation sur toute la longueur, seulement pour des longueurs sup&ewes a 0,50 m (pour d = 10 mm). De la relation (lo’), il rbulte que, plus d est petit, plus la valeur de ,!?sera prbs de I’unite, evidemment pour &, et I constants, et done la separation de substances B valeurs Rf peu &a&es sera possible. Pour la diminution de d, des p&cautions s’imposent concernant le pipetage de la substance sur le chromatogramme, la concentration de la substance et le choix phase stationnair~ph~e mobile, de sorte que la dit&sion du spot soit minime. 16
Eluant: n-butanol sat. HCF4N papier Schleicher-Schdll 2040bM
6
4
2
0
20
40
60
60
100
120
140
160
180
t, mm FIG.
5.-Hauteur
d’ascension de l’&ant en fonction du temps.
11 r&wlte toujours de la relation (10’) que plus I est grand, plus le coefficient de separation /l peut &re petit; done, la separation des substances a des valeurs Ri t&s rapprochbs sera possible. Puisque la longueur 2 de la colonne est limit6e en chromatographie isotherme a 0,30-0,40 m environ, les possibilites de separation des substances a coefficients de partage t&s rapproches seront, elles au&, limitees. Tout ceci reste valable pour la chromatographie en couche mince de cellulose ou Ie mkcanisme predominant est le partage. Evidemment, dans ce cas, on travaille avec des longueurs encore plus r&h&es. La vitesse de migration de la phase en chromatographie isotherme et en gradient de temperature a et6 CtudiQ dans les travaux anteueurs.3~7-10 Sur la Fig. 5 est portee l’ascension de l’eluant en fonction du temps pour des developpements & differents gradients de temperature et pour le developpement isotherme a 20”. L’ascension de l’eluant dans des conditions isothermes a lieu d’apres: he = a+
1122
c. LITEANUet s.
GOCAN
et en gradient de temperature d’apres: h, =
--?_ A +
(13)
Br
oti h, represente la distance jusqu’au front de l’eluant a l’instant T (en minutes). Les constantes a, n, A et B peuvent &tre dCterminCes graphiquement apres linearisation des equations (12) et (13). La vitesse de migration de l’eluant, moindre en gradient de temperature qu’en conditions isothermes, s’explique par le fait qu’une certaine quantite de l’eluant migrant s’echappe de la colonne par evaporation, car il existe Bgalement, a l’intkieur de la chambre, un gradient de tension de vapeur orient& vers le haut, de sorte qu’il y a diffusion de vapeurs de Muant du haut vers le bas, en meme temps que condensation de la phase vapeur sur la surface de l’eluant oh la temperature est la plus basse. Cette perte est compensee par l’ascension d’une nouvelle quantite d’eluant dans la colonne. De cette maniere, pour que Muant puisse atteindre le meme niveau que, dam le cas isotherme, il faut qu’un plus grand volume de liquide traverse la colonne done v’ = v + Av On peut done Ccrire la relation (11) pour la chromatographie perature :
a gradient de tem-
d
B=l+ (Rfl - Rf:,y
- Rtld
(14)
oh R,, est la valeur correspondant a un certain gradient de temperature et 8 une colonne de hauteur h. On remarque, sur la Fig. 5, qu’a partir d’un certain moment la hauteur d’ascension de l’eluant ne varie plus. Sur la Fig. 6 sont representkes les valeurs de la hauteur d’ascension de l’tluant h, correspondant au temps T = cc en fonction du gradient de temperature. Ces hauteurs ont et& calculkes a l’aide de l’equation (13). 11en resulte que, pour un certain gradient de temperature, Av peut atteindre une valeur sufhsante pour que le facteur de separation /3 approche beaucoup de l’unite.
grad. t. , FIG. 6.-Hauteur
*C/cm
d’ascention de l%luant pour T = co en fonction du gradient de tempbrature.
Thcrmochromatographie sur papier-XXII
1123
On peut &ire (14): (lit’) oti AZ= Au/A~ rep&en& la longueur supplementaire de la “colonne” en chromatographie B gradient de temperature, corresp#ndant au volume supplementaire d’&uant hr. Done, en ~~omat#grap~e 8 gradient de temperature, on peut realiser des c#l#nnes de to&es ‘“Iongueurs” &ant ainsi la possibilitt! de separation pour ks substances a valeurs t&s rapprochees des coefficients de partage.B*ll Pour illustrer ceci, examinons la separation de NiB+et Mn%+.li Dans ce cas, la difference entre les valeurs Ri de Mna+ et Ni*+a 20” a 6th de 0,040,03 = 0,Ol = (ARdticrtn et au gradient de 0,2”@m, (ARr),ti. t = 0,ll pour une distance de 90 mm entre le point de depart et le front de Ii&ant et une d&e de d~veloppement de 11 heures. Puisque :*
on a:
lOu=Aet OU 101= hi c’est-a-dire pour I = 90 mm, Al = 0,90 m. Dam ce cas, a l’aide du gradient de tempkature, on a r&&id une au~en~tio~ de la ‘4iongueurde la &onne” de 90 mm a 0,99 m, soit un facteur de m~tip~~atio~ de 11. En v&it& pour que deux substances ayant (ARt)irrotb= 0,Ol et une distance entre les centres des spots tangents d = 10 mm p&sent &re scipar&s, il faudrait, en chromatographie isotherme selon l%quation (4), une colonne de 1,OOm, I = d/(ARt’)lsoth = l,OOm+ La concordance des deux valeurs est t&s bonne- On a r&&s6 ainsi la st5paration de Mnw et Nis qui ant un wegkient de separation cafcufti selon (14’), @= 1,35+ done tres proche de l’unit& 11resulte de (14’):
&p&ion qui permet de calculer la lclngueur suppl~mentai~ de la colonne mkessaire a la separation de deux substances. Supposons, par exemple, que deux substances aient le coefficient de separation B = 1,010, d = 10 mm, que l’une ait Rfl = 0,22, et que la chromatographie ait lieu a gradient de temperature sur une colonne ayant la longueur d = 100 mm. Apres substitution en (16& on d&kit une longueur supplementaire de la eolonne Al = 5,74 m, c’est-a-dire AY= 57,4 tt, ce qui correspond a un (AR&otn = dffr + At) = 0,0017. Naturellement, on doit choisir le gradient de temperature de sorte que, pendant la migration de l’iluant sur une longueur de colonne de 100 mm (distance du point de dplp au front de l’eluant) soit mis en jeu “% que v. un volume suppiementaire Av 57 fois plus gran En ccznclusicm,la chromatographie a gradient de tempkature #f&e la possibilk-5
1124
C. L~~~ANuet S. GOCAN
de &parer des substances A coefficients de partage si voisins soient-ils, s’av&ant ainsi le plus efficace pro&E chromatograpbique connu jusqu’a prCsent. SammarJrsome problems concerning the efficiency of temperature gradient chromatography as compared to that of isothermal chromatography have been investigated. The following expression has been derived for temperature-gradient chromatography: d
j+-1+
u + Au - Ri,d (Rtl - Rrx3 7
where B is the separation coeflicient. a1 and a, are the partition c&8cients of two suhstanazsto he separated, Rf, is the retardation factor for the substancewith a1 I) is the volume of the eluent in the c01Umn, Au is the supplementary volume of the eluent passing through the column owing to evaporation caused by the temper&rqradient, Au is the cross-sectional area of the mobile chase and d is the diS~C0 &ween the mid-points of the spots on the chromatogram. It has been shown that under the influence of the temperature gradient Aa can be large enough for separation of two substances with an ada, ratio very close to 1. For this reason temperature-gradient chromatography with an open column is the most efficient means of separation so far known. Zusanuntissung-Einige
Probleme der Wirksamkeit der Chromatographie im Temperaturgef8lle im vergleich zur isothermen Chromatographie wurden untersucht. Ftlr die Chrornatographie im Temperaturgef&lle wurde folgende Beziehung abgeleitet 8=Ef=l+ 1
d CR*, - Rr,*) 9
M
- Ri,d
Hier bedeutet B den Trennfaktor, a1 und aI dieVerteilungskoetEzienten der zu trennenden Substanzen, Rfl den Rtlckhiiltefaktor der Substanz mit al, LJdas Volumen des Elutionsmittels in der Siiule, Av das Volumen des Elutionsmittels, das wegen der durch das Temperaturgefiille bewirkten Verdampfung zusiitzlich die S8ule passiert, A, die Querschnitt&lche der mobilen Phase und d die Entfernung zwischen den Mitten der Flecke auf dem Chromatogramm. Es wurde gezeigt, da8 unter dem Einflu8 des Temperaturgefalles Au gro8 genug sein kann, urn zwei Substanzen zu trennen, deren a,/a,-Verhiiltnis sehr nahe bei 1 liegt. Aus diesem Grund ist die Chrornatographie im Temperaturgefiille mit offener Siiule das wirksamste bekannte Trennverfahren. BIBLIOGRAPHIE 1. C. Liteanu et S. Gocan, St&a 2. Zdem, ibid., 1962, 7, 99.
Univ. Babes-Bobai, Chem., 1961, 6,99.
3. Z&m, Rev. Chim. Acad. Rep. Populaire Rournaine, 1962,7, 1041. 4. Zdem, Rev.Roumaine Chim., 1964, 9, 651. 5. Zdem, Ibid, 1964, 9,715. 6. Z&m, ibid., 1965, 10, 1951. 7. Zdem, Stud. Univ. B&es-BoIyai, Chem., 1966,11,71. 8. C. Liteanu, S. Gocan et M. Onisor, ibid, 1966,11,79. 9. C. Liteanu et S. Gocan, Bull. Sot. Chim. France, 1967, 3836. 10. S. Gocan et C. Liteanu, ibid., 1969, 1409.
11. 12. 13. 14. 15.
C. Liteanu et S. Gocan, ibid., 1969,1416. C. Liteanu et S. Gocan, Stud. Univ. Babes-Bolyai, Chem., 1968, 13, 134. C. L. de Ligny, H. M. Schmidt et W. de Vries, Rec. Zkw. Chim., 1963,82, 1061. I&m, ibid., 1963,82, 1076. C. L. de Ligny et A. G. Remijnse, ibid., 1967,86,421. 16. G. R. Duncan, J. Chromatog., 1962,8,37. 17. R. Consden, A. H. Gordon et A. J. P. Martin, Biochem. J., 1944,38,225.
THERMOCHROMATOGRAPHIE
SUR PAPIER-XIII
CONSIDfiRATIONS SUR L’EFFICACITR DE LA SfiPARATION EN CHROMATOGRAPHIE A GRADIENT DE TEMP&ATURE C. LITEANUet S. GOCAN Chaire de Chimie analytique, Universit6 de Cluj, dluj, Roumanie (Recu le 23 fhrier 1970. AcceptP le 1 mai 1970) R&nun&On a ttudik quelques probkmes concernant l’e&aciM de la chromatographie a gradient de tempkrature compar6e A celle de la chromatographie isotherme. On a d6duit I’expression suivante pour la chromatographie it gradient de tempbature: d
eh /I est le coefficient de ¶tion, a1 et aisont les coefficients de partage de deux substances il &parer, RQ est le facteur de ralentissement pour la substance de coefficient aI, v est le volume de l’tluant dans la colonne, Auest le volume suppl&mentaire d’&umt passant il travers la colorme par suite de l’kvaporation cau& par le gradient de temp&ature, AYIest la surface de la section droite de la phase mobile et d est la distance entre les centres des taches sur le chromatogramme. On a montrk que sous l’influence du gradient de tempkrature Au peut &KIsufiisamment grand pour la @ration de deux substances avec un rapport al/as t&s voisin de 1. Pour c&e raison la chromatographie il gradient de tempkrature avec une colonne ouverte est le moyen de skparation le plus efficace jusqu’8 prt%ent connu.
DANS une s&e de travaux antkrieurs,1-12 nous avons &udi& pour la premiere fois l’action du gradient de tempkature associk au gradient de la tension de vapeur de la phase mobile sur la siparation chromatographique sur papier de diffkrentes substances minCrales et organiques. Le dt5veloppement en gradient de tempkature a Ctt5fait a l’aide des installations d&rites par nous dans les mkmoires. 14*7*9*11La Fig. 1 repksente une chambre chromatographiquell ayant la capacitb des chambres usuelles. Cette chambre est un prisme carrC a doubles parois latkrales en Plexiglas. Les faces infkieure et supkieure sont constituQs par deux couvercles d&achables (Fig. l* et lb). L’Bluant E est contenu dans un rkipient en verre B, muni d’un serpentin S,, dont la vue en plan est donnde par la Fig. le, et a travers lequel circule l’eau d’un thermostat T,; la temperature de Muant (approx. 20”) est mesurQ & l’aide du thermom&tre t, . La tempkrature de la partie supkieure a M obtenue dans un cas (Fig. la) 81l’aide d’un systkme thermostatb, comprenant un thermomhtre g contact T,, un relais kctromagn~tique RE et un corps de chauffage R. Le corps de chauffage est form6 par 6 r&istances en sCrie, introduites chacune dans un tube en verre rempli d’alumine. Le couvercle supkieur de la chambre chromatographique est pr&+entt sur la Fig. 1”. La tempkrature de la zone supkieure est mesuke a l’aide du thermombtre t,. Dans un autre cas (Fig. lb), cette temperature a Btb obtenue au moyen d’un serpentin S,, traversC par un courant d’eau provenant d’un thermostat T,. Ix couvercle 1115
1116
C. LITMNU
et S. GOCAN
(b)
Fko. l.-L’apparate pour chromatographie A gradient de tempkture (dkription dans la texte). sup6rieur de la chambre chromatographique est represent6 sur la Fig. Id. La temperature de la zone superieure est mesuree a l’aide du thermometre t,. Dans les deux cas, deux tiges T, k&s dans le couvercle supkieur, sont pourvues a l’extr&nM plongeant dans la chambre chromatograpbique dune piece de Plexiglas P, dune longueur d’environ 130 mm, dans laquelle est pratiquee une fente pour fixer le papier chromatographique H A l’aide des clous en verre C (Fig. lf). La chambre chromatographique est munie d’un agitateur A en verre. Dans le prkent travail, on examine quelques problemes relatifs B l’efficacite de la separation en c~o~to~ap~e a gradient de temperature par comparaison a la chromatographie isotherme. Le problbme de l’efficacite de la separation en chromatographie isotherme sur papier et en couche mince a et6 aborde dans quelques travaux13-ls par de Ligny et collaborateurs, qui ont etabli une relation permettant d’analyser l’efficacite de la
Themwchromatographiesur papier-XIII
1117
tiparation de plusieurs acides amink sur diffkrentes sortes de papier chromatographique Whatman et sur plusieurs sortes de poudres de cellulose, l’6luant employ6 Ctant le butanol-acide ac&ique-eau (v/v 4: 1: 5). Duncan” donne aussi une relation pour la chromatographie en couche mince et montre que la separation de deux substances peut avoir lieu si la valeur de r dans la formule (1) est supkieure a l’unitk:
a &ant la valeur Ri de la substance migrant le plus vite, b la valeur Rt de la substance migrant le plus lentement sur la couche mince. Nous considkrons que, pour donner des indications pr6cises concernant la ¶tion de deux substances, la valeur de r doit &tre absolument associQ ZIla hauteur de la colonne. Considkons les deux exemples suivants: Ri, = 0,13 et Rf, = O,lO, soit r = 1,15; R,* = 0,90 et Rf, = 0,69, r = 1,15. Dans le premier cas, ARi = 0,03 et, dans le dew&me cas, ARt = 0,21. Si l’on admet que la sbparation de deux substances est r&lide quand leurs spots sont tangents, et en admettant que la distance de leurs centres soit d = 10 mm, conform6ment a la relation,n ARi = d/Z, la hauteur de la colonne nkcessaire, dans le premier cas, sera I = 333 mm et, dans le dew&me cas, 47 mm. La diffdrence des valeurs R, peut meme Ctre plus petite, la valeur de r restant cependant supkieure a l’unitk, par exemple: A& = 0,10-0,08, r = 1,ll; dans ce cas, pour que la sbparation soit possible, il faudrait une colonne chromatographique d’une hauteur 1 = 0,50 m. Des exemples citks, il rksulte que le fait que r soit supkieur & l’unit6 ne suffit pas pour caractkiser les conditions de separation de deux substances. Dans la chromatographie de partage sur papier, Consden, Gordon et Martini’ ont d6fini le paramhtre Ri par la relation
a &ant le coefficient de partage et k le rapport entre le volume de la phase stationnaire et la volume de la phase mobile. Cette relation a &tBvtkifitk avec de bons rkltats dans le cas des substances minkles .l* Le coefficient de partage a est d&ini en thermodynamique comme &ant le rapport entre les activitt% de la substance dans la phase mobile, aM, et dans la phase stationnaire, as, c’est-h-dire: dc- aM _ &,s-roarVBT as hueset bOM&ant les potentiels chimiques standard, R la constante des gaz parfaits et T la tempkature absolue. Pour pouvoir &parer deux substances en chromatographie de partage sur papier, il faut avoir a1 # Q. Mais, comme il s’ensuit de la relation (3), les potentiels chimiques standard sont difftkents pour des substances diffbrentes et done aI # Q. Ceci signifie que, dans ks m6mes conditions (phase mobile-phase stationnaire), il n’y a pas deux substances de meme R,, car si aI # Q, Ri, # R,,. On admet que deux substances sont &par&s lorsque leurs spots sont tangents;
1118
C. Lrnwu
et S. Gocm
la distance des centres de ceux-ci peut done &re consid&e comme un param&re cara&risant leur s6paration. La di&ence AR, = Rf, - Rt, n’indique pas la skparation complkte des deux substances, ce que l’on montrera par la suite. La diff&ence entre les vafeurs R,, n6cessairee pour la Gparation de deux substances, est : AR, = R,, - Rf, = -p d &ant la distance entre les centres des spots et I la distance entre le point de ddpart et le front de IWuant. En reprCsentant graphiquement la relation (4) sur la Fig. 2, on remarque que, pour la m&me distance d entre les centres des spots, la diffkmce AR, nkoessaire varie beaucoup avec la hauteur I. r
oosoooso-
oom 0060.
2
0050-
0040-
0030-
0020-
0
I
IO
I
1
I
20
30
40
1,
I
50
I
60
cm
DC+. 2.-Valeurs de A& en fonction de i et d.
Ainsi, plus la hauteur I est grande, plus est facilitee la s6paration de substances rS.propri&& voisines, c’est-k-dire ayant des valeurs de Rf proches ou un rapport a&, diffdrant trbs peu de l’unitk. Mais, en chromatographie isotherme, la hauteur de la colonne est limit6.e par les conditions de travail. Examinons les conditions th6oriques n&essaires pour que la Gparation de deux substances soit possible. Soient 1 Rf,= et Rf, = (5)
’
1 + qk
les valeurs R_tpour les deux substances g &parer.
1 + a&
Thermoehromatographie5ur pap&-XIII
1119
En Ccrivant les relations (5) sous la forme: (5’) et en les divisant l’une par l’autre, on a:
(6) On appelle @le coefficient de separation. Mais il resulte de (4) que Ri,= Rr,+ ARi et, en portant cette expression en (6), on a: p =
(1 --Rr,)@r,+ AR3 (1 - Rf, - ARJRi, ’
(7)
Pour Studier la relation (7), prenons une des variables pour constante, soit AR, = constante. En prenant la d&ivCe de premier ordre par rapport a Rf, et en Cgalant ii zero, done d/I/dRfl = 0, ainsi que la deride de second ordre, on remarque que la fonction (6) admet un minimum pour:
=1-A&
R
fl
2
= 0,500 - T.
09
On obtient la valeur minimale de #I en substituant la valeur du Rf, tir6e de (8) en (7) done: AR: + 2ARt + 1 Bmin = AR,z - 2AR, + 1 En substituant dans (7) la valeur du AR, don&e par (4), on a:
ou d
’ = ’ + (R,, - R1,2)l - Rfld ’
uw
Mais I est justement la distance du point de depart au front de l’eluant, et en designant par v le volume de l’eluant dans la colonne et par AM la section de la phase mobile, I = v/AN; en portant ceci dans (lo’), on a:
p=1+
d (RI, - R,:) -& - &,d
(11)
Les Figs. 3 et 4 ont ete realis& a l’aide des relations (4) et (10’). Examinons maintenant les consequences pratiques qui en decoulent. admet un minimum. Done, pour la separOn a demontre que /I = f(Ril)ARi=const ation de deux substances, il est preferable de choisir le systeme phase mobile-phase
1120
C. LITEANUet
S.
GOCAN
d -lcm
I IO
20
30
40
50
1,
FIG. 3.-Vafews
ho. 4.-Valeurs
60
80
100
cm
de ,8 en for&ion de Kc, et I.
de @ en fonction & &, et A&,
staticmnaire de telle mani&e que les valeurs Ri atteignent enviroa 0,500, puisque le coefficient de stsparation @est minimal, done l’eflkacit6 de la st+ration maximak dans ce domaine. En examinant les Figs. 2, ,3 et 4, on remarque un aplatissement des courbes avec i’augmentation de Ia Iongueur de la colonne, de sorte que pour 2 =: O,!X? m, et d = 10 mm, c’est-&dire pour A& - 0,20 = d/I = l/SO et Rt, entre 0,ZO et O,?O, Ie coefficient de skparation ,5 varie trks peu. Done, dans un intervalle des valeurs
Thermochrematographicsur papier-XIII
1121
& compris entre 0,20 et 0,70, on peut conclure que la colonne a pratiquement la mGme e&wit6 concernant la separation sur toute la longueur, seulement pour des longueurs sup&ewes a 0,50 m (pour d = 10 mm). De la relation (lo’), il rbulte que, plus d est petit, plus la valeur de ,!?sera prbs de I’unite, evidemment pour &, et I constants, et done la separation de substances B valeurs Rf peu &a&es sera possible. Pour la diminution de d, des p&cautions s’imposent concernant le pipetage de la substance sur le chromatogramme, la concentration de la substance et le choix phase stationnair~ph~e mobile, de sorte que la dit&sion du spot soit minime. 16
Eluant: n-butanol sat. HCF4N papier Schleicher-Schdll 2040bM
6
4
2
0
20
40
60
60
100
120
140
160
180
t, mm FIG.
5.-Hauteur
d’ascension de l’&ant en fonction du temps.
11 r&wlte toujours de la relation (10’) que plus I est grand, plus le coefficient de separation /l peut &re petit; done, la separation des substances a des valeurs Ri t&s rapprochbs sera possible. Puisque la longueur 2 de la colonne est limit6e en chromatographie isotherme a 0,30-0,40 m environ, les possibilites de separation des substances a coefficients de partage t&s rapproches seront, elles au&, limitees. Tout ceci reste valable pour la chromatographie en couche mince de cellulose ou Ie mkcanisme predominant est le partage. Evidemment, dans ce cas, on travaille avec des longueurs encore plus r&h&es. La vitesse de migration de la phase en chromatographie isotherme et en gradient de temperature a et6 CtudiQ dans les travaux anteueurs.3~7-10 Sur la Fig. 5 est portee l’ascension de l’eluant en fonction du temps pour des developpements & differents gradients de temperature et pour le developpement isotherme a 20”. L’ascension de l’eluant dans des conditions isothermes a lieu d’apres: he = a+
1122
c. LITEANUet s.
GOCAN
et en gradient de temperature d’apres: h, =
--?_ A +
(13)
Br
oti h, represente la distance jusqu’au front de l’eluant a l’instant T (en minutes). Les constantes a, n, A et B peuvent &tre dCterminCes graphiquement apres linearisation des equations (12) et (13). La vitesse de migration de l’eluant, moindre en gradient de temperature qu’en conditions isothermes, s’explique par le fait qu’une certaine quantite de l’eluant migrant s’echappe de la colonne par evaporation, car il existe Bgalement, a l’intkieur de la chambre, un gradient de tension de vapeur orient& vers le haut, de sorte qu’il y a diffusion de vapeurs de Muant du haut vers le bas, en meme temps que condensation de la phase vapeur sur la surface de l’eluant oh la temperature est la plus basse. Cette perte est compensee par l’ascension d’une nouvelle quantite d’eluant dans la colonne. De cette maniere, pour que Muant puisse atteindre le meme niveau que, dam le cas isotherme, il faut qu’un plus grand volume de liquide traverse la colonne done v’ = v + Av On peut done Ccrire la relation (11) pour la chromatographie perature :
a gradient de tem-
d
B=l+ (Rfl - Rf:,y
- Rtld
(14)
oh R,, est la valeur correspondant a un certain gradient de temperature et 8 une colonne de hauteur h. On remarque, sur la Fig. 5, qu’a partir d’un certain moment la hauteur d’ascension de l’eluant ne varie plus. Sur la Fig. 6 sont representkes les valeurs de la hauteur d’ascension de l’tluant h, correspondant au temps T = cc en fonction du gradient de temperature. Ces hauteurs ont et& calculkes a l’aide de l’equation (13). 11en resulte que, pour un certain gradient de temperature, Av peut atteindre une valeur sufhsante pour que le facteur de separation /3 approche beaucoup de l’unite.
grad. t. , FIG. 6.-Hauteur
*C/cm
d’ascention de l%luant pour T = co en fonction du gradient de tempbrature.
Thcrmochromatographie sur papier-XXII
1123
On peut &ire (14): (lit’) oti AZ= Au/A~ rep&en& la longueur supplementaire de la “colonne” en chromatographie B gradient de temperature, corresp#ndant au volume supplementaire d’&uant hr. Done, en ~~omat#grap~e 8 gradient de temperature, on peut realiser des c#l#nnes de to&es ‘“Iongueurs” &ant ainsi la possibilitt! de separation pour ks substances a valeurs t&s rapprochees des coefficients de partage.B*ll Pour illustrer ceci, examinons la separation de NiB+et Mn%+.li Dans ce cas, la difference entre les valeurs Ri de Mna+ et Ni*+a 20” a 6th de 0,040,03 = 0,Ol = (ARdticrtn et au gradient de 0,2”@m, (ARr),ti. t = 0,ll pour une distance de 90 mm entre le point de depart et le front de Ii&ant et une d&e de d~veloppement de 11 heures. Puisque :*
on a:
lOu=Aet OU 101= hi c’est-a-dire pour I = 90 mm, Al = 0,90 m. Dam ce cas, a l’aide du gradient de tempkature, on a r&&id une au~en~tio~ de la ‘4iongueurde la &onne” de 90 mm a 0,99 m, soit un facteur de m~tip~~atio~ de 11. En v&it& pour que deux substances ayant (ARt)irrotb= 0,Ol et une distance entre les centres des spots tangents d = 10 mm p&sent &re scipar&s, il faudrait, en chromatographie isotherme selon l%quation (4), une colonne de 1,OOm, I = d/(ARt’)lsoth = l,OOm+ La concordance des deux valeurs est t&s bonne- On a r&&s6 ainsi la st5paration de Mnw et Nis qui ant un wegkient de separation cafcufti selon (14’), @= 1,35+ done tres proche de l’unit& 11resulte de (14’):
&p&ion qui permet de calculer la lclngueur suppl~mentai~ de la colonne mkessaire a la separation de deux substances. Supposons, par exemple, que deux substances aient le coefficient de separation B = 1,010, d = 10 mm, que l’une ait Rfl = 0,22, et que la chromatographie ait lieu a gradient de temperature sur une colonne ayant la longueur d = 100 mm. Apres substitution en (16& on d&kit une longueur supplementaire de la eolonne Al = 5,74 m, c’est-a-dire AY= 57,4 tt, ce qui correspond a un (AR&otn = dffr + At) = 0,0017. Naturellement, on doit choisir le gradient de temperature de sorte que, pendant la migration de l’iluant sur une longueur de colonne de 100 mm (distance du point de dplp au front de l’eluant) soit mis en jeu “% que v. un volume suppiementaire Av 57 fois plus gran En ccznclusicm,la chromatographie a gradient de tempkature #f&e la possibilk-5
1124
C. L~~~ANuet S. GOCAN
de &parer des substances A coefficients de partage si voisins soient-ils, s’av&ant ainsi le plus efficace pro&E chromatograpbique connu jusqu’a prCsent. SammarJrsome problems concerning the efficiency of temperature gradient chromatography as compared to that of isothermal chromatography have been investigated. The following expression has been derived for temperature-gradient chromatography: d
j+-1+
u + Au - Ri,d (Rtl - Rrx3 7
where B is the separation coeflicient. a1 and a, are the partition c&8cients of two suhstanazsto he separated, Rf, is the retardation factor for the substancewith a1 I) is the volume of the eluent in the c01Umn, Au is the supplementary volume of the eluent passing through the column owing to evaporation caused by the temper&rqradient, Au is the cross-sectional area of the mobile chase and d is the diS~C0 &ween the mid-points of the spots on the chromatogram. It has been shown that under the influence of the temperature gradient Aa can be large enough for separation of two substances with an ada, ratio very close to 1. For this reason temperature-gradient chromatography with an open column is the most efficient means of separation so far known. Zusanuntissung-Einige
Probleme der Wirksamkeit der Chromatographie im Temperaturgef8lle im vergleich zur isothermen Chromatographie wurden untersucht. Ftlr die Chrornatographie im Temperaturgef&lle wurde folgende Beziehung abgeleitet 8=Ef=l+ 1
d CR*, - Rr,*) 9
M
- Ri,d
Hier bedeutet B den Trennfaktor, a1 und aI dieVerteilungskoetEzienten der zu trennenden Substanzen, Rfl den Rtlckhiiltefaktor der Substanz mit al, LJdas Volumen des Elutionsmittels in der Siiule, Av das Volumen des Elutionsmittels, das wegen der durch das Temperaturgefiille bewirkten Verdampfung zusiitzlich die S8ule passiert, A, die Querschnitt&lche der mobilen Phase und d die Entfernung zwischen den Mitten der Flecke auf dem Chromatogramm. Es wurde gezeigt, da8 unter dem Einflu8 des Temperaturgefalles Au gro8 genug sein kann, urn zwei Substanzen zu trennen, deren a,/a,-Verhiiltnis sehr nahe bei 1 liegt. Aus diesem Grund ist die Chrornatographie im Temperaturgefiille mit offener Siiule das wirksamste bekannte Trennverfahren. BIBLIOGRAPHIE 1. C. Liteanu et S. Gocan, St&a 2. Zdem, ibid., 1962, 7, 99.
Univ. Babes-Bobai, Chem., 1961, 6,99.
3. Z&m, Rev. Chim. Acad. Rep. Populaire Rournaine, 1962,7, 1041. 4. Zdem, Rev.Roumaine Chim., 1964, 9, 651. 5. Zdem, Ibid, 1964, 9,715. 6. Z&m, ibid., 1965, 10, 1951. 7. Zdem, Stud. Univ. B&es-BoIyai, Chem., 1966,11,71. 8. C. Liteanu, S. Gocan et M. Onisor, ibid, 1966,11,79. 9. C. Liteanu et S. Gocan, Bull. Sot. Chim. France, 1967, 3836. 10. S. Gocan et C. Liteanu, ibid., 1969, 1409.
11. 12. 13. 14. 15.
C. Liteanu et S. Gocan, ibid., 1969,1416. C. Liteanu et S. Gocan, Stud. Univ. Babes-Bolyai, Chem., 1968, 13, 134. C. L. de Ligny, H. M. Schmidt et W. de Vries, Rec. Zkw. Chim., 1963,82, 1061. I&m, ibid., 1963,82, 1076. C. L. de Ligny et A. G. Remijnse, ibid., 1967,86,421. 16. G. R. Duncan, J. Chromatog., 1962,8,37. 17. R. Consden, A. H. Gordon et A. J. P. Martin, Biochem. J., 1944,38,225.