- Email: [email protected]
Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit von Fraktion-I-Protein bei Gramineen und ihre mögliche Nutzung in Genetik und Züchtungsforschung
Biochem. Physiol. Pflanzen 171, S.
299~306
(1977)
Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit von Fraktion-I-Protein bei Gramineen und ihre mogliche Nutzung in Genetik und Ziichtungsforschung Differences in the Electrophoretic Mobility of Fraction I Protein and their Possible Utilization in Genetics and Plant Breeding
D. REICHENBACHER, J. RICHTER und
D~
SPAAR
Institut fur Phytopathologie Aschersleben Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR Key Term Index: fraction-I-protein, immunoelectrophoresis, electrophoretic mobility, genetic marker; Gramineae.
Summary Differences in the electrophoretic mobility of fraction I protein allow a distinction of several genera and species (Triticum, Festuca) of gramineae as could be shown by immunoelectrophoresis. The results are interpreted in the light of recent findings on the structure and synthesis of this protein. In -the case of Triticale, species of Triticum and alloplasmatic ryes we were able to show, that the electrophoretic mobility of the complete fraction I protein provides a phenotypic marker for the chloroplast genomes.
Einleitung
Das Fraktion-l-Protein (FIP) ist in den letzten Jahren auch in den Blickpunkt der Pflanzenzlichter und Genetiker gerlickt, nachdem gezeigt werden konnte, daB liber die Ermittlung seiner Polypeptid-Zusammensetzung gute phanotypische Marker der Kernund Chloroplast en-Genome erhalten werden (tJbersicht bei KUNG 1976). BekanntIich werden die beiden Untereinheiten des FlP, die groBe (large subunit) und die kleine (small subunit) mit Molekulargewichten von 55000 bzw. 12000 in hOheren Pflanzen getrennt synthetisiert, wobei die Codierung durch das Kern-Genom (kleine Untereinheiten) bzw. durch das Chloroplasten-Genom(groBe Untereinheiten) erfolgt. Als Methode der genetischen Analyse von FlP entwickelten KUNG u. a. (1974) die Elektrofokussierung von carboxymethyliertem FlP in Polyacrylamid-Gelen. Sie ermogIicht die Ermittlung der Zahl und der elektrophoretischen Beweglichkeit der einzelnen Polypeptide. Die hohe Aussagekraft der Methode wurde vor allem durch Untersuchungen an Vertretern der Gattung Nicotiana unter Beweis gestellt (KUNG 1976). Das Verfahren wurde jedoch auch zu Untersuchungen liber den Ursprung der polyploiden Weizen herangezogen (CHEN et al. 1975). lm letztgenannten FaIle konnten verschiedene Aegilops- bzw. Triticum-Arten an Hand der elektrophoretischen Beweglichkeit der drei Polypeptide der groBen Untereinheiten differenziert werden. Auf diese Weise wurde ermitteIt, welche Arten bei der spontanen Polyploidisierung des Weizens von diploiden liber tetraploide zu hexaploiden Formen das Chloroplasten-Genom beigesteuert haben und somit der mlitterIiche Elternteil waren.
300
D. REICHENBACHER, J. RICHTER und D. SPAAR
Bei immunologischen Untersuchungen tiber die Struktur und die Funktion des FIP wiesen GRAY und KEKWICK (1974) nach, da13 die gro13en Untereinheiten an der Oberflache des Molektils liegen, wahrend die kleineren im Inneren des Molektils verborgen sind. Dies bedeutet, da13 mit Antiseren gegen das komplette FIP Aussagen tiber die gro13en Untereinheiten erhalten werden konnen. Wir mochten im folgenden tiber Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit des FIP bei Gramineen berichten, die mit Hilfe der Immunelektrophorese unter Verwendung von Antiseren gegen komplettes FIP aufgefunden wurden und an Hand von Beispielen demonstrieren, da13 auch auf diese einfache Weise eine Markierung des Chloroplasten-Genoms erfolgen kann.
Material ond Methoden Die Anzucht der Pflanzen wurde wie bereits bei REICHENBACHER et al. (1976) beschrieben in Komposterde unter Gewachshausbedingungen bzw. auch in Klimazellen vorgenommen. Untersucht wurden Sorten von Gerste (Hordeum 'l:ulgare L.), Roggen (Secale cereale L.) einschlieBlich alloplasmatischer Roggenformen (bei denen das Roggen-Genom im Weizenplasma vorliegt) und Hafer (Avena saliva L.), des weiteren diploide, tetraploide und hexaploide Weizen (Triticum monococcurn L., T. durum Desf., T. turgidurn L., T. carthlicum Nevski, T. dicoccon Schrank, T. aestivum L.), Triticale (6 x und 8 x) sowie Mais (Zea mays L.), Hirse (Panicum miliaceum L.), Quecke (Agropyron repens P. B.) und eine Anzahl von Futtergrasern. 1 ) Losliche BIattproteine wurden aus Primarbliittern 7 Tage alter Pflanzen nach RICHTER et al. (1975) extrahiert. . Grob gereinigtes FIP, welches bei der Antiserumherstellung Verwendung fand, wurde modifiziert nach KAWASHIlIIA und WILDlIIAN (1971) erhalten. AnsteBe des dort verwendeten Tris-Puffers und Sephadex G-25 verwendeten wir Phosphatpuffer und Epidex-B 2. Nach abschlieBender Fraktionierung iiber Sephadex-G200 wurden aus dem Bereich des FIP(siehe bei RICHTER et a1.1975) die Hauptfraktionen gesammelt und das entstandene Volumen mit Polyathylenglycol 20000 eingeengt. ABe Extraktionsschritte wurden bei + 4 °C durchgefiihrt. Die Herstellung der Antiseren gegen FIP erfogte mittels Immunisierllng von Kaninchen in Anlehnllng an KONAREV u. a. (1970), wobei den Tieren 60 mg Protein injiziert wurden. Beim immunelektrophoretischen Vergleich der Antigenextrakte wurde die Mikromodifikation der Immunelektrophorese nach SCHEIDEGGER (1955) angewendet .Die Untersuchungsbedingungen sind die gleichen wie bereits bei REICHENBACHER u. a. (1976) fiir Blattproteinvergleiche beschrieben. Jede Probe wllrde nicht weniger als 6mal getrennt voneinander getestet.
Ergebnisse Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit zwischen verschiedencn Sorten einer Art konntcn in keincm Fallc fcstgestellt werden. Demgegentiber zeigten sich in einer Reihe von Fallen gu te Differcnzierungsmoglichkeiten zwischen unterschiedlichen Gattungen bzw. Arten innerhalb der Gramincen (Abb. 1--3). 1) Frau Dr. G. SZIGAT, Institut fiir Pflanzenziichtung Giilzow-Giistrow der AdL und Herrn Dr. C. O. LEHMANN, Zentralinstitut fiir Genetik und Kulturpflanzenforsehung Gatersleben der AdW danken wir fiir die freundliche Unterstiitzung dieser Arbeit.
A F 1
A i r
F
(
301
Fraktion-I-Protein bei Gramineen
Abb.1. Immunopherogramme von Blattextrakten mit Antiserum gegen Fraktion-I-Prolein von H. vulgare. -"! • 1 = H. vulgare; 2 = T. aestivum; 3 = S. cereale; 4 = A. sativa; a = Prazipitationslinie des Fraktion-I-Proteins; b = Prazipitationslinie einer Protein-"Verunreinigung".
J
:
5I
Abb.2. Immunopherogramme von Blatlextrakten (Getreidearten und Quecke) mit Antiserum gegen Fraktion-I-Portein von T. aestivum. 1 = Z. mays, 2 = P. miliaceum, 3 = T. aestivum, 4 = A. repens.
Das FIP in den Extrakten reagiert mit Antiserum gegen FIP aus Gerste stets unter Ausbildung einer starken Prazipitationslinie. Die zweite, schwachere Prazipitationslinie in den Immunelektropherogrammen ist auf eine Protein-Verunreinigung zuriickzufUhren, d. h. das fUr die Antiserumherstellung verwendete FIP lag nicht in hochgereinigter Form vor. Wahrend sich Weizen und Gerste nicht oder nur minimal unterscheiden (siehe auch BORNER et al. 1976), zeigen Roggen und Hafer in der genannten Reihenfolge
302
D.
REIClIEXnXCHEH,
J.
RICHTER
und D.
BPAAR
Abb.3. lmmunopherogramme von Blattextrakten (Futtergriiser) mit Antiseren gegen Fraktion-I-Protein von T. aestivum. 1 = L. multiflorum ssp. multiflorum var. westerwoldicum, Borte ,Bernburger Annua'; 2 = L. multiflorum ssp. multiflorum var. westerwoldicum, Borte ,P ollanum', 4 x; 3 = L. multiflorum ssp. italicum; 4 = L. perenne; 5 = F. ovina; 6 = F. rubra; 7 = F. pratensis.
eine gesteigerte elektrophoretische Beweglichkeit des FIP in anodischer Richtung (Abb.l). Von geringen Unterschieden in der Intensitat der Reaktion des FIP abgesehen, wurden die gleichen Pherogramme auch mit Antiseren gegen FIP aus Weizen bzw. Roggen erhalten. Anders als Weizen bzw. Gerste reagieren auch Mais und Hirse sowie Quecke, die von den beiden ersteren gleichfalls an Hand einer gro./3eren anodischen Beweglichkeit differenziert werden kann (Abb. 2). Auch bei einer Reihe von Futtergrasern konnten Differenzierungsmoglichkeiten festgestellt werden, so z. B. innerhalb der Gattung Festuca. Mit Ausnahme des Wiesenschwingels (Festuca pratensis Huds.) ist eine Unterscheidung gegeniiber Weidelgrasern (Lolium spec.) moglich (Abb. 3).
2
~
...f".., ...
t:d
.?
~
I:!I
>oj
l
>oj
.,.
~
il-
s·
t:d
n;~
Abb.4. Vergleich der elektrophoretischen Beweglichkeit von Fraktion-I-Protein (FIP) bei Triticum-Arlen. A: FIP nach immunelektrophoretischer Untersuchung mit Antiseren gegen FIP von T. aestivum. B: Polypeptide der grofien Untereinheit des.FIP nach Elektrofokussierung, schematisch nach CHEN et al. (1975). Ai: T. monococcum; A2: T. dicoccon; A3: T. aestivum; Bl: T. monococcum (AA); B2: T. dicoccon (AABB); B3: T. aestivum (AABBDD).
~
~
::l
'"'"
S :;.
~
'"'
CCl
0' ~.
:;. '"
3M-
>;-< '"d
7
0
tt
i>;"
~
'"'
"'J
304
D.
REICHENBACHER,
J.
RICHTER
und D.
SPAAR
Abb.5. lmmunopherogramme von Blatlexlrakten mit Antiserum gegen Fraktion-I-Protein von T. aestivum L. 1 = S. cereale; 2 = aUoplasmatischer Roggen.
Nach Befunden von JONES und LYTTLETON (1972) an Rotklee kann eine gesteigerte elektrophoretische Beweglichkeit von FIP auf Wechselwirkungen zwischen diesem Protein und bei der Extraktion entstehenden Produkten der Tatigkeit von Polyphenoloxydasen beruhcn. Diese Wechselwirkungen und damit die gesteigerte clektrophoretische Bewegliehkeit konnten durch Zugabe eines Polyphenoloxydasc-Inhibitors ausgeschaltet werden. Wir stellten nach Zugabe von 0,001 m Natriumdiiithyldithiocarbamat zum Extraktionsmedium keinen Ehflu13 auf die elektrophoretische Beweglichkeit der FIP bei den getesteten Gramineen fest. Somit kann geschlu13folgert werden, daB die beobaehteten Unterschiede nicht im Gcfolge der Extraktion entstanden sind, sondern auf Differenzen in der Molekularstruktur zuriickgchen. Nach den bcreits zitierten Ergebnissen von GRAY und KEKWICK (1974) erfassen wir mit unseren Antiseren gegcn das komplette FIP die groBen Untereinheiten des Proteins. Wir iiberpriiftcn an Hand folgendcr 3 Bcispiele, ob cine spezifische Position der Prazipitationslinie des FIP im Immunelektropherogramm zur Markierung des ChloroplastenGenoms (siehe Einleitung) verwendet werden kann:
1_ Beim Vergleich von Triticum-Arten zeigte sich, daB das FIP der diploiden Art T. monococcum eine hOhere anodische Beweglichkeit besitzt als das cntsprechende Protein verschiedener tetra- und hexaploider Triticum-Arten. Die .Differenzen stimmen mit denjenigen iiberein, die CHEN et al. (1975) an Hand der unterschiedlichen elektrophoretischcn Beweglichkeit der drei Polypeptide der groBen Untereinheit des FIP nachgcwiesen hatten (Abb. 4). 2_ 4 x - und 6 x -W cizen konnten nicht von Triticale (es wurden 6 X - und 8 X - Formen untersucht) unterschiedcn werden, was auf Grund des gemeinsamen Weizenplasmas verstandlich ist. 3. Es war moglich, Roggen von alloplasmatischem Roggen zu unterscheiden. Letzterer reagierte wie 4 X - oder 6 X - Weizen bzw. Triticale (Abb. 5). Die Versuche wurden an alloplasmatischen Roggenformen durchgefUhrt, die im Institut fUr Pflanzenziichtung Giilzow-Giistrow bei Kreuzungen von 6 X -Triticale (Tripel-Bastarde) aus Japan mit 2 x-Roggen entstanden (SZIGAT und KISTNER 1976). Es handelt sich um Roggen im Plasma von T. carthlicum.
Fraktion-I-Protein bei Gramineen
305
Diskussion In der vorliegenden Arbeit werden weitere Beweise dafur vorgelegt, daJ3 mit Hilfe von Unterschieden in der elektrophoretischen Beweglichkeit des FIP eine Markierung des Chloroplasten-Genoms erfolgen kann. Die Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit der FIP konnen auf verschiedene Weise erfaJ3t werden. Am leistungsfahigsten ist zweifelsohne das Verfahren von KUNG et al. (1974), da die Elektrofokussierung zu einer Auftrennung der Polypeptide filhrt und somit nicht nur die elektrophoretischen Beweglichkeiten, sondern auch die Zahl der Polypeptide in beiden Untereinheiten erfaJ3t werden. Damit konnen mittels einer einzigen Methode sowohl Kernals auch Chloroplasten-Genome markiert werden, was sich filr die Untersuchungen an Nicotiana-Arten als auf3erordentlich wertvoll erwies. Bei den Untersuchungen an Wei zen entfiel jedoch die Moglichkeit del' Markierung des Kerngenoms, da zwischen den klein en Untereinheiten keine Unterschiede auftraten (CHEN et al. 1975). Dies trifft auch auf diejenigen Methoden zu, die auf del' Feststellung von Unterschieden in der elektrophoretischen Beweglichkeit von intaktem FIP beruhen. Derartige Unterschiede lassen sich mit Hilfe del' Polyacrylamid-Gelelektrophorese (ANDERSEN et al., 1970; STEER, 1975) oder der Immunelektrophorese (vorliegende Arbeit) nachweisen. Sie gehen bei den von uns gepruften Beispielen (Triticale, Arten von Triticum, alloplasmatische Roggen) auf Unterschiede zwischen den groJ3en Protein-Untereinheiten zuruck und ermoglichen somit nur eine Markierung des Chloroplasten-Genoms. Ob auf Grund der speziellen Anordnung der kleinen Untereinheit im Gesamtprotein (GRAY und KEKWICK 1974) diese in von uns nicht gepruften Beispielen die Mobilitat des FIP ebenfalls beeinflussen kann, ist noch unklar. 1m Fall von Gerste und Weizen z. B. wirken sich elektrophoretische Unterschiede in den kleinen Untereinheiten (BORNER et al. 1976) nicht merklich auf die Mobilitat des gesamten FIP aus (siehe Abb. 1). Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese und die Immunelektrophorese sind gegenuber der Elektrofokussierung in methodischer Hinsicht einfacher, vor allem auch deshalb, weil zur Testung kein hochgereinigtes FIP benotigt wird. Daraus ergibt sich ein erheblicher Vorteil. Die immunelektrophoretischen Untersuchungen konnen z. B. mit den Rohextrakten aus einem einzigen Blatt durchgefiihrt werden, d. h., es sind Einzelpflanzenuntersuchungen moglich (REICHENBACHER, 1974). Dies ist un seres Erachtens fUr Belange der zuchterischen Praxis von Bedeutung und eroffnet Anwendungsmoglichkeiten bei der Analyse von Kreuzungsbastarden, wie dies in der vorliegenden Arbeit am Beispiel der Differenzierung von Roggen und alloplasmatischem Roggen demonstriert wurde. Mit Hilfe der beiden Verfahren kann in Zukunft auch das wichtige Problem der innerartlichen Variabilitat (siehe JOHNSON 1976) ohne groJ3eren Aufwand intensiver untersucht werden. Wir mochten an dieser Stelle betonen, daJ3 wir bei unseren bisherigen Versuchen an Einzelpflanzen bzw. an kleineren Gruppen von Pflanzen keinerlei Hinweise filr eine Variabilitat der elektrophoretischen Beweglichkeit des FIP innerhalb einer Art erhalten haben. Die beiden vereinfachten Verfahren erlauben gleichfalls Ruckschlilsse zum Verlauf der Evolution polyploider Kulturpflanzen, wie von STEER (1975) am Beispiel del' Gattung Avena gezeigt werden konnte. Auch un sere 21*
306
D. REICHENBACHER, J. RICHTER und D. SPAAR, Fraktion-I-Protein bei Gramineen
Ergebnisse an Vertretern der Gattung Triticum, die eine Bestatigung del' Befundc von CIIEN et al. (1975) darstellen, deuten in diese Richtung. Literatur ANDERSEN, W. R., WILDNER, G. F., and CRIDDLE, R. S., Ribulose diphosphate carboxylase. III. Altered forms of ribulose diphosphate carboxylase from mutant tomato plants. Arch. Biochem. Biophys. 137,84-90 (1970). BORNER, TH., JAHN, G., and HAGEMANN, R., Electrophoretic mobility of the subunits of fraction 1 protein of higher plant species. Biochem. Physiol. Pflanzen 169, 179-181 (1976). CHEN, K., GRAY, J. C., and WILDMAN, S. G., Fraction 1 protein and the origin of polyploid wheats. Science 190, 1304-1306 (1975). GRAY, J. C., und KEKWICK, R. G. 0., An immunological investigation of the structure and function of ribulose-1,5-biphosphate carboxylase. Eur. J. Biochem. 44,481-489 (1974). JOHNSON, B. L., Polyploid wheats and fraction 1-protein. Science 192, 1252 (1976). JONES, W. T., and LYTTLETON, J. W., The importance of inhibiting polyphenol oxidase in the exkaction of fraction 1- leaf protein. Phytochemistry 11, 1595-1596(1972). KAWASHIMA, N., and WILDMAN, S. G., Studies on fraction 1-protein. Effect of crystallization of fraction 1-protein from tobacco leaves on ribulose diphosphate carboxylase activity. Biochim. biophys. Actn (Amsterdam) 229, 240-249 (1971). KONAREV, V. G., GAVRILJUK, I. P., i GUBAREVA, N. K., Belkovye markery genomov psenic i ich dikich sorodicej. Immunochimceskij analiz rastvorimych belkov zerna psenic i egilopsov. Vestnik sel'skochozjajstvennoj nauki (Moskva) 15, 100-108 (1970). KUNG, S. D., Tobacco fraction 1 protein: A unique genetic marker. Science 191, 429-434 (1976). _ SAKANO, K., and WILDMAN, S. G., Multiple peptide composition of the large and small subunits of Nicotiana tabacum fraction 1-protein ascertained by fingerprinting and electrofocusing. Biochim. biophys. Acta (Amsterdam) 365, 138-147 (1974). REICHENBACHER, D., Beitrage zur serologischen Differenzierung von Sippen bei Getreide unter besonderer Beriicksichtigung von Gerste mit unterschiedlicher Resistenz gegen Gelbrost. Halle, Martin-Luther-Universitat, Diss. 1974, 159 S. _ RICHTER, J., und SPAAR, D., Beitrage zur serologischen Differenzierung von Sippen bei Getreide. Arch. Ziichtungsforsch. (Berlin) 6, 179-184 (1976). / RICHTER, J., REICHENBACHER, D., und SPOHN, H. J., Ein Beitrag zur Herstellung von Antiseren gegen losliehe Blattproteine. Biochem. Physiol. Pflanzen 167, 285-290 (1975). SCHEIDEGGER, J. J., Une micromethode de l'immunoelectrophorese. Intern. Arch. Allergy Appl. Immunol. 7, 103-110 (1955). STEER, M. W., Evolution in the genus Avena: Inheritance of different forms of ribulose diphosphate carboxylase. Can. J. Genet. Cytol. 17, 337-344 (1975). SZIGAT, G., und KISTNER, G., Dber bisherige Ergebnisse der Kreuzung von Triticale mit Roggen. Tag.-Ber., Akad. L~n.dwirtsch.- Wiss. DDR, Berlin 143, 39-48 (1976). Eingegangen 26. November 1976. Anschrift der Verfasser: Dr. D. REICHENBACHER, Dr. habil. J. RICHTER und Prof. Dr. D. SPAAR, Institut fiir Phytopathologie der Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR, 432 Aschersleben, Theodor-Roemer-Weg.
299~306
(1977)
Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit von Fraktion-I-Protein bei Gramineen und ihre mogliche Nutzung in Genetik und Ziichtungsforschung Differences in the Electrophoretic Mobility of Fraction I Protein and their Possible Utilization in Genetics and Plant Breeding
D. REICHENBACHER, J. RICHTER und
D~
SPAAR
Institut fur Phytopathologie Aschersleben Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR Key Term Index: fraction-I-protein, immunoelectrophoresis, electrophoretic mobility, genetic marker; Gramineae.
Summary Differences in the electrophoretic mobility of fraction I protein allow a distinction of several genera and species (Triticum, Festuca) of gramineae as could be shown by immunoelectrophoresis. The results are interpreted in the light of recent findings on the structure and synthesis of this protein. In -the case of Triticale, species of Triticum and alloplasmatic ryes we were able to show, that the electrophoretic mobility of the complete fraction I protein provides a phenotypic marker for the chloroplast genomes.
Einleitung
Das Fraktion-l-Protein (FIP) ist in den letzten Jahren auch in den Blickpunkt der Pflanzenzlichter und Genetiker gerlickt, nachdem gezeigt werden konnte, daB liber die Ermittlung seiner Polypeptid-Zusammensetzung gute phanotypische Marker der Kernund Chloroplast en-Genome erhalten werden (tJbersicht bei KUNG 1976). BekanntIich werden die beiden Untereinheiten des FlP, die groBe (large subunit) und die kleine (small subunit) mit Molekulargewichten von 55000 bzw. 12000 in hOheren Pflanzen getrennt synthetisiert, wobei die Codierung durch das Kern-Genom (kleine Untereinheiten) bzw. durch das Chloroplasten-Genom(groBe Untereinheiten) erfolgt. Als Methode der genetischen Analyse von FlP entwickelten KUNG u. a. (1974) die Elektrofokussierung von carboxymethyliertem FlP in Polyacrylamid-Gelen. Sie ermogIicht die Ermittlung der Zahl und der elektrophoretischen Beweglichkeit der einzelnen Polypeptide. Die hohe Aussagekraft der Methode wurde vor allem durch Untersuchungen an Vertretern der Gattung Nicotiana unter Beweis gestellt (KUNG 1976). Das Verfahren wurde jedoch auch zu Untersuchungen liber den Ursprung der polyploiden Weizen herangezogen (CHEN et al. 1975). lm letztgenannten FaIle konnten verschiedene Aegilops- bzw. Triticum-Arten an Hand der elektrophoretischen Beweglichkeit der drei Polypeptide der groBen Untereinheiten differenziert werden. Auf diese Weise wurde ermitteIt, welche Arten bei der spontanen Polyploidisierung des Weizens von diploiden liber tetraploide zu hexaploiden Formen das Chloroplasten-Genom beigesteuert haben und somit der mlitterIiche Elternteil waren.
300
D. REICHENBACHER, J. RICHTER und D. SPAAR
Bei immunologischen Untersuchungen tiber die Struktur und die Funktion des FIP wiesen GRAY und KEKWICK (1974) nach, da13 die gro13en Untereinheiten an der Oberflache des Molektils liegen, wahrend die kleineren im Inneren des Molektils verborgen sind. Dies bedeutet, da13 mit Antiseren gegen das komplette FIP Aussagen tiber die gro13en Untereinheiten erhalten werden konnen. Wir mochten im folgenden tiber Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit des FIP bei Gramineen berichten, die mit Hilfe der Immunelektrophorese unter Verwendung von Antiseren gegen komplettes FIP aufgefunden wurden und an Hand von Beispielen demonstrieren, da13 auch auf diese einfache Weise eine Markierung des Chloroplasten-Genoms erfolgen kann.
Material ond Methoden Die Anzucht der Pflanzen wurde wie bereits bei REICHENBACHER et al. (1976) beschrieben in Komposterde unter Gewachshausbedingungen bzw. auch in Klimazellen vorgenommen. Untersucht wurden Sorten von Gerste (Hordeum 'l:ulgare L.), Roggen (Secale cereale L.) einschlieBlich alloplasmatischer Roggenformen (bei denen das Roggen-Genom im Weizenplasma vorliegt) und Hafer (Avena saliva L.), des weiteren diploide, tetraploide und hexaploide Weizen (Triticum monococcurn L., T. durum Desf., T. turgidurn L., T. carthlicum Nevski, T. dicoccon Schrank, T. aestivum L.), Triticale (6 x und 8 x) sowie Mais (Zea mays L.), Hirse (Panicum miliaceum L.), Quecke (Agropyron repens P. B.) und eine Anzahl von Futtergrasern. 1 ) Losliche BIattproteine wurden aus Primarbliittern 7 Tage alter Pflanzen nach RICHTER et al. (1975) extrahiert. . Grob gereinigtes FIP, welches bei der Antiserumherstellung Verwendung fand, wurde modifiziert nach KAWASHIlIIA und WILDlIIAN (1971) erhalten. AnsteBe des dort verwendeten Tris-Puffers und Sephadex G-25 verwendeten wir Phosphatpuffer und Epidex-B 2. Nach abschlieBender Fraktionierung iiber Sephadex-G200 wurden aus dem Bereich des FIP(siehe bei RICHTER et a1.1975) die Hauptfraktionen gesammelt und das entstandene Volumen mit Polyathylenglycol 20000 eingeengt. ABe Extraktionsschritte wurden bei + 4 °C durchgefiihrt. Die Herstellung der Antiseren gegen FIP erfogte mittels Immunisierllng von Kaninchen in Anlehnllng an KONAREV u. a. (1970), wobei den Tieren 60 mg Protein injiziert wurden. Beim immunelektrophoretischen Vergleich der Antigenextrakte wurde die Mikromodifikation der Immunelektrophorese nach SCHEIDEGGER (1955) angewendet .Die Untersuchungsbedingungen sind die gleichen wie bereits bei REICHENBACHER u. a. (1976) fiir Blattproteinvergleiche beschrieben. Jede Probe wllrde nicht weniger als 6mal getrennt voneinander getestet.
Ergebnisse Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit zwischen verschiedencn Sorten einer Art konntcn in keincm Fallc fcstgestellt werden. Demgegentiber zeigten sich in einer Reihe von Fallen gu te Differcnzierungsmoglichkeiten zwischen unterschiedlichen Gattungen bzw. Arten innerhalb der Gramincen (Abb. 1--3). 1) Frau Dr. G. SZIGAT, Institut fiir Pflanzenziichtung Giilzow-Giistrow der AdL und Herrn Dr. C. O. LEHMANN, Zentralinstitut fiir Genetik und Kulturpflanzenforsehung Gatersleben der AdW danken wir fiir die freundliche Unterstiitzung dieser Arbeit.
A F 1
A i r
F
(
301
Fraktion-I-Protein bei Gramineen
Abb.1. Immunopherogramme von Blattextrakten mit Antiserum gegen Fraktion-I-Prolein von H. vulgare. -"! • 1 = H. vulgare; 2 = T. aestivum; 3 = S. cereale; 4 = A. sativa; a = Prazipitationslinie des Fraktion-I-Proteins; b = Prazipitationslinie einer Protein-"Verunreinigung".
J
:
5I
Abb.2. Immunopherogramme von Blatlextrakten (Getreidearten und Quecke) mit Antiserum gegen Fraktion-I-Portein von T. aestivum. 1 = Z. mays, 2 = P. miliaceum, 3 = T. aestivum, 4 = A. repens.
Das FIP in den Extrakten reagiert mit Antiserum gegen FIP aus Gerste stets unter Ausbildung einer starken Prazipitationslinie. Die zweite, schwachere Prazipitationslinie in den Immunelektropherogrammen ist auf eine Protein-Verunreinigung zuriickzufUhren, d. h. das fUr die Antiserumherstellung verwendete FIP lag nicht in hochgereinigter Form vor. Wahrend sich Weizen und Gerste nicht oder nur minimal unterscheiden (siehe auch BORNER et al. 1976), zeigen Roggen und Hafer in der genannten Reihenfolge
302
D.
REIClIEXnXCHEH,
J.
RICHTER
und D.
BPAAR
Abb.3. lmmunopherogramme von Blattextrakten (Futtergriiser) mit Antiseren gegen Fraktion-I-Protein von T. aestivum. 1 = L. multiflorum ssp. multiflorum var. westerwoldicum, Borte ,Bernburger Annua'; 2 = L. multiflorum ssp. multiflorum var. westerwoldicum, Borte ,P ollanum', 4 x; 3 = L. multiflorum ssp. italicum; 4 = L. perenne; 5 = F. ovina; 6 = F. rubra; 7 = F. pratensis.
eine gesteigerte elektrophoretische Beweglichkeit des FIP in anodischer Richtung (Abb.l). Von geringen Unterschieden in der Intensitat der Reaktion des FIP abgesehen, wurden die gleichen Pherogramme auch mit Antiseren gegen FIP aus Weizen bzw. Roggen erhalten. Anders als Weizen bzw. Gerste reagieren auch Mais und Hirse sowie Quecke, die von den beiden ersteren gleichfalls an Hand einer gro./3eren anodischen Beweglichkeit differenziert werden kann (Abb. 2). Auch bei einer Reihe von Futtergrasern konnten Differenzierungsmoglichkeiten festgestellt werden, so z. B. innerhalb der Gattung Festuca. Mit Ausnahme des Wiesenschwingels (Festuca pratensis Huds.) ist eine Unterscheidung gegeniiber Weidelgrasern (Lolium spec.) moglich (Abb. 3).
2
~
...f".., ...
t:d
.?
~
I:!I
>oj
l
>oj
.,.
~
il-
s·
t:d
n;~
Abb.4. Vergleich der elektrophoretischen Beweglichkeit von Fraktion-I-Protein (FIP) bei Triticum-Arlen. A: FIP nach immunelektrophoretischer Untersuchung mit Antiseren gegen FIP von T. aestivum. B: Polypeptide der grofien Untereinheit des.FIP nach Elektrofokussierung, schematisch nach CHEN et al. (1975). Ai: T. monococcum; A2: T. dicoccon; A3: T. aestivum; Bl: T. monococcum (AA); B2: T. dicoccon (AABB); B3: T. aestivum (AABBDD).
~
~
::l
'"'"
S :;.
~
'"'
CCl
0' ~.
:;. '"
3M-
>;-< '"d
7
0
tt
i>;"
~
'"'
"'J
304
D.
REICHENBACHER,
J.
RICHTER
und D.
SPAAR
Abb.5. lmmunopherogramme von Blatlexlrakten mit Antiserum gegen Fraktion-I-Protein von T. aestivum L. 1 = S. cereale; 2 = aUoplasmatischer Roggen.
Nach Befunden von JONES und LYTTLETON (1972) an Rotklee kann eine gesteigerte elektrophoretische Beweglichkeit von FIP auf Wechselwirkungen zwischen diesem Protein und bei der Extraktion entstehenden Produkten der Tatigkeit von Polyphenoloxydasen beruhcn. Diese Wechselwirkungen und damit die gesteigerte clektrophoretische Bewegliehkeit konnten durch Zugabe eines Polyphenoloxydasc-Inhibitors ausgeschaltet werden. Wir stellten nach Zugabe von 0,001 m Natriumdiiithyldithiocarbamat zum Extraktionsmedium keinen Ehflu13 auf die elektrophoretische Beweglichkeit der FIP bei den getesteten Gramineen fest. Somit kann geschlu13folgert werden, daB die beobaehteten Unterschiede nicht im Gcfolge der Extraktion entstanden sind, sondern auf Differenzen in der Molekularstruktur zuriickgchen. Nach den bcreits zitierten Ergebnissen von GRAY und KEKWICK (1974) erfassen wir mit unseren Antiseren gegcn das komplette FIP die groBen Untereinheiten des Proteins. Wir iiberpriiftcn an Hand folgendcr 3 Bcispiele, ob cine spezifische Position der Prazipitationslinie des FIP im Immunelektropherogramm zur Markierung des ChloroplastenGenoms (siehe Einleitung) verwendet werden kann:
1_ Beim Vergleich von Triticum-Arten zeigte sich, daB das FIP der diploiden Art T. monococcum eine hOhere anodische Beweglichkeit besitzt als das cntsprechende Protein verschiedener tetra- und hexaploider Triticum-Arten. Die .Differenzen stimmen mit denjenigen iiberein, die CHEN et al. (1975) an Hand der unterschiedlichen elektrophoretischcn Beweglichkeit der drei Polypeptide der groBen Untereinheit des FIP nachgcwiesen hatten (Abb. 4). 2_ 4 x - und 6 x -W cizen konnten nicht von Triticale (es wurden 6 X - und 8 X - Formen untersucht) unterschiedcn werden, was auf Grund des gemeinsamen Weizenplasmas verstandlich ist. 3. Es war moglich, Roggen von alloplasmatischem Roggen zu unterscheiden. Letzterer reagierte wie 4 X - oder 6 X - Weizen bzw. Triticale (Abb. 5). Die Versuche wurden an alloplasmatischen Roggenformen durchgefUhrt, die im Institut fUr Pflanzenziichtung Giilzow-Giistrow bei Kreuzungen von 6 X -Triticale (Tripel-Bastarde) aus Japan mit 2 x-Roggen entstanden (SZIGAT und KISTNER 1976). Es handelt sich um Roggen im Plasma von T. carthlicum.
Fraktion-I-Protein bei Gramineen
305
Diskussion In der vorliegenden Arbeit werden weitere Beweise dafur vorgelegt, daJ3 mit Hilfe von Unterschieden in der elektrophoretischen Beweglichkeit des FIP eine Markierung des Chloroplasten-Genoms erfolgen kann. Die Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit der FIP konnen auf verschiedene Weise erfaJ3t werden. Am leistungsfahigsten ist zweifelsohne das Verfahren von KUNG et al. (1974), da die Elektrofokussierung zu einer Auftrennung der Polypeptide filhrt und somit nicht nur die elektrophoretischen Beweglichkeiten, sondern auch die Zahl der Polypeptide in beiden Untereinheiten erfaJ3t werden. Damit konnen mittels einer einzigen Methode sowohl Kernals auch Chloroplasten-Genome markiert werden, was sich filr die Untersuchungen an Nicotiana-Arten als auf3erordentlich wertvoll erwies. Bei den Untersuchungen an Wei zen entfiel jedoch die Moglichkeit del' Markierung des Kerngenoms, da zwischen den klein en Untereinheiten keine Unterschiede auftraten (CHEN et al. 1975). Dies trifft auch auf diejenigen Methoden zu, die auf del' Feststellung von Unterschieden in der elektrophoretischen Beweglichkeit von intaktem FIP beruhen. Derartige Unterschiede lassen sich mit Hilfe del' Polyacrylamid-Gelelektrophorese (ANDERSEN et al., 1970; STEER, 1975) oder der Immunelektrophorese (vorliegende Arbeit) nachweisen. Sie gehen bei den von uns gepruften Beispielen (Triticale, Arten von Triticum, alloplasmatische Roggen) auf Unterschiede zwischen den groJ3en Protein-Untereinheiten zuruck und ermoglichen somit nur eine Markierung des Chloroplasten-Genoms. Ob auf Grund der speziellen Anordnung der kleinen Untereinheit im Gesamtprotein (GRAY und KEKWICK 1974) diese in von uns nicht gepruften Beispielen die Mobilitat des FIP ebenfalls beeinflussen kann, ist noch unklar. 1m Fall von Gerste und Weizen z. B. wirken sich elektrophoretische Unterschiede in den kleinen Untereinheiten (BORNER et al. 1976) nicht merklich auf die Mobilitat des gesamten FIP aus (siehe Abb. 1). Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese und die Immunelektrophorese sind gegenuber der Elektrofokussierung in methodischer Hinsicht einfacher, vor allem auch deshalb, weil zur Testung kein hochgereinigtes FIP benotigt wird. Daraus ergibt sich ein erheblicher Vorteil. Die immunelektrophoretischen Untersuchungen konnen z. B. mit den Rohextrakten aus einem einzigen Blatt durchgefiihrt werden, d. h., es sind Einzelpflanzenuntersuchungen moglich (REICHENBACHER, 1974). Dies ist un seres Erachtens fUr Belange der zuchterischen Praxis von Bedeutung und eroffnet Anwendungsmoglichkeiten bei der Analyse von Kreuzungsbastarden, wie dies in der vorliegenden Arbeit am Beispiel der Differenzierung von Roggen und alloplasmatischem Roggen demonstriert wurde. Mit Hilfe der beiden Verfahren kann in Zukunft auch das wichtige Problem der innerartlichen Variabilitat (siehe JOHNSON 1976) ohne groJ3eren Aufwand intensiver untersucht werden. Wir mochten an dieser Stelle betonen, daJ3 wir bei unseren bisherigen Versuchen an Einzelpflanzen bzw. an kleineren Gruppen von Pflanzen keinerlei Hinweise filr eine Variabilitat der elektrophoretischen Beweglichkeit des FIP innerhalb einer Art erhalten haben. Die beiden vereinfachten Verfahren erlauben gleichfalls Ruckschlilsse zum Verlauf der Evolution polyploider Kulturpflanzen, wie von STEER (1975) am Beispiel del' Gattung Avena gezeigt werden konnte. Auch un sere 21*
306
D. REICHENBACHER, J. RICHTER und D. SPAAR, Fraktion-I-Protein bei Gramineen
Ergebnisse an Vertretern der Gattung Triticum, die eine Bestatigung del' Befundc von CIIEN et al. (1975) darstellen, deuten in diese Richtung. Literatur ANDERSEN, W. R., WILDNER, G. F., and CRIDDLE, R. S., Ribulose diphosphate carboxylase. III. Altered forms of ribulose diphosphate carboxylase from mutant tomato plants. Arch. Biochem. Biophys. 137,84-90 (1970). BORNER, TH., JAHN, G., and HAGEMANN, R., Electrophoretic mobility of the subunits of fraction 1 protein of higher plant species. Biochem. Physiol. Pflanzen 169, 179-181 (1976). CHEN, K., GRAY, J. C., and WILDMAN, S. G., Fraction 1 protein and the origin of polyploid wheats. Science 190, 1304-1306 (1975). GRAY, J. C., und KEKWICK, R. G. 0., An immunological investigation of the structure and function of ribulose-1,5-biphosphate carboxylase. Eur. J. Biochem. 44,481-489 (1974). JOHNSON, B. L., Polyploid wheats and fraction 1-protein. Science 192, 1252 (1976). JONES, W. T., and LYTTLETON, J. W., The importance of inhibiting polyphenol oxidase in the exkaction of fraction 1- leaf protein. Phytochemistry 11, 1595-1596(1972). KAWASHIMA, N., and WILDMAN, S. G., Studies on fraction 1-protein. Effect of crystallization of fraction 1-protein from tobacco leaves on ribulose diphosphate carboxylase activity. Biochim. biophys. Actn (Amsterdam) 229, 240-249 (1971). KONAREV, V. G., GAVRILJUK, I. P., i GUBAREVA, N. K., Belkovye markery genomov psenic i ich dikich sorodicej. Immunochimceskij analiz rastvorimych belkov zerna psenic i egilopsov. Vestnik sel'skochozjajstvennoj nauki (Moskva) 15, 100-108 (1970). KUNG, S. D., Tobacco fraction 1 protein: A unique genetic marker. Science 191, 429-434 (1976). _ SAKANO, K., and WILDMAN, S. G., Multiple peptide composition of the large and small subunits of Nicotiana tabacum fraction 1-protein ascertained by fingerprinting and electrofocusing. Biochim. biophys. Acta (Amsterdam) 365, 138-147 (1974). REICHENBACHER, D., Beitrage zur serologischen Differenzierung von Sippen bei Getreide unter besonderer Beriicksichtigung von Gerste mit unterschiedlicher Resistenz gegen Gelbrost. Halle, Martin-Luther-Universitat, Diss. 1974, 159 S. _ RICHTER, J., und SPAAR, D., Beitrage zur serologischen Differenzierung von Sippen bei Getreide. Arch. Ziichtungsforsch. (Berlin) 6, 179-184 (1976). / RICHTER, J., REICHENBACHER, D., und SPOHN, H. J., Ein Beitrag zur Herstellung von Antiseren gegen losliehe Blattproteine. Biochem. Physiol. Pflanzen 167, 285-290 (1975). SCHEIDEGGER, J. J., Une micromethode de l'immunoelectrophorese. Intern. Arch. Allergy Appl. Immunol. 7, 103-110 (1955). STEER, M. W., Evolution in the genus Avena: Inheritance of different forms of ribulose diphosphate carboxylase. Can. J. Genet. Cytol. 17, 337-344 (1975). SZIGAT, G., und KISTNER, G., Dber bisherige Ergebnisse der Kreuzung von Triticale mit Roggen. Tag.-Ber., Akad. L~n.dwirtsch.- Wiss. DDR, Berlin 143, 39-48 (1976). Eingegangen 26. November 1976. Anschrift der Verfasser: Dr. D. REICHENBACHER, Dr. habil. J. RICHTER und Prof. Dr. D. SPAAR, Institut fiir Phytopathologie der Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR, 432 Aschersleben, Theodor-Roemer-Weg.