Untersuchungen über den Mechanismus der Induktion lysogener Bakterien

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BIOCHIM1CA ET B1OPHYSICA ACTA

BBA 95289

U N T E R S U C H U N G E N 1]BER D E N MECHANISMUS D E R I N D U K T I O N LYSOGENER BAKTERIEN IX. D I E T E M P E R A T U R A B H A N G I G K E I T D E R I N D U K T I O N D U R C H T H Y M I N - M A N G E L U N D MITOMYCIN C

ERHARD GEISSLER ~

Abteilung [~ir Genetih, Institut ]iir Krebstorschung, Deutsche Akademie der Wissenschatten zu Berlin, Berlin-Buch (Eingegangen Miirz 16, 1965)

SUMMARY

Investigations on the mechanism o/ induction o/ lysogenic bacteria. IX. Temperature dependence o[ induction by thymine deprivation and treatment with mitomycin C I. To obtain more detailed knowledge on the mechanism of thymineless induction of lysogenic Escherichia coli cells, experiments were carried out at different temperature. 2. Lysogenic and non-lysogenic thymineless mutants and wild-type bacteria treated with 5 #g/ml 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 2oo/zg/ml uracil succumb to thymineless death in thymine-free medium at 37 ° but not at 20 °. 3. Lysogenic thymineless mutants and wild-type bacteria treated with 5 #g/ml 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 200/~g/ml uracil are induced within 90 rain in t h y m i , e free medium at 37 °. At 20 ° there is no typical thymineless induction;notwithstanding, all cells of the populations treated are induced within 5 h. 4. Induction b y treatment with Io/~g/ml mitomycin C follows nearly the same kinetics at 37 ° and 20 ° , respectively. 5. It is concluded that the toxic metabolites which presumably are responsible for both thymineless death and thymineless induction accumulate more slowly at 20 °, and that the lysogenic regulatory mechanism is much more sensitive to these metabolites than is the target determining viability.

EINFOHRUNG

Lysogene Bakterien k6nnen unter anderem dutch Thymin-Mangel induziert werden: Durch Inkubation lysogener Thymin-Mangel-Mutanten in Thymin-freiem Abktirzungen: FdU, 5-Fluor-2'-desoxyuridin; U, Uracil. * Gegenwiirtige Adresse: I n s t i t u t fiir Mikrobengenetik der Universit~kt Rostock (Deutschland).

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Medium (MELECHEN UND SKAAR1) oder durch Behandlung lysogener Bakterien mit FdU (LEvlI~E*) - - speziell in Gegenwart von Uracil (GEISSLER3) --, Aminopterin (BEN-GURION4), Amethopterin (GEISSLER UND BENDER5) oder 5-Bromdesoxyuridin (GEISSLERe). M6glicherweise ist auch die -- bisher allerdings nur bei Salmonella thompson beobachtete-- Induktion durch Sulfathiazol (WILLIAMSSMITH 7) auf einen Thymin-Mangel zurfickzuffihren, w~ihrend die Induktion durch 5-Fluoruracil (GEISSLER8) zumindest zum Teil auch auf RNA-Effekte zurfickgeffihrt werden mul3 (GEISSLER9, GEISSLER UND ISSERSTEDT32). In Diskussionen fiber den Mechanismus der Thymin-Mangel-Induktion wurde in letzter Zeit oft an eine Anreicherung toxischer und gleichzeitig induzierender Stoffwechselzwischenprodukte gedacht. Solche Metabolite, beispielsweise das sich bei Thyminmangel anreichernde Desoxyadenosintriphosphat (MoNcH-PETERSEN OND NEUHARDI°), sind m6glicherweise ffir den Thymin-Mangel-Tod verantwortlich (MAALOEll). Man k6nnte annehmen, dab diese Substanzen auch den lysogenen Regulationsmechanismus st6ren, und zwar dadurch, dab sie mit den Phagenrepressoren reagieren und diese dadurch inaktivieren (BRENNERx2, GEISSLER9, GOLI)THWAIT UND JACOB13). Thymin-Mangel-Tod und Thymin-Mangel-Induktion w~iren demnach auf die Wirkung der gleichen Faktoren zuriickzuftihren. Das erscheint auch deshalb als recht wahrscheinlich, weil beide Prozesse jeweils den fiberwiegenden Anteil der einem Thymin-Mangel ausgesetzten Populationen betreffen, und zwar jeweils etwa zum gleichen Zeitpunkt. Im Folgenden sollen nun aber Befunde mitgeteilt werden, die zeigen, dab nicht in jedem Fall Beziehungen zwischen Thymin-Mangel-Tod und ThyminMangel-Induktion bestehen.

MATERIAL UND METHODEN Mitomycin C wurde bezogen von Kyowa Hakko Kagyo Co., Ltd., Tokyo. Desoxyadenosin und Thymin wurden bezogen von Calbiochem. Uracil wurde bezogen von Arco-Chemie. 5-Fluordesoxyuridin wurde freundlicherweise v o n d e r Deutschen Hoffmann-La Roche AG, Grenzach, zur Verffigung gestellt.

Escherichia coli-Stdmme KI2 (~) Hfr Ss- prot ("Hfr A'"), KI2 (~) t h y - ("E 7 o") und als Indikatorstamm KI2 F - Sr T - L - B1- lac- mal- xyl- man- gal + ("C 600"); s~imtlich aus der Sammlung des Microbial Genetics Research Unit, London, CR34 lac- T - L - TIr T5 r thy-, aus der Sammlung des Institutes ffir Genetik der Universit~it zu K61n.

Medien NB-Medium: IO g Pepton "Grfinau", 3 g ]3acto beef extract, 5 g NaC1, I g Glucose, IOOO ml Aqua dest. SS-Mediunl: 30 g Glyzerin, 3 g Bacto vitamin-free Casamino acids, o.oi g KH2PO a, o.o21 g Na2HPO4, 0.3 g MgSO,'7H20, 3.0 g NH4C1, 0.3 ml I M CaC12, IOOO ml Aqua dest. Biochirn Biophys. Acta, 114 (i966) 116-126

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N~.hragar: 8 g Bacto tryptone, 5 g NaC1, 20 g Agar, IOOOml Aqua dest. Weichagar: 8 g Agar statt 20 g. Saline (Verdtinnungsmedien): 5.85 g NaC1, 1.5 g KH2PO4, 4.19 g Na~HPO4" 2H20, 0.02 g MgSO4.7H20, IOOOml Aqua dest.

Methode I m Allgemeinen wurde mit Bakterien gearbeitet, die zuvor 3 Std. in NBMedium bei 37 ° beltiftet worden waren. Die Pr~incubation und die Ztichtung der ~3bernachtkulturen erfolgte bei den St~mmen E 7 ° und CR 34 in Gegenwart von 2o#g/ml Thymin. Diese St~mme wurden nach der Pr~tincubation drei mal mit Saline gewaschen.

A uswertung Die Bestimmung des Bakterien-Titers und des Phagen-Titers erfolgte mit den fiblichen Methoden. Zur Ermittlung des Titers der induzierten Zellen wurde die lysogene Population 20 rain mit I:IOO verdtinntem ~-Antiserum bei 37 ° incubiert. Nach anschliel3ender Verdfinnung wurde ein Teil davon zur Bestimmung des Titers der vom Antiserum nicht inaktivierten freien Phagen sofort mit Streptomycin (0.25 ml einer o.I %igen L6sung) und Indikatorbakterien ausgeplattet. Ein anderer Teil der mit Antiserum behandelten Populationen wurde mit Indikatorbakterien ohne Streptomycin ausgeplattet, 2 Std. bei 37 ° bebrtitet, mit 1 % i g e r StreptomycinL6sung besprfiht und tiber Nacht weiter bebrtitet. Auf diesen Platten entwickelten sich Plaques, die yon induzierten Zellen und von durch das Antiserum nichtinaktivierten freien Phagen herrfihrten. In den Kurven sind die aus jeweils mehreren Versuchen erhaltenen Mittelwerte mit den zugeh6rigen Streuungen eingetragen.

ERGEBNISSE

Zum Thymin-Mangel-Tod ist aktiver Stoffwechsel notwendig (COHEN UND unter anderem zur Produktion der toxischen Metabolite. Hinsichtlich des Einflusses einer Incubation bei herabgesetzten Temperaturen liegen bisher aber noch keine einheitlichen Resultate vor. W~hrend GALLANTUND SUSKIND15 fanden, dab die Thymin-Mangel-Mutante E. coli B3 bei 25 ° in Thymin-freiem Medium innerhalb von 5 Std. keinem Thymin-Mangel-Tod unterliegt, beobachteten MCFALL UND MAGASANIK16 bei E. coli 15 T - P A - bei Incubation bei 20 ° in Thyminfreiem Medium nach 75 min einen exponentiellen Abfall des 13berlebenden-Titers bis auf (nach 4 Std.) IO %. Wir konnten beim Stamm CR 34 innerhalb yon 5 Std. keinen Thymin-MangelTod beobachten, wenn die Zellen bei 20 ° in dem Thymin-freien SS-Medium incubiert wurden (Abb. I), w~ihrend von den im gleichen Medium bei 37 ° incubierten Zellen nach 5 Std. nur noch o.I % tiberlebten. Entsprechend den einleitend geAuBerten ErwAgungen sollte nun auch bei 20 ° keine Thymin-Mangel-Induktion stattfinden, zumal auch schon frfiher verschiedene Autoren (vgl. KORN UND WEISSBACH17) gefunden hatten, dab unter Bedingungen,

BARNER14), vermutlich

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bei denen ein Thymin-Mangel-Tod verhindert ist, auch keine Thymin-MangelInduktion stattfindet. Tats/ichlich nimmt auch der Titer der lysogenen E 7o-Zellen w/ihrend der Thymin-Mangel-Incubation bei 20 ° innerhalb von 5 Std. nicht ab, und im Gegensatz zu den bei 37 ° beobachteten Verhiiltnissen (Abb. 2A), wo innerhalb von 90 min alle Zellen der Population (nicht nut die zur Bildung von Kolonien bef/ihigten) induziert werden, sind nach 9 ° min Incubation bei 20 ° nur 1.8 % der Zellen induziert (Abb. 2B). Oberraschenderweise findet abet auch bei Incubation bei 20 ° eine " T h y m i n Mangel-Induktion" statt, allerdings mit v611ig anderer Kinetik als bei 37 ° (Abb. 2B). Trotzdem werden aber auch bei 20 ° s/imtliche Zellen der behandelten Population induziert, wenngleich erst innerhalb yon 5 Std. Wie Kontrollversuche ergeben, handelt es sich dabei eindeutig um eine " T h y min-Mangel-Induktion": Hfr A'-Zellen k6nnen sich bei 20 ° in SS-Medium zwar kaum vermehren (Abb. 3), sie werden abet nicht induziert. Die Incubation bei der herabgesetzten Temperatur, oder der Temperatur-downshift (von 37 ° Pr/iincubation auf 20 °) induzieren also allein nicht. Demnach ist es m6glich, durch Ver/inderung der Incubationstemperatur den Thymin-Mangel-Tod und die "typische" (bei 9 ° min maximale) Thymin-MangelInduktion zu verhindern, trotzdem abet bei geniigend langer Incubation IOO °/o der koloniebildenden Zellen durch den Thymin-Hunger zu induzieren. Daraus ergeben sich vor allem zwei Fragen: Gilt dies auch ftir andere Thymin-Mangel-Induktionen, Biochim. Biophys. Acta, 114 (1966) 1 1 6 - 1 2 6

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E.

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Abb. 2. Viabilit~.t v o n E 7o-Zellen ( t h y - ) ( 0 - 0 ) , Titer freier ).-Phagen ( x - - - x ) u n d i n d u z i e r t e E 7o-Zellen (O.-.O) bei I n c u b a t i o n in T h y m i n - f r e i e m S S - M e d i u m bei 3 7 ° (A) u n d 2 0 ° ( B ) . M i t t e l w e r t e aus 4 (A) b z w . 3 (B) V e r s u c h e n .

die nicht auf einem genetischen Defekt beruhen, sondern durch Applikation von Hemmern der Thymidylat-Synthese erzielt werden? Gilt dies auch ffir Induktionen, die offenbar nicht fiber die Schaffung eines Thymin-Mangel-Status erfolgen? Zur Beantwortung der ersten Frage fiihrten wir Versuche mit FdU durch. Beil~iufigen Mitteilungen yon LEVINE 2 und MELECHEN UND SKAAR18 zufolge wirkt FdU induzierend. An anderer Stelle hatten wir gezeigt (GEISSLER~), dab man mit 5 ffg/ml FdU s~imtliche Hfr A'-Zellen innerhalb von 9 ° rain induzieren kann, wenn man gleichzeitig 200 ffg/ml Uracil appliziert und dadurch die induktionshemmende Wirkung hydrolytisch abgespaltenen 5-Fluoruracils vermeidet. Behandelt man Hfr A'-Zellen dagegen bei 2o ° mit 5 #g/ml FdU und 2o0 ffg/ml Uracil, so erh~tlt man praktisch das gleiche Ergebnis wie bei der Induktion durch genetisch bedingten Thymin-Mangeh Innerhalb der ersten 9 ° min finder kaum eine Induktion statt, trotzdem werden innerhalb yon 5 Std. s~imtliche Zellen der behandelten Population induziert (Abb. 4). Dies ist erstens eine weitere Best~tigung daftir, dab die bei 37 ° erfolgende "typische" Induktion durch FdU (und Uracil) tats~chlich eine Thymin-MangelInduktion ist. Zweitens zeigen diese Ergebnisse, dab sich der oben beschriebene Temperatur-Effekt unabh~ngig davon auswirkt, ob es sich um einen genetisch bedingten oder um einen chemisch provozierten Thymin-Mangel handelt. Biochim. Biophy. Acta, 114 ( 1 9 6 6 ) i i 6 - i 2 6

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Abb. 3. ViabilitAt yon Hfr A'-Zellen (thy +) ( O - O ) , Titer freier ~.-Phagen ( × - - - x ) und induzierte Hfr A'-Zellen ( © . . . O) bei Incubation in SS-Medium bei 2o °. Mittelwerte aus 4 Versuchen.

Andererseits geben aber schon JACOB UND WOLLMAN19 an, dab bei Temperaturen im Bereich yon o ° bis 37 ° keine signifikanten Unterschiede in der (offenbar durch Ultraviolett-Bestrahlung erhaltenen) Induktionsrate beobachtet werden konnten. Analoge Ergebnisse erhielten wir in Versuchen mit Mitomycin C, dessen induzierende Wirkung yon OTSUJI et al. 2° beschrieben worden war. Durch Mitomycin C (IO #g/ml) werden sowohl bei 37 ° als auch bei 20 ° innerhalb von 20 min etwa gleich viel Zellen induziert (Abb. 5). In den ersten 20 min liegt die Induktionsrate bei 20 ° etwas unter der bei 37 ° erhaltenen; die Differenzen sind aber --vor allem im Vergleich zu den bei der Thymin-Mangel-Induktion beobachteten Unterschieden -- so geringffigig, dab sie in unserem Zusammenhang wohl vernachl~ssigt werden dfirfen. Interessanterweise zeigen diese Versuche gleichzeitig eine starke Abh~ngigkeit der Inaktivierung der lysogenen Bakterien durch Mitomycin v o n d e r Behandlungstemperatur, wobei ein Dosis-Reduktionsfaktor von etwa 4 zu beobachten ist. Eine AbhAngigkeit der bakteriziden Mitomycin C-Wirkung v o n d e r Temperatur war auch yon WINKLER~1 beobachtet worden. Es liegt nahe, die Temperatur-abh~ngigkeit der Inaktivierung darauf zurtickzuffihren, dab das Mitomycin erst enzymatisch aktiviert werden muB (IYER UND SZYBALSKI22),ehe es cross-linkings und andere DNA-Sch~tden verursacht, und dab die Aktivierungsrate bei 37 ° signifikant gr6Ber sein dfirfte als bei 20 °. Aus der Tatsache, dab zwar die Inaktivierung temperaturabh~ngig verl~uft, nicht aber die Induktion, k6nnte m6glicherweise geschlossen werden, dab auch bier I3iochim. Biophys. Acta, 114 (1966) i i 6 - i 2 6

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A b b . 4. Viabilit~it yon Hfr A'-Zellen (thy +) ( • - O ), Titer freier ~t-Phagen ( × - - - x ) und induzierte Hfr A'-Zellen ( O . . . O ) bei Irmubation in SS-Medium in Gegenwart yon 5 # g / m l 5 - F l u o r - a ' desoxyuridin u n d 2oo/~g/ml Uracil bei 3 7 ° ( A ) u n d 2 0 ° ( B ) . Mittelwerte aus 5 ( A ) b z w . 3 ( B )

Versuchen.

Induktion und Inaktivierung auf verschiedene Prozesse zurtickzuftihren sind, wobei m6glicherweise Mitomycin C eine induzierende Aktivit~t entfalten k6nnte, ohne vorher enzymatisch aktiviert werden zu mtissen. SchlieBlich soll an dieser Stelle noch auf die bemerkenswerte, uns zuniichst v611ig unerkl~irliche Tatsache hingewiesen werden, dab von den in Gegenwart yon FdU und Uracil bei 20 ° incubierten Zellen keine Phagen produziert werden w~ihrend bei der in 37 ° incubierten Kultur der Phagentiter etwa um das 4" lO3 fache erh6ht wird, wobei von jeder induzierten Zelle iiberschlagsm~iSig lO S Phagen produziert werden (Abb. 4).

DISKUSSION

Bei der Diskussion des oder der m6glichen Induktionsmechanismen kann man sicher davon ausgehen, dab die lysogene Regulation letztlich auf der Produktion cytoplasmatischer Repressoren beruht (vgl. JACOB UND MONODY3), die einer zur Einleitung der Phagenreplikation notwendige sog. "friihe Funktion" reprimieren. Dabei ist es im zu besprechenden Zusammenhang gleichgtiltig, ob die Kontrolle Biochim. Biophys. Acta, 1 1 4 ( 1 9 6 6 )

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entsprechend dem Vorschlag von JACOB UND MONOD~ dadurch erfolgt, dab die Repressoren mit einem entsprechenden Operator im Prophagen-Genom reagieren ("Transcriptions-Kontrolle") oder ob eine "Translations-Kontrolle" erfolgt wobei die Bildung oder die Funktion der Polysomen durch die Repressoren blockiert wfirde. Ein solcher Kontrolltyp wird unter anderem von STENT~ ffir die Regulation der induzierbaren und reprimierbaren Enzyme diskutiert und ist am besten geeignet, die Hemmung der Induktion durch Protein- und RNA-Synthese-Hemmer zu inter-

pretieren (GEISSLERg). Theoretisch k6nnte die Induktion die Folge sein yon (a) einer Inaktivierung der Phagen-Repressoren, (b) einer reversiblen Sch/idigung des ffir die RepressorSynthese verantwortlichen Regulatorgenes, sodaB keine oder keine funktionellen Repressoren synthetisiert werden, (c) einer reversiblen Alteration des Operators oder der ffir den Repressor sensiblen Komponente des Polysoms, sodal] eine "Taubheit" dem Repressor gegen/iber resultiert. Die bisher vorliegenden Befunde, die an anderer Stelle zusammengefaBt wurden (GEISSLERg), schlieBen weitgehend aus, dab die Induktion die Folge der Abheftung des Prophagen vom Bakterienchromosom ist und lassen die M6glichkeiten b und c zugunsten der M6glichkeit a stark zurficktreten. Insbesondere kann Biochim, Biophys. Acta, 114 (][966) n 6 - 1 2 6

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ftir die Induktion durch ultraviolette Strahlen mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit angenommen werden, dab sie indirekt durch eine Inaktivierung der Repressoren erfolgt. Deshalb wird im Folgenden vorausgesetzt, dab auch die Induktion durch Thymin-Mangel die Folge einer Inaktivierung der Phagenrepressoren ist. Schon einleitend war darauf hingewiesen worden, dab man sich die ThyminMangel-Induktion so vorstellte (BRENNER1~, GEISSLER 9, GOLDTHWAITUND JACOBIn), dab die Phagenrepressoren von irgendwelchen Metaboliten X inaktiviert werden, die sich unter Thymin-Mangel-Bedingungen anreichern. Diese toxischen Stoffwechselprodukte werden auch fiir den Thymin-Mangel-Tod verantwortlich gemacht (MAALOEn); m6glicherweise handelt es sich dabei (unter anderem?) um Desoxyadenosintriphosphat, das sich bei Thymin-Mangel stark akkumuliert (MuNcHPETERSEN UND NEUHARD10). Nun zeigen aber die Ergebnisse unserer oben beschriebenen Versuche, dab bei herabgesetzter Temperatur kein Thymin-Mangel-Tod und keine typische ThyminMangel-Induktion stattfindet, gleichgiiltig ob es sich um genetisch bedingten oder chemisch ausgel6sten Thymin-Mangel handelt, w~ihrend trotzdem innerhalb einer ftinfsttindigen Thymin-Mangel-Behandlung s~imtliche betroffenen lysogenen Zellen induziert werden. Dies geschieht aber mit einer vSllig anderen Kinetik als bei 37 °. Diese Befunde legen den Gedanken nahe, dab die "typische" Thymin-MangelInduktion tats~ichlich sehr eng mit dem Thymin-Mangel-Tod korreliert ist, da beide unter anderem auch bei 20 ° aufgehoben sind. Man ist geneigt, dies darauf zuriickzuftihren, dab das toxische und induzierende Produkt X bei 20 ° nicht oder nicht in ausreichender Menge gebildet wird. (Modellversuche zur weiteren Analyse dieses Problems mit Desoxyadenosin sind bisher fehlgeschlagen. Obwohl LARK25 und MUNCH-PETERSEN26 mit Desoxyadenosin Bakterien hemmen konnten, fanden wir bei Applikation selbst yon 500 #g/ml Desoxyadenosin, sowie mit geringeren Dosen sowohl in NB- als auch in SS-Medium weder eine H e m m u n g der Vermehrung von Hfr A'-Zellen, noch eine Induktionswirkung.) Die Tatsache, dab trotzdem bei 2o ° innerhalb von 5 Std. siimtliche betroffenen Zellen durch Thymin-Mangel induziert werden, ist im Augenblick nur sehr unbefriedigend, weil weitgehend spekulativ zu deuten. Am ehesten wird man annehmen, dab die Substanz X zwar auch bei 20 ° gebildet wird, aber sehr viel langsamer und deshalb mit wesentlich geringerer Ausbeute als bei 37 °. Wenn man nun unterstellt, dab die noch unbekannte zellul~ire Komponente, die fiir die inaktivierende Wirkung der Substanz X sensibel ist, weitaus st~irker quantitativ vertreten ist als die Phagenr e p r e s s o r e n - - v o n denen nach Befunden von JACOB et al. ~7 offenbar weniger als lO 3 pro monolysogener Zellen vorhanden sein dtirften -- w~ire verst~indlich, dab die Zellen innerhalb von 5 Std. zwar allm~ihlich zunehmend induziert, aber noch nicht inaktiviert werden. Der lysogene Regulationsmechanismus ware damit wesentlich sensibler als die fiir die Vitalit~it essentielle, durch X inaktivierte Komponente. Wenn diese Vorstellung richtig sein sollte, dann miisste auch bei 20 ° ein ThyminMangel-Tod stattfinden, wenn die Kultur gentigend lange inkubiert wird, d.h., wenn sich die zur Manifestierung der letalen Wirkung erforderliche Menge der Substanz X anreichert. Tats~ichlich haben wit gefunden, dab CR 34-Zellen bei 20 ° in SS-Medium zunehmend inaktiviert werden, wenn man sie l~inger als 5 Std. incubiert: Nach IO Std. iiberleben nur noch 4 4 ± 1 7 °/o, nach 20 Std. I 2 ~ 4 . I °Zo und Biochim. Biophys. Acta, II 4 (1966) 116-126

I N D U K T I O N LYSOGENER BAKTERIEN

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nach 4 ° Std. 3.1+o.8 % (Mittelwerte aus drei Versuchen). Dabei handelt es sich tats~ichlich um einen Thymin-Mangel-Tod, denn Indikatorbakterien verm6gen sich unter diesen Bedingungen allm~ihlich zu vermehren und erreichen nach 4 ° Std. Incubation das IO* fache des Ausgangstiters. Unsere Interpretation findet weiterhin auch in dem Befund eine gewisse Sttitze, dab die lysogenen Zellen auch bei 37 ° sensibler fiir die Induktion als ftir die Inaktivierung durch Thymin-Mangel sind. Um nahezu s~imtliche Zellen (13o °/o der Koloniebildner) zu induzieren, genfigt schon eine Thymin-Mangel-Incubation von 90 min, w~ihrend zur Inaktivierung yon mehr als 99 % der Zellen 3 Std. Incubation erforderlich sind (Abb. 2A). In diesem Zusammenhang ist auch interessant, dab auBerdem die induzierende und inaktivierende Wirkung von X bei 37 ° sich offenbar unter verschiedenen Bedingungen realisiert: MAALOE11 schlieBt aus seinen Befunden, dab der Thymin-MangelTod in zwei Etappen erfolgt. In der ersten Etappe, die im Thymin-Mangel-Medium abl~iuft, wird die toxische Substanz X synthetisiert. Diese wirkt sich aber erst in einer zweiten Etappe, in Gegenwart von Thymin (iiblicherweise nach dem Plattieren der Bakterien auf Thymin-haltigem Agar) letal aus. Der eigentliche Thymin-Mangel-Tod findet also normalerweise nicht w~ihrend der Thymin-Mangel-Behandlung statt. Dagegen ist aus den Abb. 2A und 4A eindeutig zu entnehmen, dab sich die induzierende Aktivit~it der Substanz X bereits w~ihrend des Thymin-Mangels realisiert: W~ihrend der Thymin-Mangel-Behandlung steigt der Phagen-Titer betr~ichtlich an, was nur die Folge der Lyse der induzierten Zellen sein kann (deren Titer dann auch nach 9 ° min st~indig abnimmt). Die Hypothese h~itte schlieBlich auch den Vorteil, zun~ichst exklusiv nur fiir Thymin-Mangel-Bedingungen zu gelten. Und das mul3 in diesem Fall gefordert werden, da ja die bereits erw~ihnten Ergebnisse von JACOB UND WOLLMAN19 als auch unsere Befunde mit Mitomycin C eindeutig zeigen, dab die Induktion durch andere Noxen temperaturunabh~ingig erfolgt. In diesem Zusammenhang ist besonders interessant, dab hier zwei Noxen zum Vergleich herangezogen werden k~innen, die nachweislich unterschiedlich wirken: Die Ultraviolett-Induktion erfolgt indirekt, die durch Mitomycin C dagegen direkt (RYAN~8). SchlieBlich sei an die schon lange bekannten Befunde erinnert (die den Anstol3 zu unseren Versuchen gegeben haben), dab sowohl die lytische Reaktion bei Shigella dysenteriae SH (BERTANI UND NICE 29) als auch die Transferinduktion von ~t-Prophagen--transduziert durch den Phagen 363 - (JAcoBa°) durch Incubation bei 20 ° verhindert werden. In diesem Temperaturbereich ist also im "Wettlauf zwischen Repressor und early protein-Synthese" eindeutig die Synthese des Phagenrepressors bevorzugt--wenngleich auch diese Resultate nicht verallgemeinert werden dtirfen und nicht ftir die Lysogenisierung yon E. coli KI2 durch zutreffen (LIEB31).

ZUSAMMENFASSUNG

I. Um weitere Aufschliisse fiber den Mechanismus der Thymin-MangelInduktion von lysogenen E. coli-Zellen zu erhalten wurden Induktionsversuche bei verschiedenen Temperaturen durchgeftihrt. 2. Lysogene und nicht lysogene Thymin-Mangel-Mutanten unterliegen ebenso Biochim. Biophys. Acta, 114 (1966) i i 6 - i 2 6

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•. GEISSLER

wie mit 5/~g/ml 5-Fluor-2'-desoxyuridin und 200 #g/ml Uracil behandelte Wildtyp-Bakterien in Thymin-freiem Medium bei 37 ° einem Thymin-Mangel-Tod, der aber zumindest innefltalb yon 5 Std. vollst~ndig vermieden wird, wenn die Zellen bei 20 ° incubier~ werd~n. 3. Lysogene Thymin-Mangel-Mutanten und mit 5 # g / m l 5-Fluor-2'-desoxyuridin und 2oo#g/ml Uracil behandelte lysogene Wildtypzellen werden in Thyminfreiem Medium bei 37 ° innerhalb yon 9 ° rain induziert. Diese typische ThyminMangel-Inc~uktion findet bei 2o ° nicht statt, trotzdem werden bei dieser Temperatur s~mtliche.Zellen innerhalb von 5 Std. induziert. 4. Die Induktion durch IO/zg/ml Mitomycin C erfolgt dagegen bei 37 ° und 20 ° mit weitgehend identischer Kinetik. 5. Es wird angenommen, dab sich die ffir Thymin-Mangel-Tod und -Inaktivierung verantwortlich gemachten toxischen Metaboliten bei 20 ° langsamer anreichern als bei 37 °, und dab der lysogene Regulationsmechanismus diesen Metaboliten gegentiber sensibler ist als die sensible, ffir die VitalitXt verantwortliche Zellk6mponente. DANK

Frl. A. SCHfiTT danke ich ffir ihre sehr fleiBige und sorgf~ltige Mitarbeit beiden Versuchen. Herrn Prof. Dr. A, GRAFFI danke ich ffir seine F6rderung meiner Arbeit und fiir kl~rende Diskussionen. LITERATUR I N. E. MELECHEN UND P. D. SKAAR, Federation Proc., 19 (196o) 41o. 2 M. LEVlNE, Virology, 13 (1961) 493. 3 E. GEISSLER, Acta Biol. Med. Germ., i2 (1964) 719. 4 R. BEN-GURION, Biochem. Biophys. Res. Commun., 8 (1962) 456. 5 E. GEISSLER rIND E. BENDER, Arch. Geschwulstlorsch., 22 (I963) 183. 6 E. GEISSLER, Acta Biol. Med. Germ., i i (1963) 286. 7 H. WILLIAMS SMITH, J. Gen. Microbiot., 8 (1953) 116. 8 E. GEISSLER, Acta Biol. Med. Germ., IO (1963) 417 . 9 E. GEISSLER, Habilitationsschritt, H u m b o l d t - U n i v e r s i t A t B e r l i n (1964). io A. MUNCH-PETERSEN UND J. NEUHARD, Biochim. Biophys. Acta, 8o (1964) 542. 11 O. MAALOE, J. Cellular Comp. Physiol. 62, Suppl. i (1963) 31. i2 S. BRENNER, pers6nl. M i t t e i l u n g (1964). 13 D. GOLDTHWAIT UND F. JACOB, Compt. Rend. Acad. Sci. Paris, 259 (1964) 661. 14 S. S. COHEN AND H. D. EARNER, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 4 ° (1954) 885. 15 J. GALLANT UND S. 1~. SUSKIND, J. Bacteriol., 82 (1961) 187. 16 E. McFALL UND B. MAGASANIK, Biochim. Biophys. Acta, 55 (1962) 92o. 17 D. KORN UND A. WEISSBACH, Biochim. Biophys. Acta, 61 (1962) 775I8 N. E. MELECHEN UND P. D. SKAAR, Virology, 16 (1962) 21. 19 F. JAcoB UND E. L. WOLLMAN, Cold Spring Harbor Syrup. Quant. Biol., 18 (1953) i o i . 20 N. OTSUJI, M. SEKIGUCHI, T. IIJIMA UND Y. TAKAHI, Nature London, 184 (1959) lO79. 21 U. WINKLER, Z. Naturlorsch., 17b (1962) 67o. 22 V. N. IYER UND W . SZYBALSKI, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 5 ° (1963) 355. 23 F. JACOB OND J. MONOD, J. Mol. Biol., 3 (1961) 318. 24 G. SZENT, Science, 144 (1964) 816. 25 K. LARK, Biochim. Biophys. Acta, 45 (196o) 121. 26 A. MUNcH-PETERSEN UND J. NEUHARD, Acta Chem. Scand., 17 (1963) 891. 27 F. JAcoB, R. SUSSMAN UND J. MONOD, Compt. Rend. Aead. Sci. Paris, 254 (1962) 4214. 28 A. M. RYAN, BiocMm. Biophys. Acta, 6o (1962) 455. 29 G. EERTANI UND S. J. NICE, J. Bacteriol., 67 {I954) 202. 30 F. JACOB, Virology, I (1955) 207. 31 M. LIES, Cold Spring Harbor Syrup, Quant. Biol., 18 (1953) 7 I. 32 E. GEISSLER UND ISSERSTEDT, Biochim. Biophys. Acta, i m Druck.

Biochim. Biophys. Acta, 114 (1966) 116-126