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Utilisation du polyéthylène glycol pour la précipitation du complexe hormone-anticorps dans le dosage radioimmunologique des gonadotrophines de rat
BIOCHIMIE, 1976, 58, 1417-1418.
U tilisation du polydthyl6ne glycol pour la prdcipitation du complexe hormone-anticorps dans le dosage radioimmunologique des gonadotrophines de rat. Henri
KERCRET el J a c q u e s
DUVAL.
Laboratoire de Neurobiologie Mol~culaire, Equipe de Recherche associde au C.X.R.S. n ° 567, Aoenae du Gdnt'ral Leclerc, 35031 R e n n e s Cedex. (16-7-1976).
INTRODUCTION. La pr6cipitation du complexe hormone-anticorps d a n s les d o s a g e s r a d i o - i m m u n o l o g i q u e s e s t le p l u s s o u v e n t r6alis6e p a r la m 6 t h o 4 e d u d o u b l e a n t i c o r p s . P o u r des r a i s o n s de m o i u d r e coot, n o n s a v o n s 6td a m e n 6 s h r e c h e r c h e r u n e m ~ t h o d e q u i p e r m e t le r e i n p l a c e m e n t d u s d r u m de m o u t o n a n t i - ~ - g l o b u l i n e de l a p i n (SMAL) pal" u n p r o d u i t c h i m i q u e p e u coOteux : le p o l y 6 t h y l 6 n e glycol. N o u s a v o n s a d a p t d la t e c h n i q u e de D e s b u q u o i s et A u r b a c h [!1] a u d o s a g e d e s g o n a d o t r o p h i n e s de r a t darts les m i l i e u x d ' i n c u b a t i o n d ' h y p o p h y s e s collect6s a u ' t o u r s d ' e x p O ' i e n c e s de p 6 r i p e r f u s i o n .
Pdriperfusions. 4 d e m i - h y p o p h y s e s de r a t s o n t i n c u bdes h 37 ° d a n s u n e cellule de nGtre c o n c e p t i o n , s e l o n u n p r o t o e o l e v o i s i n de celui de D o w d et coil. [3i. B r i 6 v e m e n t , cette c e l l u l e e s t c o n s t i t u d e h p a r t i r d ' u n e s e r i n g u e en p l a s t i q u e de 2,5 m l . Le m i l i e u u t i l i s 6 p o u r la p 6 r i p e r f u s i o n e s l d n l i q u i d e de K r e b s - R i n g e r - b i c a r b o n a t e - g l u c o s e pH 7,5 (KRBG) gazd p a r u n m 6 1 a n g e O,_,/COe (95 p. c e n t / 5 p. cent). L ' i n j e c t i o n de ce m i l i e u e s t r6alis6 h l ' a i d e d ' u n e p o m p e p a r l ' e m b o u t de fixat i o n de l ' a i g u i l l e t a n d i s q u e la s o r t i e a lieu g r a c e h u n e a i g u i l l e t r a v e r s a n t le p i s t o n ; le v o l u m e de la c h a m b r e e s t a i n s i m a i n t e n u h 0,4 m l . Le d~bit est de 12 m l / h e u r e , les f r a c t i o n s 6 t a n t r e c u e i l l i e s t o u t e s les 20 m i n u t e s . A d i f f 6 r e n t s t e m p s de la p 6 r i p e r f u s i o n , les TABLEAU I.
M A T E R I E L ET METHODES. Dosage r a d i o i m m u n o l o g i q a e . N o u s a v o n s u t i l i s 6 les k i t s LH et F S H d u NIAMD e t l a t e c h n i q u e r e c o m m a n d6e p o u r l a f o r m a t i o n d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s . L ' 6 t u d e d e s c o n d i t i o n s les p l u s f a v o r a b l e s p o u r l ' u t i l i s a t i o n d u p o l y 6 t h y l b n e glycol a dt6 f a i t e s u r d e u x sdries de t u b e s e o n t e n a n t soit l ' h o r m o n e iodSc (FSH e n v i r o n 30 000 d p m p a r t u b e ) l ' a n t i c o r p s et la s o l u t i o n d i l u a n t e , soil l ' h o r m o n e iod6e e t l a s o l u t i o n d i ] u a n t e . La p r e m i e r e s~rie de t u b e s p e r m e t d ' 6 v a t u e r l ' e n s e m b l e de la r a d i o a c t i v i t ~ 'pr4cipitable p a r le p o l y d t h y l ~ n e glycol darts les c o n d i t i o n s d u d o s a g e . La d e u x i ~ m e s~rie de t u b e s p e r m e t de c o n n a i t r e ]a p r d c i p i t a t i o n a s p d c i f i q u e n o n i m p u t a b l e h la p r 6 c i p i t a t i o n d u c o m plexe antig6ne-anticorps. L'hormone (LH-I-4 o n FSH-I-3) e s t iod6e p a r l'iode 125 ( A m e r s h a m ) p a r la t e c h n i q u e r e c o m m a n d d e p a r le N I A M D q u i e s t proch,e de celle de G r e e n w o o d et coll. [2J, l'exc6s de c h l o r a m i n e T ~ t a n t 61imin6 p a r le b i s u l f i t e . L a s o l u t i o n d i l u a n t e est c o n s t i t u d e de t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M p H 7,4, NaC1 0,15 M, m e r t h i o l a t e O,01 p. cent, a l b u m i n e b o v i n e 1 p. cent. L e s s o l u t i o n s de p o l y 4 t h y l 6 n e glycol (PEG 6 0 0 0 , Merck) et de s d r u m de l a p i n n o r m a l s o n t f a i t e s darts d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M p H 7,4, NaC1 0,15 M. A la s o l u t i o n e o n t e n a n t le c o m p l e x e h prdcipiter, o n a j o u t e s u c c e s s i v e m e n t le s 6 r u m p u i s le PEG. L a p r 6 c i p i t a t i o n p a r le p o l y d t h y l 6 n e glycol d u r e u n e n u i t e n c h a m b r e f r o i d e . L e s t u h e s s o n t c e n t r i f u g 6 s 5_ 1 500 g p e n d a n t 30 m i n u t e s h t e m . p ~ r a t u r e o r d i n a i r e , le s u r n a g e a n t est a s p i r d et le c u l o t e s t lavb p a r 1 nfl de la s o l u t i o n de PEG et centrifugal 'h n o u v e a u . AprSs a s p i r a t i o n d u s u r n a g e a n t de l a v a g e , les t u b e s s o n t c o m p t d s a u e o m p t e u r g a m m a ( I n t e r t e c h n i q u e CG 301).
D d t e r m i n a l i o n des conditions d'utilisation du polye t h y l e n e glycol p o a r le dosage de la FSH.
Concentration
Pr6cipitation asp6eifique p. cent des cpm totaux
Complexe hormone anticorps pr~cipit6 p. cent des cpm totanx
S6rum de l a p i n lyophilis6 mg/ml 0,3 0,6 1,2 3,0 6,0
10,0 10,5 12,5 15,5 19,5
38,5 41,0 42,0
P o l y 6 t h y l ~ n e glycol p. c e n t en p o i d s / v o l u m e 2,0 3,1 6,25 9,4 12,25
5,5 5,5 6,5 9.5 16,5
0 0 7 31,5 38,0
39,0 36,0
L o t s de l ' ~ t u d e d e s c o n c e n t r a t i o n s de s d r u m de l a p i n , le p o l y e t h y l e n e glycol a (~td u t i l i s ~ h la c o n c e n t r a t i o n de 12,5 p. cent. L o r s de l ' ~ t u d e d e s c o n c e n t r a t i o n s de p o l y ~ t h y l 6 n e glycol, le s 6 r u m de l a p i n a ~t6 u t i l i s 6 h la c o n c e n t r a t i o n de 3 m g / m l . Les p o u r c e n t a g e s de p r 6 c i p i t a t i o n d n c o m p l e x e hormone-anticorps correspondent aux valeurs obtenues a v e c la m ~ t h o d e a u d o u b l e a n t i c o r p s p o u r la m£qne d i l u t i o n d u N I A M D - A - R a t FSHS-6.
1418
H. Kercret
hypophyses sont stimul6es par des injections brbves (10 m i n u t e s ) de L H - R F (100 n g / m l ) q u i n o u s a 6t6 f o u r n i g r a c i e u s e m e n t p a r les L a b o r a t o i r e s H o e c h s t . Les c o n t e n u s e n L H et F S H de c h a q u e f r a c t i o n o n t 6t6 d6termin4s.
3o, o/e lie
x x
xx x xx
20.
\x xx
~
ng de L H - R P - I
ou de FSH~oR0P-I
FI6. 1. - - C o m p a r a i s o n des g a m m e s d ' ~ t a l o n n a g e de L H et de F S H o b t e n u e s p a r la m d t h o d e d u d o u b l e a n t i corps et p a r la m S t h o d e au p o l y d t h y l ~ n e glycol. Le s 6 r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n e s t u t i l i s ~ d i l u 6 a u d e m i avec d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M p H 7,4 NaC1 0,15 M. La p r e c i p i t a t i o n d u r e 24 h e u r e s 4 ° C ; le e u l o t d e p r 6 e i p i t a t i o n est lay6 p a r 1 m l d u t a m p o n pr~cSdent. --m6thode du double anticorps. ....... m ~ t h o d e a u p o l y ~ t h y l b n e glycol. D a n s le c a s de la m 6 t h o d e a u p o l y ~ t h y l b n e glycol, la c o n c e n t r a t i o n de s 6 r u m de l a p i n e s t de 1 m g / m l , la c o n c e n t r a t i o n de p o l 6 t h y l b n e g l y c o l e s t de 11 p. cent.
~
2
sa~.
et J. Dural. RESULTATS. Les r 6 s u l t a t s p r ~ s e n t ~ s d a n s le t a b l e a u I n o u s m o n t r e n t q u e l a p r e c i p i t a t i o n spdciflque d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s e s t tr&s p e n affect4e p a r la q u a n t i t y de s ~ r u m de l a p i n p r ~ s e n t e ; p a r c o n t r e , p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n s u p ~ r i e u r e h 1,2 m g / m l , la p r e c i p i t a t i o n a s p ~ e i f i q u e d e v i e n t i m p o r t a n t e . La c o n c e n t r a t i o n m i n i m u m de p o l y 4 t h y l + n e glycol n~cessair,e p o u r o b t e n i r u n e b o n n e pr~ei'pitation d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i corps, v o i s i n e de celle o b t e n u e h a b i t u e l l e m e n t avee le SMAL, s a n s e n t r a l n e r ui~e p r S e i p i t a t i o n aspSeifique t r o p i m p o r t a n t e , est c o m p r i s e e n t r e 9 et 12 p. cent. D a n s les c o n d i t i o n s r e t e n u e s (1 m g / m l de s 6 r u m de l a p i n , 11 p. c e n t de P E G ) , les g a m m e s d ' 6 t a l o n n a g e o b t e n t t e s a u s s i b i e n p o u r 1~ L H q u e p o u r la F S H (fig. 1) s o n t e n b o n accord avee celles o b t e n u e s a p r b s p r S c i p i t a t i o n d u c o m p l e x e p a r le s ~ r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n . Les s t i m u l a t i o n s s u c c e s s i v e s de s~er~tion de LH et de F S H p a r le L H - R F lors d e s e x p e r i e n c e s de p 6 r i p e r fusion d'hypophyses sont 5galement bien mises en 6 v i d e n e e p a r ]es d o s a g e s r 6 a l i s ~ s h l ' a i d e d n P E G (fig. 2). DISCUSSION. Les c o n d i t i o n s e x p b r i m e n t a l e s les p l u s j n d i e i e n s e s p o u r p r ~ c i p i t e r 1,e e o m p l e x e a n t i g + n e - a n t i c o r p s s o n t 1 m g / m l e n s ~ r u m de l a p i n et 1I p. c e n t e n PEG 6 000. D a n s ces c o n d i t i o n s , les g a m m e s d ' ~ t a l o n n a g e c o r r e s p o n d e n t h celles o b t e n u e s p a r la t e c h n i q u e e l a s s i q n e , la s e n s i b i l i t 6 ~ t a n t la m ~ m e d a n s t o u t ],e d o m a i n e de c o n c e n t r a t i o n s u t i l i s a b l e s , t a u t p o u r LH q u e p o u r FSH. Les d o s a g e s r~alis~s darts des m i l i e u x d ' i n e u b a t i o n rgv&lent q u e la m g t h o d e a u P E G p e r m e t d ' g v a l u e r u n e s t i m u l a t i o n de s ~ c r g t i o n in vitro. N o u s a v o n s 6 g a l e m e n t e o n s t a t ~ ( e x p e r i e n c e s n o n dOt a i l l g e s iei) q u e la p r g e i p i t a t i o n a u P E G p e r m e t de d o s e r ]es g o n a d o t r o p h i n e s d a n s d e s e x t r a i t s h y p o p h y s a i r e s ; elle est, p a r e o n t r e , i n u t i l i s a b l e darts n o s c o n d i t i o n s aetuell,es p o u r d o s e r ees m ~ m e s h o m u o n e s d a n s le s ~ r u m , la c o n c e n t r a t i o n glev~e en y - g l o b u l i n e s p r o v o q u a n t u n e p r g e i p i t a t i o n a s p 6 e i f i q u e tr~s i m p o r t a n t e , Le p o l y g t h y l + n e glycol, p r o d u i t p e u eofiteux, p e u t d o n e r e m p l a e e r a v a n t a g e u s e m e n t le s g r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e de l a p i n p o u r le d o s a g e de L H et F S H d a n s les h y p o p h y s e s et dan.s les m i l i e u x d ' i n c u h a t i o n .
S ~ e raps
4 heures
5
Fro. 2. - - E f f e t s de s t i m u l a t i o n s c o u r l e s p a r le L H - R F s u r la l i b ~ r a t i o ~ de L H et de F S H dosdes p a r la m ~ l h o d e au p o l y d t h y l O n e glycol. Les r ~ s u l t a t s p r 6 s e n t ~ s c o r r e s p o n d e n t h l ' i n c u t ) a t i o n de 2 a d ~ n o h y p o p h y s e s de r a t s ~g~s de 35 j o u r s , soit e n v i r o n 10 m g de t i s s u . Le d S b i t de p ~ r i p e r f u s i o n e s t de 12 m l / h e u r e . L ' ~ l u a t e s t collect6 p a r f r a c t i o n s de 20 m i n u t e s . Les s t i m u l a t i o n s p a r le L H - R F (h la c o n c e n t r a t i o n de 100 n g / m l ) d u r e n t 10 m i n u t e s . Le d d b u t de c h a q u e s t i m u l a t i o n e s t i n d i q u ~ p a r u n e fl~ehe. [ ~ - - ~ LH. • • FSH.
B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 11-12.
Remerciemenls. N o u s r e m e r c i o n s le D o c t e u r B l a n c de I'I.N.tl.A. ( N o u z i l l y ) de n o u s a v o i r f o u r n i le s b r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n . N o u s r e m e r e i o n s ~ g a l e m e n t les l a b o r a t o i r e s H o e c h s t p o u r l e u r d o n de L H - R F . BIBLIOGRAPHIE. 1. D e s b u q u o i s , B. & A u r b a c h , G. D. (1971) J. Clin. Endocr., 33, 732-738. 2. Green'wood, F. C., H u n t e r , W. M. ,~ C r o v e r , J. S. (1963) B i o c h e m . J., 80, 114. 3. D o w d , A., B a r o f s k y , A. Z,, C h a u d h u r i , N., L l o y d , C. W . & W e i s z , J. (1975.) E n d o c r i n o l o g y , 96, 243-252.
U tilisation du polydthyl6ne glycol pour la prdcipitation du complexe hormone-anticorps dans le dosage radioimmunologique des gonadotrophines de rat. Henri
KERCRET el J a c q u e s
DUVAL.
Laboratoire de Neurobiologie Mol~culaire, Equipe de Recherche associde au C.X.R.S. n ° 567, Aoenae du Gdnt'ral Leclerc, 35031 R e n n e s Cedex. (16-7-1976).
INTRODUCTION. La pr6cipitation du complexe hormone-anticorps d a n s les d o s a g e s r a d i o - i m m u n o l o g i q u e s e s t le p l u s s o u v e n t r6alis6e p a r la m 6 t h o 4 e d u d o u b l e a n t i c o r p s . P o u r des r a i s o n s de m o i u d r e coot, n o n s a v o n s 6td a m e n 6 s h r e c h e r c h e r u n e m ~ t h o d e q u i p e r m e t le r e i n p l a c e m e n t d u s d r u m de m o u t o n a n t i - ~ - g l o b u l i n e de l a p i n (SMAL) pal" u n p r o d u i t c h i m i q u e p e u coOteux : le p o l y 6 t h y l 6 n e glycol. N o u s a v o n s a d a p t d la t e c h n i q u e de D e s b u q u o i s et A u r b a c h [!1] a u d o s a g e d e s g o n a d o t r o p h i n e s de r a t darts les m i l i e u x d ' i n c u b a t i o n d ' h y p o p h y s e s collect6s a u ' t o u r s d ' e x p O ' i e n c e s de p 6 r i p e r f u s i o n .
Pdriperfusions. 4 d e m i - h y p o p h y s e s de r a t s o n t i n c u bdes h 37 ° d a n s u n e cellule de nGtre c o n c e p t i o n , s e l o n u n p r o t o e o l e v o i s i n de celui de D o w d et coil. [3i. B r i 6 v e m e n t , cette c e l l u l e e s t c o n s t i t u d e h p a r t i r d ' u n e s e r i n g u e en p l a s t i q u e de 2,5 m l . Le m i l i e u u t i l i s 6 p o u r la p 6 r i p e r f u s i o n e s l d n l i q u i d e de K r e b s - R i n g e r - b i c a r b o n a t e - g l u c o s e pH 7,5 (KRBG) gazd p a r u n m 6 1 a n g e O,_,/COe (95 p. c e n t / 5 p. cent). L ' i n j e c t i o n de ce m i l i e u e s t r6alis6 h l ' a i d e d ' u n e p o m p e p a r l ' e m b o u t de fixat i o n de l ' a i g u i l l e t a n d i s q u e la s o r t i e a lieu g r a c e h u n e a i g u i l l e t r a v e r s a n t le p i s t o n ; le v o l u m e de la c h a m b r e e s t a i n s i m a i n t e n u h 0,4 m l . Le d~bit est de 12 m l / h e u r e , les f r a c t i o n s 6 t a n t r e c u e i l l i e s t o u t e s les 20 m i n u t e s . A d i f f 6 r e n t s t e m p s de la p 6 r i p e r f u s i o n , les TABLEAU I.
M A T E R I E L ET METHODES. Dosage r a d i o i m m u n o l o g i q a e . N o u s a v o n s u t i l i s 6 les k i t s LH et F S H d u NIAMD e t l a t e c h n i q u e r e c o m m a n d6e p o u r l a f o r m a t i o n d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s . L ' 6 t u d e d e s c o n d i t i o n s les p l u s f a v o r a b l e s p o u r l ' u t i l i s a t i o n d u p o l y 6 t h y l b n e glycol a dt6 f a i t e s u r d e u x sdries de t u b e s e o n t e n a n t soit l ' h o r m o n e iodSc (FSH e n v i r o n 30 000 d p m p a r t u b e ) l ' a n t i c o r p s et la s o l u t i o n d i l u a n t e , soil l ' h o r m o n e iod6e e t l a s o l u t i o n d i ] u a n t e . La p r e m i e r e s~rie de t u b e s p e r m e t d ' 6 v a t u e r l ' e n s e m b l e de la r a d i o a c t i v i t ~ 'pr4cipitable p a r le p o l y d t h y l ~ n e glycol darts les c o n d i t i o n s d u d o s a g e . La d e u x i ~ m e s~rie de t u b e s p e r m e t de c o n n a i t r e ]a p r d c i p i t a t i o n a s p d c i f i q u e n o n i m p u t a b l e h la p r 6 c i p i t a t i o n d u c o m plexe antig6ne-anticorps. L'hormone (LH-I-4 o n FSH-I-3) e s t iod6e p a r l'iode 125 ( A m e r s h a m ) p a r la t e c h n i q u e r e c o m m a n d d e p a r le N I A M D q u i e s t proch,e de celle de G r e e n w o o d et coll. [2J, l'exc6s de c h l o r a m i n e T ~ t a n t 61imin6 p a r le b i s u l f i t e . L a s o l u t i o n d i l u a n t e est c o n s t i t u d e de t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M p H 7,4, NaC1 0,15 M, m e r t h i o l a t e O,01 p. cent, a l b u m i n e b o v i n e 1 p. cent. L e s s o l u t i o n s de p o l y 4 t h y l 6 n e glycol (PEG 6 0 0 0 , Merck) et de s d r u m de l a p i n n o r m a l s o n t f a i t e s darts d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M p H 7,4, NaC1 0,15 M. A la s o l u t i o n e o n t e n a n t le c o m p l e x e h prdcipiter, o n a j o u t e s u c c e s s i v e m e n t le s 6 r u m p u i s le PEG. L a p r 6 c i p i t a t i o n p a r le p o l y d t h y l 6 n e glycol d u r e u n e n u i t e n c h a m b r e f r o i d e . L e s t u h e s s o n t c e n t r i f u g 6 s 5_ 1 500 g p e n d a n t 30 m i n u t e s h t e m . p ~ r a t u r e o r d i n a i r e , le s u r n a g e a n t est a s p i r d et le c u l o t e s t lavb p a r 1 nfl de la s o l u t i o n de PEG et centrifugal 'h n o u v e a u . AprSs a s p i r a t i o n d u s u r n a g e a n t de l a v a g e , les t u b e s s o n t c o m p t d s a u e o m p t e u r g a m m a ( I n t e r t e c h n i q u e CG 301).
D d t e r m i n a l i o n des conditions d'utilisation du polye t h y l e n e glycol p o a r le dosage de la FSH.
Concentration
Pr6cipitation asp6eifique p. cent des cpm totaux
Complexe hormone anticorps pr~cipit6 p. cent des cpm totanx
S6rum de l a p i n lyophilis6 mg/ml 0,3 0,6 1,2 3,0 6,0
10,0 10,5 12,5 15,5 19,5
38,5 41,0 42,0
P o l y 6 t h y l ~ n e glycol p. c e n t en p o i d s / v o l u m e 2,0 3,1 6,25 9,4 12,25
5,5 5,5 6,5 9.5 16,5
0 0 7 31,5 38,0
39,0 36,0
L o t s de l ' ~ t u d e d e s c o n c e n t r a t i o n s de s d r u m de l a p i n , le p o l y e t h y l e n e glycol a (~td u t i l i s ~ h la c o n c e n t r a t i o n de 12,5 p. cent. L o r s de l ' ~ t u d e d e s c o n c e n t r a t i o n s de p o l y ~ t h y l 6 n e glycol, le s 6 r u m de l a p i n a ~t6 u t i l i s 6 h la c o n c e n t r a t i o n de 3 m g / m l . Les p o u r c e n t a g e s de p r 6 c i p i t a t i o n d n c o m p l e x e hormone-anticorps correspondent aux valeurs obtenues a v e c la m ~ t h o d e a u d o u b l e a n t i c o r p s p o u r la m£qne d i l u t i o n d u N I A M D - A - R a t FSHS-6.
1418
H. Kercret
hypophyses sont stimul6es par des injections brbves (10 m i n u t e s ) de L H - R F (100 n g / m l ) q u i n o u s a 6t6 f o u r n i g r a c i e u s e m e n t p a r les L a b o r a t o i r e s H o e c h s t . Les c o n t e n u s e n L H et F S H de c h a q u e f r a c t i o n o n t 6t6 d6termin4s.
3o, o/e lie
x x
xx x xx
20.
\x xx
~
ng de L H - R P - I
ou de FSH~oR0P-I
FI6. 1. - - C o m p a r a i s o n des g a m m e s d ' ~ t a l o n n a g e de L H et de F S H o b t e n u e s p a r la m d t h o d e d u d o u b l e a n t i corps et p a r la m S t h o d e au p o l y d t h y l ~ n e glycol. Le s 6 r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n e s t u t i l i s ~ d i l u 6 a u d e m i avec d u t a m p o n p h o s p h a t e 0,01 M p H 7,4 NaC1 0,15 M. La p r e c i p i t a t i o n d u r e 24 h e u r e s 4 ° C ; le e u l o t d e p r 6 e i p i t a t i o n est lay6 p a r 1 m l d u t a m p o n pr~cSdent. --m6thode du double anticorps. ....... m ~ t h o d e a u p o l y ~ t h y l b n e glycol. D a n s le c a s de la m 6 t h o d e a u p o l y ~ t h y l b n e glycol, la c o n c e n t r a t i o n de s 6 r u m de l a p i n e s t de 1 m g / m l , la c o n c e n t r a t i o n de p o l 6 t h y l b n e g l y c o l e s t de 11 p. cent.
~
2
sa~.
et J. Dural. RESULTATS. Les r 6 s u l t a t s p r ~ s e n t ~ s d a n s le t a b l e a u I n o u s m o n t r e n t q u e l a p r e c i p i t a t i o n spdciflque d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i c o r p s e s t tr&s p e n affect4e p a r la q u a n t i t y de s ~ r u m de l a p i n p r ~ s e n t e ; p a r c o n t r e , p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n s u p ~ r i e u r e h 1,2 m g / m l , la p r e c i p i t a t i o n a s p ~ e i f i q u e d e v i e n t i m p o r t a n t e . La c o n c e n t r a t i o n m i n i m u m de p o l y 4 t h y l + n e glycol n~cessair,e p o u r o b t e n i r u n e b o n n e pr~ei'pitation d u c o m p l e x e h o r m o n e - a n t i corps, v o i s i n e de celle o b t e n u e h a b i t u e l l e m e n t avee le SMAL, s a n s e n t r a l n e r ui~e p r S e i p i t a t i o n aspSeifique t r o p i m p o r t a n t e , est c o m p r i s e e n t r e 9 et 12 p. cent. D a n s les c o n d i t i o n s r e t e n u e s (1 m g / m l de s 6 r u m de l a p i n , 11 p. c e n t de P E G ) , les g a m m e s d ' 6 t a l o n n a g e o b t e n t t e s a u s s i b i e n p o u r 1~ L H q u e p o u r la F S H (fig. 1) s o n t e n b o n accord avee celles o b t e n u e s a p r b s p r S c i p i t a t i o n d u c o m p l e x e p a r le s ~ r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n . Les s t i m u l a t i o n s s u c c e s s i v e s de s~er~tion de LH et de F S H p a r le L H - R F lors d e s e x p e r i e n c e s de p 6 r i p e r fusion d'hypophyses sont 5galement bien mises en 6 v i d e n e e p a r ]es d o s a g e s r 6 a l i s ~ s h l ' a i d e d n P E G (fig. 2). DISCUSSION. Les c o n d i t i o n s e x p b r i m e n t a l e s les p l u s j n d i e i e n s e s p o u r p r ~ c i p i t e r 1,e e o m p l e x e a n t i g + n e - a n t i c o r p s s o n t 1 m g / m l e n s ~ r u m de l a p i n et 1I p. c e n t e n PEG 6 000. D a n s ces c o n d i t i o n s , les g a m m e s d ' ~ t a l o n n a g e c o r r e s p o n d e n t h celles o b t e n u e s p a r la t e c h n i q u e e l a s s i q n e , la s e n s i b i l i t 6 ~ t a n t la m ~ m e d a n s t o u t ],e d o m a i n e de c o n c e n t r a t i o n s u t i l i s a b l e s , t a u t p o u r LH q u e p o u r FSH. Les d o s a g e s r~alis~s darts des m i l i e u x d ' i n e u b a t i o n rgv&lent q u e la m g t h o d e a u P E G p e r m e t d ' g v a l u e r u n e s t i m u l a t i o n de s ~ c r g t i o n in vitro. N o u s a v o n s 6 g a l e m e n t e o n s t a t ~ ( e x p e r i e n c e s n o n dOt a i l l g e s iei) q u e la p r g e i p i t a t i o n a u P E G p e r m e t de d o s e r ]es g o n a d o t r o p h i n e s d a n s d e s e x t r a i t s h y p o p h y s a i r e s ; elle est, p a r e o n t r e , i n u t i l i s a b l e darts n o s c o n d i t i o n s aetuell,es p o u r d o s e r ees m ~ m e s h o m u o n e s d a n s le s ~ r u m , la c o n c e n t r a t i o n glev~e en y - g l o b u l i n e s p r o v o q u a n t u n e p r g e i p i t a t i o n a s p 6 e i f i q u e tr~s i m p o r t a n t e , Le p o l y g t h y l + n e glycol, p r o d u i t p e u eofiteux, p e u t d o n e r e m p l a e e r a v a n t a g e u s e m e n t le s g r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e de l a p i n p o u r le d o s a g e de L H et F S H d a n s les h y p o p h y s e s et dan.s les m i l i e u x d ' i n c u h a t i o n .
S ~ e raps
4 heures
5
Fro. 2. - - E f f e t s de s t i m u l a t i o n s c o u r l e s p a r le L H - R F s u r la l i b ~ r a t i o ~ de L H et de F S H dosdes p a r la m ~ l h o d e au p o l y d t h y l O n e glycol. Les r ~ s u l t a t s p r 6 s e n t ~ s c o r r e s p o n d e n t h l ' i n c u t ) a t i o n de 2 a d ~ n o h y p o p h y s e s de r a t s ~g~s de 35 j o u r s , soit e n v i r o n 10 m g de t i s s u . Le d S b i t de p ~ r i p e r f u s i o n e s t de 12 m l / h e u r e . L ' ~ l u a t e s t collect6 p a r f r a c t i o n s de 20 m i n u t e s . Les s t i m u l a t i o n s p a r le L H - R F (h la c o n c e n t r a t i o n de 100 n g / m l ) d u r e n t 10 m i n u t e s . Le d d b u t de c h a q u e s t i m u l a t i o n e s t i n d i q u ~ p a r u n e fl~ehe. [ ~ - - ~ LH. • • FSH.
B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 11-12.
Remerciemenls. N o u s r e m e r c i o n s le D o c t e u r B l a n c de I'I.N.tl.A. ( N o u z i l l y ) de n o u s a v o i r f o u r n i le s b r u m de m o u t o n a n t i - y - g l o b u l i n e s de l a p i n . N o u s r e m e r e i o n s ~ g a l e m e n t les l a b o r a t o i r e s H o e c h s t p o u r l e u r d o n de L H - R F . BIBLIOGRAPHIE. 1. D e s b u q u o i s , B. & A u r b a c h , G. D. (1971) J. Clin. Endocr., 33, 732-738. 2. Green'wood, F. C., H u n t e r , W. M. ,~ C r o v e r , J. S. (1963) B i o c h e m . J., 80, 114. 3. D o w d , A., B a r o f s k y , A. Z,, C h a u d h u r i , N., L l o y d , C. W . & W e i s z , J. (1975.) E n d o c r i n o l o g y , 96, 243-252.