- Email: [email protected]
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani
M. Frączek i inni
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani Prognostic value of CDC25 phosphatases expression in laryngeal cancer Marcin Frączek1, Zdzisław Woźniak2, David Ramsey3, Tomasz Zatoński1, Beata Nadolska1, Tomasz Kręcicki1 1Klinika
Otolaryngologii Akademii Medycznej we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. T. Kręcicki 2Zakład Anatomii Patologicznej Akademii Medycznej we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. J. Rabczyński 3Instytut Matematyki Politechniki Wrocławskiej Kierownik: prof. dr hab. Z. Olszak
Summary CDC25 phosphatases, significant positive regulators of the cell cycle play a pivotal role in controlling cell proliferation during development and tumorigenesis. The prevalence and clinical implications of CDC25 immunoreactivity in laryngeal squamous cell cancer (LSCC) patients however, have not been elucidated. Aim. The object of the study was to assess the relationship between the expression levels of CDC25A, CDC25B and clinicopathological parameters and overall survival time of patients with LSCC. Material and methods. Tissue blocks from 46 patients treated surgically at our institution between 1992 and 2000 were available for this study. Immunohistochemistry using polyclonal antibodies against CDC25A and CDC25B was used to examine proteins expression. Ki-67 antigen expression was examined as a cell proliferation marker. Control group consisted of 21 samples of unchanged mucosa. Results. CDC25A and CDC25B expression was observed in 96% (44/46) and 56,5% (26/46) of tumors; the mean labeling index was 73,9% and 36,5% respectively. CDC25 phosphatases expression was higher in LSCC compare to the control group (p<0,001). There was not any significant correlation between the levels of CDC25 phosphatases and investigated variables. In univariate analysis, all classical clinicopathological parameters but none of the proteins were related to the overall survival time. Conclusions. The expression of CDC25A, CDC25B and the proliferation marker Ki-67 are not associated with prognosis in LSCC. Hasła i n de kso we : CDC25A, CDC25B, immunohistochemia, rak krtani Ke y wo rds: CDC25A, CDC25B, immunohistochemistry, laryngeal cancer Otolaryngol Pol 2007; LXI (5):,668–674 © 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
WSTĘP Zaburzenie przebiegu cyklu komórkowego uważane jest za jeden z kluczowych mechanizmów procesu kancerogenezy. Przebieg cyklu podziałowego pozostaje pod ścisłą kontrolą rodziny białek o aktywności kinaz serynowo-treoninowych zależnych od cyklin (kinazy CDK; cyclin dependent kinase) [17]. Aktywność kinaz CDK jest precyzyjnie regulowana przez odwracalną
fosforylację oraz przyłączenie i odłączanie białek regulatorowych. Grupą białek o właściwościach pozytywnych regulatorów cyklu komórkowego są kwaśne fosfatazy CDC25. Poprzez defosforylację reszty tyrozynowej położonej przy N-końcu cząsteczek CDK (Tyr 15 w CDK2 i CDC2, Tyr 17 w CDK4) oraz treoniny Thr 14 aktywują one kompleksy złożone z kinazy CDK i cykliny. Proces ten indukuje ich aktywność enzymatyczną niezbędną w kolejnych etapach cyklu [5].
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
668
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani
Nieprawidłowa aktywność kompleksów cyklina-CDK, wynikająca m.in. z podwyższonej ekspresji fosfataz CDC25 może więc przyczynić się do zaburzenia przebiegu cyklu, czego następstwem może być utrata kontroli nad proliferacją komórki. Potencjalnym skutkiem przyspieszenia proliferacji jest pojawienie się nowych aberracji przenoszonych kolejno do komórek potomnych i w konsekwencji wzrost nowotworu. U człowieka zidentyfikowano trzy białka należące do rodziny CDC25: CDC25B, CDC25B i CDC25C [5, 16]. Cząsteczki CDC25 charakteryzuje identyczny w 40–50% skład aminokwasowy, ale tylko izoformom CDC25A i B przypisuje się rolę potencjalnych onkogenów [5]. Fosfatazy CDC25 funkcjonują na różnych etapach cyklu komórkowego. CDC25A osiąga maksymalny poziom ekspresji w komórce pod koniec fazy G1, stopniowo zmniejszający się w fazie G2; pozostaje ufosforylowana aż do fazy M [10]. CDC25B posiada dwa maksima ekspresji – podczas interfazy G1/S oraz w fazie G2 [13]. Substratem fosfatazy CDC25C jest kinaza CDK1, a fosfatazy CDC25A i B kinaza CDK2 i CDK4 [10]. Uważa się, że CDC25A jest czynnikiem ograniczającym tempo progresji przez fazę G1 oraz inicjację replikacji DNA. Efektem zwiększonej ekspresji CDC25A w nowotworze jest wzrost liczby komórek będących w fazie S. CDC25B w kooperacji z innymi onkogenami wykazuje natomiast potencjał do transformacji nowotworowej komórek. Białko to jest niezbędne do wejścia komórki w fazę M cyklu. Podanie do komórki przeciwciał blokujących białko CDC25B lub stworzenie mutantów nie wykazujących ekspresji CDC25B (CDC25B-/-) zatrzymuje cykl w fazie G2 [4]. Udział fosfataz CDC25 w kształtowaniu fenotypu raka płaskonabłonkowego krtani, a tym samym kliniczna wartość ekspresji CDC25 jako markerów prognostycznych jest słabo poznana. W nowotworach o innej lokalizacji, podwyższona ekspresja fosfataz CDC25 związana jest z wyższym stopniem zaawansowania, obecnością przerzutów węzłowych i niższym zróżnicowaniem guzów [6, 14, 21]. W raku przełyku podwyższona ekspresja CDC25 jest niezależnym czynnikiem prognostycznym [14]. Celem pracy była analiza korelacji pomiędzy ekspresją białek CDC25A i CDC25B ocenioną metodą immunohistochemii a parametrami klinicznymi i histologicznymi oraz czasem przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
MATERIAŁ I METODY W badaniach wykorzystano materiał tkankowy pochodzący od 46 (3 kobiet i 43 mężczyzn) pacjentów leczonych w Klinice Otolaryngologii AM we Wrocławiu w latach 1992–2000 z powodu raka krtani. Najmłodsza osoba miała 44 lata, a najstarsza 71 lat (średnio 58 lat). W okresie obserwacji 20 (43%) pacjentów zmarło. Najkrótszy czas przeżycia wyniósł 46 dni, a maksymalny 8 lat (średnio 5 lat). Przed zabiegiem operacyjnym żaden z pacjentów nie był poddany leczeniu radio- lub chemioterapią. Stopień zaawansowania nowotworu określono za pomocą klasyfikacji TNM wg UICC. Guzy pierwotne o zaawansowaniu ogniska pierwotnego pT1 występowały u 3 chorych, pT2 u 4, pT3 u 21 i pT4 u 18 pacjentów. W 20 (43%) przypadkach stwierdzono przerzuty nowotworowe do węzłów chłonnych szyi. W 3 przypadkach stan zaawansowania klinicznego oceniono jako Iº, w 4 jako IIº, w 17 jako IIIº i w 22 jako IVº. Biorąc pod uwagę lokalizację guza w krtani, w 14 przypadkach miejscem wyjścia nowotworu była głośnia, w 1 przypadku nagłośnia, a w 4 przypadkach okolica podgłośniowa. W pozostałych 27 przypadkach, ze względu na duże zaawansowanie zmian, nie można było określić pierwotnego miejsca wyjścia nowotworu (lokalizacja przezgłośniowa). Stopień zróżnicowania histologicznego według kryteriów WHO oceniony jako wysoki (G1) wystąpił w 6 przypadkach, średni (G2) u 22 chorych, a u 18 stwierdzono raka niskozróżnicowanego (G3). Pacjenci w zaawansowanych stadiach choroby, zgodnie z przyjętymi standardami po zabiegu chirurgicznym poddani zostali radioterapii uzupełniającej. Do grupy kontrolnej zakwalifikowano 21 pacjentów z łagodnymi zmianami nabłonkowymi krtani, potwierdzonymi w badaniu histopatologicznym. Wśród nich wyróżniono 7 (33%) pacjentów z obrzękiem Reinkego, 8 (38%) z polipem fałdu głosowego i 6 (28%) z guzkami śpiewaczymi. Średni wiek pacjentów wyniósł 45 lat (zakres od 36 do 55 lat). Immunohistochemia Materiał pooperacyjny utrwalono w 10% zbuforowanej formalinie, opracowano metodą rutynową i zatopiono w bloczki parafinowe, które pocięto na skrawki. Badania immunohistochemiczne wykonano stosując metodę ABComplex/HRP z króliczymi poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko ludzkiemu białku CDC25A (sc-97) i CDC25B (sc-326) firmy Santa Cruz (USA) w rozcieńczeniu 1:200, przez 1 godz., w temperaturze pokojowej. Wizualizację odczynu uzyskano inkubując skrawki z roztworem
669
M. Frączek i inni
Tabela. I. Zależność pomiędzy ekspresją białka CDC25A i CDC25B a parametrami klinicznymi i histopatologicznymi guzów krtani Parametr Średni wiek (zakres) Zróżnicowanie histologiczne Cecha pT
Cecha pN Zaawansowanie kliniczne
Lokalizacja
Typ histopatologiczny
N [%] 59 (44-71) G1 G2 G3 pT1 pT2 pT3 pT4 pN+ pN0 Iº IIº IIIº IVº nadgłośniowa głośnia podgłośniowa przezgłośniowa rogowaciejący nierogowaciejący
6 (100%) 21 (95%) 17 (94%) 3 (100%) 4 (100%) 20 (95%) 17 (94%) 25 (96%) 19 (95%) 3 (100%) 4 (100%) 16 (94%) 21 (95%) 0 13 (93%) 4 (100%) 27 (100%) 29 (97%) 15 (94%)
czterochlorowodorku 3,3’-dwuaminobenzydyny (DAB). Barwienie w kierunku antygenu proliferacyjnego Ki-67 z użyciem przeciwciał MIB-1 firmy DAKO (Dania) zostało wykonane zgodnie z sugestią producenta. W kontroli negatywnej przeciwciała zastępowano surowicami kontrolnymi, zachowując pozostałe warunki reakcji. Oceny preparatów dokonywano używając mikroskopu Olympus BX 50 z torem wizyjnym i komputerowego systemu analizy obrazów MultiScanBase v. 8.08 (Css Scan). Reakcję immunohistochemiczną oceniano w sposób ilościowy, obliczając indeks barwliwości (IB), będący odsetkiem komórek z odczynem dodatnim do całkowitej liczby ocenianych komórek. Każdorazowo uwzględniano nie mniej niż 500 komórek wykorzystując powiększenie 400-krotne, wybierając pola o najsilniejszej reakcji barwnej (hot spot). Jako pozytywną traktowano reakcję zlokalizowaną w cytoplazmie komórek. Statystyka Do opracowania danych wykorzystano pakiet statystyczny Statistica 6.0 (StatSoft, Inc. 2001). W celu analizy statystycznej danych korzystano z testu niezależności Fishera, a do oceny zależność pomiędzy cechami testu korelacji Kendalla oraz Manna-Whitney’a. Przy wyznaczaniu krzywych przeżycia zastosowano test Coxa-Mantela. Wartości p<0,05 uznawano za istotne statystycznie.
670
Średnia IB CDC25A (zakres) [%] 80,6 (57-89,9) 70,8 (3,8-95) 75,4 (38-94,5) 86,7 (81,3-90) 79,6 (22-30,5) 72,3 (3,8-90,1) 72,3 (50,2-95) 73,3 (3,8-95) 74,6 (50,2-94) 86,9 (81,3-90) 79,6 (57-88,9) 69,1 (3,8-90) 74,8 (37,9-95) 0 68,4 (3,8-89,9) 77,4 (50,2-90) 78,9 (57,2-95) 74 (37,9-90) 69,6 (3,8-90)
p
N [%]
0,42 0,97
2 (33%) 15 (68%) 9 (50%) 1 (33%) 1 (25%) 14 (67%) 10 (56%) 14 (54%) 12 (60%) 1 (33%) 1 (25%) 10 (59%) 14 (64%) 0 7 (50%) 3 (75%) 16 (59%) 17 (57%) 9 (56%)
0,14
0,8 0,48
0,9
0,33
Średnia IB CDC25B (zakres) [%] 16,9 (0-67) 46,1 (0-90,9) 31,4 (0-91,1) 22,3 (0-67) 17,9 (0-71,5) 45,8 (0-90,9) 32,2 (0-91,1) 30,8 (0-90,9) 44 (0-91,1) 22,3 (0-67) 17,9 (0-71,5) 37,4 (0-90,9) 41,2 (0-91,1) 0 30 (0-83,9) 45,6 (0-82,5) 40 (0-91,1) 36,5 (0-90,9) 39,1 (0-68,3)
p 0,89 0,72
0,75
0,28 0,7
0,36
0,64
WYNIKI Ekspresja fosfatazy CDC25A Białko CDC25A w badaniu immunohistochemicznym stwierdzono w 44 (96%) przypadkach raka krtani. Wartości IB mieściły się w zakresie od 3,8 do 95% (średnia 73,9%; SD 23%). Analizując korelacje indeksu barwliwości dla CDC25A z parametrami klinicznymi i histopatologicznymi nie stwierdzono istotnych zależności (tab. I). Nieznacznie wyższą średnią wartość IB wykazywały guzy dobrze zróżnicowane (IB = 80,6%), o niskim stadium zaawansowania narządowego (pT1) i w I° zaawansowania klinicznego (IB = 86,9%). Przypadki słabo zróżnicowane, bardziej zaawansowane miejscowo i klinicznie charakteryzowały się niższymi średnimi IB. W grupie kontrolnej obecność białka CDC25A stwierdzono w 17 (81%) preparatach. Reakcja cytoplazmatyczna zlokalizowana była we wszystkich warstwach nabłonka. Sporadycznie, podobnie jak w przypadkach raka krtani, słabsza reakcja barwna spotykana była również w zrębie łącznotkankowym. Indeksy barwliwości miały wartości w zakresie od 3,8% do 68,8% (średnia 32%; SD 25%). W grupie tej stężenie białka CDC25A nie korelowało z obecnością antygenu Ki-67 (r = 0,11; p = 0,48). Porównanie ekspresji białka CDC25A wykazało istotny wzrost
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani
Ryc. 1. Całkowity czas przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani w zależności od ekspresji białka CDC25A (p = 0,085) średnich wartości IB pomiędzy grupą kontrolną a grupą raków płaskonabłonkowych (p<0,001). Ekspresja fosfatazy CDC25B Białko CDC25B stwierdzono w 26 (56,5%) przypadkach raka krtani. Wartości IB mieściły się w zakresie od 0 do 91,1% (średnia 36,5%; SD 36,4%). Słaba reakcja cytoplazmatyczna obecna była również w podścielisku łącznotkankowym, podobnie jak dla CDC25A. Analizując ekspresję białka CDC25B pod kątem korelacji z parametrami klinicznymi i histopatologicznymi nie wykazano istotnych zależności (tab. I). Średnia wartość IB oraz częstość występowania białka CDC25B w guzach o zróżnicowaniu G2 i G3 była wyższa niż w G1. W guzach o zaawansowaniu miejscowym pT3 i pT4, z współistniejącymi przerzutami węzłowymi oraz o wyższym zaawansowaniu klinicznym częściej obserwowano obecność białka CDC25B. Średnie wartości IB w tych przypadkach były wyższe niż w guzach pT1 i pT2 bez przerzutów węzłowych i o niższym zaawansowaniu klinicznym. Również raki podgłośniowe częściej wykazywały ekspresję CDC25B, a jej średnia wartość była wyższa niż w przypadkach o innej lokalizacji. W preparatach pochodzących z grupy kontrolnej nie wykazano reakcji barwnej dla białka CDC25B. Białko CDC25B znamiennie częściej występowało u chorych na raka krtani, w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,001). Ekspresja antygenu proliferacyjnego Ki-67 Antygen Ki-67 w preparatach pochodzących od pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani stwierdzono w 40 (87%) przypadkach. Wartości indeksu barwliwości dla Ki-67 mieściły się w zakre-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Ryc. 2. Całkowity czas przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani w zależności od ekspresji fosfatazy CDC25B (p = 0,961)
Ryc. 3. Całkowity czas przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani w zależności od ekspresji antygenu proliferacyjnego Ki-67 (p = 0,471) sie od 4 do 66,2% (średnia 29,5%; SD 18%). W grupie kontrolnej antygen Ki-67 obecny był w 9 (43%) przypadkach. IB dla Ki-67 mieściły się w zakresie od 6,5 do 20,4%, (średnia 5,9%; SD 7,6%). Porównanie wartości średnich IB wykazało istnienie istotnej różnicy pomiędzy grupą z rakiem krtani a grupą kontrolną (p<0,001). Nie wykazano natomiast związku pomiędzy ekspresją białka CDC25A i CDC25B a obecnością antygenu Ki-67 (odpowiednio r = -0,02; p = 0,87 i r = 0,06; p = 0,54). Analiza całkowitego czasu przeżycia Analiza zależności pomiędzy ekspresją białek CDC25A, CDC25B oraz antygenu Ki-67 z całkowitą długością czasu przeżycia pacjentów nie wykazała istotnych statystycznie zależności (ryc. 1–3).
671
M. Frączek i inni
Tabela II. Analiza korelacji pomiędzy ekspresją badanych białek i parametrami klinicznymi a całkowitym czasem przeżycia pacjentów z rakiem krtani Parametr CDC25A CDC25B Ki-67 Typ histopatologiczny Zróżnicowanie histologiczne Ognisko pierwotne Stan węzłów chłonnych Zaawansowanie kliniczne
Porównywane grupy CDC25A < 82% / CDC25A > 82% CDC25B < 32% / CDC25B > 32% Ki-67 < 25% / Ki-67 > 25% rak płaskonabłonkowy rogowaciejący / nierogowaciejący G1 + G2 / G3 pT1 + pT2 / pT3 / pT4 pN+ / pN0 Iº + IIº / IVº IIIº / IVº Iº + IIº / IIIº / IVº
W analizie czasu przeżycia do wyznaczenia granicy podziału zastosowano medianę wartość IB dla białka CDC25A i B, która wyniosła odpowiednio 82% i 32%. W przypadku antygenu Ki-67 w obliczeniach zastosowano medianę IB dla tego antygenu (31%) oraz wartość IB równą 25%, która często przyjmowana jest jako wartość graniczna. Parametrami najsilniej związanymi ze skróconym całkowitym czasem przeżycia była obecność przerzutów w węzłach chłonnych szyi oraz wysoki stan zaawansowania klinicznego choroby (p < 0,01) (tab. II).
DYSKUSJA Badania nad białkami regulatorowymi cyklu komórkowego, a zwłaszcza punktów restrykcyjnych, umożliwiają poznanie zmian charakterystycznych dla danego nowotworu i pozwalają lepiej zrozumieć proces kancerogenezy. W komórkach nowotworowych, stan fizjologicznej równowagi pomiędzy pozytywnymi a negatywnymi regulatorami cyklu podziałowego nie jest zwykle zachowany. Konsekwencją tego jest dysregulacja proliferacji komórki, która wraz z ograniczeniem apoptozy traktowana jest jako minimalny warunek niezbędny do manifestacji fenotypu nowotworowego. Ogólną cechą większości ludzkich guzów litych jest również ścisły związek między poziomem proliferacji a stopniem ich agresywności [3]. W wielu przeprowadzonych badaniach wysoki współczynnik proliferacji komórkowej był współzależny ze złą prognozą dla pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani [12, 20]. W prezentowanym materiale pomimo wyraźnie podwyższonego poziomu ekspresji białek CDC25A i CDC25B w raku krtani w porównaniu z grupą kontrolną nie wykazano korelacji pomiędzy ich
672
p p=0,912 p=0,96 p=0,471 p<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,01 p<0,05 p<0,05 p<0,01
ekspresją a parametrami klinicznymi i histopatologicznymi. Publikacje dotyczące ekspresji fosfatazy CDC25 w rakach regionu głowy i szyi są bardzo nieliczne. Gasparotto i wsp. [7] ocenili ekspresję genów CDC25A, CDC25B i CDC25C za pomocą metody QRT-PCR bez analizy korelacji z cechami klinicznymi, wykazując zwiększoną ekspresję mRNA dla CDC25A i CDC25B odpowiednio w 80% i 55% przypadków. W raku płaskonabłonkowym przełyku Nishioka i wsp. [14] stwierdzili podwyższoną ekspresję CDC25A i CDC25B w 46% i 48% przypadków. W materiale tym ekspresja CDC25A i CDC25B była współzależna z wielkością guza, stanem węzłów chłonnych i stopniem zaawansowania klinicznego. W naszych badaniach guzy o zaawansowaniu miejscowym pT3 i pT4, w stadium N+ oraz przypadki o zaawansowaniu klinicznym III° i IV° również charakteryzowała wyższa średnia wartość IB dla białka CDC25B. Xu i wsp. [21] w pierwotnym raku wątroby zaobserwowali podwyższoną ekspresję CDC25A i CDC25B odpowiednio w 42,4% i 20,3% przypadków. Stwierdzili również korelację pomiędzy wzrastającym poziomem CDC25A a rosnącym stopniem odróżnicowania komórek nowotworowych. W analizowanej grupie chorych wśród 44 przypadków wykazujących CDC25A, fosfataza CDC25B była obecna u 26 osób. Wartości IB dla CDC25A były wyższe niż dla CDC25B. Takie różnice w ekspresji obu białek wykazano w nowotworach o innej lokalizacji [9]. Świadczy to o tym, że pomimo podobieństwa w budowie ekspresja fosfataz CDC25 jest prawdopodobnie regulowana niezależnie. Z drugiej strony, geny te mogą pełnić różne role w procesie nowotworzenia. Wiadomo również, że aktywność enzymatyczna CDC25A jest do 10 razy wyższa od aktywności CDC25B, dlatego też możliwe jest, że zmiany w ekspresji CDC25A poniżej poziomu
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani
wykrywalnego metodą immunohistochemii mogą również uczestniczyć w patogenezie raka krtani [11]. W naszych badaniach nie wykazano współzależności ekspresji białka CDC25A i B z ekspresją antygenu proliferacyjnego Ki-67, co pozostaje w zgodzie z obserwacjami w raku piersi [6]. Przeciwnie, w pierwotnym raku wątroby Xu i wsp. [21] zaobserwowali związek ekspresji CDC25A, ale nie CDC25B z ekspresją białka PCNA. Również w chłoniakach nieziarniczych wysoki poziom mRNA dla CDC25B był współzależny z wyższą złośliwością kliniczną guzów i wyższą aktywnością proliferacyjną, wyrażoną frakcją komórek będących w fazie S (SPF) [9]. Fosfatazy CDC25 pełnią funkcję pozytywnych regulatorów cyklu komórkowego, a wyindukowana nadekspresja CDC25A prowadzi do aktywacji cykliny E-CDK2 i cykliny A-CDK2, co wskazuje, że kompleksy te są jednymi z głównych substratów fosfatazy CDC25A [1, 16]. W związku z powyższym, zwiększenie ekspresji CDC25A powinno wiązać się z podwyższeniem aktywności kompleksów cyklina-CDK, a tym samym zwiększeniem proliferacji komórkowej. Brak związku pomiędzy ekspresją białek CDC25 a Ki-67 w analizowanej grupie raków krtani nie potwierdza tego założenia i sugeruje istnienie bardziej skomplikowanych zależności regulujących proliferację komórki. Może także sugerować obecność w komórkach raka krtani dodatkowych czynników wpływających na stężenie białka CDC25A. W prezentowanej pracy nie zaobserwowano istotnej korelacji pomiędzy ekspresją białek CDC25A i B a długością całkowitego okresu przeżycia pacjentów z rakiem krtani. W przypadkach nowotworów o innej lokalizacji stężenie białek z rodziny fosfataz CDC25 często miało charakter rokowniczy. Wyniki pracy Nishioka i wsp. [14] sugerują, że wysoka ekspresja CDC25A jest złym czynnikiem prognostycznym dla pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym przełyku. W grupie tej pacjenci z niską ekspresją białka CDC25A istotnie częściej osiągali 5-letni okres przeżycia. W analizie wieloczynnikowej spośród: głębokości nacieku, obecności przerzutów węzłowych, stopnia zaawansowania wg TNM, poziomu ekspresji CDC25A i B, tylko status CDC25A był dla chorych z rakiem przełyku niezależnym czynnikiem prognostycznym. Xu i wsp. [21] w grupie pacjentów z pierwotnym rakiem wątroby stwierdzili, że wysoka ekspresja CDC25A obok niskiego zróżnicowania histologicznego guza oraz nacieku żyły wrotnej jest czynnikiem predysponującym do wznowy choroby. Również u chorych z rakiem piersi wysoka ekspresja CDC25B związana była z krótszym okresem wolnym od wznowy [6].
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Różnice pomiędzy wynikami badań mogą być konsekwencją heterogenności guzów, a także osobniczo zmiennego zróżnicowania ekspresji danych genów. W przypadku białek CDC25 wykazano, że różnice we właściwościach onkogennych mogą wynikać z czasu trwania poszczególnych faz i całego cyklu komórkowego, jak również odmiennej specyficzności substratowej ww. fosfataz [5]. Mechanizm zwiększenia ekspresji białek CDC25A i B w komórkach nowotworowych nie jest do końca poznany. Jedną z możliwych przyczyn, jakkolwiek rzadko stwierdzaną, jest amplifikacja genów fosfataz. W niektórych nowotworach złośliwych, jak rak jelita grubego, nie obserwowano amplifikacji genów CDC25, a w innych, jak raku niedrobnokomórkowym płuc, amplifikację regionu 20p13, w którym zawiera się gen CDC25B stwierdzono w 40% przypadków, ale nie towarzyszyła jej podwyższona ekspresja białka [9, 21]. Wśród czynników biorących udział w regulacji ekspresji fosfataz wyróżnia się m.in. czynnik transkrypcyjny E2F oraz TGF-b [2]. Transkrypcja genów CDC25A i CDC25B jest jednym z bezpośrednich celów działania onkogenu c-Myc. Uważa się, że fosfatazy CDC25 pełnią istotną rolę mediatora w zależnej od c-Myc indukcji rozpoczęcia cyklu komórkowego i apoptozy [6, 8]. Dotychczasowe badania wskazują na udział onkogenu c-Myc w patogenezie wielu nowotworów, również raka krtani [18]. Nadekspresję c-Myc wykazano w 3070% raków płaskonabłonkowych głowy i szyi [19]. Podwyższony poziom CDC25A i CDC25B w tych przypadkach może mieć związek z nieprawidłową ekspresją onkogenu c-Myc. Regulacja transkrypcji CDC25A i B przez c-Myc łączy potencjał onkogenu tego genu z cyklem podziałowym komórki. Uzyskane wyniki wskazują, że białka CDC25A i B pomimo wysokiej i powszechnej ekspresji w komórkach nowotworowych nie mają wartości prognostycznej dla pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani. Badania poszerzyły jednak wiedzę na temat procesu kancerogenezy i aberracji ekspresji analizowanych białek w raku krtani.
PIŚMIENNICTWO 01. Blomberg I, Hoffman I. Ectopic expression of Cdc25A accelerates the G1/S transition and lead to the premature activation of cyclin E and A-dependent kinases. Moll Cell Biol. 1999; 19: 6183-6194. 02. Chen X, Prywes R. Serum-induced expression of the cdc25A gene by relief of E2F-mediated repression. Mol Cell Biol. 1999; 19: 4695-4702.
673
M. Frączek i inni
03. Crissman JD, Zarbo RJ. Squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract: histologic parameters with prognostic value. In: Fee W.E. Jr, Goepfert H., Johns M.E., Strong E.W., Ward P.H. (eds). Head and Neck Cancer. Vol. 2. Decker, Toronto, 1990. 04. Gabrielli B, De Souza CP, Tonks ID, Clark JM, Hayward NK, Ellem KA. Cytoplasmic accumulation of cdc25B phosphatase in mitosis triggers centrosomal microtubule nucleation in HeLa cells. J Cell Sci. 1996; 109: 1081-1093. 05. Galaktionov K, Beach D. Specific activation of cdc25 tyrosine phosphatases by B-type cyclins: evidence for multiple roles of mitotic cyclins. Cell 1991; 67: 1181-1194. 06. Galaktionov K, Lee AK, Eckstein J, Draetta G, Meckler J, Loda M, Beach D. CDC25 phosphatases as potential human oncogenes. Science 1995; 269: 1575-1577. 07. Gasparotto D, Maestro R, Piccinin S, Vukosavljevic T, Barzan L, Sulfaro S, Boiocchi M. Overexpression of CDC25A and CDC25B in head and neck cancers. Cancer Res. 1997; 15: 2366-2368. 08. Hernandez S, Hernandez L, Bea S, Cazorla M, Fernandez PL, Nadal A, Muntane J, Mallofre C, Montserrat E, Cardesa A, Campo E. Cdc25 cell cycle-activating phosphatases and c-myc expression in human non-Hodgikin lymphomas. Cancer Res. 1998; 58: 1762-1767. 09. Hernandez S, Hernandez L, Bea S, Pinyol M, Nayach I, Bellosillo B, Nadal A, Ferrer A, Fernandez PL, Montserrat E, Cardesa A, Campo E. Cdc25a and the splicing variant cdc25b2, but not cdc25B1, -B3 or -C, are overexpressed in aggressive human non-Hodgkin’s lymphomas. Int J Cancer. 2000; 89: 148-152. 10. Hoffman I, Jinno S, Suto K, Nagata A, Igarashi M, Kanaoka Y, Nojima H, Okayama H. Cdc25A is a novel phosphatase functioning early in the cell cycle. EMBO J 1994;13:4302-4310. 11. Jinno S, Suto K, Nagata A, Igarashi M, Kanaoka Y, Nojima H, Okayama H. Cdc25A is a novel phosphatase functioning early in the cel cycle. EMBO J. 1994; 13: 1549-1556. 12. Liu M, Lawson G, Delos M, Jamart J, Chatelain B, Remacle M, Marbaix E. Prognostic value of cell proliferation markers, tumour suppressor proteins and cell adhesion molecules in primary squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx. Eur Arch Otorchinolaryngology. 2003; 260: 28-34. 13. Nagata A, Igarashi M, Jinno S, Suto K, Okayama H. An additional homolog of the fission yeast cdc25+ gene occurs in
674
humans and is highly expressed in human cancer cells. New Biol. 1991; 3: 959-968. 14. Nishioka K, Doki Y, Shiozaki H, Yamamoto H, Tamura S, Yasuda T, Fujiwara Y, Yano M, Miyata H, Kishi K, Nakagawa H, Shamma A, Monden M. Clinical significance of CDC25A and CDC25B expression in squamous cell carcinomas of the oesophagus. Br J Cancer. 2001; 85: 412-421. 15. Sadhu K, Reed SI, Richardson H, Russell P. Human homolog of fission yeast cdc25 mitotic inducer is predominantly expressed in G2. Proc Natl Acad Sci. USA 1990; 87: 5139-5143. 16. Sandhu C, Donovan J, Bhattacharya N, Stampfer M, Worland P, Slingerland J. Reduction of CDC25 contributes to cyclin E1CDC2 inhibition at senescence in human mammary epithelial cells. Oncogene. 2000; 19: 5314-5323. 17. Sherr CJ. G1 phase progression: cycling on cue. Cell. 1994; 79: 551-5. 18. Spencer CA, Groudine M. Control of c-myc regulation in normal and neoplastic cells. Adv Cancer Res. 1991; 68: 1-48. 19. Takes RP, Baatenburg de Jong RJ, Schuuring E, Hermans J, Vis AA, Litvinov SV, van Krieken JH. Markers for assessment of nodal metastasis in laryngeal carcinoma. Arch Otolaryngol. Head Neck Surg. 1997; 123: 412-419. 20. Welkoborsky HJ, Hinni M, Dienes HP, Mann WJ. Predicting recurrence and survival in patients with laryngeal cancer by means of DNA cytometry, tumor front grading, and proliferation markers. Ann Otol Rhinol Laryngol. 1995;104:503-510. 21. Xu X, Yamamoto H, Sakon M, Yasui M, Ngan CY, Fukunaga H, Morita T, Ogawa M, Nagano H, Nakamori S, Sekimoto M, Matsuura N, Monden M. Overexpression of CDC25 phosphatase is associated with hypergrowth activity and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas. Clin Cancer Research. 2003; 5: 1764-1772. Adres autora: Klinika Otolaryngologii Akademia Medyczna ul. Chałubińskiego 2 50-368 Wrocław Pracę nadesłano: 27.02.2007 r.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani Prognostic value of CDC25 phosphatases expression in laryngeal cancer Marcin Frączek1, Zdzisław Woźniak2, David Ramsey3, Tomasz Zatoński1, Beata Nadolska1, Tomasz Kręcicki1 1Klinika
Otolaryngologii Akademii Medycznej we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. T. Kręcicki 2Zakład Anatomii Patologicznej Akademii Medycznej we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. J. Rabczyński 3Instytut Matematyki Politechniki Wrocławskiej Kierownik: prof. dr hab. Z. Olszak
Summary CDC25 phosphatases, significant positive regulators of the cell cycle play a pivotal role in controlling cell proliferation during development and tumorigenesis. The prevalence and clinical implications of CDC25 immunoreactivity in laryngeal squamous cell cancer (LSCC) patients however, have not been elucidated. Aim. The object of the study was to assess the relationship between the expression levels of CDC25A, CDC25B and clinicopathological parameters and overall survival time of patients with LSCC. Material and methods. Tissue blocks from 46 patients treated surgically at our institution between 1992 and 2000 were available for this study. Immunohistochemistry using polyclonal antibodies against CDC25A and CDC25B was used to examine proteins expression. Ki-67 antigen expression was examined as a cell proliferation marker. Control group consisted of 21 samples of unchanged mucosa. Results. CDC25A and CDC25B expression was observed in 96% (44/46) and 56,5% (26/46) of tumors; the mean labeling index was 73,9% and 36,5% respectively. CDC25 phosphatases expression was higher in LSCC compare to the control group (p<0,001). There was not any significant correlation between the levels of CDC25 phosphatases and investigated variables. In univariate analysis, all classical clinicopathological parameters but none of the proteins were related to the overall survival time. Conclusions. The expression of CDC25A, CDC25B and the proliferation marker Ki-67 are not associated with prognosis in LSCC. Hasła i n de kso we : CDC25A, CDC25B, immunohistochemia, rak krtani Ke y wo rds: CDC25A, CDC25B, immunohistochemistry, laryngeal cancer Otolaryngol Pol 2007; LXI (5):,668–674 © 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
WSTĘP Zaburzenie przebiegu cyklu komórkowego uważane jest za jeden z kluczowych mechanizmów procesu kancerogenezy. Przebieg cyklu podziałowego pozostaje pod ścisłą kontrolą rodziny białek o aktywności kinaz serynowo-treoninowych zależnych od cyklin (kinazy CDK; cyclin dependent kinase) [17]. Aktywność kinaz CDK jest precyzyjnie regulowana przez odwracalną
fosforylację oraz przyłączenie i odłączanie białek regulatorowych. Grupą białek o właściwościach pozytywnych regulatorów cyklu komórkowego są kwaśne fosfatazy CDC25. Poprzez defosforylację reszty tyrozynowej położonej przy N-końcu cząsteczek CDK (Tyr 15 w CDK2 i CDC2, Tyr 17 w CDK4) oraz treoniny Thr 14 aktywują one kompleksy złożone z kinazy CDK i cykliny. Proces ten indukuje ich aktywność enzymatyczną niezbędną w kolejnych etapach cyklu [5].
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
668
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani
Nieprawidłowa aktywność kompleksów cyklina-CDK, wynikająca m.in. z podwyższonej ekspresji fosfataz CDC25 może więc przyczynić się do zaburzenia przebiegu cyklu, czego następstwem może być utrata kontroli nad proliferacją komórki. Potencjalnym skutkiem przyspieszenia proliferacji jest pojawienie się nowych aberracji przenoszonych kolejno do komórek potomnych i w konsekwencji wzrost nowotworu. U człowieka zidentyfikowano trzy białka należące do rodziny CDC25: CDC25B, CDC25B i CDC25C [5, 16]. Cząsteczki CDC25 charakteryzuje identyczny w 40–50% skład aminokwasowy, ale tylko izoformom CDC25A i B przypisuje się rolę potencjalnych onkogenów [5]. Fosfatazy CDC25 funkcjonują na różnych etapach cyklu komórkowego. CDC25A osiąga maksymalny poziom ekspresji w komórce pod koniec fazy G1, stopniowo zmniejszający się w fazie G2; pozostaje ufosforylowana aż do fazy M [10]. CDC25B posiada dwa maksima ekspresji – podczas interfazy G1/S oraz w fazie G2 [13]. Substratem fosfatazy CDC25C jest kinaza CDK1, a fosfatazy CDC25A i B kinaza CDK2 i CDK4 [10]. Uważa się, że CDC25A jest czynnikiem ograniczającym tempo progresji przez fazę G1 oraz inicjację replikacji DNA. Efektem zwiększonej ekspresji CDC25A w nowotworze jest wzrost liczby komórek będących w fazie S. CDC25B w kooperacji z innymi onkogenami wykazuje natomiast potencjał do transformacji nowotworowej komórek. Białko to jest niezbędne do wejścia komórki w fazę M cyklu. Podanie do komórki przeciwciał blokujących białko CDC25B lub stworzenie mutantów nie wykazujących ekspresji CDC25B (CDC25B-/-) zatrzymuje cykl w fazie G2 [4]. Udział fosfataz CDC25 w kształtowaniu fenotypu raka płaskonabłonkowego krtani, a tym samym kliniczna wartość ekspresji CDC25 jako markerów prognostycznych jest słabo poznana. W nowotworach o innej lokalizacji, podwyższona ekspresja fosfataz CDC25 związana jest z wyższym stopniem zaawansowania, obecnością przerzutów węzłowych i niższym zróżnicowaniem guzów [6, 14, 21]. W raku przełyku podwyższona ekspresja CDC25 jest niezależnym czynnikiem prognostycznym [14]. Celem pracy była analiza korelacji pomiędzy ekspresją białek CDC25A i CDC25B ocenioną metodą immunohistochemii a parametrami klinicznymi i histologicznymi oraz czasem przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
MATERIAŁ I METODY W badaniach wykorzystano materiał tkankowy pochodzący od 46 (3 kobiet i 43 mężczyzn) pacjentów leczonych w Klinice Otolaryngologii AM we Wrocławiu w latach 1992–2000 z powodu raka krtani. Najmłodsza osoba miała 44 lata, a najstarsza 71 lat (średnio 58 lat). W okresie obserwacji 20 (43%) pacjentów zmarło. Najkrótszy czas przeżycia wyniósł 46 dni, a maksymalny 8 lat (średnio 5 lat). Przed zabiegiem operacyjnym żaden z pacjentów nie był poddany leczeniu radio- lub chemioterapią. Stopień zaawansowania nowotworu określono za pomocą klasyfikacji TNM wg UICC. Guzy pierwotne o zaawansowaniu ogniska pierwotnego pT1 występowały u 3 chorych, pT2 u 4, pT3 u 21 i pT4 u 18 pacjentów. W 20 (43%) przypadkach stwierdzono przerzuty nowotworowe do węzłów chłonnych szyi. W 3 przypadkach stan zaawansowania klinicznego oceniono jako Iº, w 4 jako IIº, w 17 jako IIIº i w 22 jako IVº. Biorąc pod uwagę lokalizację guza w krtani, w 14 przypadkach miejscem wyjścia nowotworu była głośnia, w 1 przypadku nagłośnia, a w 4 przypadkach okolica podgłośniowa. W pozostałych 27 przypadkach, ze względu na duże zaawansowanie zmian, nie można było określić pierwotnego miejsca wyjścia nowotworu (lokalizacja przezgłośniowa). Stopień zróżnicowania histologicznego według kryteriów WHO oceniony jako wysoki (G1) wystąpił w 6 przypadkach, średni (G2) u 22 chorych, a u 18 stwierdzono raka niskozróżnicowanego (G3). Pacjenci w zaawansowanych stadiach choroby, zgodnie z przyjętymi standardami po zabiegu chirurgicznym poddani zostali radioterapii uzupełniającej. Do grupy kontrolnej zakwalifikowano 21 pacjentów z łagodnymi zmianami nabłonkowymi krtani, potwierdzonymi w badaniu histopatologicznym. Wśród nich wyróżniono 7 (33%) pacjentów z obrzękiem Reinkego, 8 (38%) z polipem fałdu głosowego i 6 (28%) z guzkami śpiewaczymi. Średni wiek pacjentów wyniósł 45 lat (zakres od 36 do 55 lat). Immunohistochemia Materiał pooperacyjny utrwalono w 10% zbuforowanej formalinie, opracowano metodą rutynową i zatopiono w bloczki parafinowe, które pocięto na skrawki. Badania immunohistochemiczne wykonano stosując metodę ABComplex/HRP z króliczymi poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko ludzkiemu białku CDC25A (sc-97) i CDC25B (sc-326) firmy Santa Cruz (USA) w rozcieńczeniu 1:200, przez 1 godz., w temperaturze pokojowej. Wizualizację odczynu uzyskano inkubując skrawki z roztworem
669
M. Frączek i inni
Tabela. I. Zależność pomiędzy ekspresją białka CDC25A i CDC25B a parametrami klinicznymi i histopatologicznymi guzów krtani Parametr Średni wiek (zakres) Zróżnicowanie histologiczne Cecha pT
Cecha pN Zaawansowanie kliniczne
Lokalizacja
Typ histopatologiczny
N [%] 59 (44-71) G1 G2 G3 pT1 pT2 pT3 pT4 pN+ pN0 Iº IIº IIIº IVº nadgłośniowa głośnia podgłośniowa przezgłośniowa rogowaciejący nierogowaciejący
6 (100%) 21 (95%) 17 (94%) 3 (100%) 4 (100%) 20 (95%) 17 (94%) 25 (96%) 19 (95%) 3 (100%) 4 (100%) 16 (94%) 21 (95%) 0 13 (93%) 4 (100%) 27 (100%) 29 (97%) 15 (94%)
czterochlorowodorku 3,3’-dwuaminobenzydyny (DAB). Barwienie w kierunku antygenu proliferacyjnego Ki-67 z użyciem przeciwciał MIB-1 firmy DAKO (Dania) zostało wykonane zgodnie z sugestią producenta. W kontroli negatywnej przeciwciała zastępowano surowicami kontrolnymi, zachowując pozostałe warunki reakcji. Oceny preparatów dokonywano używając mikroskopu Olympus BX 50 z torem wizyjnym i komputerowego systemu analizy obrazów MultiScanBase v. 8.08 (Css Scan). Reakcję immunohistochemiczną oceniano w sposób ilościowy, obliczając indeks barwliwości (IB), będący odsetkiem komórek z odczynem dodatnim do całkowitej liczby ocenianych komórek. Każdorazowo uwzględniano nie mniej niż 500 komórek wykorzystując powiększenie 400-krotne, wybierając pola o najsilniejszej reakcji barwnej (hot spot). Jako pozytywną traktowano reakcję zlokalizowaną w cytoplazmie komórek. Statystyka Do opracowania danych wykorzystano pakiet statystyczny Statistica 6.0 (StatSoft, Inc. 2001). W celu analizy statystycznej danych korzystano z testu niezależności Fishera, a do oceny zależność pomiędzy cechami testu korelacji Kendalla oraz Manna-Whitney’a. Przy wyznaczaniu krzywych przeżycia zastosowano test Coxa-Mantela. Wartości p<0,05 uznawano za istotne statystycznie.
670
Średnia IB CDC25A (zakres) [%] 80,6 (57-89,9) 70,8 (3,8-95) 75,4 (38-94,5) 86,7 (81,3-90) 79,6 (22-30,5) 72,3 (3,8-90,1) 72,3 (50,2-95) 73,3 (3,8-95) 74,6 (50,2-94) 86,9 (81,3-90) 79,6 (57-88,9) 69,1 (3,8-90) 74,8 (37,9-95) 0 68,4 (3,8-89,9) 77,4 (50,2-90) 78,9 (57,2-95) 74 (37,9-90) 69,6 (3,8-90)
p
N [%]
0,42 0,97
2 (33%) 15 (68%) 9 (50%) 1 (33%) 1 (25%) 14 (67%) 10 (56%) 14 (54%) 12 (60%) 1 (33%) 1 (25%) 10 (59%) 14 (64%) 0 7 (50%) 3 (75%) 16 (59%) 17 (57%) 9 (56%)
0,14
0,8 0,48
0,9
0,33
Średnia IB CDC25B (zakres) [%] 16,9 (0-67) 46,1 (0-90,9) 31,4 (0-91,1) 22,3 (0-67) 17,9 (0-71,5) 45,8 (0-90,9) 32,2 (0-91,1) 30,8 (0-90,9) 44 (0-91,1) 22,3 (0-67) 17,9 (0-71,5) 37,4 (0-90,9) 41,2 (0-91,1) 0 30 (0-83,9) 45,6 (0-82,5) 40 (0-91,1) 36,5 (0-90,9) 39,1 (0-68,3)
p 0,89 0,72
0,75
0,28 0,7
0,36
0,64
WYNIKI Ekspresja fosfatazy CDC25A Białko CDC25A w badaniu immunohistochemicznym stwierdzono w 44 (96%) przypadkach raka krtani. Wartości IB mieściły się w zakresie od 3,8 do 95% (średnia 73,9%; SD 23%). Analizując korelacje indeksu barwliwości dla CDC25A z parametrami klinicznymi i histopatologicznymi nie stwierdzono istotnych zależności (tab. I). Nieznacznie wyższą średnią wartość IB wykazywały guzy dobrze zróżnicowane (IB = 80,6%), o niskim stadium zaawansowania narządowego (pT1) i w I° zaawansowania klinicznego (IB = 86,9%). Przypadki słabo zróżnicowane, bardziej zaawansowane miejscowo i klinicznie charakteryzowały się niższymi średnimi IB. W grupie kontrolnej obecność białka CDC25A stwierdzono w 17 (81%) preparatach. Reakcja cytoplazmatyczna zlokalizowana była we wszystkich warstwach nabłonka. Sporadycznie, podobnie jak w przypadkach raka krtani, słabsza reakcja barwna spotykana była również w zrębie łącznotkankowym. Indeksy barwliwości miały wartości w zakresie od 3,8% do 68,8% (średnia 32%; SD 25%). W grupie tej stężenie białka CDC25A nie korelowało z obecnością antygenu Ki-67 (r = 0,11; p = 0,48). Porównanie ekspresji białka CDC25A wykazało istotny wzrost
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani
Ryc. 1. Całkowity czas przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani w zależności od ekspresji białka CDC25A (p = 0,085) średnich wartości IB pomiędzy grupą kontrolną a grupą raków płaskonabłonkowych (p<0,001). Ekspresja fosfatazy CDC25B Białko CDC25B stwierdzono w 26 (56,5%) przypadkach raka krtani. Wartości IB mieściły się w zakresie od 0 do 91,1% (średnia 36,5%; SD 36,4%). Słaba reakcja cytoplazmatyczna obecna była również w podścielisku łącznotkankowym, podobnie jak dla CDC25A. Analizując ekspresję białka CDC25B pod kątem korelacji z parametrami klinicznymi i histopatologicznymi nie wykazano istotnych zależności (tab. I). Średnia wartość IB oraz częstość występowania białka CDC25B w guzach o zróżnicowaniu G2 i G3 była wyższa niż w G1. W guzach o zaawansowaniu miejscowym pT3 i pT4, z współistniejącymi przerzutami węzłowymi oraz o wyższym zaawansowaniu klinicznym częściej obserwowano obecność białka CDC25B. Średnie wartości IB w tych przypadkach były wyższe niż w guzach pT1 i pT2 bez przerzutów węzłowych i o niższym zaawansowaniu klinicznym. Również raki podgłośniowe częściej wykazywały ekspresję CDC25B, a jej średnia wartość była wyższa niż w przypadkach o innej lokalizacji. W preparatach pochodzących z grupy kontrolnej nie wykazano reakcji barwnej dla białka CDC25B. Białko CDC25B znamiennie częściej występowało u chorych na raka krtani, w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,001). Ekspresja antygenu proliferacyjnego Ki-67 Antygen Ki-67 w preparatach pochodzących od pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani stwierdzono w 40 (87%) przypadkach. Wartości indeksu barwliwości dla Ki-67 mieściły się w zakre-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Ryc. 2. Całkowity czas przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani w zależności od ekspresji fosfatazy CDC25B (p = 0,961)
Ryc. 3. Całkowity czas przeżycia pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani w zależności od ekspresji antygenu proliferacyjnego Ki-67 (p = 0,471) sie od 4 do 66,2% (średnia 29,5%; SD 18%). W grupie kontrolnej antygen Ki-67 obecny był w 9 (43%) przypadkach. IB dla Ki-67 mieściły się w zakresie od 6,5 do 20,4%, (średnia 5,9%; SD 7,6%). Porównanie wartości średnich IB wykazało istnienie istotnej różnicy pomiędzy grupą z rakiem krtani a grupą kontrolną (p<0,001). Nie wykazano natomiast związku pomiędzy ekspresją białka CDC25A i CDC25B a obecnością antygenu Ki-67 (odpowiednio r = -0,02; p = 0,87 i r = 0,06; p = 0,54). Analiza całkowitego czasu przeżycia Analiza zależności pomiędzy ekspresją białek CDC25A, CDC25B oraz antygenu Ki-67 z całkowitą długością czasu przeżycia pacjentów nie wykazała istotnych statystycznie zależności (ryc. 1–3).
671
M. Frączek i inni
Tabela II. Analiza korelacji pomiędzy ekspresją badanych białek i parametrami klinicznymi a całkowitym czasem przeżycia pacjentów z rakiem krtani Parametr CDC25A CDC25B Ki-67 Typ histopatologiczny Zróżnicowanie histologiczne Ognisko pierwotne Stan węzłów chłonnych Zaawansowanie kliniczne
Porównywane grupy CDC25A < 82% / CDC25A > 82% CDC25B < 32% / CDC25B > 32% Ki-67 < 25% / Ki-67 > 25% rak płaskonabłonkowy rogowaciejący / nierogowaciejący G1 + G2 / G3 pT1 + pT2 / pT3 / pT4 pN+ / pN0 Iº + IIº / IVº IIIº / IVº Iº + IIº / IIIº / IVº
W analizie czasu przeżycia do wyznaczenia granicy podziału zastosowano medianę wartość IB dla białka CDC25A i B, która wyniosła odpowiednio 82% i 32%. W przypadku antygenu Ki-67 w obliczeniach zastosowano medianę IB dla tego antygenu (31%) oraz wartość IB równą 25%, która często przyjmowana jest jako wartość graniczna. Parametrami najsilniej związanymi ze skróconym całkowitym czasem przeżycia była obecność przerzutów w węzłach chłonnych szyi oraz wysoki stan zaawansowania klinicznego choroby (p < 0,01) (tab. II).
DYSKUSJA Badania nad białkami regulatorowymi cyklu komórkowego, a zwłaszcza punktów restrykcyjnych, umożliwiają poznanie zmian charakterystycznych dla danego nowotworu i pozwalają lepiej zrozumieć proces kancerogenezy. W komórkach nowotworowych, stan fizjologicznej równowagi pomiędzy pozytywnymi a negatywnymi regulatorami cyklu podziałowego nie jest zwykle zachowany. Konsekwencją tego jest dysregulacja proliferacji komórki, która wraz z ograniczeniem apoptozy traktowana jest jako minimalny warunek niezbędny do manifestacji fenotypu nowotworowego. Ogólną cechą większości ludzkich guzów litych jest również ścisły związek między poziomem proliferacji a stopniem ich agresywności [3]. W wielu przeprowadzonych badaniach wysoki współczynnik proliferacji komórkowej był współzależny ze złą prognozą dla pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani [12, 20]. W prezentowanym materiale pomimo wyraźnie podwyższonego poziomu ekspresji białek CDC25A i CDC25B w raku krtani w porównaniu z grupą kontrolną nie wykazano korelacji pomiędzy ich
672
p p=0,912 p=0,96 p=0,471 p<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,01 p<0,05 p<0,05 p<0,01
ekspresją a parametrami klinicznymi i histopatologicznymi. Publikacje dotyczące ekspresji fosfatazy CDC25 w rakach regionu głowy i szyi są bardzo nieliczne. Gasparotto i wsp. [7] ocenili ekspresję genów CDC25A, CDC25B i CDC25C za pomocą metody QRT-PCR bez analizy korelacji z cechami klinicznymi, wykazując zwiększoną ekspresję mRNA dla CDC25A i CDC25B odpowiednio w 80% i 55% przypadków. W raku płaskonabłonkowym przełyku Nishioka i wsp. [14] stwierdzili podwyższoną ekspresję CDC25A i CDC25B w 46% i 48% przypadków. W materiale tym ekspresja CDC25A i CDC25B była współzależna z wielkością guza, stanem węzłów chłonnych i stopniem zaawansowania klinicznego. W naszych badaniach guzy o zaawansowaniu miejscowym pT3 i pT4, w stadium N+ oraz przypadki o zaawansowaniu klinicznym III° i IV° również charakteryzowała wyższa średnia wartość IB dla białka CDC25B. Xu i wsp. [21] w pierwotnym raku wątroby zaobserwowali podwyższoną ekspresję CDC25A i CDC25B odpowiednio w 42,4% i 20,3% przypadków. Stwierdzili również korelację pomiędzy wzrastającym poziomem CDC25A a rosnącym stopniem odróżnicowania komórek nowotworowych. W analizowanej grupie chorych wśród 44 przypadków wykazujących CDC25A, fosfataza CDC25B była obecna u 26 osób. Wartości IB dla CDC25A były wyższe niż dla CDC25B. Takie różnice w ekspresji obu białek wykazano w nowotworach o innej lokalizacji [9]. Świadczy to o tym, że pomimo podobieństwa w budowie ekspresja fosfataz CDC25 jest prawdopodobnie regulowana niezależnie. Z drugiej strony, geny te mogą pełnić różne role w procesie nowotworzenia. Wiadomo również, że aktywność enzymatyczna CDC25A jest do 10 razy wyższa od aktywności CDC25B, dlatego też możliwe jest, że zmiany w ekspresji CDC25A poniżej poziomu
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Znaczenie prognostyczne ekspresji kwaśnych fosfataz CDC25 w raku krtani
wykrywalnego metodą immunohistochemii mogą również uczestniczyć w patogenezie raka krtani [11]. W naszych badaniach nie wykazano współzależności ekspresji białka CDC25A i B z ekspresją antygenu proliferacyjnego Ki-67, co pozostaje w zgodzie z obserwacjami w raku piersi [6]. Przeciwnie, w pierwotnym raku wątroby Xu i wsp. [21] zaobserwowali związek ekspresji CDC25A, ale nie CDC25B z ekspresją białka PCNA. Również w chłoniakach nieziarniczych wysoki poziom mRNA dla CDC25B był współzależny z wyższą złośliwością kliniczną guzów i wyższą aktywnością proliferacyjną, wyrażoną frakcją komórek będących w fazie S (SPF) [9]. Fosfatazy CDC25 pełnią funkcję pozytywnych regulatorów cyklu komórkowego, a wyindukowana nadekspresja CDC25A prowadzi do aktywacji cykliny E-CDK2 i cykliny A-CDK2, co wskazuje, że kompleksy te są jednymi z głównych substratów fosfatazy CDC25A [1, 16]. W związku z powyższym, zwiększenie ekspresji CDC25A powinno wiązać się z podwyższeniem aktywności kompleksów cyklina-CDK, a tym samym zwiększeniem proliferacji komórkowej. Brak związku pomiędzy ekspresją białek CDC25 a Ki-67 w analizowanej grupie raków krtani nie potwierdza tego założenia i sugeruje istnienie bardziej skomplikowanych zależności regulujących proliferację komórki. Może także sugerować obecność w komórkach raka krtani dodatkowych czynników wpływających na stężenie białka CDC25A. W prezentowanej pracy nie zaobserwowano istotnej korelacji pomiędzy ekspresją białek CDC25A i B a długością całkowitego okresu przeżycia pacjentów z rakiem krtani. W przypadkach nowotworów o innej lokalizacji stężenie białek z rodziny fosfataz CDC25 często miało charakter rokowniczy. Wyniki pracy Nishioka i wsp. [14] sugerują, że wysoka ekspresja CDC25A jest złym czynnikiem prognostycznym dla pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym przełyku. W grupie tej pacjenci z niską ekspresją białka CDC25A istotnie częściej osiągali 5-letni okres przeżycia. W analizie wieloczynnikowej spośród: głębokości nacieku, obecności przerzutów węzłowych, stopnia zaawansowania wg TNM, poziomu ekspresji CDC25A i B, tylko status CDC25A był dla chorych z rakiem przełyku niezależnym czynnikiem prognostycznym. Xu i wsp. [21] w grupie pacjentów z pierwotnym rakiem wątroby stwierdzili, że wysoka ekspresja CDC25A obok niskiego zróżnicowania histologicznego guza oraz nacieku żyły wrotnej jest czynnikiem predysponującym do wznowy choroby. Również u chorych z rakiem piersi wysoka ekspresja CDC25B związana była z krótszym okresem wolnym od wznowy [6].
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5
Różnice pomiędzy wynikami badań mogą być konsekwencją heterogenności guzów, a także osobniczo zmiennego zróżnicowania ekspresji danych genów. W przypadku białek CDC25 wykazano, że różnice we właściwościach onkogennych mogą wynikać z czasu trwania poszczególnych faz i całego cyklu komórkowego, jak również odmiennej specyficzności substratowej ww. fosfataz [5]. Mechanizm zwiększenia ekspresji białek CDC25A i B w komórkach nowotworowych nie jest do końca poznany. Jedną z możliwych przyczyn, jakkolwiek rzadko stwierdzaną, jest amplifikacja genów fosfataz. W niektórych nowotworach złośliwych, jak rak jelita grubego, nie obserwowano amplifikacji genów CDC25, a w innych, jak raku niedrobnokomórkowym płuc, amplifikację regionu 20p13, w którym zawiera się gen CDC25B stwierdzono w 40% przypadków, ale nie towarzyszyła jej podwyższona ekspresja białka [9, 21]. Wśród czynników biorących udział w regulacji ekspresji fosfataz wyróżnia się m.in. czynnik transkrypcyjny E2F oraz TGF-b [2]. Transkrypcja genów CDC25A i CDC25B jest jednym z bezpośrednich celów działania onkogenu c-Myc. Uważa się, że fosfatazy CDC25 pełnią istotną rolę mediatora w zależnej od c-Myc indukcji rozpoczęcia cyklu komórkowego i apoptozy [6, 8]. Dotychczasowe badania wskazują na udział onkogenu c-Myc w patogenezie wielu nowotworów, również raka krtani [18]. Nadekspresję c-Myc wykazano w 3070% raków płaskonabłonkowych głowy i szyi [19]. Podwyższony poziom CDC25A i CDC25B w tych przypadkach może mieć związek z nieprawidłową ekspresją onkogenu c-Myc. Regulacja transkrypcji CDC25A i B przez c-Myc łączy potencjał onkogenu tego genu z cyklem podziałowym komórki. Uzyskane wyniki wskazują, że białka CDC25A i B pomimo wysokiej i powszechnej ekspresji w komórkach nowotworowych nie mają wartości prognostycznej dla pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani. Badania poszerzyły jednak wiedzę na temat procesu kancerogenezy i aberracji ekspresji analizowanych białek w raku krtani.
PIŚMIENNICTWO 01. Blomberg I, Hoffman I. Ectopic expression of Cdc25A accelerates the G1/S transition and lead to the premature activation of cyclin E and A-dependent kinases. Moll Cell Biol. 1999; 19: 6183-6194. 02. Chen X, Prywes R. Serum-induced expression of the cdc25A gene by relief of E2F-mediated repression. Mol Cell Biol. 1999; 19: 4695-4702.
673
M. Frączek i inni
03. Crissman JD, Zarbo RJ. Squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract: histologic parameters with prognostic value. In: Fee W.E. Jr, Goepfert H., Johns M.E., Strong E.W., Ward P.H. (eds). Head and Neck Cancer. Vol. 2. Decker, Toronto, 1990. 04. Gabrielli B, De Souza CP, Tonks ID, Clark JM, Hayward NK, Ellem KA. Cytoplasmic accumulation of cdc25B phosphatase in mitosis triggers centrosomal microtubule nucleation in HeLa cells. J Cell Sci. 1996; 109: 1081-1093. 05. Galaktionov K, Beach D. Specific activation of cdc25 tyrosine phosphatases by B-type cyclins: evidence for multiple roles of mitotic cyclins. Cell 1991; 67: 1181-1194. 06. Galaktionov K, Lee AK, Eckstein J, Draetta G, Meckler J, Loda M, Beach D. CDC25 phosphatases as potential human oncogenes. Science 1995; 269: 1575-1577. 07. Gasparotto D, Maestro R, Piccinin S, Vukosavljevic T, Barzan L, Sulfaro S, Boiocchi M. Overexpression of CDC25A and CDC25B in head and neck cancers. Cancer Res. 1997; 15: 2366-2368. 08. Hernandez S, Hernandez L, Bea S, Cazorla M, Fernandez PL, Nadal A, Muntane J, Mallofre C, Montserrat E, Cardesa A, Campo E. Cdc25 cell cycle-activating phosphatases and c-myc expression in human non-Hodgikin lymphomas. Cancer Res. 1998; 58: 1762-1767. 09. Hernandez S, Hernandez L, Bea S, Pinyol M, Nayach I, Bellosillo B, Nadal A, Ferrer A, Fernandez PL, Montserrat E, Cardesa A, Campo E. Cdc25a and the splicing variant cdc25b2, but not cdc25B1, -B3 or -C, are overexpressed in aggressive human non-Hodgkin’s lymphomas. Int J Cancer. 2000; 89: 148-152. 10. Hoffman I, Jinno S, Suto K, Nagata A, Igarashi M, Kanaoka Y, Nojima H, Okayama H. Cdc25A is a novel phosphatase functioning early in the cell cycle. EMBO J 1994;13:4302-4310. 11. Jinno S, Suto K, Nagata A, Igarashi M, Kanaoka Y, Nojima H, Okayama H. Cdc25A is a novel phosphatase functioning early in the cel cycle. EMBO J. 1994; 13: 1549-1556. 12. Liu M, Lawson G, Delos M, Jamart J, Chatelain B, Remacle M, Marbaix E. Prognostic value of cell proliferation markers, tumour suppressor proteins and cell adhesion molecules in primary squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx. Eur Arch Otorchinolaryngology. 2003; 260: 28-34. 13. Nagata A, Igarashi M, Jinno S, Suto K, Okayama H. An additional homolog of the fission yeast cdc25+ gene occurs in
674
humans and is highly expressed in human cancer cells. New Biol. 1991; 3: 959-968. 14. Nishioka K, Doki Y, Shiozaki H, Yamamoto H, Tamura S, Yasuda T, Fujiwara Y, Yano M, Miyata H, Kishi K, Nakagawa H, Shamma A, Monden M. Clinical significance of CDC25A and CDC25B expression in squamous cell carcinomas of the oesophagus. Br J Cancer. 2001; 85: 412-421. 15. Sadhu K, Reed SI, Richardson H, Russell P. Human homolog of fission yeast cdc25 mitotic inducer is predominantly expressed in G2. Proc Natl Acad Sci. USA 1990; 87: 5139-5143. 16. Sandhu C, Donovan J, Bhattacharya N, Stampfer M, Worland P, Slingerland J. Reduction of CDC25 contributes to cyclin E1CDC2 inhibition at senescence in human mammary epithelial cells. Oncogene. 2000; 19: 5314-5323. 17. Sherr CJ. G1 phase progression: cycling on cue. Cell. 1994; 79: 551-5. 18. Spencer CA, Groudine M. Control of c-myc regulation in normal and neoplastic cells. Adv Cancer Res. 1991; 68: 1-48. 19. Takes RP, Baatenburg de Jong RJ, Schuuring E, Hermans J, Vis AA, Litvinov SV, van Krieken JH. Markers for assessment of nodal metastasis in laryngeal carcinoma. Arch Otolaryngol. Head Neck Surg. 1997; 123: 412-419. 20. Welkoborsky HJ, Hinni M, Dienes HP, Mann WJ. Predicting recurrence and survival in patients with laryngeal cancer by means of DNA cytometry, tumor front grading, and proliferation markers. Ann Otol Rhinol Laryngol. 1995;104:503-510. 21. Xu X, Yamamoto H, Sakon M, Yasui M, Ngan CY, Fukunaga H, Morita T, Ogawa M, Nagano H, Nakamori S, Sekimoto M, Matsuura N, Monden M. Overexpression of CDC25 phosphatase is associated with hypergrowth activity and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas. Clin Cancer Research. 2003; 5: 1764-1772. Adres autora: Klinika Otolaryngologii Akademia Medyczna ul. Chałubińskiego 2 50-368 Wrocław Pracę nadesłano: 27.02.2007 r.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 5