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Zum Tyrosinstoffwechsel der Insekten—XIV. Radioautographische Lokalisation der Sklerotisierungssubstanz im Puppentönnchen von Calliphora erythrocephala
J. Im. Physiol.,1964, Vol. 10, pp. 525 to 527. Pergamon Press Ltd.
Printed in Great Britain
ZUM TYROSINSTOFFWECHSEL DER INSEKTEN-XIV. RADIOAUTOGRAPHISCHE LOKALISATION DER SKLEROTISIERUNGSSUBSTANZ IM PUPPENTONNCHEN VON CALLIPHORA ER YTHROCEPHALA HELMUT
AMMON
Physiologisch-chemisches
und
PETER
KARLSON
Institut der Universitat Munchen
(Received 9 December 1963) Abstract-When labelled tyrosine, dopamine, or N-acetyl-dopamine is injected into mature larvae of Culliphora erythrocephalu, the radioactivity appears mainly in the sclerotized parts of the puparium. There is no difference in the picture after administration of (aJ4C)-dopamine or N-(1-r4C-acetyl)-dopamine. It is concluded that the tanning agent, i.e. N-acetyldopamine, is incorporated as a whole entity. The tanning agent is also present though in lower concentration in the outer endocuticle. It is presumably transported from the haemolymph through the epidermal cells into the exocuticle. This renders the concept of ‘self-tanning cuticular proteins’ unlikely. EINLEITUNG IN
DER XIII.
Mitteilung
Tyrosinmetaboliten
in
dieser der
Reihe
haben
Cuticula
von
wir
iiber
Schistocerca
die
Lokalisation
gregaria
von
berichtet
(SCHLOSSBERGER-RAECKE und
KARLSON, 1964). Da wir die meisten biochemischen Untersuchungen iiber die Sklerotisierung bei Calliphora durchgefiihrt haben, war es von Interesse, such bei diesem Objekt etwas iiber die Lokalisierung zu erfahren. Die hier mitgeteilten Befunde bestatigen und erweitern das bisherige Bild von der Sklerotisierung der Larvencuticula. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass zwischen der Lokalisierung von Tyrosin, Dopamin und N-Acetyldopamin kein Unterschied besteht. MATERIAL
UND
METHODEN
Die radioaktivenPraparate, generell markiertes [14C]-L-Tyrosin, [cllJ4C]Dopamin und [ 1J4C]Acetanhydrid, wurden vom Radiochemical Centre, Amersham, und der California Corporation for Biochemical Research bezogen. Dopamin wurde von der Firma Hoffmann La Roche zur Verfiigung gestellt. N-[lJ4C-Acetyll-dopamin wurde von uns aus [lJ4C]Acetanhydrid und Dopamin synthetisiert (KARLSON und AMMON,
1963).
Die markierten Substanzen wurden den Larven von Calliphora erythrocephala ca. 12 Stunden vor der Verpuppung in das Abdomen injiziert. Dabei wurden 0,Ol PC N-[1-14C-Acetyll-dopamin bzw. [a-14C]Dopamin und O,Ol-0,03 $2 [‘“ClL-Tyrosin injiziert. 525
526
HELMUT.AMMOS~rp;o PETERKARLSON
Die Tiere wurden in verschiedenen Abstinden nach der Verpuppung fixiert. Zur Fixierung diente eine von WEAVER und THOMAS (‘1956) angegebene Lijsung (5 ml 40 prozentiger Formaldehyd, 2,s ml Eisessig und 20 g Chloralhydrat in 100 ml Wasser); nach ca. 48 Stunden wurde das Fixiermittel durch 12-stiindiges Wsssern herausgewaschen. Anschliessend wurde aufsteigend in Alkohol entwgssert. Bereits abgeworfene PuppentGnnchen wurden ohne vorherige Fixierung gleich mit A%lkohol behandelt. Die Prgparate wurden nach RATHMAYER (1962) in Methylmethacrylat eingebettet und nach der entsprechenden iLlethode mit einem schweren Mikrotom (Tetrander der Fa. Jung, Heidelberg) geschnitten.” Die Schnittdicke betrug im allgemeinen 10 p. Die Kadioautographien wurden mit der Strippingiilmmethode nach PELT rt rrl. (1947, 1948) angefertigt. Es wurden Kodak Autoradiographic Stripping Plates AK 10 verwendet. Dieser Strippingfilm hat eine Emulsionsschicht \-on 5 ,L und ein ,hufliisungsvermBgen von 2 I”. Die Belichtungszeit betrug zwischen 3 und 10 Wochen. ERGEHNISSE Der Aufbau der Cuticula von Cnfliphoru ist bereits beschrieben (FRAENKEL und Die aussere Schicht, Exocuticula genannt, I
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ZUM TYROSINSTOFFWECHSEL DER INSEIiTEN-XIV
527
DISKUSSION
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen eine vijllige iibereinstimmung zwischen dem Grad der Sklerotisierung und der Radioaktivitit in der Cuticula. Auch der zeitliche Verlauf (Zunahme der Aktivitat im friihen Tijnnchen) geht parallel mit dem schon optisch erkennbaren Sklerotisierungsgrad. Man kann daraus schliessen, dass die Sklerotisierung tatsachlich in einer Einlagerung der Tyrosinmetaboliten in die Cuticula besteht. Diese Metaboliten gelangen iiber die Epidermiszellen an ihren Ort. Biochemisch ist die ubereinstimmung der Autographien nach Gabe van L-Tyrosin, Dopamin und N-Acetyldopamin bemerkenswert. Sie zeigt, dass die natiirliche Sklerotisierungssubstanz, nach unseren Befunden das N-Acetyl-dopamin, ohne wesentliche Umwandlung, zumindest ohne Abspaltung der Acetylgruppe, eingelagert wird. Es bleibt nun noch zu klsren, wie die Bindung mit den hochmolekularen Komponenten der Cuticula erfolgt und wodurch die Hgrtung zu erkliren ist. Diese Frage wird sich nur mit chemischen Methoden 16sen lassen. .-lnev/zennzzng-Der stiitzung dieser Arbeit.
Deutschen
Forschungsgemeinschaft
danken
wir
fiir
die
Unter-
LITERATUR DENNEL R. (1958) The hardening of insect cuticle. Biol. Reel. 33, 178-196. FRAENE;EL G. und RUDALL K. M. (1940) A study of the physical and chemical properties of the insect cuticle. Proc. roy. Sot. (B) 129, l-34. der Insekten, SI. Biogenese KARLSON P. und AMMON H. (1963) Z urn Tyrosinstoffwechsel und Schicksal der Acetylgruppe des N-Acetyl-dopamins. Hoppe-Sevl. 2. 330, 161-168. PELC S. R., BOYD G. A., und MACDONALD -4. M. (1947, 1948) zitiert bei: NII
Printed in Great Britain
ZUM TYROSINSTOFFWECHSEL DER INSEKTEN-XIV. RADIOAUTOGRAPHISCHE LOKALISATION DER SKLEROTISIERUNGSSUBSTANZ IM PUPPENTONNCHEN VON CALLIPHORA ER YTHROCEPHALA HELMUT
AMMON
Physiologisch-chemisches
und
PETER
KARLSON
Institut der Universitat Munchen
(Received 9 December 1963) Abstract-When labelled tyrosine, dopamine, or N-acetyl-dopamine is injected into mature larvae of Culliphora erythrocephalu, the radioactivity appears mainly in the sclerotized parts of the puparium. There is no difference in the picture after administration of (aJ4C)-dopamine or N-(1-r4C-acetyl)-dopamine. It is concluded that the tanning agent, i.e. N-acetyldopamine, is incorporated as a whole entity. The tanning agent is also present though in lower concentration in the outer endocuticle. It is presumably transported from the haemolymph through the epidermal cells into the exocuticle. This renders the concept of ‘self-tanning cuticular proteins’ unlikely. EINLEITUNG IN
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UND
METHODEN
Die radioaktivenPraparate, generell markiertes [14C]-L-Tyrosin, [cllJ4C]Dopamin und [ 1J4C]Acetanhydrid, wurden vom Radiochemical Centre, Amersham, und der California Corporation for Biochemical Research bezogen. Dopamin wurde von der Firma Hoffmann La Roche zur Verfiigung gestellt. N-[lJ4C-Acetyll-dopamin wurde von uns aus [lJ4C]Acetanhydrid und Dopamin synthetisiert (KARLSON und AMMON,
1963).
Die markierten Substanzen wurden den Larven von Calliphora erythrocephala ca. 12 Stunden vor der Verpuppung in das Abdomen injiziert. Dabei wurden 0,Ol PC N-[1-14C-Acetyll-dopamin bzw. [a-14C]Dopamin und O,Ol-0,03 $2 [‘“ClL-Tyrosin injiziert. 525
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Deutschen
Forschungsgemeinschaft
danken
wir
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die
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LITERATUR DENNEL R. (1958) The hardening of insect cuticle. Biol. Reel. 33, 178-196. FRAENE;EL G. und RUDALL K. M. (1940) A study of the physical and chemical properties of the insect cuticle. Proc. roy. Sot. (B) 129, l-34. der Insekten, SI. Biogenese KARLSON P. und AMMON H. (1963) Z urn Tyrosinstoffwechsel und Schicksal der Acetylgruppe des N-Acetyl-dopamins. Hoppe-Sevl. 2. 330, 161-168. PELC S. R., BOYD G. A., und MACDONALD -4. M. (1947, 1948) zitiert bei: NII