Zur anwendung der phasenkontrastmikroskopie fu¨r histologische untersuchungen des nervensystems

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BRAIN RESEARCIJ

ZUR ANWENDUNG DER PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE FOR HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DES NERVENSYSTEMS

WERNER N1KLOWITZ Max-Planck-lnstitut fiir Hirnforschung, Neuroanatomische Abteilung, Frankfurt-Niederrad (Deutschland)

(Empfangen, den 20.Mai, 1966)

EINLEITUNG Zur lichtmikroskopischen Darstellung der Histologie, Cytologie und Architektonik (Cyto-, Myelo- und auch Angioarchitektonik) des Nervensystems sind verschiedene F/irbe- und Impr/ignationsverfahren im Gebrauch 7,8,n. Mit Hilfe dieser Darstellungsmethoden ist es m6glich, bestimmte Zelltypen und -strukturen u.a. selektiv darzustellen und zu identifizieren. Um jedoch alle vorhandenen Gewebebestandteile und Zellstrukturen darzustellen, sind Mehrfachf/irbungen, die meist nicht alle Bestandteile gleichm/issig optimal darstellen, am selben Objekt oder an /iquivalenten Schnitten notwendig. lm Laufe unserer licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen zur Struktur normaler und experimentell ver/inderter Nervenzellen 3,5 wurde zur lichtmikroskopischen Darstellung der Histologie der Hirnstrukturen u.a. das Phasenkontrastverfahren angewendet, das durchaus geeignet ist, neben cytologischen und histologischen auch architektonische Untersuchungen an kleineren Gewebebereichen ohne jeglichen f/irberischen Aufwand durchzufiihren. Folgende Mitteilung soil neben der ausfiJhrlichen Darstellung derPr/iparationsund Untersuchungsmethodik, ihre Anwendungsbereiche und Leistungsf/ihigkeit am Nervengewebe zeigen. BESCHREIBUNGDER METHODE Untersucht wurden die Hirne bzw. das Riickenmark von Katzen, Kaninchen, Ratten und M/tusen. Die Gewebe wurden unter Narkose (3 %ige Chloralhydratlbsung, Nembutal, i.p.) nach Offnung der Sch/ideldecke den Versuchstieren entnommen und in gekiJhtter Fixationsl/Jsung (s.u.) in transversale Scheiben von 1-2 mm Dicke zerlegt. Eine Anwendung der Perfusionsmethode ist dann angezeigt, wenn gleichzeitig verschiedene Gewebebereiche zu Untersuchungen benStigt werden. Brain Research, 3 (1966) 150-157

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PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE IN DER HISTOLOGIE

Als Fixationsmedium verwandten wir eine 6.5~ige GlutaraldehydliSsung in 0.1 M Cacodylatpuffer9 unter Zusatz von Saccharose (pH 7.4). Die Fixierung und nachfolgenden Pr/iparationen wurden bis zum 70 ~igen Alkohol im Kiihlschrank (0-2 °) durchgefiihrt. Die Fixierung dauerte gewiShnlich 16-20 Std. Anschliessend wurden die Objekte fiir 2 Std. in Cacodylatpuffer gewaschen. Ein Teil der Objekte wurde nach der W/isserung fiir eine Nachkontrastierung in eine 2~ige OsO4-LSsung (Michaelispuffer, pH 7.4, 3 Std.) gebracht. Nach dem Waschen wurden die Objekte in steigender Alkoholreihe entw/issert und in Epon z oder fiir Vergleichsuntersuchungen in Paraffin eingebettet. Mit einem gewShnlichen Schlittenmikrotom wurden 1-3 # und 5-7 /z dicke Einzelschnitte angefertigt, die auf Glasobjekttr/iger iibertragen und in einem Einschlussmittel (C. Zeiss, L 15, nD 1.515) eingeschlossen wurden. W/ihrend das Paraffin zuvor aus den Paraffinschnitten entfernt wurde, verblieben die Eponschnitte im Einbettungsmedium. Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte in einem Zeiss-Photomikroskop unter Verwendung einer Phasenkontrasteinrichtung. Die Photogramme wurden auf Agepe-FF-Film (Agfa) aufgenommen. Sowohl fiir die photographische Wiedergabe als auch fiir die visuelle Beobachtung wurde ein Griinfilter in den Strahlengang eingeschaltet*. BESPRECHUNG DER METHODE

Bei der beschriebenen Pr/tparation handelt es sich um eine giinstige Kombination verschiedener Pr/iparations- und Untersuchungsverfahren. W~thrend fiir die lichtmikroskopische Identifizierung und Darstellung der Zellen und Zellbestandteile in der Histologie u.a. verschiedene F~irbe- und Impr/ignationsverfahren angewendet werden, benutzen wir das Phasenkontrastverfahren. Diese Untersuchungsmethode ist dann angezeigt, wenn sowohl licht- als auch elektronenmikroskopische Untersuchungen am selben Objekt durchgefiihrt werden, da einmal fiir beide Untersuchungsmethoden dieselben Pr/iparationen durchgefiihrt werden und zum anderen das phasenoptische Bild gleichzeitig ein .4"quivalentbild zur elektronenmikroskopischen Abbildung darstellt. In einer folgenden Mitteilung soil anhand licht- und elektronenmikroskopischer Untersuchungsbefunde tiber die Darstellung und Kenntnis der Moosfaserschicht des Hippocampus berichtet werden 5. Aus obigen Griinden stellt die Phasenkontrastmikroskopie ein wichtiges Bindeglied zwischen der normalen Lichtmikroskopie und der Elektronenmikroskopie dar. Die Anwendung der Phasenkontrastmikroskopie in der Histologie des Nervensystems besitzt gegeniiber den f~.rberischen Darstellungsmethoden erhebliche Vorteile. Folgende Bedingungen miissen f'tir eine erfolgversprechende Anwendung der Phasenkontrastmikroskopie fiir histologische Untersuchungen erfiillt sein: (1) Die Objekte miissen einen optimalen Grad der Strukturerhaltung besitzen und * Ftir die unermiidliche technische Assistenz m~Schteich Mne Madeleine Essayan danken,

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(2) das Einbettungsmittel darf nicht aus den Schnitten herausgel6st werden. (Ad 1) In den letzten Jahren konnte durch die Feinstrukturuntersuchungen biologischen Materials mit Hilfe des Elektronenmikroskops die z.Zt. brauchbarsten Fixationsmethoden und -mittel erarbeitet werden, lm Prinzip sind es drei Fixationsmedien, die diesbeztiglichen Anforderungen an die Erhaltung der Feinstruktur entsprechen: (1) die Fixierung mit gepufferter OsO4-L6sung nach Palade 6, (2) die Fixierung mit Kaliumpermanganat nach Luft 1 und (3) eine Fixierung mit gepufferter Glutaraldehydlbsung nach Sabatini et aL 9. Das letzte Fixationsmittel hat sich auch ftir enzymhisto- und cytochemische Untersuchungen als brauchbar erwiesen 10. Fiir unsere Untersuchungen verwandten wir haupts/ichlich gepufferte Glutaraldehydl6sung. Es zeigte sich, dass sowohl nach einer reinen Glutaraldehydfixierung als auch nach einer zus~itzlichen Nachkontrastierung oder -fixierung mit OsO4 befriedigende Ergebnisse erzielt werden kSnnen. Eine Nachkontrastierung mit OsO4 besitzt aber den Vorteil, dass cytologische Details und die Merkmale bestimmter cytoarchitektonischer Felder und ihre Grenzen besser zu identifizieren und darzustellen sind. Vergleichsuntersuchungen mit Formol oder Bouin fixierten Objekten, wie diese Fixationsmedien noch h/iufig fiir cytoarchitektonische Untersuchungen angewandt werden, ergaben dagegen ffir eine phasenkontrastmikroskopische Untersuchung histologischer Schnitte keine brauchbaren Resultate. (Ad 2) Um zu prtifen, inwieweit die Strukturerhaltung von der Art des Einbettungsmittels abh/ingig ist, wurden die Objekte einmal in Paraffin und zum anderen in Epon - - einem Epoxydharz - - eingebettet. (Anstelle des Epons kSnnen auch andere Einbettungsmedien wie Celloidin, Methacrylat, Vestopal, Araldit und andere Kunststoffe verwendet werden.) W~thrend das Paraffin wie iiblich aus den Schnitten entfernt wurde, verblieb das Einbettungsmittel in den Eponschnitten. Nachweisbare qualitative Unterschiede zwischen diesen beiden Einbettungsmitteln bestehen'3"darin, dass die Paraffinschnitte, obwohl sie einen besseren Kontrast geben, zus/itzlich artifizielle Vedinderungen aufweisen. Dieselben und z.T. noch schwerwiegendere Ver~inderungen treten auf, wenn auch die Kunststoffe herausgel6st werden, wie es Wischnitzed z fiir eine phasenkontrastmikroskopische Beobachtung von Methacrylatschnitten empfohlen hatte. Diese sekund~iren VerRnderungen sind in erster Linie auf das HerauslSsen der Einbettungsmittel zuriickzuftihren. Dadurch fallen die Strukturen zusammen, werden vergr/Sbert und tRuschen eine Kontraststeigerung vor..~hnliche Beobachtungen konnten auch im Vergleich yon Epon- und Methacrylatschnitten bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung biologischen Materials nachgewiesen werdenL In der lichtmikroskopischen Histologie ktinnen an Eponschnitten die einzelnen Zellteile und Zellbestandteile detaillierter und auch in ihrer nattirlichen Anordnung und Lage wiedergegeben werden. Wahrscheinlich besitzt das Epon einen gtinstigen Brechungsindex, der fiir eine gute phasenoptische Darstellung zus~itzlich yon besonderer Bedeutung ist. Eine gewisse Schwierigkeit bereitet das Schneiden gr6sserer Objekte oder eines ganzen, gr/Ssseren Gehirns. Aus diesem Grunde wurden vorliegende Untersuchungen zun~ichst an kleirteren Gewebestiieken durchgefiihrt. Inwieweit eine Anwendung dieser Brain Research, 3 (1966) 150-157

Abb. 1. Photomontage des Grenzbereiches zwischen den cytoarchitektonischen Feldern CA2 und CA3 des Hippocampus vom Kaninchen. Das Zellband der Pyramidenzellen (Str. pyr.) mit den stark ausgepr~tgten apikalen Dendriten (ap. Dend.) im Stratum radiatum (Str. rad.)tritt besoaders deutlich hervor. Links im Bild ist das Ende des suprapyramidalen Moosfasertraktes (M.F.) im Stratum radiatum und des infrapyramidalen Moosfasertraktes im Stratum oriens (Str. off.) eindeutig zu erkennen. Oben im Bild k6nnen die Faserziige der Schafferschen Kollateralen (Sch. K.) beobachtet werden. Alv. = Alveus; G. = Blutgef~isse; B.Z. = Horizontalzelle? Vergr. : 220 ×.

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Abb. 2. P h o t o m o n t a g e des Grenzbereiches zwischen den cytoarchitektonischen Feldern CA1 u n d C A 2 des H i p p o c a m p u s v o m K a n i n c h e n . Besonders deutlich ist hier der Verlauf der apikalen D e n driten i m S t r a t u m r a d i a t u m (Str. rad.) bis z u m S t r a t u m l a c u n o s u m - m o l e c u l a r e (Str. lac. tool.) zu beobachten. Str. pyr. ~ S t r a t u m pyramidale; Str. ori. = S t r a t u m oriens; G. = Gefhsse. Vergr. : 230 x .

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Abb. 3. Photomontage aus dem Bereich des Gyrus dentatus vom Hippocampus des Kaninchens re.it der K/Srnerzellschicht (K.G.D.), und den dazugeh6rigen Dendriten (K. Dend.) im Stratum moleculare (Str. tool.), der plexiformen Schieht im Hilus (PI.) und dem Endbereich des Feldes CA3 des Pyramidenzellbandes. Oben im Bild ist die Fissura hippocampi (Fis. h.) schwach angedeutet. Ausserdem ist hier noch die Moosfaserschicht im Feld CA3 auf beiden Seiten des Pyramidenzellbandes zu erkennen (M.F.). Vergr.: 220 x.

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Methode zur Darstellung grSsserer Hirnabschnitte oder ganzer Hirne m6glich ist, soll weiteren Untersuchungen vorbehalten bleiben. Die Schnittqualit~2t und auch das Schneiden der ObjektblScke selbst ist in jedem Fall yon der Glare des Mikrotommessers abh/ingig. ERGEBNISSE

Die universelle Brauchbarkeit und Leistungsf/ihigkeit dieser Praparations- und Untersuchungsmethodik zeigt sich darin, dass sie jederzeit reproduzierbar ist und dass alle vorhandenen Gewebeanteile exakt zu identifizieren und darzustellen sind. So werden neben den Ganglienzellen mit ihren Axonen und Dendriten auch alle tibrigen Zellen und Strukturelemente des Nervengewebes (z.B. auch die Gef/isse) in ihrer natiJrlichen Lage und Anordnung wiedergegeben (Abb. l, 2 und 3). Es ist ferner m/Sglich, die Cyto- und Myeloarchitektonik am gleichen Schnitt zu studieren. Ein weiterer wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die genaue Wiedergabe der Begrenzung einzelner Zellen, Zellstrukturen, cytoarchitektonischer Felder und Schichten im Nervengewebe (s. Abb. l, 2 und 3). Auf Grund der geringen Schnittdicke allerdings k~Snnen die Axone nicht in ihrer ganzen Ausdehnung verfolgt werden. Ausserdem ist fiir eine geeignete Axondarstellung eine einfache Glutaraldehydfixierung geeigrteter, da durch die Nachkontrastierung mit OsO4 bestimmte Zellstrukturen 5 starker geschw~irzt werden, welche die Axone tiberlagern und deren Verlauf maskieren kSnnen. Zur Prtifung einer allgemeingtiltigen Brauchbarkeit dieser Untersuchungs- und PrS.parationsmethode fiir histologische Untersuchungen wurden Bereiche des ZNS (rnotorische Rinde, Cerebellum, Hippocampus) und das Riickenmark untersucht. Danach hat sich ergeben, dass yon allen untersuchten Gewebebereichen brauchbare Resultate erhalten werden. Anhand einiger Photogramme sollen unsere Befunde, die wit vom Hippocampus des Kaninchens erhalten konnten, belegt werden (s. Abb 1, 2 und 3). Abschliessend kSnnen wir feststellen, dass die Anwendung der Phasenkontrastmikroskopie an dtinnen grossflachigen Schnitten eine wesentliche Erweiterung der bisher tiblichen Darstellungsmethoden in der Histologie bedeutet, zumal alle Gewebeelemente reproduzierbar und gleichzeitig an einem Schnitt beobachtet und dargestellt werden k6nnen, sowohl in cytologischen als auch in architektonischen Anwendungsbereichen. ZUSAMMENFASSUNG ES wird tiber eine wesentliche Erweiterung in der Anwendung der Phasenkontrastmikroskopie zur Histologie des Nervensystems unter Anwendung geeigneter Pdiparationsmethoden berichtet, die gleichzeitig elektronenmikroskopische Vergleichsuntersuchungen am selben Objekt erlauben. Untersuchungen mit verschiedenen Fixierungs- und Einbettungsmitteln zeigen, dass fiir eine erfolgreiche phasenkontrastmikroskopischen Beobachtung und Darstellung sowohl histologischer als auch cytologischer Einzelheiten folgende Pr/iparationsschritte erforderlich sind: Brain Research, 3 (1966) 150--157

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(1) Line optimale Fixierung der Gewebe (z.B. gepufferte 6 . 5 ~ i g e GlutaraldehydliSsung); (2) eine darauffolgende Nachkontrastierung oder -fixierung (gepufferte 2~oige OsO4-LSsung) und (3) eine Einbettung in einen Kunststoff (z.B. Epon), der zur Untersuchung im Schnitt belassen wird. Durch diese Pr/iparations- und Untersuchungsmethodik werden am Hippocampusgewebe des Kaninchens alle Gewebeelemente in ihrer natiJrlichen Anordnung und Lokalisation zur Wiedergabe gebracht, so dass am selben Objekt sowohl cytologische und architektonische als auch elektronenmikroskopische Vergleichsuntersuchungen durchgefiihrt werden kiSnnen. SUMMARY HISTOLOGICAL INVESTIGATION OF THE NERVOUS SYSTEM USING PHASE-CONTRAST MICROSCOPY

A suitable application of phase-contrast microscopy for the histology of nervous system is described, which allows both light- and electronmicroscopical examination of the same object. Tests with different fixatives and embedding media show that for a successful phase-contrast microscopical demonstration of histological as well as cytological details, the following steps of preparation are necessary: (1) an optimal fixation of the tissue (buffered 6.5 ~o glutaraldehyde solution), (2) a postfixation (buffered 2 ~ OsO4 solution) and (3) embedding in an epoxy resin (Epon), which is not removed from the section for the observation. With this technique all tissue elements in the hippocampus of the rabbit are shown in their normal arrangement and localization so that cytological and architectonical observations in the same object may serve for comparative light- and electronmicroscopical studies. LITERATUR 1 LUFT,J. I-I., Permanganate. A new fixative for electron microscopy, J. biophys, biochem. Cytol. 2 (1956) 799-801. 2 LUET, J. H., Improvements in epoxy resin embedding methods, J. biophys, biochem. CytoL, 9 (1961) 409-414. 3 NIKLOWlTZ, W., Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Pyramidenzellen des Ammonshorns, Nervenarzt, 35 (1964) 463-467. 4 NIKLOWITZ,W., Elektronenmikroskopische Untersuchungen am Ammonshorn. II. Ober die Substruktur der Pyramidenzellen nach Methoxypyridoxin-Vergiftung, Z. Zellforsch., 70 (1966)220-239. 5 NIKLOWITZ,W., Vergleichende phasenkontrast- und elektronenmikroskopische Darstellung der Moosfaserschicht des Ammonshorns, In Vorbereitung (1966). 6 PALADE,G. E., A study of fixation for electron microscopy, J. exp. Med., 95 (1952) 285-297. 7 ROtaEIS,B., Mikroskopische Teehnik, 15. Aufl., Oldenburg, M6inchen, 1948. 8 ROULET,F., Methoden der pathologischen Histologie, Springer-Verlag, Wien, 1948. 9 SABATINI,D. D., BENSCH,K. G., ANDBARRNETT, R. J., Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation, Cell BioL, 17 (1963) 19-58. 10 SABATINI,D. D., MILLER,F., AND BARRNETT,R. J., Aldehyde fixation for morphological and enzyme histochemical studies with the electron microscope, J. Histochem. Cytochem., 12 (1964)57-71. 11 WINDLE,W. F., New Research Techniques of Neuroanatomy, Thomas, Springfield, 1957. 12 WISCI-mITZER,S., Phase microscopy as an aid to cytological electron microscopy, Mikroskopie (Wien), 17 (1962) 112-119. Brain Research, 3 (1966) 150-157