Zur Biosynthese von L-Orcylalanin

Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd. 163, S. 518-523 (1972) Institut fiir Biochemie der Pflanzen des Forschungszentrums fiir Molekularbiologic und Medizin der Akademie der Wissenschaften der DDR, Halle (Saale)

Zur Biosynthese von L-Orcylalanin Von H. R. SCHUTTE und P. MULLER Mit einer Abbildung (Eingegangen am 1. Juni 1972)

To biosynthesis of L-orcylalanine Snmmary The aromatic part of the nonprotein amino acid orcylalanine (2,4-dihydroxy-6-methyl-phenylalanine) from the mature seeds of the corn cockle Agrostemma githago L. (Caryophyllaceae) is derived from acetate, whereas the side chain comes from serine. It was proposed a possible biosynthetic mechanism involving condensation of serine with orsellinic acid with simultaneous decarboxylation of the latter. By feeding orsellinic acid-(2-14C), subsequent isolation of the radioactive amino acid and degradation to aspartic acid it was shown that orsellinic acid is an effective and specific precursor of orcylalanine. By incubation of orcylalanine from the plant with L-amino acid oxidase the L-configuration of the amino acid could be demonstrated.

Unter den nicht proteinogenen Aminosauren nimmt das in den reifen Samen der Kornrade Agrostemma githago L. (Caryophyllaceae) aufgefundene Orcylalanin (2,4-Dihydroxy-6-methylphenylalanin) (1, 2, 3) eine gewisse Sonderstellung ein. Die Verbindung gehort zu den wenigen bisher in hOheren Pflanzen nachgewiesenen phenolischen Aminosauren. Fur die Biosynthese des Orcylalanins konnte gezeigt werden (4, 5), daB der Ring einschlieBlich der C-Methylgruppe aus Acetateinheiten aufgebaut wird. Fur die Seitenkette wurde eine Bildung aus Serin wahrscheinlich gemacht. Ais mogliche Biosynthesefolge wurde eine Kondensation von Orsellinsaure unter gleichzeitiger Decarboxylierung mit Serin bzw. eine Reaktion von Orcin nach vorheriger Decarboxylierung der Orsellinsaure mit Serin p08tuliert. Um zu priifen, ob tatsachlich dieses Benzoesaurederivat eine effektive Vorstufe des Orcylalanins ist, synthetisierten wir Orsellinsaure-(2-14C) (6) und verabreichten diese Verbindung an unreife Samen von Agrostemma githago. Parallel dazu verfutterten wir Natriumacetat-(l- 14 C). Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, werden beide Verbindungen mit sehr guten Einbauratel1 und in etwa gleicher GroBenordnung in Orcylalanin inkorporiert.

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Zur Biosynthese von L-Orcylalanin Tabelle 1 Einbau von Natriumacetat und Orsellinsaure in Orcylalanin Verbindung

Menge mg

appl. Akt. Z/min

spez. Akt. Z/min· m Mol

Orcylalanin spez. Einspez. Akt. baurate% ZJmin'mMol

Natriumacetat-(l-14C) Orsellinsaure-(2-14C)

10 14

11,35.107 9,8 .107

9,31.108 11,76. 108

2,39' 107 4,03.107

2.56 3.42

Zur t)berpriifung eines spezifischen Einbaues wurde das aus beiden Versuchen erhaltene Orcylalanin einer Permanganatoxydation unterworfen (2). 1m sauren Medium wird Orcylalanin durch KMn04 zu Asparaginsiiure oxydiert, die die Alaninseitenkette und das C-Atom l' des Ringes vom Orcylalanin enthiilt (Abb. 1).

q'H

J 2 1 CH2-~H-COOH

caOH HC¢OH J 9' ~

I __~>~

He" a~ J 9' Z' ~

I

OH

Ifl'1nO+

/HzSO~

>

OH

Orse//insaure

z ,

,'.1

HOOC-CHz-CH-COOH

I

NHz

Orcy/a/anin

Abb.1. Biosynthese und Abbau von Orcylalanin

Die Alaninseitenkette und das C-Atom l' des Orcylalanins enthalten nur einen sehr geringen Anteil der Aktivitiit (Tabelle 2). Tabelle 2 Abbau des Orcylalanins Abbauprodukt

Asparaginsaure aus Vers. 1 (Tabelle 1) Asparaginsaure aus Vers. 2 (Tabelle 1)

spezif. Akt. d. spezif. Akt. d. einges. Orcylalanins Asparaginsaure Z/min· mMol Z/min . m Mol

% Aktivitat in Asparaginsaure

3,85· 1()5

2,03·104

5,2

15,15· 1()5

2,27.104

1,5

Bei Verabreichung von Acetat ist wohl infolge der leichten Metabolisierung eine gewisse Verschmierung der Aktivitiit zu erwarten. Sowohl die Einbaurate von Acetat-(1-14C) als auch der Aktivitiitsanteil in der Asparaginsiiure liegen in der gleichen GroBenordnung wie bei HADWIGER et al. (5) und bestiitigen deren Befunde, daB der Ring des Orcylalanins aus Acetat aufgebaut wird, wiihrend die Seitenkette nicht direkt vom Acetat stammt. Eine Zerlegung des aromatischen Ringes der Orsellinsaure und Metabolisierung der Bruchstiicke ist unter den Versuchsbedingungen un-

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wahrscheinlich. Es kann angenommen werden, da.l3 die Aktivitat im Orcylalanin nach Applikation von Orsellinsaure-(2-14C) im wesentlichen im C-Atom 2' lokalisiert ist. Demnach sollte tatsachlich bei der Bildung des Orcylalanins eine Kondensation von Orsellinsaure mit Serin erfolgen, wobei unklar bleibt, ob die Decarboxylierung der Orsellinsaure simultan erfolgt oder der eigentliche Reaktionspartner des Serins Orcin ist. Die Umsetzung der phenolischen Vorstufen mu.l3 sehr schnell und vollstandig ablaufen bzw. nur in einer ganz bestimmten Reifungsphase der Samen gegeben sein. In reifen Samen sind sowohl Orsellinsaure als auch Orcin nicht einmal in Spuren nachweis bar. Autoradiographisch lie.l3 sich zeigen, da.l3 nach Applikation von Orsellinsaure in der Aminosaurefraktion der Samen lediglich das Orcylalanin markiert ist, wahrend nach Verabreichung von Acetat erwartungsgema.l3 auch einige andere proteinogene Aminosauren radioaktiv sind, insbesondere Glutaminsaure. Nukleophile Substitutionen des tJ-C-Atoms von Serin sind bereits wiederholt gefunden worden, so bei der Bildung von Tryptophan aus Serin und Indol-3-glycerinphosphat (7), von tJ-Cyanoalanin aus Serin und Cyanid (8), von tJ- Pyrazol-1-yl-alanin aus Serin und Pyrazol (9). Serin liefert ferner die Alaninseitenkette von Mimosin (10). Eine Analogie der Kondensation unter gleichzeitiger Decarboxylierung findet sich bei der Bildung von Indol-3-glycerinphosphat durch Cyclisierung von Anthranilsauredesoxyribonukleotid im Verlauf der Tryptophanbiosynthese (11) sowie bei der Biogenese des Nicotins aus Nicotinsaure und N-Methylpyrroliniumsalz (12). Uber die Konfiguration des Orcylalanins war bisher nichts bekannt. Wir haben versucht, diese Frage durch Umsetzung mit L-Aminosaureoxydase zu klaren. Bei der Reaktion wird aus der Aminosaure Ammoniak abgespalten und die entstehende ex-Ketosaure durch das gleichzeitig gebildete H 2 0 2 in Abwesenheit von Katalase zur um ein C-Atom verkiirzten Carbonsaure umgesetzt. Orcylalanin aus Agrostemma wird innerhalb 24 Std. quantitativ abgebaut. 1m Reaktionsansatz konnte papierchromatographisch als Hauptkomponente lediglich eine atherlosliche Phenolcarbonsaure nachgewiesen werden, die in Analogie zu den aus anderen Aminosauren entstehenden Reaktionsprodukten als 2,4-Dihydroxy-6-methyl-phenylessigsaure anzusprechen ist. Synthetisch gewonnenes Orcylalanin wird in der gleichen Zeit erwartungsgema.l3 nur etwa zur Halfte umgesetzt, wonach die Reaktion zum Stillstand kommt. Vergleichsweise eingesetztes L-Tryptophan wird quantitativ in tJ-Indolylessigsaure verwandelt, wahrend D-Tryptophan unverandert liegen bleibt. Danachist dem Orcylalanin aus Agrostemma L- Konfiguration zuzuschreiben. Das steht in Einklang mit der Konfiguration der meisten nicht proteinogenen Aminosauren aus hoheren Pflanzen. Experimenteller Teil Die Agrostemma-Pflanzen wurden bis zur einsetzenden Reife der Kapseln im Gewachshaus kultiviert.

T

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Radioaktive Verbindungen: Natriumacetat-(P4C) (14 mCJmMol) sowie Acetessigester-(2-14C) wurden von der Isocommerz GmbH Berlin bezogen. Orsellinsaure-(2-14C) (0,53 mC/mMol) synthetisierten wir aus Crotonsaureathylester und Acetessigester-(2-14C) (6). Trager-Orcylalanin wurde synthetisch aus Orcylaldehyd tiber das Azlacton dargestellt (2), F. = 258°C (Zers.) (Lit. 251°C (2)). Orcylaldehyd wurde durch Vilsmeier-Formylierung aus Orcin gewonnen (13). Dartiber hinaus haben wir Orcylalanin durch Extraktion aus Samenmaterial von Agrostemma githago erhalten. Dazu wurden 200 g gemahlene ausgereifte Samen mit 2 l Wasser unter Zusatz von 10 ml schwefliger Saure und nach Einstellen mit Essigsaure auf pH 3 etwa 24 Std. unter tifterem Umrtihren bei Raumtemperatur extrahiert. Der Rtickstand wurde noch 2mal mit je 500 ml der beschriebenen wa.l3rigen Losung extrahiert. Die im Vakuum auf ein Drittel eingeengten Extrakte wurden an Dowex 50 W X 8 (H+-Form) durch grtindliches Was chen mit Wasser und Elution mit 50%igem Alkohol mit 2 % Ammoniak vorgetrennt. Die im Vakuum eingedampften Eluate haben wir mit n-Propanol/Wasser (3: 1) aufgenommen und tiber eine Zellulosesaule (0 2,5 cm, h = 36 cm) grob getrennt. Die orcylalaninhaltigen Fraktionen wurden erneut tiber eine Zellulosesaule (0 1,9 cm, h = 60 cm) gegeben und anschlie.l3end mittels Dowex 1 (CH3COO--Form) von beigemengter Glutaminsaure befreit. Eine Abtrennung von Alanin- und Threonin-Beimengungen gelang durch Abkiihlung der stark eingeengten Losung auf + 2°C, wobei das Orcylalaninin farblosen Nadeln ausfiel. Aus der Mutterlauge konnte nach Behandeln mit wenig Aktivkohle und weiterem Einengen ein zusiitzlicher Anteil des Orcylalanins gewonnen werden. Nach Umkristallisieren aus 2%iger Essigsaure erhielten wir 158 mg Orcylalanin vom Schmp. 255-257°C, Zers., das papierchromatographisch einheitlich war. Zur Applikation der radioaktiven Verbindungen wurden diese als Natriumsalze in 5 ml Wasser gelost. Je 5 g unreife leicht gelb bis braunlich gefarbte Samen von Agrostemma githago wurden angeritzt und sofort in kleine Petrischalen mit der Precursorlosung tiberftihrt, wobei durch weiteren Wasserzusatz die Samen von der Losung bedeckt wurden. Nach 24 Std. war die Losung aufgenommen und wurde durch Wasser ersetzt. Am 3. Tag wurden die Samen durch grtindliches Spiilen von anhaftender Restaktivitat befreit und zum Trocknen auf Filterpapier ausgebreitet. Nach 7 Tagen wurden die ausgereiften und dunkel verfarbten Samen aufgearbeitet. Isolierung des Orcylalanins Die Samen wurden nach Versetzen mit fltissigem Stickstoff pulverisiert und mit 70%igem Xthanol (4mal je 20 ml) flir 10 Min. in der Siedehitze extrahiert. Die vereinigten Filtrate brachten wir auf kleine Saulen mit Dowex 50 W x 8 (H+-Form) (Nachwaschen mit 70%igem Xthanol und Wasser). Die Aminosauren wurden mit

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je 50 mll n waBrigem Pyridin eluiert, im Vakuum zur Trockne gebracht, in je 2 ml 50%igem Athanol aufgenommen und eindimensional absteigend auf Schleicher & Schtill-Papier Nr. 2043 b in n-Propanol/Wasser (3: 1) (Laufmittel I) aufgetrennt. Die orcylalaninhaltigen Zonen (Nachweis: diazotierte Sulfanilsaure) wurden mit 2%iger Essigsaure eluiert und durch erneute Auftrennung mit Phenol/Wasser (3: 1) (Laufmittel II) weiter gereinigt. Nach Abdampfen wurden letzte Phenolspuren durch Was chen mit Ather entfernt. Die Orcylalaninkonzentration haben wir am Zeiss-Spektrophotometer VSU bei 280 nm V'max des Orcylalanins) ermittelt. N ach Verdtinnung mit inaktivem Orcylalanin wurde die Aminosaure aus schwach essigsaurem Wasser bis zur konstanten spezifischell Radioaktivitat umkristallisiert. Der Abbau des Orcylalanins (5 mg) zu Asparagillsaurc mit Kaliumpermangallat in Schwefelsaure erfolgte nach SCHNEIDER (2). Der Reaktionsansatz wurde nach Abfiltrieren des Braunsteins tiber eine kleine Saule mit Dowex 50 W X 8 (H +- Form) gegeben, diese neutral gewaschen und die Aminosauren mit 2%igem waBrigen Ammoniak eluiert. In dem im Vakuum stark eingeengten Eluat lieB sich chromatographisch nur Asparaginsaure nachweisen. Andere Aminosauren einschlieBlich unveranderten Orcylalanins traten nicht auf. Die Asparaginsaure wurde durch Chromatographie in Laufmittel I (aufsteigend, 2maliger Lauf) gereinigt. 1m Gegensatz zu HADWIGER et al. (5) erhielten wir bei diesem Abbau Ausbeuten bis zu 30 % (quantitative Bestimmung am Zeiss-Spektrocolorimeter Spekol bei 570 nm nach NinhydrinReaktion (14)). Inkubation mit L-Aminosaureoxydase 1m Versuchsansatz wurden 0,2 ml einer 0,4%igen waBrigen Losul1g (= 0,8 mg Aminosaure/Ansatz) von D- bzw. L-Tryptophan, DL-Orcylalanin und Orcylalanin aus Agrostemma in kleinen Reagenzglasern mit 0,33 ml 0,2 M Trispuffer pH = 7,4 und 0,13 ml einer Losung von 75 mg Toxin von Agkistrodon piscivorus (Tierpark Berlin) in 3 ml 0,1 M KCI versetzt, mit Wasser auf 1 ml erganzt, verschlossen und im Brutschrank bei 37°C mit Luft in der Gasphase inkubiert. In regelmal3igen Abstanden wurdel1 Proben fUr die Papierchromatographie in Laufmittel I entnommen, wobei der Nachwcis mit Ninhydrin, Ehrlichs Reagens (Tryptophan) bzw. diazotierter Sulfal1ilsaure (Phenole) erfolgte. Die Hauptkomponente der Reaktion des Orcylalanins aus Agrostemma ist ninhydrinnegativ, reagiert mit diazotierter Sulfanilsaure kraftig gelb und hat in allen verwendeten Laufmitteln einen groBeren Rf-Wert als Orcylalanin. Sie laBt sich nach Ansauern des Reaktionsmediums mit Ather extrahieren. Die Radioaktivitatsmessungen erfolgten mit einem FltissigkeitsszintillationsSpektrometer, Modell Tricarb 3365 (Fa. Packard Instruments). Mit Hilfe eines automatischen extern en 226Ra-Standards wurden die gemessenen Impuls in Zerfalle pro Minute (Zpm) umgerechnet.

t

I I 'I

t II 'I

1 ,

I

Zur Biosynthese von L-Oreylalanin

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Zusammenfassung Die in den reifen Samen der Kornrade Agrostemmagl:thago L.(Caryophyllaceae) auftretende nicht proteinogene Aminosaure Orcylalanin (2,4-Dihydroxy-6-methylphenylalanin) wird in ihrem aromatischen Teil aus Acetateinheiten aufgebaut. Als miiglicher Biosyntheseweg wurde eine Kondensation von Orsellinsaure mit Serin unter gleichzeitiger Decarboxylierung bzw. eine Reaktion von Orcin nach vorheriger Decarboxylierung der Orsellinsaure mit Serin postuliert. Durch Applikation von Orsellinsiiure- (2_14C) an unreife Samen von Agrostemma githago, Isolierung des markierten Orcylalanins und Abbau zu Asparaginsaure konnten wir zeigen, daB Orsellinsaure eine wirksame, spezifisch eingebaute Vorstufe des Orcylalanins darstellt. Durch Inkubation pflanzeneigenen Orcylalanins mit L-Aminosaureoxydase lieB sich die Zugehiirigkeit dieser Aminosaure zur L-Reihe zeigen.

Literatur 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

SCHNEIDER, G., Xaturwissensrhaften 44, 422 (1907). - Biochem Z. 330, 428 (1958). - Physio!. Plant. 14, 638 (1961). HADWIGER, L. A., und CONN, E. E., Plant Physio!. 39, Supp!. XIX (1964). - FLOSS, H.-G., STOKER, J. R, und CONN, E. E., Phytochemistry 4, 825 (1965). UNVERRICHT, A., PFUTZNER, P., STECIIER, B., und SCHUTTE, H. R, Z. Chern. 12, 285 (1972). TATUM, E. L., und SHEMIN, D., J. bio!. Chern. 209, 671 (1954). NIGAM, S. X., und RESSLER, C., Biochim. biophys. Acta 93, 339 (1964). DUNNILL, P. )1., und FOWDEN, L., J. expo Bot. (London) 14, 237 (1963). TIWARI, H. P., PENROSE, W. R, und SPENSER, 1. D., Phytochemistry 6, 1245 (1967). YANOFSKY, C., Biochim. biophys. Acta 20, 438 (1956). GROSS, D., in: MOTHES, K., und SCHUTTE, H. R, Biosynthese der Alkaloide. Berlin 1969, 234. BAYER, 0., in: Houben-Weyl, Methoden der organ. Chemie, Bd. VII/1, 29-36; Stuttgart 1954, 4. Auf!. 14. MOORE, S., unci STEIN, W. H., J. bioI. Chern. 211, 893, 904 (1954). Anschrift der Verfasser: Prof. Dr. H. R SCHUTTE, Dr. P. MULLER, Institut fiir Biochemie der Pflanzen cles Forschungszentrums fiir I\Iolekularbiologie unci )Ieclizin cler Akaclemie der Wissenschaften der DDR, 402 Halle (Saale), Weinbergweg.