Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire

Transfusion Clinique et Biologique 10 (2003) 335–352 www.elsevier.com/locate/tracli

Revue générale

Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire> Application of molecular biology techniques to malignant haematology E. Delabesse *, V. Asnafi, E. Macintyre Laboratoire d’hématologie, hôpital Necker–Enfants Malades, 149, rue de Sèvres, 75743 Paris cedex 15, France

Résumé Les hémopathies malignes constituent un groupe hétérogène dans leur pronostic et leur oncogenèse, mais représentent un modèle privilégié des mécanismes de cancérogenèse chez l’homme, par la présence récurrente d’anomalies génétiques impliquées dans leur processus oncogénique, et la disponibilité de matériel tumoral. Le diagnostic et la prise en charge thérapeutique de ces maladies font aujourd’hui une large place aux techniques de biologie moléculaire. Ces techniques ont transformé notre capacité à caractériser les hémopathies malignes et à comprendre les processus qui les induisent. Grâce aux développements technologiques, la biologie moléculaire, d’abord cantonnée à la recherche, s’applique de plus en plus à l’évaluation biologique de malades atteints d’hémopathie maligne. Ces techniques aident au diagnostic, à l’évaluation du pronostic et au suivi du malade après traitement. Sur un plan plus fondamental, l’analyse structurale et fonctionnelle des gènes dérégulés dans les leucémies et les lymphomes a beaucoup amélioré notre compréhension des mécanismes, à la fois oncogéniques et physiologiques. © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Malignant hemopathies, although heterogeneous in their prognosis and oncogenesis, represent an interesting model for studying cancer genesis mechanisms in man through the recurrent presence of genetic abnormalities involved in oncogenesis and the availability of tumour material. Nowadays, molecular biology techniques are very much used for the diagnosis, the treatment and the follow-up of these diseases. Firstly used for research, the new techniques have completely changed our ability to characterise malignant hemopathies and to understand the cancer-inducing processes, permitting us to perform the biological assessment of patients with malignant hemopathies, the diagnosis, and to estimate and follow the outcome of patients after treatment. At a more fundamental level, the structural and functional analysis of the deregulated genes implied in leukaemia and lymphoma has improved our knowledge and understanding of oncogenic and physiologic mechanisms significantly. © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Hémopathie maligne ; Biologie moléculaire ; Clonalité lymphoïde ; Translocation chromosomique ; Maladie résiduelle Keywords: Malignant hemopathy; Molecular biology; Lymphoid clonality; Chromosome translocation; Residual disease

1. Introduction Depuis la découverte de la structure en double hélice de l’acide désoxyribonucléique (ADN), il y a 50 ans, la biologie >

Première publication : Encycl Méd Chir (Editions Scientifiques et Médicales Elsevier SAS, Paris, tous droits réservés), Hématologie, 13-000K-30, 2003, 14 p. * Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (E. Delabesse). © 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/S1246-7820(03)00105-8

moléculaire a transformé notre capacité à caractériser les hémopathies malignes et à comprendre les processus qui les induisent. Grâce aux développements technologiques, la biologie moléculaire, d’abord cantonnée à la recherche, s’applique de plus en plus à l’évaluation biologique de malades atteints d’hémopathie maligne. Ces techniques aident au diagnostic, à l’évaluation du pronostic et au suivi du malade après traitement. Sur un plan plus fondamental, l’analyse structurale et fonctionnelle des gènes dérégulés dans les

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leucémies et les lymphomes a beaucoup amélioré notre compréhension des mécanismes, à la fois oncogénique et physiologique. 2. Techniques de base de la biologie moléculaire 2.1. Prélèvements Les acides nucléiques dans la cellule sont de deux types : • l’acide désoxyribonucléique (ADN), enchaînement de 3 milliards de nucléotides chez l’homme répartis sur 46 chromosomes, appelé ADN génomique ; • l’acide ribonucléique (ARN), lien entre le génotype (l’ADN) et le phénotype (la protéine). Ces deux acides, même s’ils ne diffèrent que par l’absence d’un oxygène au niveau d’un sucre de l’ADN par rapport à l’ARN, n’ont pas les mêmes caractéristiques physicochimiques et ne donneront pas les mêmes informations en biologie moléculaire. L’ADN et l’ARN sont extraits des cellules nucléées : un millilitre de sang contient en moyenne 30 à 50 µg d’ADN. L’ADN est relativement résistant, à la différence de l’ARN. La qualité de l’extraction est importante pour la méthode de Southern (analyse de l’ADN génomique) et pour l’analyse de l’ARN. 2.2. Analyse de l’acide désoxyribonucléique L’analyse de l’ADN en hématologie sert principalement à caractériser : • soit des mutations ponctuelles ; • soit des anomalies de structure : remaniements (translocations, réarrangements des gènes d’immunoglobulines ou du récepteur des cellules T) ou délétion ; • soit des polymorphismes permettant l’analyse de la clonalité soit myéloïde, soit lymphoïde. 2.2.1. Méthode de Southern Quand une solution d’ADN est exposée à un pH ou une température élevée (90 °C), les deux brins complémentaires qui constituent l’ADN se séparent. Ce phénomène, appelé dénaturation, est réversible, et la réassociation peut avoir lieu entre n’importe quel acide nucléique (ARN ou ADN) tant que les séquences sont complémentaires. Ceci est la base de la méthode décrite initialement par Edwin Southern en 1975 (Fig. 1) [91]. L’ADN chromosomique est d’abord digéré par des enzymes de restriction qui coupent à des sites précis (comme EcoRI qui coupe entre le G et le A après avoir reconnu la séquence GAATTC) afin de diminuer la taille des fragments à analyser. Ces fragments sont ensuite séparés selon leur taille par électrophorèse en gel d’agarose. Les fragments d’ADN ainsi séparés sont transférés sur un support solide (nylon ou nitrocellulose) après une étape de dénaturation. Une fois transférées, les séquences étudiées sont mises en évidence par hybridation d’une sonde préalablement marquée, radioactivement (phosphore 32) ou non (avec une perte

de sensibilité dans ce dernier cas). Après lavage, la membrane est mise au contact d’un film radiographique pour faire apparaître le signal de radioactivité. Le fragment détecté est : • soit de même taille et de même intensité que le témoin (par exemple ADN de placenta) : on parle de bande germinale (bande 1 de la Fig. 1), et comme l’ADN est diploïde (2n chromosomes), les deux allèles du même gène sont tous les deux sous forme germinale ; • soit de même taille mais d’intensité réduite de moitié par rapport au témoin : dans ce cas, un des deux allèles est délété tandis que l’autre est toujours sous forme germinale ; • soit de taille différente : on parle alors de bande réarrangée (bande 2 de la Fig. 1) ; • soit absence de bande en autoradiographie : les deux allèles du gène étudié sont délétés (bande 3 de la Fig. 1). Cette méthode permet de connaître la structure des gènes. Sa sensibilité est de l’ordre de 5 %, c’est-à-dire qu’elle peut détecter parmi la population cellulaire analysée des cellules ayant une modification génotypique présente dans au moins une cellule sur 20. Cependant, elle ne permet pas de reconnaître les mutations ponctuelles, à l’exception des mutations affectant le site reconnu par l’enzyme de restriction nécessaire à la digestion de l’ADN. 2.2.2. Amplification en chaîne par une ADN polymérase thermostable (PCR) Cette méthode a révolutionné la biologie moléculaire des années 1990 et a été couronnée par l’attribution du prix Nobel de chimie en 1993 [64]. Elle est fondée sur l’amplification de fragments d’ADN délimités par deux courtes séquences reconnues par deux oligonucléotides, dites amorces, grâce à une ADN polymérase résistante à haute température (95 °C). Il existe trois phases distinctes lors de l’amplification en chaîne par la polymérase (le sigle américain de cette méthode, PCR pour polymerase chain reaction, universellement connu, est utilisé dans le texte) (Fig. 2) : • dénaturation : l’ADN est dénaturé par chauffage à haute température (95 °C), température à laquelle l’ADN polymérase résiste à la dégradation : les deux brins se séparent ; • hybridation : la température de la solution est ramenée à une température de l’ordre de 50 à 60 °C, pour permettre à deux petits fragments d’ADN simple brin d’une vingtaine de bases (amorces), complémentaires de la région à amplifier et l’encadrant, de s’apparier à l’ADN génomique dénaturé (la distance entre les deux amorces peut varier entre une centaine de paires de bases et environ 2 kb en routine). Ces amorces se fixent préférentiellement à la région à amplifier. Elles sont nécessaires au fonctionnement du système car la polymérase ne peut initier d’elle-même la réplication, et apportent aussi la spécificité de la réaction ; • élongation : la température est remontée à 72 °C, température optimale d’activité de l’ADN polymérase, en-

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Fig. 1. Méthode de Southern. A. Théorie. Voir texte pour détails (pour simplifier la compréhension, nous n’avons dessiné qu’un allèle, mais les cellules eucaryotes étant diploïdes, il faut tenir compte de l’état des deux allèles). Le réarrangement d’un segment V (V1) à un segment J (J1) d’un gène hypothétique d’Ig ou du récepteurs des cellules T est illustré à titre d’exemple. B. Exemple de Southern où G correspond à une bande germinale, R correspond à une bande réarrangée et D correspond à une bande délétée.

zyme extraite d’une bactérie thermophile isolée au niveau de geysers, Thermus aquaticus, à laquelle elle doit son nom : Taq polymérase. Cette enzyme n’est pas dégradée par l’étape de dénaturation de 95 °C, à la différence des ADN polymérases qui avaient été préalablement utilisés. La Taq polymérase copie l’ADN simple brin à partir des deux amorces. Le fragment d’ADN compris entre les deux amorces s’est alors dupliqué. Puis ces trois étapes (un cycle) sont répétées. Après n cycles, le nombre de copies de la région amplifiée est théoriquement de 2n. Ces cycles étant répétés habituellement 30 fois, on obtient en théorie 230 copies du gène initial, soit une amplification de l’ordre du milliard ! Le produit de l’amplification est ensuite visualisé sur un gel soit d’agarose, soit d’acrylamide (selon la taille du fragment amplifié), qui permet la résolution des fragments en fonction de la taille. Plus récemment, l’utilisation d’amorces fluorescentes a per-

mis d’améliorer la résolution de l’analyse du produit de PCR [38,58]. L’une des amorces est rendue fluorescente par la fixation, à son extrémité 5’, d’une molécule capable d’émettre une fluorescence de longueur d’onde déterminée après une excitation laser. Par cette approche, le produit de PCR obtenu après amplification est détectable par la fluorescence émise lors du passage devant la fenêtre de lecture au cours d’une migration capillaire électrophorétique sur un analyseur de fragments. Ceci permet de lui attribuer une taille précise, et améliore la sensibilité de détection du signal. Plus généralement, la PCR apporte un énorme gain de sensibilité : le minimum nécessaire pour la méthode de Southern est de 5 µg, soit environ 750 000 cellules, tandis qu’avec la PCR on peut aller jusqu’à l’analyse d’une seule cellule. Elle est donc particulièrement indiquée pour la détection de séquences très peu représentées, ou quand on dispose de peu de matériel pathologique. Cette méthode possède de

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dénaturant, et le polymorphisme conformationnel des structures simple brin. 2.2.3.1. Séquençage. La méthode décrite par Sanger [87] est fondée sur l’arrêt de l’élongation lors de la réplication par une ADN polymérase. Cet arrêt est réalisé par la présence de didésoxynucléotides (ddNTP) qui, à la différence des désoxynucléotides (dNTP ou N signifie une des quatre bases ; constituant l’ADN, ne permettent pas l’ajout de la base suivante lors de l’élongation car le radical hydroxyl nécessaire a été remplacé par un simple atome d’hydrogène. En modifiant le ddNTP incorporé (par exemple ddATP au lieu de dATP) et en faisant migrer les quatre réactions d’élongation sur un gel de polyacrylamide permettant la résolution à une base près, on peut définir précisément l’enchaînement des nucléotides dans le gène étudié. 2.2.3.2. Polymorphisme conformationnel des structures simples brins. Cette méthode met à profit les différences de réappariement des molécules d’ADN simple brin sur ellesmêmes, aboutissant à une structure en épingle à cheveu [76], cette structure variant en fonction de la composition en nucléotides de l’ADN. Ainsi, lors d’une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide non dénaturant, après dénaturation des deux brins de l’ADN à étudier, on observe une différence de migration non seulement selon leur taille mais aussi selon leur séquence, ce qui permet de distinguer un fragment d’ADN simple brin muté d’un fragment témoin, non muté.

Fig. 2. Amplification génomique par polymérisation en chaîne (PCR). A. Théorie. Voir texte pour description détaillée. B. Exemple de PCR. 1. Marqueur de poids moléculaire ; 2. Contrôle d’amplification sans acide désoxyribonucléique (ADN) ; 3. Produit d’amplification.

nombreux avantages par rapport à la méthode de Southern, d’où son utilisation plus fréquente en routine : rapidité (1 jour contre 1 semaine), sensibilité, possibilité d’analyser du matériel partiellement dégradé (ADN fixé) et absence de produits radioactifs. Mais la sensibilité très élevée de cette méthode représente cependant un inconvénient majeur, le risque de faux positifs par amplification d’ADN présent comme aérosol dans le laboratoire, ou contaminant les échantillons à analyser, d’où la nécessité de travailler dans des conditions très rigoureuses permettant de rendre des résultats fiables. 2.2.3. Analyse des mutations Pour étudier les mutations ponctuelles pouvant affecter le fonctionnement des gènes, plusieurs méthodes peuvent être utilisées : • l’établissement de la séquence des nucléotides constituant ce gène, méthode relativement lourde mais fiable ; • deux autres méthodes indirectes de recherche de mutations ponctuelles, l’électrophorèse en gel de gradient

2.2.3.3. Électrophorèse en gel de gradient dénaturant. Une des premières méthodes développées pour rechercher des mutations dans des régions étendues de l’ADN fut l’électrophorèse en gel de gradient dénaturant [28]. Cette technique est fondée sur le fait que l’ADN simple brin migre beaucoup moins vite que l’ADN double brin. Un ADN double brin contenant un défaut d’appariement (hétéroduplex réalisé in vitro entre un ADN simple brin muté et un ADN simple brin témoin) sera dénaturé plus rapidement qu’un ADN double brin parfaitement apparié. En présence d’un gradient d’agent dénaturant (urée...), l’ADN mal apparié se dissocie plus rapidement, d’où un arrêt de sa migration plus précoce par rapport à l’ADN double brin témoin. Une différence d’une seule base entre l’ADN muté et l’ADN témoin est suffisante pour provoquer des profils de migration différents. 2.2.4. Étude du polymorphisme Dans un certain nombre de cas, il est utile de distinguer les deux allèles d’un même chromosome, par exemple pour analyser la clonalité myéloïde, ou pour effectuer une étude de chimérisme postallogreffe. Le polymorphisme étudié peut être de différents types : • présence sur un allèle et absence sur l’autre d’un site de restriction. En utilisant d’une part cette enzyme de restriction lors de l’analyse par la méthode de Southern, et d’autre part une sonde spécifique de cette région, il est possible de distinguer les deux allèles. C’est le polymor-

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phisme de longueur des fragments de restriction (RFLP en anglais pour restriction fragment length polymorphism) ; • le polymorphisme étudié peut provenir également d’une séquence répétée d’une manière différente sur chaque allèle (par exemple, 10 répétitions sur un allèle et 15 sur l’autre) analysé soit par la méthode de Southern, soit par PCR. Ces séquences sont plus ou moins longues : C de 11 à 60 nucléotides pour les minisatellites ou VNTR (variable number of tandem repeats), utilisées pour l’analyse du chimérisme postallogreffe ; C de une à quatre bases pour les microsatellites ou STR (short tandem repeats), répétitions de 12 à 40 copies (application à la clonalité associée à l’inactivation aléatoire du chromosome, par exemple avec le gène du récepteur aux androgènes dont le microsatellite est représenté par la séquence CAG répétée de 12 à 26 fois). L’informativité relative de ces polymorphismes est nettement plus importante pour les microsatellites et les minisatellites que pour les RFLP. 2.3. Analyse de l’acide ribonucléique L’étude des produits de transcription permet la détection des ARN messagers normaux, ainsi que des ARN messagers de fusion résultant de translocations chromosomiques telle que bcr-abl, caractéristique de la leucémie myéloïde chronique. L’étude de ces translocations est pratiquement impossible au niveau de l’ADN, car leurs points de cassure sont éparpillés sur les introns. Lors de l’épissage des ARN messagers après transcription de l’ADN, les exons sont raboutés les uns aux autres (Fig. 3A), générant ainsi des ARN et des protéines de fusion uniformes. La grande sensibilité de l’ARN vis-à-vis des ribonucléases, enzymes dégradant l’ARN et non l’ADN, présentes de manière ubiquitaire (mains...) et elles-mêmes résistantes à la dégradation, implique un soin particulier lors de sa manipulation. 2.3.1. Northern-blot Cette méthode permet d’étudier les produits de transcription, mais nécessite une trop grande quantité d’ARN pour être utilisée en routine. Elle est fondée sur le même principe que celle développée par Edwin Southern, et elle fut dénommée par jeu de mots la méthode du Northern [3]. L’ARN est migré dans un gel d’agarose dénaturant (pour maintenir sa forme simple brin linéaire), puis il est transféré sur une membrane de nylon et hybridé avec une sonde radioactive, comme pour le Southern. Un ARN de fusion n’aura pas la même taille que l’ARN messager sauvage. Cette méthode permet une quantification de l’ARN messager d’une manière plus fiable que la RT-PCR (PCR après transcription inverse), mais avec une sensibilité moindre. 2.3.2. Dot-blot Cette méthode est une simplification de la méthode du Northern, qui permet la quantification des ARN messagers

Fig. 3. A. Synthèse de l’acide ribonucléique (ARN) messager. L’ARN prémessager est synthétisé à partir du promoteur par l’ARN polymérase. Il est ensuite poly-adénylé et les introns sont épissés, produisant ainsi l’ARN messager mature. B. Synthèse de l’acide désoxyribonucléique (ADN) complémentaire. En présence d’une amorce (soit oligo-d(T) qui se fixe sur la région poly-adénylée [illustré ici], soit hexamères de séquence aléatoire qui se fixent partout sur l’ARN, soit amorce spécifique), la transcriptase inverse (ADN-polymérase ARN-dépendante) copie le brin d’ARN messager en brin d’ADN complémentaire. Lors du premier cycle de PCR, le brin d’ARN messager est éliminé, et les amorces de PCR se fixent sur le brin d’ADN complémentaire.

sans évaluer leur taille. Elle ne distingue pas un ARN de fusion d’un ARN normal. Une goutte d’ARN est directement déposée sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose (formant un petit disque sur cette membrane, d’où le nom anglais : dot = point). La membrane est ensuite mise au contact de la sonde marquée, puis l’hybridation spécifique est révélée par autoradiographie. 2.3.3. RT-PCR L’étude des ARN de fusion est devenue très aisée avec l’apport de la PCR. Cette méthode avait été initialement décrite pour l’ADN, mais une simple modification permet de l’utiliser aussi pour l’ARN [29]. Elle utilise une enzyme caractéristique des rétrovirus, la transcriptase inverse, une ADN polymérase ARN-dépendante, qui permet de copier, en présence d’une amorce, une molécule d’ARN simple brin en une molécule d’ADN simple brin complémentaire de la séquence de l’ARN messager (Fig. 3B). Une fois cette molécule d’ADN complémentaire (ADNc ou cDNA) obtenue, la

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Fig. 4. Principe de la polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel (système avec sonde spécifique). La sonde est dégradée au cours de l’élongation par l’activité exonucléasique de la polymérase, entraînant une libération de l’émission de fluorescence par le reporter (R). L’accumulation de cette fluorescence est détectée par l’appareil sans interruption de la réaction de PCR. La cinétique de l’accumulation de la fluorescence émise est proportionnelle à la quantité de cible présente dans l’échantillon. L’utilisation d’une gamme de calibration permet de quantifier le prélèvement.

réaction classique de PCR peut être effectuée avec deux amorces spécifiques du gène à étudier. 2.4. Méthodes quantitatives : PCR en temps réel Cette technique récente mesure la cinétique de formation du produit d’amplification au cours de la réaction de PCR, sans l’interrompre, et en déduit une quantification de la cible dans l’échantillon analysé. Elle peut s’appliquer aussi bien à l’analyse en RT-PCR qu’à l’analyse génomique sur matrice d’ADN [17,31,34]. Cette approche nécessite un marqueur fluorescent, dont le signal augmente de manière spécifique avec l’amplification au cours de la réaction de PCR, et un système de mesure externe de la fluorescence en temps réel. Le module de détection fait appel à une excitation par laser ou diode de tungstène et la mesure de la fluorescence réémise à des intervalles très rapprochés au cours de la réaction de PCR. Deux systèmes fluorescents sont disponibles : • Sybr Green : agent intercalant qui émet une fluorescence lorsqu’il se fixe à l’ADN double brin. Il présente l’avantage d’être utilisable sans restriction avec tous les systèmes de détection, mais n’assure qu’une spécificité relative qui peut nécessiter une vérification ; • Sonde spécifique : ce système utilise soit une sonde doublement marquée à ses deux extrémités, soit deux sondes se fixant en tandem sur la séquence cible. La particularité de cette dernière technologie (système Taqman) est d’ajouter aux deux amorces une sonde fluorescente qui possède deux fluorophores différents : un Reporter

(FAM) en 5’ et un Quencher (TAMRA) en 3’. Lorsque la sonde est intacte, la proximité du Reporter et du Quencher induit la suppression de la fluorescence du Reporter par le phénomène de tranfert d’énergie appelé FRET (fluorescent resonance energy transfert). Lors de la PCR, la Taq polymérase commence l’élongation et dégrade la sonde par son activité 5’exonucléasique, et donc sépare le Reporter du Quencher qui ne pourra alors plus empêcher l’émission fluorescente du Reporter. La fluorescence émise par le Reporter est ainsi proportionnelle à la quantité de sonde dégradée et donc de produit de PCR accumulé (Fig. 4). Les avantages de l’approche sonde spécifique sont, d’une part la grande spécificité apportée par la sonde, et d’autre part, pour certaines applications, la possibilité de coamplifier plusieurs séquences cibles dans la même réaction en utilisant des sondes marquées par des fluochromes différents. Son coût est cependant nettement plus élevé. La quantification de la séquence cible se fait grâce à l’établissement d’une courbe de calibration avec des dilutions d’une lignée positive ou des plasmides. Pour chaque point de la gamme, on définit le seuil de détection également appelé « cycle threshold » (Ct) à partir duquel la fluorescence détectée dépasse le seuil de positivité (threshold), ce qui permet d’établir une courbe d’étalonnage. Il suffit alors de reporter le Ct obtenu pour l’échantillon à analyser dans cette courbe et d’en déduire une quantification de la cible. L’efficacité et la spécificité de la PCR sont évaluables par la pente de cette courbe (slope) qui doit être proche de 3,3, ce qui correspond à une efficacité de 100 % (Fig. 4).

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Le résultat est corrigé grâce à l’amplification sur le même échantillon d’un gène domestique d’expression ubiquitaire qui permet la normalisation quantitative et qualitative de l’échantillon analysé. Le choix de ce gène est crucial, en effet il doit être d’expression constante quels que soient les tissus ou les pathologies en cause. De plus, son niveau d’expression et sa cinétique de dégradation doivent être proches de ceux du gène cible analysé. Différents modes de calcul sont proposés. Leur description dépasse le cadre de cet article. Il faut enfin signaler que cette technologie permet également la mise en évidence de mutations ponctuelles grâce à des « courbes de fusion », dont les applications, très larges en génétique, n’ont pas été encore définies en hématologie. En conclusion, cette technologie apporte, au-delà de son aspect quantitatif, une définition de la qualité du matériel étudié, grâce à l’utilisation d’un gène domestique, très nettement supérieure aux approches qualitatives. Sa facilité d’utilisation et les avantages qu’elle apporte en font certainement une approche dont les applications seront de plus en plus larges. 3. Applications à l’hématologie maligne 3.1. Évaluation initiale 3.1.1. Détection d’une population clonale La mise en évidence d’une population clonale est un argument important de la nature maligne d’une prolifération hématopoïétique, bien que la corrélation ne soit pas parfaite (cf infra). Les techniques les plus répandues permettant de détecter une population cellulaire clonale sont soit l’examen cytogénétique montrant une anomalie caryotypique, soit l’étude du réarrangement des gènes d’immunoglobulines (Ig) ou du récepteur des cellules T (TCR pour T cell receptor) dans une prolifération lymphoïde, soit l’étude de l’inactivation d’un seul chromosome X chez une femme pour l’étude d’une prolifération myéloïde. 3.1.1.1. Clonalité lymphoïde. Bien que la détection d’une population lymphoïde B mature clonale soit possible depuis

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longtemps par une analyse de l’expression des chaînes légères d’Ig (j ou k) par immunophénotypage ou par détection d’une paraprotéine monoclonale [84], une analyse équivalente des populations lymphoïdes pré-B ou T n’était pas possible. L’identification et la caractérisation des gènes codant des molécules de surface (Ig pour les lymphocytes B, TCR pour les lymphocytes T) ont permis la mise en évidence de clones lymphoïdes par détection des réarrangements soit des gènes d’Ig, soit ceux du TCR, initialement par hybridation par la méthode de Southern puis par PCR. Réarrangements des gènes d’Ig et du TCR. Les Ig sont composées de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères, tandis que le complexe du TCR comporte soit une chaîne a et une chaîne b, soit une chaîne c et une chaîne d (pour revues : [47,56]). La structure et les mécanismes de réarrangement des gènes codant les chaînes lourdes (IgH, chromosome 14q32), les chaînes légères (Ig j, chromosome 2p12 et Ig k, chromosome 22q11), le locus des TCR a/d (chromosome 14q11), le TCR b (chromosome 7q35) et le TCR c (chromosome 7p15) sont similaires. Dans leur configuration non réarrangée (appelée germinale), elles consistent en de nombreux segments discontinus dénommés : variable (V), de jonction (J) et, pour les gènes des IgH, du TCR b et du TCR d uniquement, de diversité (D). Il existe aussi en aval de ces segments, un ou deux segments constants (C). Au cours de la différenciation lymphoïde, la diversité des gènes d’Ig et du TCR est générée par un processus de recombinaison entre ces segments V, (D) et J (Fig. 5). Dans le système IgH, par exemple, un des deux allèles IgH subit d’abord une recombinaison génique entre un des segments DH et un des segments JH, entraînant l’excision de l’ADN les séparant. Dans un deuxième temps, un des segments VH se recombine au réarrangement DHJH, créant ainsi une unité de transcription VHDHJH. Ce gène réarrangé est d’abord transcrit en prémessager puis, après épissage des introns séparant le segment JH du segment CH, l’ARN messager (ARNm) VHDHJHCH est traduit en protéine IgH mature (Fig. 5). L’ordre de réarrangement des gènes d’Ig est IgH puis Ig j et enfin Ig k tandis que celui des gènes des TCR est : TCR d puis TCR c et TCR b et

Fig. 5. Structure des gènes codant les récepteurs à l’antigène (immunoglobuline [Ig] ou T cell receptor [TCR]). Le locus IgH est illustré à titre d’exemple. Voir texte pour détails. Emu = enhancer mu (élément régulateur induisant la transcription des IgH) ; Smu = séquence de switch important pour la commutation de classe des Ig.

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Tableau 1 Répertoire des gènes réarrangeants

Segments V Familles de segments V Segments D Segments J Additions N

Immunoglobulines (Ig) IgH Igj Diversité germinale 100–200 40–80 (7) (4) > 20 – 6 5 Diversité jonctionnelle +++ +

Igk

TCR ab TCR a

TCR b

TCR cd TCR c

TCR d

> 40 (7) – >4

60 (29) – 75

≈ 70 (24) 2 13

8 (4) – 5

8 (?) 3 3

+

+

++

++

+++

TCR : T cell receptor.

finalement TCR a avec délétion du TCR d sur le même allèle puisque le locus du TCR d est à l’intérieur du locus TCR a, entre les segments Va et Ja. La production d’une Ig ou d’un TCR fonctionnel nécessite la juxtaposition, dans une même unité de transcription et dans le même cadre de lecture, des segments V, D et J. Si le réarrangement V–(D)–J du premier allèle s’avère fonctionnel, le processus dit d’exclusion allélique empêche le réarrangement du deuxième allèle. Sinon un deuxième réarrangement a lieu sur l’autre allèle, augmentant ainsi la possibilité de produire un récepteur fonctionnel. Le réarrangement de segments V, D et J est réalisé par l’intermédiaire de signaux de recombinaison (RSS pour recognition signal sequences) situés en aval des segments V, en amont des segments J et de part et d’autre des segments D. Ces RSS, qui sont similaires dans tous les gènes d’Ig et du TCR, comportent un heptamère (c’est-à-dire une séquence de sept nucléotides) hautement conservé et un nonamère (une séquence de neuf nucléotides) riche en bases A et T, séparés par une séquence non conservée soit de 12, soit de 23 paires de bases. Ces RSS servent à diriger le système de recombinaison, encore mal compris mais partiellement médié par deux gènes, RAG 1 et RAG 2 (recombinase activating gene) [30,75], vers les segments V, D et J. Trois mécanismes concourent à la génération de la diversité des gènes des Ig et du TCR : • réarrangement combinatoire. La diversité des gènes des Ig et du TCR, qui peut être générée par la recombinaison V(D)J, est déterminée par le nombre de segments V, D et J de chaque locus. Comme le montre le Tableau 1, cette diversité combinatoire varie beaucoup selon les gènes ; • diversité jonctionnelle. Lors du réarrangement, les séquences situées à la jonction des segments V, D ou J, peuvent être modifiées soit par la délétion des nucléotides situés en aval des segments V, en amont des segments J, et de part et d’autre des segments D, soit par l’addition de courtes séquences non codées à l’état germinal, et ajoutées grâce à l’activité de la terminaldésoxynucléotidyl-transférase (TdT), créant ainsi les régions « N » ou CDR3 (complementarity determining region) de séquences et de longueurs hautement variables (Fig. 6). Dans la majorité des cas (deux tiers en théorie), ces processus de recombinaison créent une séquence dont le cadre de lecture n’est pas conservé : elle peut être transcrite en ARN mais ne peut être tra-

duite en protéine (réarrangement non fonctionnel). Lors de la différenciation lymphoïde, seuls les lymphocytes capables d’exprimer un récepteur à l’antigène fonctionnel sont sélectionnés. Il en découle que les réarrangements retrouvés dans une cellule ou dans un clone lymphoïde immature peuvent être non fonctionnels, mais qu’au moins un des deux réarrangements des populations lymphoïdes matures est fonctionnel ; • mutation somatique. La séquence des gènes d’Ig réarrangés (mais pas celle des gènes du TCR) peut être modifiée par mutation ponctuelle des nucléotides avoisinant les régions codant les séquences protéiques qui reconnaissent l’antigène. Ce mécanisme sert à augmenter l’affinité de la molécule d’Ig vis-à-vis de son antigène (maturation d’affinité). Détection d’un réarrangement d’Ig ou du TCR. • Hybridation par la méthode de Southern. Le processus de réarrangement des gènes d’Ig ou du TCR entraîne une modification des positions relatives des sites de restriction, et donc de la taille des fragments d’ADN reconnus par une sonde IgH, par exemple. Dans une prolifération lymphoïde polyclonale, chaque réarrangement produit un fragment d’ADN de taille différente selon les segments V et D utilisés ; en raison de cette hétérogénéité, chaque réarrangement reste en dessous du seuil de détection par la méthode de Southern (sensibilité d’environ 5 à 10 %). Dans une population clonale, en revanche, tous les réarrangements sur un allèle sont de taille identique et produisent une bande réarrangée (Fig. 1). Comme le locus IgH se réarrange en premier, la détection d’une population lymphoïde B clonale se fait surtout par analyse de ce locus [59,90,95]. Dans les proliférations plus matures, le réarrangement des chaînes légères peut être utile pour confirmer leur caractère clonal. Cependant, le locus Ig j est parfois délété, et l’analyse du locus Ig k par Southern est rendue plus complexe par la présence de plusieurs gènes Ck. Les réarrangements des TCR b, c et d ont lieu à la fois dans les précurseurs T ab et cd, et leur mise en évidence ne permet donc pas de distinguer entre les proliférations des deux lignées. Un réarrangement du TCR a indique une différenciation vers la lignée TCR ab mais comme le nombre important de segments Ja rend difficile l’analyse directe de ce locus par la technique de Southern,

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Fig. 6. Détection d’une population lymphoïde clonale par amplification de la région N des V–(D)–J des IgH ou TCR (T cell receptor) à partir de l’acide désoxyribonucléique (ADN) par polymérisation en chaîne (PCR) classique et dépôt sur gel (A) et par PCR fluorescente et analyse de fragment (B). A. 1. Population clonale : réarrangement monoallélique ; 2. population clonale : réarrangement biallélique ; 3. population lymphoïde polyclonale ; 4. population non lymphoïde. B. Analyse des fragments : haut : taille des fragments en paires de bases. Courbes verte, noire et bleue : PCR spécifique du TCR ou des IgH. Courbe rouge : marqueur de poids moléculaire (voir le texte pour les détails).

c’est souvent la présence d’une délétion biallélique du TCR d qui fournit une évidence indirecte du réarrangement du TCR a. La détection d’une population T clonale par la méthode de Southern se fait le plus souvent avec une sonde du TCR b, ce locus étant réarrangé à un stade relativement précoce de la différenciation T [15,81,93]. Un réarrangement majoritaire des TCR c ou d indique la présence d’une population clonale, et peut être utile dans les proliférations très précoces. En revanche, le nombre limité de combinaisons de segments V, D et J des TCR c et d, et l’utilisation préférentielle de certains segments dans certains tissus [77,92] signifient que la présence d’une bande minoritaire réarrangée peut représenter soit une sous-population clonale, soit des lymphocytes T réactionnels qui utilisent tous les mêmes segments V et J, limitant ainsi l’intérêt de ces loci pour la détection des clones minoritaires [59]. • PCR. La technique de Southern, malgré l’amélioration qu’elle a apportée dans notre compréhension des proliférations lymphoïdes, présente certains désavantages (cf supra). La détection des réarrangements clonaux des Ig ou du TCR par PCR représente une stratégie alternative plus rapide, non radioactive et au moins aussi sensible, qui en outre peut être effectuée avec beaucoup moins d’ADN (Fig. 6). L’amplification à partir de l’ADN avec des amorces spécifiques des segments V et J, permet l’amplification de la région hypervariable V(D)J, dite région

N ou CDR3. Dans une population lymphoïde clonale, la jonction V–(D)–J est identique dans toutes les cellules, tandis que dans une prolifération polyclonale, la taille des jonctions est variable. L’analyse des produits d’amplification après électrophorèse sur gel d’acrylamide, de meilleure résolution que celle sur gel d’agarose, permet la distinction entre population clonale (bande discrète) et polyclonale (traînée d’ADN) (Fig. 6A). L’utilisation de ces techniques pour la détection de la clonalité a été appliquée à l’analyse des réarrangements des gènes du TCR c et des IgH [95]. Le répertoire restreint (Tableau 1) du locus du TCR c permet l’utilisation d’un mélange d’oligonucléotides spécifiques de chaque segment V et J, tandis que la complexité du locus des IgH nécessite l’utilisation d’oligonucléotides « consensus » qui reconnaissent des séquences conservées entre les différents segments V et J, soit de toutes les familles VH [25,102], soit spécifiques de chaque famille [19]. L’inconvénient majeur de l’utilisation du TCR c pour l’analyse par PCR est la présence dans le sang de jonctions V–J « canoniques » ayant peu de diversité jonctionnelle pouvant donner des résultats faussement positifs par PCR avec certains segments (Vc9 et JcP par exemple) si leur présence n’est pas suspectée [23]. La qualité de l’analyse du produit de PCR peut être améliorée grâce à l’utilisation d’amorces fluorescentes. Par cette approche, on peut définir de manière précise la taille du réarrangement amplifié, ce qui peut être d’une

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aide précieuse lors de l’analyse de prélèvements de suivi, ou pour définir un envahissement a minima (bilan d’extension) de prélèvements périphériques. Par ailleurs, l’utilisation d’amorces marquées par des fluochromes différents, permet dans une PCR multiplex, d’identifier les différents segments V ou J impliqués dans le réarrangement. Ceci apporte une meilleure compréhension des répertoires utilisés dans différentes pathologies, et peut également s’avérer utile pour l’analyse de prélèvements de suivi (Fig. 6B). On peut par ailleurs identifier les réarrangements dits canoniques (cf supra), et éliminer ainsi le risque de faux positifs liés à leur présence au sein d’un répertoire très restreint. Cette approche présente par ailleurs l’avantage d’être très reproductible et facile à mettre en œuvre [22]. Il faut cependant signaler le risque de détection de faux positifs par la PCR fluorescente, notamment lorsque le répertoire étudié est restreint ou peu utilisé, comme par exemple dans l’analyse des réarrangements du TCR gamma ou delta. En conclusion, si cette méthologie présente d’indiscutables avantages, son utilisation suppose une bonne expérience et une interprétation ici plus qu’ailleurs, en fonction de la pathologie sousjacente. Apport de l’analyse des réarrangements des gènes des Ig et du TCR. La mise en évidence d’un réarrangement clonal des gènes des Ig et du TCR représente un argument décisif de la nature clonale d’une prolifération lymphoïde [54]. Ceci est particulièrement important lorsque l’aspect morphologique ou histologique est polymorphe, ce qui est parfois le cas dans certains lymphomes. Il faut cependant signaler que, bien que dans la plupart des cas la présence d’une population clonale signifie une population maligne, ceci n’est pas toujours vrai [59,90]. D’une part, il existe certaines proliférations lymphoïdes clonales dont l’évolution clinique ne correspond pas à celle d’un processus malin, telles les populations lymphoïdes B associées à une gammapathie monoclonale bénigne, la papulose lymphomatoïde et certaines proliférations à grands lymphocytes à grains (LGL pour large granular lymphocytes). D’autre part, le développement de techniques de plus en plus sensibles permet de mettre en évidence la présence de populations réactionnelles, qui représentent en fait l’expansion d’une population clonale lymphoïde stimulée par l’antigène [8,101]. Ces populations réactionnelles clonales sont détectées surtout si le répertoire de réarrangements des TCR est restreint, comme dans les lymphocytes T cd du sang et les lymphocytes T ab de l’intestin [77,85]. Malgré ces limitations, la mise en évidence d’une population lymphoïde clonale a beaucoup aidé notre capacité à distinguer les proliférations bénignes des proliférations malignes. L’analyse des réarrangements des Ig et du TCR permet aussi de déterminer la nature lymphoïde de certaines proliférations. Historiquement, avant le développement des anticorps monoclonaux spécifiques des sous-populations lymphoïdes, c’est la mise en évidence des réarrangements des

gènes d’IgH qui a permis la démonstration de l’appartenance à la lignée B de la plupart des LAL de l’enfant. De la même manière, la détection des réarrangements des gènes des Ig a fourni la preuve que les leucémies à tricholeucocytes étaient des tumeurs lymphoïdes B. La démonstration d’une population T clonale, même minoritaire, dans certaines proliférations polymorphes, telles que la lymphadénopathie angioimmunoblastique, a permis de les classer dans le cadre des lymphomes T périphériques. L’analyse des réarrangements des gènes d’Ig et du TCR dans une population lymphoïde, dont la nature T ou B n’est pas clairement établie par l’immunophénotypage, permet parfois de déterminer la lignée lymphoïde impliquée (T ou B), surtout dans les proliférations matures. Il existe cependant une incidence non négligeable de réarrangements dits « illégitimes » dans les proliférations lymphoïdes immatures, surtout dans les LAL. Le TCR c, par exemple, est réarrangé dans 40 à 70 % des LAL de la lignée B [12]. L’explication de ces réarrangements illégitimes dans les LAL est probablement liée au fait que les lymphocytes T et B utilisent le même système de recombinaison des gènes des Ig ou du TCR. Il en découle que l’utilisation des réarrangements des gènes du TCR ou des Ig pour faire la distinction entre prolifération T ou B est plus fiable pour l’analyse des populations matures dans la mesure où ces réarrangements « illégitimes » sont beaucoup plus rares, mais, dans tous les cas, ces résultats doivent être interprétés en fonction des données cliniques, morphologiques et immunologiques. 3.1.1.2. Clonalité associée à l’inactivation aléatoire du chromosome X. Quand l’étude du réarrangement des gènes d’Ig et du TCR n’est pas possible, la détermination de la présence d’une population clonale est plus délicate. L’analyse de la clonalité associée à l’inactivation aléatoire du chromosome X est fondée sur deux principes : • l’existence de polymorphismes sur les deux chromosomes X, permettant la distinction des deux allèles ; • l’inactivation aléatoire d’un des deux chromosomes X chez la femme au cours de l’embryogenèse (habituellement au stade huit à 16 cellules) [52]. L’inactivation du chromosome X peut être étudiée de deux manières : • au niveau de l’expression (soit des protéines [glucose 6-phosphate déshydrogénase], soit des ARN messagers, le chromosome inactif n’étant pas transcrit) ; • par étude de la méthylation, en utilisant des enzymes sensibles à la méthylation comme HpaII ou HhaI, qui ne coupent pas quand le site de restriction est méthylé. En effet, le chromosome inactif est hyperméthylé [2,97,98]. En pratique, trois gènes sont étudiés pour l’analyse de la clonalité : le gène de la phosphoglycérate kinase (PGK), celui de l’hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT), et celui du récepteur des androgènes (AR) [13]. Combinées, ces trois méthodes permettent d’analyser la clonalité chez la quasi-totalité des femmes, mais elles sont limitées aux femmes ayant des proliférations majoritaires (> 25 % de la

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population cellulaire analysée) et leurs analyses sont d’interprétation délicate. 3.1.2. Détection moléculaire des anomalies chromosomiques L’évaluation du pronostic des leucémies et notre compréhension des mécanismes d’oncogenèse se sont améliorées grâce à l’identification d’anomalies caryotypiques associées à certains types de tumeurs et à l’analyse moléculaire des gènes impliqués, expliquant ainsi l’importance croissante de la cytogénétique en hématologie. Il existe cependant certaines situations où la cytogénétique classique ne permet pas de mettre en évidence ces anomalies. Ainsi, il est parfois difficile d’obtenir des métaphases de qualité acceptable, comme par exemple lorsqu’un prélèvement est effectué après chimiothérapie, ou dans les proliférations matures où l’index mitotique est moins important, ou encore quand la population maligne est minoritaire. De plus, l’analyse des métaphases n’est pas possible sur du matériel congelé ou fixé en paraffine. Certaines anomalies chromosomiques sont difficiles à détecter par une analyse classique, comme l’inversion du chromosome 16 des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) M4 avec éosinophiles anormaux [33]. Il existe aussi un nombre croissant d’anomalies détectées par biologie moléculaire qui ne sont pas visibles par caryotype classique. La résolution maximale possible par analyse des chromosomes marqués en bandes R ou G est de l’ordre de 1 à 10 mégabases d’ADN (c’est-à-dire 1 à 10 millions de paires de bases). La délétion tald, par exemple, anomalie chromosomique la plus fréquente dans les LAL-T (environ 25 % des cas), consistant en une délétion spécifique de 90 kilobases d’ADN en amont du gène tal-1, n’est pas visible par caryotype classique, mais peut être détectée facilement soit par la méthode de Southern, soit par PCR [21]. La fréquence élevée de la délétion de CDK4I, gène important dans la régulation du cycle cellulaire, observée dans plusieurs tumeurs, y compris les leucémies, suggère que les microdélétions peuvent représenter un mécanisme important d’oncogenèse [70,88]. En revanche, les techniques moléculaires de détection ne permettent pas l’analyse globale du caryotype et la détection d’anomalies nouvelles ou inattendues. Pour toutes ces raisons, l’analyse des hémopathies malignes nécessite de plus en plus une approche complémentaire à la fois par la cytogénétique classique et par la cytogénétique moléculaire. 3.1.2.1. Détection des anomalies chromosomiques par PCR. La détection des anomalies chromosomiques (translocation ou inversion) par PCR est fondée sur la juxtaposition anormale de deux séquences nucléotidiques bien définies. Il est donc évident que seules les anomalies bien caractérisées sur le plan moléculaire, associées à des points de cassure conservés, soit au niveau de l’ADN, soit de l’ARN, peuvent être détectées par cette technique. Les anomalies chromosomiques accessibles à la PCR sont détaillées dans le Tableau 2. Seules les caractéristiques générales des anomalies fréquen-

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tes (> 5 %) ou associées à un sous-type particulier, donc d’importance diagnostique et/ou pronostique, sont incluses dans cet article [96]. Il existe deux catégories majeures d’anomalies chromosomiques (Fig. 7). Anomalies qualitatives. Il s’agit de translocations conduisant à l’expression d’un transcrit de fusion résultant en la juxtaposition des parties codantes de deux gènes (Fig. 7A). Elles sont détectées par RT-PCR à partir de l’ARN. Ces anomalies se retrouvent dans les tumeurs lymphoïdes et myéloïdes. Les transcrits de fusion et donc les produits de PCR sont identiques chez tous les malades atteints du même type de translocation et impliquant les mêmes introns. Cette uniformité rend possible la détection de la quasi-totalité des translocations avec une ou deux paires d’amorces d’amplification mais, du fait de cette uniformité, cette analyse est très sensible aux contaminations de la PCR. À titre d’exemple, les translocations t(9 ; 22)(q34 ; q11) des LMC et des LAL sont identiques sur le plan caryotypique mais diffèrent sur le plan moléculaire, bien que toutes les deux impliquent les gènes BCR et ABL (pour revue [1]). Dans les deux cas, le point de cassure du chromosome 9 se produit au sein de l’intron 1 du gène ABL, qui s’étend sur environ 200 kb. En revanche, les points de cassure sont plus éparpillés sur le chromosome 22. Dans la grande majorité des LMC, la translocation se trouve dans la partie centrale du gène BCR (major breakpoint cluster region ou M-BCR), soit entre les exons 13 et 4, soit entre les exons 14 et 15. Cette hétérogénéité génomique produit deux types de transcrits de fusion, qui peuvent être distingués selon la taille des fragments générés par RT-PCR avec une paire d’amorces spécifiques des exons 13 de BCR et 2 de ABL. Ces transcrits de fusion sont traduits en protéine anormale dite p210. Dans les LAL possédant une translocation t(9 ; 22), la majorité des cas est caractérisée par un point de cassure bien plus en amont du gène BCR, dans l’intron 1 (minor breakpoint cluster region ou m-BCR), et sont détectés par RT-PCR avec des amorces spécifiques de l’exon 1 de BCR et de l’exon 2 de ABL. Le produit protéique de ce gène s’appelle p190. Anomalies quantitatives. Il s’agit de translocations conduisant à l’expression aberrante d’un proto-oncogène qualitativement normal, suite à sa juxtaposition à une séquence régulatrice inhabituelle, souvent un gène des Ig ou du TCR (Fig. 7B). Les points de cassure du côté du protooncogène se trouvent en dehors de la partie codante du gène, parfois à une distance considérable (une centaine de kb pour les t(11;14)(q13;q32) des lymphomes du manteau par exemple) [82,89] et la protéine reste donc intacte. Le résultat final de ces anomalies est une dérégulation de l’expression du proto-oncogène, soit à un stade inhabituel de la différenciation ou du cycle cellulaire, soit au niveau d’un tissu n’exprimant pas ce produit physiologiquement. Ces anomalies chromosomiques représentent souvent des erreurs de la recombinase lors des réarrangements des gènes codant les Ig ou le TCR (cf supra) et se retrouvent, par conséquent, dans les tumeurs lymphoïdes. Les points de

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Tableau 2 Anomalies chromosomiques accessibles à la polymerase chain reaction (PCR) Anomalie t(12;21) t(1;19) t(4;11) tald t(9;22)

t(8;21) t(15;17) inv(16)

t(14;18)3 t(11;14)

t(2;5)

Gènes TEL (12p13) AML 1 (21q22) PBX (1q23) E2A (19p13) AF4/FEL (4q21) MLL/HRX/ALL-1 (11q23) SIL (1p32) tal-1/SCL (1p32) abl (9q34) bcr (22q11)

Famille ETS Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription ? Facteur de transcription Tyrosine kinase Transduction des signaux d’activation

ETO (8q22) AML-1/CBF␣ (21q22) PML (15q22) RAR␣ (17q11) MYH11 (16p) CBFb (16q)

? Facteur de transcription Facteur de transcription Facteur de transcription Myosine Facteur de transcription

IgH (14q32) Bcl-2 (18q21) CCND-1/PRAD-1/bcl-1 (11p13) IgH (14q32) ALK (2p23) NPM (5q35)

Récepteur des antigènes Apoptose Cycline Récepteur des antigènes Tyrosine kinase Transport intracellulaire

Incidence • LAL-lignée B enfant

25 %

• LAL-lignée B • LAL pré-B Ig Cyto. + • LAL • LAL < 1 an • LAL-T

5% 25 % 5% 70 % 10 à 25 %

• LMC • LAL de l’adulte • LAL de l’enfant • LAM • LAM-2 • LAM • LAM-3 • LAM • LAM-4 • LAM-4 éosino. • LNH folliculaires • LNH de haut grade : • LNH du manteau :

98 % 25 % <5% 10 % 20–40 % 10 % > 95 % 6% 20 % 95 % 60 % 20 % 50 %

• LNH anaplasiques

(T > B)

PCR2

Référence

ARN

[86]

ARN

[37,41,72]

ARN

[9,14,104]

ADN

[4]

ARN

[42,45,48]

ARN

[60,73]

ARN

[51,99]

ARN

[18,50]

ADN

[6,46,67,68]

ADN

[5,82,89,100]

ARN

[63]

LAL(M) : leucémie aiguë lymphoblastique (myéloblastique) ; LMC : leucémie myéloïde chronique ; LNH : lymphome non hodgkinien ; Ig cyto : immunoglobulines cytoplasmiques. (1) Seules les anomalies fréquentes (> 5 %) ou associées à un sous-type particulier, et donc d’importance diagnostique et/ou pronostique sont détaillées ici. (2) Les anomalies détectées à partir de l’ARN correspondent aux anomalies qualitatives (voir texte pour détails), et celles détectées à partir de l’ADN aux anomalies quantitatives. (3) Seules les translocations impliquant les gènes codant les IgH sont décrites ici. Il existe aussi de rares formes variantes impliquant les gènes codant les chaînes légères sur les chromosomes 2p12 et 22q11.

cassure sont situés au niveau d’un RSS réel du côté des Ig ou du TCR, le plus souvent du type heptamère-nonamère, et d’une séquence qui lui ressemble du côté du proto-oncogène. L’accessibilité de cette séquence de type RSS à la recombinase est probablement déterminée par la configuration chromatinienne ouverte du gène due à son activité transcriptionnelle ; ceci suggère que ces proto-oncogènes sont actifs lors du réarrangement des gènes d’Ig ou du TCR. La jonction nucléotidique entre les deux chromosomes est soumise aux mêmes modifications que les réarrangements physiologiques des Ig ou du TCR, créant ainsi une région N spécifique de chaque malade. L’amplification de ce type de translocation par PCR se fait à partir de l’ADN (même à partir de matériel fixé [49]) et génère des produits de PCR de taille variable, ce qui rend plus facile l’identification de la translocation de chaque malade et donc leur distinction d’éventuels produits contaminants. En revanche, seuls les points de cassure qui sont regroupés dans la région avoisinant les amorces d’amplification sont détectés. L’amplification par PCR de la région principale de cassure (MBR pour major breakpoint cluster) de la translocation t(14 ; 18) des lymphomes folliculaires, par exemple, ne détecte que les 70 % des cas caractérisés par une translocation t(14 ; 18) caryotypique [46,68]. De même, la détection par PCR de la translocation t(11 ; 14)

des lymphomes du manteau est positive seulement dans la moitié des cas [61,83], quand le point de cassure implique la région préférentielle de translocation MTC (major translocated cluster) en amont du gène dérégulé, CCND1 ou PRAD1. La plupart des translocations de ce type analysées en routine impliquent le gène IgH (Tableau 2). La délétion tald, en revanche, n’implique pas les gènes des Ig ou du TCR, mais est apparentée dans la mesure où elle est médiée par la recombinase, et où la juxtaposition de la partie 5’ non codante du gène SIL, en amont de la délétion, à la partie codante de tal1, conduit à une expression aberrante de la protéine Tal1 [4]. 3.1.3. Limites de détection des translocations 3.1.3.1. Points de cassure trop étendus. Il existe une autre catégorie de translocations non aléatoires qui ne se prête pas facilement à une analyse par PCR ou par RT-PCR. Les translocations affectant le gène c-myc sur le chromosome 8q24 se trouvent d’une manière préférentielle dans le lymphome de Burkitt ou son équivalent leucémique, les LALL3. Elles impliquent soit le chromosome 14 (gènes IgH) soit, plus rarement, les chromosomes 2 ou 22 (gènes Ig j ou Ig k

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res de MLL ont été clonés [32,65,79] et il est possible de détecter la translocation t(4 ; 11) par RT-PCR [9]. On peut donc envisager la possibilité de détecter la grande majorité de ces translocations par RT-PCR, mais du fait de la grande variabilité des partenaires, un bilan moléculaire par hybridation par la méthode de Southern représente probablement un meilleur choix. Une autre stratégie prometteuse est de détecter ces translocations par FISH avec une sonde MLL sur métaphase ou sur noyau interphasique. Les translocations impliquant le gène BCL6 sur le chromosome 3q27 [43,103], retrouvées dans environ 25 % des lymphomes B de haut grade, sont similaires dans la mesure où seulement 50 % des translocations impliquent un gène des Ig, les autres partenaires étant hétérogènes [7]. Une comparaison de l’intérêt des différentes stratégies d’analyse moléculaire (Southern, FISH et PCR) permettrait de définir la meilleure méthode de détection de ce type d’anomalie. 3.1.4. Apport de l’analyse moléculaire des anomalies chromosomiques

Fig. 7. Deux catégories d’anomalies chromosomiques. Ig : immunoglobulines ; TCR : T cell receptor ; PCR : polymérisation en chaîne.

respectivement) [55]. Même si le résultat final de toutes ces anomalies est la dérégulation de l’expression du gène c-myc, les points de cassure sont très hétérogènes, à la fois sur le chromosome 8, où elles s’étendent sur environ 350 kb en amont ou en aval du gène c-myc, et du côté IgH où elles peuvent impliquer les segments JH ou les séquences de switch des régions CH (séquences d’ADN intervenant dans le phénomène de commutation de classe des Ig). Il est évident qu’une telle hétérogénéité rend difficile la détection de ces translocations par PCR ou même par Southern. 3.1.3.2. Partenaires variables. Il existe aussi des anomalies où un gène situé sur un chromosome donné est constamment impliqué, alors que le partenaire chromosomique est variable. Les translocations touchant le segment 11q23, par exemple, impliquent de nombreux chromosomes : 4, 2 et 19, les trois premiers chromosomes étant les plus fréquemment touchés. Ces anomalies se trouvent dans environ 5 à 10 % des LAL et des LAM en général, et d’une manière préférentielle dans les leucémies aiguës des enfants âgés de moins de 1 an (70 %) et dans certaines leucémies secondaires [104]. Du côté du chromosome 11, toutes ces translocations impliquent le même gène, MLL, et la grande majorité des points de cassure sont regroupés dans une région d’environ 10 kb, favorisant leur détection par hybridation selon la méthode de Southern avec une sonde MLL [62]. De nombreux partenai-

À la différence des réarrangements des Ig ou du TCR qui représentent des marqueurs indirects de malignité dans les tumeurs lymphoïdes, les anomalies chromosomiques sont plus ou moins directement impliquées dans le processus malin. Leur détection aide donc non seulement au diagnostic mais aussi à l’évaluation du pronostic. L’intérêt de l’analyse de chaque anomalie dépend de sa fréquence, de son importance pronostique et de leur facilité et fiabilité de détection. 3.1.4.1. Intérêt diagnostique. Certaines anomalies sont pathognomoniques d’une maladie et leur mise en évidence devient nécessaire pour établir le diagnostic, notamment dans tous les cas ayant une présentation clinique atypique. Entre 5 et 10 % des LMC n’ont pas de chromosome de Philadelphie (Ph1) correspondant à la translocation t(9 ; 22) [94]. La détection d’un réarrangement impliquant les gènes BCR et ABL, d’abord par Southern et plus récemment par RT-PCR, a montré que la majorité de ces cas présentait la même anomalie moléculaire que les LMC Ph1+. Il devient maintenant difficile de porter un diagnostic de LMC en l’absence soit de la translocation t(9 ; 22), soit d’un réarrangement BCR-ABL, et il est fort possible que les LMC « atypiques » n’ayant pas de réarrangement BCR-ABL représentent une entité différente. De la même manière, le diagnostic de LAM M3 [99] en l’absence d’une translocation t(15 ; 17)(q22 ; q11) et/ou d’un transcrit de fusion PML-RAR ␣ [40] nécessite la mise en évidence d’une forme moléculaire variante telle que la translocation t(11 ; 17)(q23 ; q21) ou de son transcrit de fusion, PLZF-RAR ␣ [16]. Du côté lymphoïde, la mise en évidence soit par caryotype classique, soit par analyse moléculaire de la translocation t(14 ; 18)(q32 ; q21) [IGH-BCL-2] ou de la t(11 ; 14)(q13 ; q32) [IgH-CCND1] aide au diagnostic différentiel entre un lymphome folliculaire et un lymphome du manteau.

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3.1.4.2. Intérêt pronostique. Dans les LAL de la lignée B, les translocations t(9 ; 22)(q34 ; q11), et t(4 ; 11)(q21 ; q23) représentent des marqueurs de mauvais pronostic [48,104]. Dans un nombre croissant de protocoles cliniques, leur mise en évidence, indique un changement de traitement vers un protocole plus agressif, voire une greffe de moelle allogénique. Un bilan moléculaire systématique des gènes impliqués (BCR-ABL, E2A-PBX1 et MLL-AF4 et TEL-AML1 respectivement) montre que ces anomalies peuvent ne pas être détectées par caryotype classique [14,39]. Cependant, les techniques de cytogénétique moléculaire, notamment FISH, ont une sensibilité proche des techniques de biologie moléculaire (en situation diagnostique) et la cytogénétique classique offre la possibilité d’une analyse globale susceptible d’orienter vers de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans l’oncogenèse et susceptibles d’avoir un impact pronostique. Ces différentes techniques sont donc certainement complémentaires. Au total, s’il est maintenant admis que la mise en évidence d’un réarrangement moléculaire de BCR-ABL ou de MLLAF4 est associée avec un pronostic défavorable dans les LAL-B, l’impact pronostique d’autres réarrangements comme TEL-AML1 ou E2A-PBX1 reste encore débattu et des études moléculaires systématiques dans le cadre de protocoles thérapeutiques homogènes devraient prochainement y répondre. En ce qui concerne les LAM, les anomalies détectables par RT-PCR, telles que les transcrits de fusion PML-RAR a des LAM M3 [51], AML-1-ETO des LAM M2 [73] et CBF b-MYH11 des LAM M4 éosinophiles [18] sont plutôt associées à un pronostic relativement favorable. Il est envisageable que ces anomalies, à l’instar des anomalies des LAL, soient prises en compte lors de la stratification thérapeutique initiale de malades atteints de LAM. Plus récemment, la détection d’une anomalie qualitative du gène FLT3, dont le couple ligand–récepteur joue un rôle central dans les étapes précoces de l’hématopoïèse, s’est révélée associée à un mauvais pronostic dans les LAM. Cette anomalie consiste en une duplication en tandem d’une partie du gène FLT3. Il s’agit d’un facteur pronostique défavorable et indépendant présent dans environ 20 % des LAM. Il est probable que les futurs protocoles de chimiothérapie des LAM proposeront une stratification thérapeutique différente en fonction de la présence ou non de cette anomalie, dont la mise en évidence est essentiellement accessible par les méthodes moléculaires (PCR) [44,66].

Tableau 3 Sensibilité comparative des méthodes de détection de la maladie résiduelle Morphologie Southern-blot Caryotype Immunophénotype Double marquage PCR

Sensibilité % 5 5 5 1 0,1 0,001

5 × 10–2 5 × 10–2 5 × 10–2 10–2 10–3 10–5

PCR : polymerase chain reaction.

3.2.1. Détection de la maladie résiduelle La maladie résiduelle est définie par la persistance des cellules tumorales qui ont survécu à la chimiothérapie, présentes en nombre inférieur au seuil de détection des méthodes morphologiques classiques (moins de 5 % de blastes). Il a été estimé que la masse tumorale totale au moment du diagnostic d’une leucémie est de l’ordre de 1012 cellules, et que l’induction la réduit d’au moins deux logs décimaux. Il en résulte que la « rémission complète » peut représenter entre 0 et 1010 cellules tumorales. La sensibilité de la détection des cellules tumorales rares par PCR dépasse de plusieurs logs décimaux celle d’autres techniques (Tableau 3) (Fig. 8) [78]. 3.2.1.2. Détection moléculaire des anomalies chromosomiques Leucémie myéloïde chronique. L’anomalie chromosomique la plus recherchée par PCR pour le suivi des malades est BCR-ABL dans les LMC [74]. Cette recherche doit désormais se faire par PCR quantitative, et il est probable qu’une cinétique croissante de l’évolution du taux de transcrit peut avoir une incidence thérapeutique directe pour les patients, qu’il s’agisse d’adapter la posologie des traitements médicamenteux (comme l’imatinib ou l’interféron) ou de moduler l’immunosuppression et/ou de réinjecter des lymphocytes du donneur pour induire un effet greffon contre leucémie (GVL) chez les patients ayant bénéficié d’une allogreffe de moelle.

3.2. Suivi des malades après traitement L’identification de marqueurs moléculaires clonospécifiques permet la surveillance du clone tumoral après traitement et donc la détection de la maladie résiduelle, voire l’émergence de sous-clones résistants. Cette évaluation a désormais une place importante et croissante dans la prise en charge des hémopathies malignes [26,35,80].

Fig. 8. Représentation schématique des possibilités de l’évolution de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës et niveaux de sensibilité requis pour sa détection.

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L’utilisation de la PCR quantitative est par ailleurs un atout indispensable dans l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques comme les inhibiteurs de la tyrosine kinase dans cette pathologie. Leucémies aiguës. De nombreuses données récentes de la littérature ont apporté la preuve de la pertinence du monitorage de la maladie résiduelle minime (MRM) dans les LAL pour l’identification de groupe à haut risque de rechute dont le pronostic pourrait être amélioré par un traitement intensif. Les protocoles thérapeutiques des LAL notamment, sont désormais stratifiés en fonction du niveau de détection de la MRM, après les premières cures de chimiothérapie. Cette évaluation initialement réalisée par des méthodes semiquantitatives ou compétitives sera, à terme, réalisée en PCR quantitative. Les cibles utilisables sont de deux types : soit des remaniements chromosomiques (30 % environ des LAM et des LAL), soit des réarrangements VDJ clonospécifiques (90 % des LAL). Les premiers présentent l’avantage d’être stables au cours de l’évolution de la maladie, mais ne concernent qu’un tiers des patients. Les réarrangements VDJ permettent une informativité de plus de 90 % dans les LAL, mais ont l’inconvénient d’être instables, notamment par évolution clonale ou émergence d’un sous-clone avec un réarrangement différent. 3.2.1.3. Détection des réarrangements des Ig et du TCR. Pour près de 90 % des malades atteints de LAL, les réarrangements des gènes des Ig et/ou du TCR peuvent représenter des marqueurs moléculaires permettant l’analyse de la maladie résiduelle. Ces stratégies sont de deux types : distinguer la population clonale résiduelle de la population réactionnelle par la taille des fragments générés par PCR [10,20] ; détecter d’une manière spécifique la région N du réarrangement V–(D)–J du clone de départ. Cette deuxième stratégie nécessite soit le séquençage de la région N et la fabrication d’un oligonucléotide spécifique [53,102], soit l’utilisation du produit d’amplification de la région N comme sonde spécifique [69]. Plus récemment ont été mises au point des techniques semi-quantitatives par compétition utilisant un standard interne, ou quantitatives par PCR quantitative dont la place dans la stratification thérapeutique des leucémies aiguës reste à préciser [27]. Il faut juste signaler que la stratégie spécifique de la région CDR3, soit par hybridation, soit par PCR quantitative, est plus spécifique et plus sensible (de l’ordre de 10–4 à 10–5 soit une cellule maligne pour 10 000 à 100 000 cellules normales par rapport à 10–3) mais a l’inconvénient de détecter seulement le clone de départ. 3.2.2. Évolution clonale La comparaison par la méthode de Southern et/ou par PCR des réarrangements des gènes d’Ig ou du TCR dans les tumeurs lymphoïdes lors du diagnostic et de la rechute, peut permettre de déterminer si la rechute représente la réapparition du même clone ou son remplacement par un autre clone. L’apparition d’un nouveau réarrangement des gènes d’Ig ou

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du TCR peut représenter soit une modification du réarrangement majoritaire, soit l’émergence d’un sous-clone minoritaire pouvant être sélectionné par une résistance à la chimiothérapie. La mise en évidence de certaines anomalies moléculaires, telles que les mutations ponctuelles de l’antioncogène p53 [36] lors d’une rechute, permet de caractériser l’apparition de clones plus agressifs. Ces anomalies moléculaires sont souvent corrélées avec une aggravation clinique ou l’acquisition de nouvelles anomalies caryotypiques. 3.2.3. Détection de la résistance aux drogues L’analyse des mécanismes de résistance à la chimiothérapie reste pour l’instant confinée aux laboratoires de recherche. Certains gènes responsables de l’efflux des agents cytotoxiques des cellules hématopoïétiques, comme mdr-1 (pour multidrug resistance), ont été identifiés [71]. L’expression de mdr-1 peut être détectée par des techniques d’immunohistochimie au niveau protéique ; par hybridation in situ ; par dot-blot ou par RT-PCR au niveau de l’ARN messager ; et par mesure de la vitesse d’efflux d’un fluorochrome au niveau de l’analyse fonctionnelle [11]. Une hyperexpression est observée fréquemment lors de la rechute des LAM, des myélomes et des lymphomes. Au diagnostic des LAM, l’hyperexpression de mdr-1 représente un facteur de mauvais pronostic qui prédit une résistance à la chimiothérapie. Il reste donc à déterminer quelle technique sera la plus fiable pour l’analyse en routine des malades. 3.2.4. Évaluation moléculaire post-allogreffe Il est parfois important de déterminer si la reconstitution hématopoïétique après allogreffe est celle du receveur ou du donneur. S’il existe une différence de sexe entre le receveur et le donneur, cette analyse peut se faire par détection du chromosome Y, soit par marquage à la quinacrine sur métaphase, soit par FISH sur noyau interphasique avec une sonde Y [24]. Quand il n’y a pas de différence de sexe, la distinction entre l’hématopoïèse de type receveur ou de type donneur se faisait historiquement à l’aide des minisatellites (VNTR), mais de plus en plus elle se fait par étude des microsatellites (STR) [57]. 4. Perspectives d’avenir L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans l’oncogenèse hématopoïétique a permis d’identifier des anomalies à différents niveaux de la fonction cellulaire : • anomalies de l’expression des récepteurs de surface ; • anomalies de la transmission des signaux d’activation ; • anomalies de localisation intranucléaire des protéines ; • anomalies impliquant les facteurs de transcription ; • dérégulation du cycle cellulaire ; • inhibition de l’apoptose. L’identification de ces anomalies, plus ou moins spécifiques des tumeurs, permettra le développement de stratégies thérapeutiques adaptées. Ainsi la démonstration dans les LAM M3, caractérisées par une translocation impliquant le

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récepteur a de l’acide rétinoïque (RAR a), qu’il est possible de traiter les malades par de l’acide rétinoïque tout-trans, et d’induire ainsi une différenciation des blastes promyélocytaires vers des formes granulocytaires plus matures, illustre une application thérapeutique des observations plus fondamentales.

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