- Email: [email protected]
Attività antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento
articolo originale
PREVENZIONE DELLE INFEZIONI
Attivit a antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Ricevuto il 16 maggio 2011 Accettato il 12 settembre 2011 Disponibile online 30 novembre 2011 *Autore di riferimento: Germano Orru` [email protected]
Antibacterial activity of two products containing hydrogen peroxide and silver salts b,* S. Del Neroa, G. Marcheseb, D. Mandasb, M. Liciardic, G. Denottib, G. Orru a
CEFLA Dental Group, Imola, Bologna degli Studi di Cagliari, Oral Biotechnology Laboratory (OBL), Dipartimento di Chirurgia e Universita Scienze Odontostomatologiche (Direttore: prof. V. Piras) c Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Dipartimento di Cagliari (Responsabile: dott. M. Liciardi) b
Riassunto Obiettivi. E stata valutata la funzione antibiofilm e l’attivita antibatterica del perossido di idrogeno, come tale e dopo aggiunta di sali d’argento. Materiali e metodi. Un esteso set di microrganismi e stato valutato, in forma sia planctonica sia sessile (biofilm), attraverso metodiche standard e innovative per la valutazione dell’attivita antibatterica di: 1) H2O2 a 300 e 600 ppm (parti per milione) e al 3%; 2) le stesse varianti con l’aggiunta di Ag+ alla concentrazione di 5 e 10 ppm. Risultati. Tutti i microrganismi in esame venivano inibiti a concentrazioni inferiori a quelle normalmente utilizzate nei riuniti odontoiatrici – Minimum Inhibitory Concentration (MIC) < 600 ppm – inclusi alcuni patogeni nosocomiali come Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Conclusioni. I preparati con i sali d’argento hanno evidenziato una spiccata attivita di inibizione verso il biofilm rispetto al controllo negativo (H2O2 senza aggiunta di ioni Ag+). Parole chiave: * Biofilm * Disinfezione delle condotte idriche del riunito * Ioni argento * Legionella pneumophila * Perossido di idrogeno
1. Introduzione
Abstract Objectives. The purpose of this study was to examine the antibiofilm and the antibacterial activity efficacy of H2O2 alone and combined with silver salts. Materials and methods. We used standard and innovative methods to assess the antibacterial effects of (i) H2O2 at 300 e 600 ppm (parts per million), and at 3%; (ii) the same H2O2 concentrations with the addition of Ag+ salts at 5 and 10 ppm, against a large number of microorganisms, in planctonic and sessile (biofilm) forms. Results. All of the microorganisms tested (including some nosocomial pathogens, such as Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa) were inhibited at concentrations lower than those commonly used in dental unit waterlines (MIC < 600 ppm) Conclusions. H2O2 with silver salts displayed greater antibiofilm efficacy than the negative control (H2O2 without silver ions). Keywords: * Biofilm * Dental unit waterline (DUWL) disinfection * Silver ions * Legionella pneumophila * Hydrogen peroxide
riportati casi di riuniti odontoiatrici che,
legati ai microrganismi presenti nell’ac-
privi di sistemi di decontaminazione,
qua erogata dal riunito odontoiatrico, la
noto, il riunito odontoiatrico e Com’e
erogavano acqua contenente alti titoli di
presenza in essa di alti numeri di pato-
un’apparecchiatura particolarmente
5
microrganismi, anche nell’ordine di 10
geni genera preoccupazione. Esporre i
esposta alla contaminazione da parte di
formanti colonie (UFC)/mL [1,2]. unita
microrganismi provenienti dall’acqua di
Sebbene non esistano evidenze epide-
pazienti o il personale odontoiatrico ad microbiologica, acqua di scarsa qualita
rete o dal paziente. In letteratura sono
miologiche circa problemi di salute
nonostante
96
| DENTAL CADMOS | 2/2012
la
mancanza
di
effetti
0011-8524/5 - see front matter Ó 2011 Elsevier Srl. Tutti i dirtti riservati. doi: 10.1016/j.cadmos.2011.09.007
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
in contraddidocumentati sulla salute, e
paragosporigeni. L’effetto battericida e
contribuire alla diffusione aerea degli
zione con i principi universalmente
nabile a quello svolto da altri metalli, ma per l’uomo che senza l’elevata tossicita
agenti
[3]. L’American Dentists Association
invece caratterizza i metalli pesanti: cio
sione dell’infezione, in modo particolare
(ADA) nel 1995 ha stabilito un limite
consente una buona differenza tra con-
fra i pazienti immunocompromessi [10].
superiore pari a 200 UFC/mL per
centrazione antibatterica e concentra antibatterica zione tossica [5,6]. L’attivita
Parallelamente, Pseudomonas spp. pre-
accettati per il controllo delle infezioni
patogeni,
che
nel
caso
di
la prevalente via di trasmisLegionella, e
conteggio delle colonie a 22 C per
attribuibile alla tendenza dell’Ag a fore
senta numerosi determinanti di patogeni nel proprio genoma, inclusa la cita
l’acqua potabile in bottiglia, stabilito dal
mare stabili legami con i principali meta-
di resistere a innumerevoli tipi capacita
D.L. 2 febbraio 2001, n. 31, “Attuazione
boliti batterici, impedendo di fatto i pro-
della direttiva 98/83/CE relativa alla qua delle acque destinate al consumo lita
cessi
di disinfettanti e antibiotici. P. aeruginosa la seconda causa piu frequente di infee
microrganismi, quali la respirazione.
zioni nei reparti di Terapia Intensiva e una
inferiore a 100 UFC/mL. umano”, e basato Il razionale degli esperimenti si e
Un aspetto interessante del presente costituito dalla valutazione lavoro e
frequente causa di polmoniti associate ai
sulla precedente esperienza acquisita nell’uso dell’acqua ossigenata nella disin-
dei preparati saggiati nei condell’attivita uno dei fronti della Legionella, che e
fezione dei condotti idrici dei riuniti odon-
possibili contaminanti del riunito odon-
toiatrici, in particolare su precedenti lavori
toiatrico [7,8]. In Italia sono registrate
da recenti lavori [11].
eseguiti
mediamente alcune centinaia di casi di
Infine, diversi studi hanno dimostrato che
legionellosi ogni anno, ma si ritiene che sottostimato, tale numero sia in realta anche perche a volte la malattia non viene
le condotte dei riuniti odontoiatrici ven-
letale nel diagnosticata; la malattia e un 5-15% dei casi [9]. Legionella spp. e
batteri, funghi e protozoi. Alloggiati in uno
batterio ubiquitario Gram negativo aero di bio, di cui sono state identificate piu
“glicocalice”, i microrganismi risultano mici, finendo con l’esibire nella fase ses-
l’efficacia del perossido di idrogeno al 3%
colle pericolosa, cui e 50 specie; la piu gato circa il 90% dei casi di legionellosi, e
nei confronti del biofilm sessile instauratosi
L. pneumophila. Legionella deve il proprio
da 4 settimane [4]. Scopo del presente set
nome all’epidemia acuta che nell’estate del 1976 colpı un gruppo di veterani
superiore a quella esibita dallo stesso
dell’American Legion riuniti in un albergo
[3,11].
l’acqua erogata dal riunito, mentre il
presso
l’Oral
Biotechnology desti Laboratory (OBL) dell’Universita Studi di Cagliari. Infatti, in un esperimento precedente era stato possibile dimostrare l’efficacia del perossido di idrogeno al 3% e a 300 e 600 parti per milione (ppm) nei confronti di un ampio spettro microbico (micobatteri, batteri Gram positivi e Gram stata inoltre dimostrata negativi, funghi). E
di esperimenti era la valutazione dell’atti antibatterica di un preparato a base di vita
biochimici
fondamentali
per
i
ventilatori. Per le stesse ragioni esposte per Legionella, esiste una reale possibilita che Pseudomonas spp. possa contaminare i riuniti odontoiatrici, come segnalato
gono colonizzate dai microrganismi sotto contenere forma di biofilm; il biofilm puo strato di matrice organica chiamato anche protetti dall’aggressione dei germicidi chisile una resistenza all’inattivazione chi essere da 10 a 1.000 volte mica che puo microrganismo
in
fase
planctonica
perossido di idrogeno e sali d’argento
di Filadelfia, causando ben 34 morti su
verso
221 contagiati. Il range termico di prolife compreso tra 15 e razione del batterio e
2. Materiali e metodi
colare, si voleva valutare se l’aggiunta di
50 C (fino a 22 C il batterio permane ma inattivo). Il riunito odontoiatrico sembra e
2.1. Microrganismi saggiati
sali d’argento a una soluzione di acqua
essere un’apparecchiatura particolar-
In questo lavoro sono stati utilizzati
ossigenata
il
mente esposta alla contaminazione da
microrganismi a crescita aerobia o anae-
potere antibatterico rispetto alla soluzione
robi facoltativi, isolabili come contami-
nativa. Le basi sperimentali a favore
Legionella, data la presenza di un circuito instaurare il biofilm. idrico in cui si puo
dell’utilizzo dei sali d’argento quali antibat-
Inoltre, il riunito odontoiatrico produce
1. Pseudomonas aeruginosa: sono
terici sono evidenziate in diversi lavori su batteri Gram negativi e positivi, nonche
aerosol durante l’uso degli strumenti puo odontoiatrici dinamici e cio
stati saggiati due distinti ceppi di
ceppi
batterici
comunemente
riscontrati come contaminanti dei riuniti, inclusa Legionella pneumophila. In parti-
potesse
incrementarne
nanti dell’acqua in ingresso nel riunito.
P. aeruginosa, il primo (ATCC
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 97
S. Del Nero et al.
dall’American
diversi autori come indicatore biolo-
una letteratura completa sull’effica-
Type Culture Collection (ATCC), il un isolato clinico secondo (LIC1) e
gico di resistenza ai disinfettanti, in di formare quanto la possibilita
cia dei diversi disinfettanti, compreso
proveniente da una grave forma di
endospore consente al batterio di
mastite ovina. L’utilizzo di due ceppi
resistere a condizioni di vita proibi-
10. Candida albicans, ATCC 10261: stato utilizzato un ceppo provee
27853)
proveniva
il perossido di idrogeno.
era validato dalla recente descri-
tive [4]. Nel presente lavoro viene
zione in letteratura della notevole ai disinfettanti degli isorefrattarieta
utilizzato un ceppo proveniente da
dalla collezione ATCC. responsabile di gravi C. albicans e
una
commerciale
infezioni orali, in particolare nei sog-
lati clinici di Pseudomonas, in parti-
impiegata normalmente quale pro-
getti anziani o immunodepressi, e
biotico intestinale.
potrebbe rappresentare un conta-
colare se i ceppi erano presenti in
formulazione
niente
forma sessile ovvero in uno stato di
stato utiliz7. Enterococcus faecalis: e
minante retrogrado nel sistema
biofilm maturo [12]. stato utilizzato il 2. Escherichia coli: e
zato un isolato clinico da infezione descritto in endodontica (GO2), gia
di coltura dei ceppi e Le modalita
ceppo di collezione ATCC 7075.
letteratura per le potenziali capacita
3. Klebsiella pneumoniae: rappresenta
di formare biofilm in vitro e di resi-
alcune indicazioni sulle prove di sensibi ai preparati sono state eseguite conlita
stere a diversi disinfettanti orali [15].
sultando le procedure standard (NCCL
il principale microrganismo opportu-
ATCC
Committee for Clinical Laboratory
comiali; diversi autori riportano bio-
6538: responsabile di diverse infe-
Standards, http://www.clsi.org/) e il
film persistenti di K. pneumoniae nei
zioni suppurative nell’uomo, viene
testo di Koneman et al. [16].
sistemi idrici [13]. Per valutare l’effet stato tiva resistenza ai preparati e
spesso isolato nel cavo orale in por-
I ceppi batterici (eccetto Legionella) sono
tatori di protesi. Per la notevole atti catalasica viene utilizzato da vita
stati coltivati su un terreno di crescita spe€ller-Hinton agar, Microbiol, Uta, cifico (Mu
4. Salmonella enterica (sierotipo typhi), infettare isolato clinico LIC3: puo
diversi autori come indicatore biolo-
Cagliari) e fatti crescere a 37 C (E. faeca-
gico di resistenza nei composti a
il riunito tramite acqua di rete, qua-
lis in CO2 al 5%) fino alla fase di crescita stata esponenziale. L. pneumophila e
lora quest’ultima accidentalmente
base di perossidi [4]. stato utilizzato un 9. Vibrio cholerae: e
venisse contaminata da reflui prove-
isolato ambientale (acque di sca-
Extract agar (BCYE) con supplemento
nienti dalle condotte fognarie; recenti
(Microbiol, Uta, Cagliari) a 37 C, in atmo-
studi hanno individuato nel genoma il
rico di un impianto fognario); il stato identificato come ceppo e
set completo dei geni necessari per
V. cholerae attraverso sequenzia-
la strutturazione di biofilm [14].
mento del gene 16S; alle prove
caratteristiche colonie bianche. C. albi stato coltivato su un terreno di cans e
nista responsabile di infezioni noso-
utilizzato un isolato clinico (LIC2).
5. Legionella
pneumophila
subsp.
aureus,
seminata in Buffered Charcoal Yeast
sfera di CO2 al 5% fino alla comparsa delle
sierologiche risultava un sierotipo un patogeno 1. V. cholerae e
crescita specifico per i lieviti, Sabouraud
pneumophila, DSM 7513: isolata da Brenner da una fatale forma di
alimentare
Cagliari) a 37 C in aerobiosi.
polmonite; proveniva dalla German
acqua o alimenti. Nonostante i dati
Collection of Microorganisms and
epidemiologici sulla popolazione
Cell Culture (DSMZ, http://www.
italiana indichino chiaramente come
dsmz.de/).
le sporadiche infezioni siano causate
un batterio 6. Bacillus atrophaeus: e Gram positivo sporigeno; benche
98
8. Staphylococcus
idrico dei riuniti odontoiatrici [4].
trasmissibile
tramite
da sierotipi non epidemici, questo
agar o Sabouraud broth (Microbiol, Uta,
2.2. Preparati saggiati Sulla base degli esperimenti effettuati in deciso di valutare l’efficapassato [4], si e cia di due preparati a base di perossido di
non abbia alcuna corrispondenza
microrganismo rimane all’attenzione vi delle strutture sanitarie perche
con infezioni umane e tantomeno
la possibilita di rilevare sierotipi e
con le contaminazioni nei riuniti
altamente virulenti (O1-O139).
contenevano la medesima concentra testata, zione di perossido di idrogeno gia
odontoiatrici, viene utilizzato da
Contemporaneamente, non esiste
3%, cui sono state addizionate due
| DENTAL CADMOS | 2/2012
idrogeno e sali d’argento. I due preparati
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
distinte concentrazioni di ioni argento, rispettivamente
0,0005%
(5 ppm)
*
MIC (Minimum Inhibitory Concen-
1. Pseudomonas aeruginosa, ceppo ATCC 27853.
e
tration) o concentrazione minima ini-
0,001% (10 ppm). I preparati erano testati a diverse diluizioni, tal quale (3% H2O2, 5
bente: rappresenta la concentrazione minima del preparato (diluizione piu
2. Staphylococcus aureus, ATCC 6538. 3. Pool batterico cosı composto:
e 10 ppm Ag) e diluiti a 300 e 600 ppm
elevata) in grado di inibire la crescita
a. Pseudomonas aeruginosa, ATCC
(come H2O2).
27853;
batterica;
Le formulazioni addizionate con ioni
*
MBC (Minimum Bactericidal Concen-
b. Escherichia coli, ATCC 7075;
confrontate,
tration) o concentrazione minima bat-
c. Klebsiella pneumoniae, LIC2;
durante l’esperimento, con H2O2 pura a
tericida (CMB in italiano): rappresenta bassa concentrazione della forla piu
d. Salmonella
elevata) in mulazione (diluizione piu
e. Bacillus atrophaeus.
d’argento
sono
state
pari concentrazione come controllo. 2.3. Valutazione dell’attivita
grado di uccidere i batteri.
enterica
(sierotipo
typhi), LIC3. f. Enterococcus faecalis, GO2. g. Staphylococcus aureus, ATCC
antibatterica sui ceppi 2.4. Calcolo della riduzione di vitalita
in sospensione
6538. Nel pool ciascun ceppo partecipava
Per tutti i ceppi citati, a eccezione di
di un farDai protocolli in uso, l’attivita
alla sospensione con un titolo di
Legionella, sono state saggiate concen-
maco antibatterico viene valutata misu del microrganismo (MIC rando la vitalita
1,4106 UFC/mL; il titolo complessivo
trazioni scalari di ciascun preparato su una sospensione batterica pari a 106 UFC/mL. Dopo un’incubazione in
e MCB) dopo 24 e 48 ore di esposizione: deriva da procedure utilizzate negli cio
piastre multiwell da 96 pozzetti (Corning,
il tempo di antibiogrammi, dove pero
Corning, USA) per 48 ore a 37 C, in €ller-Hinton broth (Microbiol, terreno Mu stata valutata la preUta, Cagliari), e senza/assenza della crescita microbica /limpidezza del sulla base della torbidita
permanenza di un antibiotico, specie a livello sistemico, differisce notevolmente rispetto a quello di un antibatterico usato nel riunito. Il protocollo prevede l’esposizione al preparato da 0 a 40 mi-
mezzo di crescita, tramite lettura allo
nuti, a intervalli di 10 minuti, di una
spettrofotometro a una lunghezza d’onda
sospensione batterica di 1107 UFC/mL.
di
Instruments, Germany). Dalle sospen-
Aliquote della sospensione sono state €ller-Hinton agar seminate nel terreno Mu
sioni in cui si osservava completa inibi-
e sono state valutate le UFC. I valori
zione della crescita sono state allestite €llersubculture in terreno agarizzato (Mu
di UFC/mL sono stati espressi come
Hinton agar, Microbiol, Uta, Cagliari), residua per valutare l’eventuale vitalita
terica (RL) applicando la seguente
620 nm
(SLT-Spectra
IIÔ,
SLT
del microrganismo (MCB). Come gia descritto, i formulati in esame sono stati
logaritmo della riduzione della conta batformula [4]: RL ¼ LogðA=BÞ
finale era di 1107 UFC/mL. 2.5. Misura del biofilm In questo lavoro, assieme ai parametri che di un antibatterico su valutano l’attivita patogeni in forma sospesa (planctonica), abbiamo introdotto una nuova misura, definita
Minimum
Biofilm
Eliminating
Concentration (MBEC) [17]. In queste condizioni la MBEC rappresenta la piu bassa concentrazione di disinfettante elevata) in grado di inibire (diluizione piu la strutturazione a biofilm. L’inibizione del stata valutata per i due ceppi di biofilm e P. aeruginosa e per E. faecalis dopo 7 giorni di incubazione in piastre multiwell, utilizzando la stessa procedura di crescita per le prove in sospensione tramite il metodo di Lehtola et al. modificato [18].
saggiati a concentrazioni seriali, secondo la diluilo schema (D = 1/2X), dove D e
ove A = UFC/mL nel campione inoculato e B = UFC/mL nel campione prelevato.
2.6. Valutazione dell’attivita
zione e X rappresenta un numero intero
Sono state valutate le seguenti concen-
inibitoria su Legionella pneumophila
tra 1 e 10. Per ciascuna formulazione
trazioni di H2O2 dei preparati: 600 ppm,
sono state valutate la concentrazione
300 ppm, 3% (solo nel pool batterico).
dei terreni e dei tempi di Le peculiarita
minima inibente (MIC) e la concentrazione
Le combinazioni dei microrganismi sono
crescita di L. pneumophila hanno imposto
minima battericida (MBC):
state le seguenti.
una procedura differente nella valutazione
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 99
S. Del Nero et al.
stato inibitoria dei preparati. E dell’attivita
di inibizione della crescita microbica e
concentrazione di H2O2 comunemente
utilizzato il metodo della diffusione in agar
misurata dal diametro, in millimetri, del
usata nel riunito odontoiatrico per la disin-
di Kirby-Bauer [15]. 10 mL di ciascuna
suddetto alone circolare.
fezione in continuo (600 ppm). I dati ripor tati nelle tabelle I e II indicano attivita
3. Risultati
inibente e battericida compresa fino alle
diluizione del preparato in esame sono stati deposti su dischetto di carta assor-
diluizioni 1/26 e 1/210, corrispondenti ai
bente, diametro pari a 6 mm (Kairosafe, Trieste), contenuto in una piastra di
dei preparati sui ceppi 3.1. Attivita
preparati diluiti, rispettivamente, 64 e
BCYE, previamente seminata in superficie
in sospensione
2.048 volte, pari a un intervallo di concen-
con una sospensione di 106 UFC/mL di veniva valutata L. pneumophila. L’attivita in base alla presenza/assenza di un alone
I valori delle MIC e delle MBC indicano ben al di sotto della livelli di attivita
trazione compreso tra 468 e 14,6 ppm di H2O2. In base ai risultati esposti si puo inoltre affermare che:
Tabella I Minima concentrazione inibente (MIC) (massima diluizione attiva) Preparato saggiato Ceppo
H2O2
H2O2+[Ag+] 5 ppm
H2O2+[Ag+] 10 ppm
1
P. aeruginosa (ATCC 27853)
1/512
1/512
1/512
2
P. aeruginosa (LIC1)
1/512
1/512
1/512
3
Escherichia coli
1/512
1/512
1/512
4
Klebsiella pneumoniae
1/256
1/256
1/256
5
Salmonella enterica
1/512
1/512
1/512
6
Staphylococcus aureus
1/256
1/512
1/512
7
Bacillus atrophaeus
1/256
1/256
1/256
8
Enterococcus faecalis
1/256
1/256
1/256
9
Vibrio cholerae
1/2.048
1/1.024
1/1.024
10
Candida albicans
1/64
1/64
1/64
Legenda: 1/2.048 = 24 ppm H2O2; 1/512 = 59 ppm H2O2; 1/256 = 117,1 ppm H2O2; 1/64 = 468,7 ppm H2O2.
Tabella II Minima concentrazione battericida (MCB) (massima diluizione attiva) Preparato saggiato Ceppo
H2O2
H2O2+[Ag+] 5 ppm
H2O2+[Ag+] 10 ppm
1
P. aeruginosa (ATCC 27853)
1/512
1/512
1/512
2
P. aeruginosa (LIC1)
1/512
1/512
1/512
3
Escherichia coli
1/512
1/512
1/512
4
Klebsiella pneumoniae
1/256
1/256
1/256
5
Salmonella enterica
1/512
1/512
1/512
6
Staphylococcus aureus
1/256
1/512
1/512
7
Bacillus atrophaeus
1/256
1/256
1/256
8
Enterococcus faecalis
1/256
1/256
1/256
9
Vibrio cholerae
1/2.048
1/1.024
1/1.024
10
Candida albicans
1/64
1/64
1/64
Legenda: 1/2.048 = 24 ppm H2O2; 1/512 = 59 ppm H2O2; 1/256 = 117,1 ppm H2O2; 1/64 = 468,7 ppm H2O2.
100
| DENTAL CADMOS | 2/2012
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
*
MIC e MBC coincidono per ciascun
[(Fig._1)TD$IG]Fig. 1
ceppo e per ciascuna diluizione; *
eccetto che per S. aureus e Vibrio cholerae, non si rilevano differenze tra assenza o aggiunta di Ag (fig. 1).
3.2. Calcolo della riduzione della conta batterica *
Pseudomonas aeruginosa, ATCC 27853.
Alla
concentrazione
di
300 ppm di H2O2 non si ottiene una diminuzione significativa della vitalita del ceppo (massimo 2 log a 40 minuti) anti(fig. 2a); un aumento dell’attivita batterica si osserva a 600 ppm di
[(Fig._2a,b)TD$IG]Fig. 2a,b
H2O2, indipendentemente dalla concentrazione di argento (fig. 2a,b). *
Staphylococcus aureus, ATCC 6538. La scelta del batterio Gram positivo stata dettata dal fatto che S. aureus e discusso, esso rappresenta, come gia un buon indicatore biologico per l’atti dei disinfettanti a base di perossidi. vita essere In aggiunta, il ceppo puo responsabile di gravi infezioni nosocomiali, per esempio i ceppi meticillinoresistenti [16]. Come per le MIC e le MBC, la differenza nella riduzione della tra assenza o presenza di vitalita apprezzabile (fig. 3a,b). argento e
[(Fig._3a,b)TD$IG]Fig. 3a,b
3.3. Pool batterico antibatterica risulta perossido e L’attivita argento-dipendente. Alla concentrazione di H2O2 a 600 ppm (fig. 4a-c) l’aumento
Fig. 1 Densita ottica di una sospensione di S. aureus cresciuto a differenti diluizioni di H2O2 con e senza argento Fig. 2a,b Riduzione della conta batterica in P. aeruginosa, ATCC 27853 Fig. 3a,b Riduzione della conta batterica in S. aureus, ATCC 6538
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 101
S. Del Nero et al.
antibatterica dovuta all’incredi attivita evidente, tuttavia alle mento di [Ag+] e
[(Fig._4a-c)TD$IG]Fig. 4a-c
concentrazioni di H2O2 a 300 ppm e al dovuta alla concen3% prevale l’attivita trazione del perossido. La concentrazione di H2O2 al 3%, come indicato in altra pubblicazione [4], risulta estremamente attiva nei confronti del pool batterico. 3.4. Valutazione dell’attivita inibitoria su Legionella pneumophila Come
gia
esposto
nel
paragrafo
antibatterica “Materiali e metodi”, l’attivita stata dei preparati su L. pneumophila e valutata tramite il metodo della diffusione in agar di Kirby-Bauer. Le diluizioni minime attive (alone di inibizione > 0) sono state di 117 ppm per i formulati
[(Fig._5)TD$IG]Fig. 5
con argento e di 59 ppm per il perossido puro (fig. 5). antibiofilm 3.5. Attivita La misura del biofilm, formatosi dopo 7 giorni di incubazione in presenza del disinfettante, ha mostrato i risultati esposti qui di seguito. 3.5.1. Ceppi di Pseudomonas aeruginosa La Minimum Biofilm Inhibitory Concen pari a 1/29, ovvero al fortration (MBIC) e mulato diluito 512 volte (fig. 6). A dosi subinibitorie del principio attivo (fig. 6)
Fig. 4a-c Riduzione della conta batterica in un pool di sette differenti specie batteriche Fig. 5 L. pneumophila: misura degli aloni di inibizione dopo 4 giorni di crescita in presenza dei disinfettanti a base di H2O2 Fig. 6 Studio dell’inibizione del biofilm con H2O2 utilizzando due stipiti di P. aeruginosa
102
| DENTAL CADMOS | 2/2012
[(Fig._6)TD$IG]Fig. 6
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
[Ag+] a 5 ppm al disinfettante con
[(Fig._7)TD$IG]Fig. 7
[Ag+] a 10 ppm.
4. Discussione I risultati sopra esposti evidenziano, in generale, un potenziamento dell’attivita antibatterica del perossido di idrogeno con sali d’argento, rispetto al formulato contenente il solo perossido. In particolare, l’aggiunta di argento in S. aureus coltivato in sospensione sposta di un valore di diluizione la MIC e la MBC; cio potrebbe essere dovuto alla capacita Fig. 7 Diminuzione della velocita di formazione del biofilm di un isolato clinico di P. aeruginosa sottoposto a disinfettanti a base di H2O2 con diverse concentrazioni di argento
dell’insieme Ag + H2O2 di contrastare l’effetto delle catalasi prodotte dal batterio tramite una maggiore formazione di
l’isolato clinico (LIC1) ha un’attitudine a
3.5.2. Ceppo di Enterococcus
formare biofilm 4 volte superiore rispetto
faecalis
al ceppo di collezione ATCC 27853. risulta potenziata in presenza di L’attivita
In E. faecalis (fig. 8a,b) la riduzione della di formazione del biofilm risulta velocita
Non si rilevano differenze tra le due con-
argento, intorno a 3 volte rispetto al
argento-dipendente e diminuisce di
La riduzione della conta batterica nel
perossido senza aggiunte (fig. 7).
3 volte passando dal preparato con
tempo mostra comportamenti estrema-
radicali H-O, dovuta all’azione catalitica dell’argento sul perossido di idrogeno. centrazioni di argento saggiate (fig. 1).
mente differenti a seconda del microrganismo saggiato, per esempio se si tratta [(Fig._8a,b)TD$IG]Fig. 8a,b
di un Gram positivo o negativo, oppure se i preparati vengono saggiati su sospensioni mono o polimicrobiche. In P. aeruginosa, una riduzione di 5 log si osserva dopo 30 minuti di esposizione con i preparati contenenti H2O2 a 600 ppm. In questo esperimento la presenza di Ag non sembra determinante batnell’influenzare la riduzione di vitalita terica; al contrario, svolge un ruolo decisivo la concentrazione del perossido di idrogeno (fig. 2a,b). Invece, per S. aureus, diversamente dai risultati ottenuti per P. aeruginosa, il ruolo dell’argento e determinante: il perossido puro presenta una riduzione di 5 log solo a 600 ppm dopo 40 minuti di esposizione. A
Fig. 8a,b Quantita di biofilm (a) e diminuzione della velocita di formazione del biofilm (b) di un isolato clinico di E. faecalis sottoposto a disinfettanti a base di H2O2 con diversi preparati
300 ppm risultano efficaci soltanto i preparati con Ag: complessivamente,
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 103
S. Del Nero et al.
l’aggiunta di questo elemento riduce i di almeno 10-15 minuti; tempi di attivita
disinfezione
in
continuo
nei
riuniti
e proporzionale entro 20 minuti l’attivita
voluta sagIn questo lavoro, inoltre, si e dei preparati nei confronti di giare l’attivita
(600 ppm).
inibitoria del perossido di idroall’attivita geno con le differenti concentrazioni osservare che la fund’argento. Si puo
Una situazione come quella simulata con improbabile in un riunito il pool batterico e
un ceppo di L. pneumophila; i dati di let-
zione dell’argento nell’inibire la forma intorno a 3 volte rispetto zione di biofilm e
teratura sulla presenza del patogeno nei
al perossido senza aggiunte.
verificarsi (fig. 4a-c); potrebbero pero
riuniti, e sul possibile rischio di contami-
L’isolato clinico (GO2) di E. faecalis
rare situazioni di pluricontaminazione
nazione in ambiente odontoiatrico, risul-
mostra un andamento paragonabile a
dovute a:
tano scarsi e incompleti, in particolare per dei disinfettanti, quanto riguarda l’attivita
quello osservato per P. aeruginosa.
alla sua concentrazione (fig. 3a,b).
*
distacco di biofilm da grossi serbatoi
Come
evidenziato
nei
grafici
della
di forfigura 8, la riduzione della velocita
contaminazioni accidentali da rete
Nel presente lavoro si evidenza un buon del perossido in tutte le range di attivita
fognaria.
formulazioni saggiate. Considerando che
Ag+ a 5 ppm e a ben 6 volte con Ag+ a
la concentrazione di esercizio in continuo di 600 ppm, un possibile rilanel riunito e
10 ppm.
eccezionale indicatore biologico; in situazioni estreme le diverse specie sono in
scio di tale microrganismo nel sistema
grado di mettere in atto un complesso
idrico del riunito, con successiva coloniz-
network protettivo capace di contrastare
zazione delle tubature, dovrebbe essere,
efficacemente l’azione dei disinfettanti. evidenziato Un aspetto di quest’azione e
secondo i dati esposti, insolito (fig. 5). mostrato nei risultati, l’attivita Come gia
Tutti gli esperimenti eseguiti confermano
nella figura 4a, dove il perossido di idro-
antibiofilm risulta ceppo e clone-dipen-
geno a 300 ppm risulta debolmente attivo e in un range di esposizione di 50 minuti
dente; in particolare, mostra range di atti differenti se si considerano ceppi di vita
nei confronti dei diversi ceppi batterici saggiati, cosı com’era stato dimostrato
non si osservano variazioni dovute alla
laboratorio o isolati clinici.
gruppo [4].
presenza di argento. L’utilizzo del peros-
Il comportamento di P. aeruginosa nella
Nell’insieme, gli esperimenti con diversi
sido a 600 ppm cambia lo scenario ed
formazione di biofilm a dosi subinibitorie completadi perossido di idrogeno e
patogeni evidenziano un effetto dose-
idrici siti a monte del riunito; *
Inoltre, il pool batterico rappresenta un
mazione del biofilm si attesta a 3 volte con
5. Conclusioni
l’efficacia del perossido di idrogeno
in un precedente lavoro del nostro
mente diversa con i due ceppi saggiati.
dipendente per quanto riguarda la concentrazione di ioni argento, a parita
sono paragonabili a quelli ottenuti con
Mentre il ceppo di collezione viene inibito
di concentrazione del perossido di
Pseudomonas spp., con una riduzione
anche a diluizioni molto elevate di peros-
idrogeno.
di 5 log a 40 minuti in presenza di Ag
sido, l’isolato clinico mostra, alle stesse
significativi appaiono quelli di I risultati piu
(fig. 4b).
concentrazioni, una spiccata tendenza a
seguito elencati.
voluta In queste condizioni estreme si e valutare anche l’attivita del perossido di
formare un biofilm misurabile; in tali con dizioni (assenza di argento) la MBIC e
*
evidenzia una differente e maggiore atti in presenza di argento: i risultati vita
9
Pool batterico (fig. 4b). A 40 minuti, con il solo perossido di idrogeno a
idrogeno al 3%, per verificare se si potes-
pari a 1/2 , ovvero al formulato diluito
600 ppm, si ottiene una riduzione della
sero osservare riduzioni nei tempi di
512 volte (fig. 6). La fig. 6 evidenzia le rette di regressione indicanti la velocita
conta batterica totale pari a circa
di formazione del biofilm man mano che
con i preparati contenenti perossido
sizione, indipendentemente dalla con-
diminuisce la concentrazione del princi-
di idrogeno e argento la riduzione
centrazione di Ag. Dai risultati esposti in
pio attivo. L’isolato clinico (LIC1) presenta
questo paragrafo sul calcolo della ridu-
un incremento in biofilm di circa 4 volte
ammonta a 5 log. In termini pratici, significa che in un riunito in cui circio
zione della conta batterica, il vantaggio evidel ricorso ai composti d’argento e
rispetto al ceppo di collezione ATCC
colano diluizioni del preparato di peros-
27853. In una seconda prova (fig. 7), l’iso stato sottoposto lato clinico (LIC1) e
sido di idrogeno e argento alle concen-
esposizione. La fig. 4c evidenzia una a 10 minuti di esporiduzione di 7 log gia
dente alla concentrazione usata per la
104
| DENTAL CADMOS | 2/2012
2-3 log rispetto al valore iniziale, mentre
trazioni, rispettivamente, di 600 ppm
come H2O2 e che viene lasciato fermo per un tempo di 40 minuti, si realizza la una riduzione della disinfezione, cioe conta batterica paragonabile a quanto si ottiene di solito con il solo perossido di idrogeno al 3% in 10 minuti. Questo rappresenta una grande sicurezza per gli utilizzatori del riunito: i preparati contenenti perossido di idrogeno e argento non si limitano a realizzare la batteriostasi, ma determinano una riduzione del titolo batterico tale da configurarsi come disinfezione. *
Legionella pneumophila. Alle concentrazioni saggiate, il perossido di idrogeno si dimostra attivo nei confronti di un risultato L. pneumophila. Questo e molto interessante in considerazione della
*
scarsa
letteratura
esistente
sull’argomento [19]. antibiofilm. Dal momento che Attivita dalla letteratura risulta evidente come i condotti idrici del riunito vengano colonizzati dal biofilm, il risultato di questa porzione degli esperimenti appare estremamente interessante. Entrambi i set di esperimenti eseguiti su P. aeruginosa ed E. faecalis evidenziano come il biofilm esposto ai preparati contenenti argento presenti una di ricrescita decisamente infevelocita riore, una volta che il disinfettante e stato rimosso, rispetto al biofilm esposto al solo perossido di idrogeno. Anche tale risultato si traduce in un aspetto pratico importante: la presenza di ioni argento inibisce la ricre di scita del biofilm nel lume dei tubi piu quanto faccia il solo perossido di idrogeno.
Conflitto di interessi Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.
Finanziamento dello studio stato finanziato da CEFLA Lo studio e S.C. Bibliografia 1. Walker JT, Bradshaw DJ, Bennett AM, Fulford MR, Martin MV, Marsh PD. Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol 2000;66(8):3363–7. 2. Barbeau J, Tanguay R, Faucher E, Avezard C, Trudel L, C^ote L, et al. Multiparametric analysis of waterline contamination in dental units. Appl Environ Microbiol 1996;62(11):3954–9. 3. Kohn WG, Harte JA, Malvitz DM, Collins AS, Cleveland JL, Eklund KJ. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for infection control in dental health care settings—2003. J Am Dent Assoc 2004;135(1):33–47. 4. Orru G, Del Nero S, Tuveri E, Laura Ciusa M, Pilia F, Erriu M, et al. Evaluation of antimicrobial-antibiofilm activity of a hydrogen peroxide decontaminating system used in dental unit water lines. Open Dent J 2010;4:140–6. 5. Syed MA, Babar S, Bhatti AS, Bokhari H. Antibacterial effects of silver nanoparticles on the bacterial strains isolated from catheterized urinary tract infection cases. J Biomed Nanotechnol 2009;5(2):209–14. 6. Miola M, Ferraris S, Di Nunzio S, Robotti PF, Bianchi G, Fucale G, et al. Surface silver-doping of biocompatible glasses to induce antibacterial properties. Part II: Plasma sprayed glass-coatings. J Mater Sci Mater Med 2009;20(3):741–9. 7. Challacombe SJ, Fernandes LL. Detecting Legionella pneumophila in water systems: a comparison of various dental units. J Am Dent Assoc 1995;126(5):603–8. 8. Atlas RM, Williams JF, Huntington MK. Legionella contamination of dental-unit waters. Appl Environ Microbiol 1996;62(4):1491. 9. Napoli C, Fasano F, Iatta R, Barbuti G, Cuna T, Montagna MT. Legionella spp. and legionellosis in Southeastern Italy: disease epidemiology and environmental surveillance in community and health care facilities. BMC Public Health 2010;10:660. 10. Veronesi L, Capobianco E, Affanni P, Pizzi S, Vitali P, Tanzi ML. Legionella contamination in the water system of hospital dental settings. Acta Biomed 2007;78(2):117–22. 11. Barben J, Schmid J. Dental units as infection sources of Pseudomonas aeruginosa. Eur Respir J 2008;32(4):1122–3. 12. Saitou K, Furuhata K, Kawakami Y, Fukuyama M. Biofilm formation abilities and disinfectantresistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from cockroaches captured in hospitals. Biocontrol Sci 2009;14(2):65–8.
13. Barreto S, Zambrano M, Araque M. Phenotypic variations of susceptibility in Klebsiella pneumoniae strains of nosocomial origin and their association with biofilm formation. Invest Clin 2009; 50(2):221–9. 14. Boddicker JD, Ledeboer NA, Jagnow J, Jones BD, Clegg S. Differential binding to and biofilm formation on, HEp-2 cells by Salmonella enterica serovar Typhimurium is dependent upon allelic variation in the fimH gene of the fim gene cluster. Mol Microbiol 2002;45(5):1255–65. 15. Denotti G, Piga R, Montaldo C, Erriu M, Pilia F, Piras A, et al. In vitro evaluation of Enterococcus faecalis adhesion on various endodontic medicaments. Open Dent J 2009;3:120–4. 16. Koneman EW, Allen SD, Janda WM. Introduzione alla microbiologia diagnostica. Roma: Delfino Antonio, 1996. 17. Sepandj F, Ceri H, Gibb A, Read R, Olson M. Minimum inhibitory concentration (MIC) versus minimum biofilm eliminating concentration (MBEC) in evaluation of antibiotic sensitivity of Gramnegative bacilli causing peritonitis. Perit Dial Int 2004;24(1):65–7. 18. Lehtola MJ, Pitk€anen T, Miebach L, Miettinen IT. Survival of Campylobacter jejuni in potable water biofilms: a comparative study with different detection methods. Water Sci Technol 2006; 54(3):57–61. 19. Shimizu I, Isshiki Y, Nomura H, Sakuda K, Sakuma K, Kondo S. The antibacterial activity of fragrance ingredients against Legionella pneumophila. Biol Pharm Bull 2009;32(6):1114–7.
PREVENZIONE DELLE INFEZIONI
Attivit a antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Ricevuto il 16 maggio 2011 Accettato il 12 settembre 2011 Disponibile online 30 novembre 2011 *Autore di riferimento: Germano Orru` [email protected]
Antibacterial activity of two products containing hydrogen peroxide and silver salts b,* S. Del Neroa, G. Marcheseb, D. Mandasb, M. Liciardic, G. Denottib, G. Orru a
CEFLA Dental Group, Imola, Bologna degli Studi di Cagliari, Oral Biotechnology Laboratory (OBL), Dipartimento di Chirurgia e Universita Scienze Odontostomatologiche (Direttore: prof. V. Piras) c Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Dipartimento di Cagliari (Responsabile: dott. M. Liciardi) b
Riassunto Obiettivi. E stata valutata la funzione antibiofilm e l’attivita antibatterica del perossido di idrogeno, come tale e dopo aggiunta di sali d’argento. Materiali e metodi. Un esteso set di microrganismi e stato valutato, in forma sia planctonica sia sessile (biofilm), attraverso metodiche standard e innovative per la valutazione dell’attivita antibatterica di: 1) H2O2 a 300 e 600 ppm (parti per milione) e al 3%; 2) le stesse varianti con l’aggiunta di Ag+ alla concentrazione di 5 e 10 ppm. Risultati. Tutti i microrganismi in esame venivano inibiti a concentrazioni inferiori a quelle normalmente utilizzate nei riuniti odontoiatrici – Minimum Inhibitory Concentration (MIC) < 600 ppm – inclusi alcuni patogeni nosocomiali come Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Conclusioni. I preparati con i sali d’argento hanno evidenziato una spiccata attivita di inibizione verso il biofilm rispetto al controllo negativo (H2O2 senza aggiunta di ioni Ag+). Parole chiave: * Biofilm * Disinfezione delle condotte idriche del riunito * Ioni argento * Legionella pneumophila * Perossido di idrogeno
1. Introduzione
Abstract Objectives. The purpose of this study was to examine the antibiofilm and the antibacterial activity efficacy of H2O2 alone and combined with silver salts. Materials and methods. We used standard and innovative methods to assess the antibacterial effects of (i) H2O2 at 300 e 600 ppm (parts per million), and at 3%; (ii) the same H2O2 concentrations with the addition of Ag+ salts at 5 and 10 ppm, against a large number of microorganisms, in planctonic and sessile (biofilm) forms. Results. All of the microorganisms tested (including some nosocomial pathogens, such as Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa) were inhibited at concentrations lower than those commonly used in dental unit waterlines (MIC < 600 ppm) Conclusions. H2O2 with silver salts displayed greater antibiofilm efficacy than the negative control (H2O2 without silver ions). Keywords: * Biofilm * Dental unit waterline (DUWL) disinfection * Silver ions * Legionella pneumophila * Hydrogen peroxide
riportati casi di riuniti odontoiatrici che,
legati ai microrganismi presenti nell’ac-
privi di sistemi di decontaminazione,
qua erogata dal riunito odontoiatrico, la
noto, il riunito odontoiatrico e Com’e
erogavano acqua contenente alti titoli di
presenza in essa di alti numeri di pato-
un’apparecchiatura particolarmente
5
microrganismi, anche nell’ordine di 10
geni genera preoccupazione. Esporre i
esposta alla contaminazione da parte di
formanti colonie (UFC)/mL [1,2]. unita
microrganismi provenienti dall’acqua di
Sebbene non esistano evidenze epide-
pazienti o il personale odontoiatrico ad microbiologica, acqua di scarsa qualita
rete o dal paziente. In letteratura sono
miologiche circa problemi di salute
nonostante
96
| DENTAL CADMOS | 2/2012
la
mancanza
di
effetti
0011-8524/5 - see front matter Ó 2011 Elsevier Srl. Tutti i dirtti riservati. doi: 10.1016/j.cadmos.2011.09.007
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
in contraddidocumentati sulla salute, e
paragosporigeni. L’effetto battericida e
contribuire alla diffusione aerea degli
zione con i principi universalmente
nabile a quello svolto da altri metalli, ma per l’uomo che senza l’elevata tossicita
agenti
[3]. L’American Dentists Association
invece caratterizza i metalli pesanti: cio
sione dell’infezione, in modo particolare
(ADA) nel 1995 ha stabilito un limite
consente una buona differenza tra con-
fra i pazienti immunocompromessi [10].
superiore pari a 200 UFC/mL per
centrazione antibatterica e concentra antibatterica zione tossica [5,6]. L’attivita
Parallelamente, Pseudomonas spp. pre-
accettati per il controllo delle infezioni
patogeni,
che
nel
caso
di
la prevalente via di trasmisLegionella, e
conteggio delle colonie a 22 C per
attribuibile alla tendenza dell’Ag a fore
senta numerosi determinanti di patogeni nel proprio genoma, inclusa la cita
l’acqua potabile in bottiglia, stabilito dal
mare stabili legami con i principali meta-
di resistere a innumerevoli tipi capacita
D.L. 2 febbraio 2001, n. 31, “Attuazione
boliti batterici, impedendo di fatto i pro-
della direttiva 98/83/CE relativa alla qua delle acque destinate al consumo lita
cessi
di disinfettanti e antibiotici. P. aeruginosa la seconda causa piu frequente di infee
microrganismi, quali la respirazione.
zioni nei reparti di Terapia Intensiva e una
inferiore a 100 UFC/mL. umano”, e basato Il razionale degli esperimenti si e
Un aspetto interessante del presente costituito dalla valutazione lavoro e
frequente causa di polmoniti associate ai
sulla precedente esperienza acquisita nell’uso dell’acqua ossigenata nella disin-
dei preparati saggiati nei condell’attivita uno dei fronti della Legionella, che e
fezione dei condotti idrici dei riuniti odon-
possibili contaminanti del riunito odon-
toiatrici, in particolare su precedenti lavori
toiatrico [7,8]. In Italia sono registrate
da recenti lavori [11].
eseguiti
mediamente alcune centinaia di casi di
Infine, diversi studi hanno dimostrato che
legionellosi ogni anno, ma si ritiene che sottostimato, tale numero sia in realta anche perche a volte la malattia non viene
le condotte dei riuniti odontoiatrici ven-
letale nel diagnosticata; la malattia e un 5-15% dei casi [9]. Legionella spp. e
batteri, funghi e protozoi. Alloggiati in uno
batterio ubiquitario Gram negativo aero di bio, di cui sono state identificate piu
“glicocalice”, i microrganismi risultano mici, finendo con l’esibire nella fase ses-
l’efficacia del perossido di idrogeno al 3%
colle pericolosa, cui e 50 specie; la piu gato circa il 90% dei casi di legionellosi, e
nei confronti del biofilm sessile instauratosi
L. pneumophila. Legionella deve il proprio
da 4 settimane [4]. Scopo del presente set
nome all’epidemia acuta che nell’estate del 1976 colpı un gruppo di veterani
superiore a quella esibita dallo stesso
dell’American Legion riuniti in un albergo
[3,11].
l’acqua erogata dal riunito, mentre il
presso
l’Oral
Biotechnology desti Laboratory (OBL) dell’Universita Studi di Cagliari. Infatti, in un esperimento precedente era stato possibile dimostrare l’efficacia del perossido di idrogeno al 3% e a 300 e 600 parti per milione (ppm) nei confronti di un ampio spettro microbico (micobatteri, batteri Gram positivi e Gram stata inoltre dimostrata negativi, funghi). E
di esperimenti era la valutazione dell’atti antibatterica di un preparato a base di vita
biochimici
fondamentali
per
i
ventilatori. Per le stesse ragioni esposte per Legionella, esiste una reale possibilita che Pseudomonas spp. possa contaminare i riuniti odontoiatrici, come segnalato
gono colonizzate dai microrganismi sotto contenere forma di biofilm; il biofilm puo strato di matrice organica chiamato anche protetti dall’aggressione dei germicidi chisile una resistenza all’inattivazione chi essere da 10 a 1.000 volte mica che puo microrganismo
in
fase
planctonica
perossido di idrogeno e sali d’argento
di Filadelfia, causando ben 34 morti su
verso
221 contagiati. Il range termico di prolife compreso tra 15 e razione del batterio e
2. Materiali e metodi
colare, si voleva valutare se l’aggiunta di
50 C (fino a 22 C il batterio permane ma inattivo). Il riunito odontoiatrico sembra e
2.1. Microrganismi saggiati
sali d’argento a una soluzione di acqua
essere un’apparecchiatura particolar-
In questo lavoro sono stati utilizzati
ossigenata
il
mente esposta alla contaminazione da
microrganismi a crescita aerobia o anae-
potere antibatterico rispetto alla soluzione
robi facoltativi, isolabili come contami-
nativa. Le basi sperimentali a favore
Legionella, data la presenza di un circuito instaurare il biofilm. idrico in cui si puo
dell’utilizzo dei sali d’argento quali antibat-
Inoltre, il riunito odontoiatrico produce
1. Pseudomonas aeruginosa: sono
terici sono evidenziate in diversi lavori su batteri Gram negativi e positivi, nonche
aerosol durante l’uso degli strumenti puo odontoiatrici dinamici e cio
stati saggiati due distinti ceppi di
ceppi
batterici
comunemente
riscontrati come contaminanti dei riuniti, inclusa Legionella pneumophila. In parti-
potesse
incrementarne
nanti dell’acqua in ingresso nel riunito.
P. aeruginosa, il primo (ATCC
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 97
S. Del Nero et al.
dall’American
diversi autori come indicatore biolo-
una letteratura completa sull’effica-
Type Culture Collection (ATCC), il un isolato clinico secondo (LIC1) e
gico di resistenza ai disinfettanti, in di formare quanto la possibilita
cia dei diversi disinfettanti, compreso
proveniente da una grave forma di
endospore consente al batterio di
mastite ovina. L’utilizzo di due ceppi
resistere a condizioni di vita proibi-
10. Candida albicans, ATCC 10261: stato utilizzato un ceppo provee
27853)
proveniva
il perossido di idrogeno.
era validato dalla recente descri-
tive [4]. Nel presente lavoro viene
zione in letteratura della notevole ai disinfettanti degli isorefrattarieta
utilizzato un ceppo proveniente da
dalla collezione ATCC. responsabile di gravi C. albicans e
una
commerciale
infezioni orali, in particolare nei sog-
lati clinici di Pseudomonas, in parti-
impiegata normalmente quale pro-
getti anziani o immunodepressi, e
biotico intestinale.
potrebbe rappresentare un conta-
colare se i ceppi erano presenti in
formulazione
niente
forma sessile ovvero in uno stato di
stato utiliz7. Enterococcus faecalis: e
minante retrogrado nel sistema
biofilm maturo [12]. stato utilizzato il 2. Escherichia coli: e
zato un isolato clinico da infezione descritto in endodontica (GO2), gia
di coltura dei ceppi e Le modalita
ceppo di collezione ATCC 7075.
letteratura per le potenziali capacita
3. Klebsiella pneumoniae: rappresenta
di formare biofilm in vitro e di resi-
alcune indicazioni sulle prove di sensibi ai preparati sono state eseguite conlita
stere a diversi disinfettanti orali [15].
sultando le procedure standard (NCCL
il principale microrganismo opportu-
ATCC
Committee for Clinical Laboratory
comiali; diversi autori riportano bio-
6538: responsabile di diverse infe-
Standards, http://www.clsi.org/) e il
film persistenti di K. pneumoniae nei
zioni suppurative nell’uomo, viene
testo di Koneman et al. [16].
sistemi idrici [13]. Per valutare l’effet stato tiva resistenza ai preparati e
spesso isolato nel cavo orale in por-
I ceppi batterici (eccetto Legionella) sono
tatori di protesi. Per la notevole atti catalasica viene utilizzato da vita
stati coltivati su un terreno di crescita spe€ller-Hinton agar, Microbiol, Uta, cifico (Mu
4. Salmonella enterica (sierotipo typhi), infettare isolato clinico LIC3: puo
diversi autori come indicatore biolo-
Cagliari) e fatti crescere a 37 C (E. faeca-
gico di resistenza nei composti a
il riunito tramite acqua di rete, qua-
lis in CO2 al 5%) fino alla fase di crescita stata esponenziale. L. pneumophila e
lora quest’ultima accidentalmente
base di perossidi [4]. stato utilizzato un 9. Vibrio cholerae: e
venisse contaminata da reflui prove-
isolato ambientale (acque di sca-
Extract agar (BCYE) con supplemento
nienti dalle condotte fognarie; recenti
(Microbiol, Uta, Cagliari) a 37 C, in atmo-
studi hanno individuato nel genoma il
rico di un impianto fognario); il stato identificato come ceppo e
set completo dei geni necessari per
V. cholerae attraverso sequenzia-
la strutturazione di biofilm [14].
mento del gene 16S; alle prove
caratteristiche colonie bianche. C. albi stato coltivato su un terreno di cans e
nista responsabile di infezioni noso-
utilizzato un isolato clinico (LIC2).
5. Legionella
pneumophila
subsp.
aureus,
seminata in Buffered Charcoal Yeast
sfera di CO2 al 5% fino alla comparsa delle
sierologiche risultava un sierotipo un patogeno 1. V. cholerae e
crescita specifico per i lieviti, Sabouraud
pneumophila, DSM 7513: isolata da Brenner da una fatale forma di
alimentare
Cagliari) a 37 C in aerobiosi.
polmonite; proveniva dalla German
acqua o alimenti. Nonostante i dati
Collection of Microorganisms and
epidemiologici sulla popolazione
Cell Culture (DSMZ, http://www.
italiana indichino chiaramente come
dsmz.de/).
le sporadiche infezioni siano causate
un batterio 6. Bacillus atrophaeus: e Gram positivo sporigeno; benche
98
8. Staphylococcus
idrico dei riuniti odontoiatrici [4].
trasmissibile
tramite
da sierotipi non epidemici, questo
agar o Sabouraud broth (Microbiol, Uta,
2.2. Preparati saggiati Sulla base degli esperimenti effettuati in deciso di valutare l’efficapassato [4], si e cia di due preparati a base di perossido di
non abbia alcuna corrispondenza
microrganismo rimane all’attenzione vi delle strutture sanitarie perche
con infezioni umane e tantomeno
la possibilita di rilevare sierotipi e
con le contaminazioni nei riuniti
altamente virulenti (O1-O139).
contenevano la medesima concentra testata, zione di perossido di idrogeno gia
odontoiatrici, viene utilizzato da
Contemporaneamente, non esiste
3%, cui sono state addizionate due
| DENTAL CADMOS | 2/2012
idrogeno e sali d’argento. I due preparati
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
distinte concentrazioni di ioni argento, rispettivamente
0,0005%
(5 ppm)
*
MIC (Minimum Inhibitory Concen-
1. Pseudomonas aeruginosa, ceppo ATCC 27853.
e
tration) o concentrazione minima ini-
0,001% (10 ppm). I preparati erano testati a diverse diluizioni, tal quale (3% H2O2, 5
bente: rappresenta la concentrazione minima del preparato (diluizione piu
2. Staphylococcus aureus, ATCC 6538. 3. Pool batterico cosı composto:
e 10 ppm Ag) e diluiti a 300 e 600 ppm
elevata) in grado di inibire la crescita
a. Pseudomonas aeruginosa, ATCC
(come H2O2).
27853;
batterica;
Le formulazioni addizionate con ioni
*
MBC (Minimum Bactericidal Concen-
b. Escherichia coli, ATCC 7075;
confrontate,
tration) o concentrazione minima bat-
c. Klebsiella pneumoniae, LIC2;
durante l’esperimento, con H2O2 pura a
tericida (CMB in italiano): rappresenta bassa concentrazione della forla piu
d. Salmonella
elevata) in mulazione (diluizione piu
e. Bacillus atrophaeus.
d’argento
sono
state
pari concentrazione come controllo. 2.3. Valutazione dell’attivita
grado di uccidere i batteri.
enterica
(sierotipo
typhi), LIC3. f. Enterococcus faecalis, GO2. g. Staphylococcus aureus, ATCC
antibatterica sui ceppi 2.4. Calcolo della riduzione di vitalita
in sospensione
6538. Nel pool ciascun ceppo partecipava
Per tutti i ceppi citati, a eccezione di
di un farDai protocolli in uso, l’attivita
alla sospensione con un titolo di
Legionella, sono state saggiate concen-
maco antibatterico viene valutata misu del microrganismo (MIC rando la vitalita
1,4106 UFC/mL; il titolo complessivo
trazioni scalari di ciascun preparato su una sospensione batterica pari a 106 UFC/mL. Dopo un’incubazione in
e MCB) dopo 24 e 48 ore di esposizione: deriva da procedure utilizzate negli cio
piastre multiwell da 96 pozzetti (Corning,
il tempo di antibiogrammi, dove pero
Corning, USA) per 48 ore a 37 C, in €ller-Hinton broth (Microbiol, terreno Mu stata valutata la preUta, Cagliari), e senza/assenza della crescita microbica /limpidezza del sulla base della torbidita
permanenza di un antibiotico, specie a livello sistemico, differisce notevolmente rispetto a quello di un antibatterico usato nel riunito. Il protocollo prevede l’esposizione al preparato da 0 a 40 mi-
mezzo di crescita, tramite lettura allo
nuti, a intervalli di 10 minuti, di una
spettrofotometro a una lunghezza d’onda
sospensione batterica di 1107 UFC/mL.
di
Instruments, Germany). Dalle sospen-
Aliquote della sospensione sono state €ller-Hinton agar seminate nel terreno Mu
sioni in cui si osservava completa inibi-
e sono state valutate le UFC. I valori
zione della crescita sono state allestite €llersubculture in terreno agarizzato (Mu
di UFC/mL sono stati espressi come
Hinton agar, Microbiol, Uta, Cagliari), residua per valutare l’eventuale vitalita
terica (RL) applicando la seguente
620 nm
(SLT-Spectra
IIÔ,
SLT
del microrganismo (MCB). Come gia descritto, i formulati in esame sono stati
logaritmo della riduzione della conta batformula [4]: RL ¼ LogðA=BÞ
finale era di 1107 UFC/mL. 2.5. Misura del biofilm In questo lavoro, assieme ai parametri che di un antibatterico su valutano l’attivita patogeni in forma sospesa (planctonica), abbiamo introdotto una nuova misura, definita
Minimum
Biofilm
Eliminating
Concentration (MBEC) [17]. In queste condizioni la MBEC rappresenta la piu bassa concentrazione di disinfettante elevata) in grado di inibire (diluizione piu la strutturazione a biofilm. L’inibizione del stata valutata per i due ceppi di biofilm e P. aeruginosa e per E. faecalis dopo 7 giorni di incubazione in piastre multiwell, utilizzando la stessa procedura di crescita per le prove in sospensione tramite il metodo di Lehtola et al. modificato [18].
saggiati a concentrazioni seriali, secondo la diluilo schema (D = 1/2X), dove D e
ove A = UFC/mL nel campione inoculato e B = UFC/mL nel campione prelevato.
2.6. Valutazione dell’attivita
zione e X rappresenta un numero intero
Sono state valutate le seguenti concen-
inibitoria su Legionella pneumophila
tra 1 e 10. Per ciascuna formulazione
trazioni di H2O2 dei preparati: 600 ppm,
sono state valutate la concentrazione
300 ppm, 3% (solo nel pool batterico).
dei terreni e dei tempi di Le peculiarita
minima inibente (MIC) e la concentrazione
Le combinazioni dei microrganismi sono
crescita di L. pneumophila hanno imposto
minima battericida (MBC):
state le seguenti.
una procedura differente nella valutazione
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 99
S. Del Nero et al.
stato inibitoria dei preparati. E dell’attivita
di inibizione della crescita microbica e
concentrazione di H2O2 comunemente
utilizzato il metodo della diffusione in agar
misurata dal diametro, in millimetri, del
usata nel riunito odontoiatrico per la disin-
di Kirby-Bauer [15]. 10 mL di ciascuna
suddetto alone circolare.
fezione in continuo (600 ppm). I dati ripor tati nelle tabelle I e II indicano attivita
3. Risultati
inibente e battericida compresa fino alle
diluizione del preparato in esame sono stati deposti su dischetto di carta assor-
diluizioni 1/26 e 1/210, corrispondenti ai
bente, diametro pari a 6 mm (Kairosafe, Trieste), contenuto in una piastra di
dei preparati sui ceppi 3.1. Attivita
preparati diluiti, rispettivamente, 64 e
BCYE, previamente seminata in superficie
in sospensione
2.048 volte, pari a un intervallo di concen-
con una sospensione di 106 UFC/mL di veniva valutata L. pneumophila. L’attivita in base alla presenza/assenza di un alone
I valori delle MIC e delle MBC indicano ben al di sotto della livelli di attivita
trazione compreso tra 468 e 14,6 ppm di H2O2. In base ai risultati esposti si puo inoltre affermare che:
Tabella I Minima concentrazione inibente (MIC) (massima diluizione attiva) Preparato saggiato Ceppo
H2O2
H2O2+[Ag+] 5 ppm
H2O2+[Ag+] 10 ppm
1
P. aeruginosa (ATCC 27853)
1/512
1/512
1/512
2
P. aeruginosa (LIC1)
1/512
1/512
1/512
3
Escherichia coli
1/512
1/512
1/512
4
Klebsiella pneumoniae
1/256
1/256
1/256
5
Salmonella enterica
1/512
1/512
1/512
6
Staphylococcus aureus
1/256
1/512
1/512
7
Bacillus atrophaeus
1/256
1/256
1/256
8
Enterococcus faecalis
1/256
1/256
1/256
9
Vibrio cholerae
1/2.048
1/1.024
1/1.024
10
Candida albicans
1/64
1/64
1/64
Legenda: 1/2.048 = 24 ppm H2O2; 1/512 = 59 ppm H2O2; 1/256 = 117,1 ppm H2O2; 1/64 = 468,7 ppm H2O2.
Tabella II Minima concentrazione battericida (MCB) (massima diluizione attiva) Preparato saggiato Ceppo
H2O2
H2O2+[Ag+] 5 ppm
H2O2+[Ag+] 10 ppm
1
P. aeruginosa (ATCC 27853)
1/512
1/512
1/512
2
P. aeruginosa (LIC1)
1/512
1/512
1/512
3
Escherichia coli
1/512
1/512
1/512
4
Klebsiella pneumoniae
1/256
1/256
1/256
5
Salmonella enterica
1/512
1/512
1/512
6
Staphylococcus aureus
1/256
1/512
1/512
7
Bacillus atrophaeus
1/256
1/256
1/256
8
Enterococcus faecalis
1/256
1/256
1/256
9
Vibrio cholerae
1/2.048
1/1.024
1/1.024
10
Candida albicans
1/64
1/64
1/64
Legenda: 1/2.048 = 24 ppm H2O2; 1/512 = 59 ppm H2O2; 1/256 = 117,1 ppm H2O2; 1/64 = 468,7 ppm H2O2.
100
| DENTAL CADMOS | 2/2012
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
*
MIC e MBC coincidono per ciascun
[(Fig._1)TD$IG]Fig. 1
ceppo e per ciascuna diluizione; *
eccetto che per S. aureus e Vibrio cholerae, non si rilevano differenze tra assenza o aggiunta di Ag (fig. 1).
3.2. Calcolo della riduzione della conta batterica *
Pseudomonas aeruginosa, ATCC 27853.
Alla
concentrazione
di
300 ppm di H2O2 non si ottiene una diminuzione significativa della vitalita del ceppo (massimo 2 log a 40 minuti) anti(fig. 2a); un aumento dell’attivita batterica si osserva a 600 ppm di
[(Fig._2a,b)TD$IG]Fig. 2a,b
H2O2, indipendentemente dalla concentrazione di argento (fig. 2a,b). *
Staphylococcus aureus, ATCC 6538. La scelta del batterio Gram positivo stata dettata dal fatto che S. aureus e discusso, esso rappresenta, come gia un buon indicatore biologico per l’atti dei disinfettanti a base di perossidi. vita essere In aggiunta, il ceppo puo responsabile di gravi infezioni nosocomiali, per esempio i ceppi meticillinoresistenti [16]. Come per le MIC e le MBC, la differenza nella riduzione della tra assenza o presenza di vitalita apprezzabile (fig. 3a,b). argento e
[(Fig._3a,b)TD$IG]Fig. 3a,b
3.3. Pool batterico antibatterica risulta perossido e L’attivita argento-dipendente. Alla concentrazione di H2O2 a 600 ppm (fig. 4a-c) l’aumento
Fig. 1 Densita ottica di una sospensione di S. aureus cresciuto a differenti diluizioni di H2O2 con e senza argento Fig. 2a,b Riduzione della conta batterica in P. aeruginosa, ATCC 27853 Fig. 3a,b Riduzione della conta batterica in S. aureus, ATCC 6538
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 101
S. Del Nero et al.
antibatterica dovuta all’incredi attivita evidente, tuttavia alle mento di [Ag+] e
[(Fig._4a-c)TD$IG]Fig. 4a-c
concentrazioni di H2O2 a 300 ppm e al dovuta alla concen3% prevale l’attivita trazione del perossido. La concentrazione di H2O2 al 3%, come indicato in altra pubblicazione [4], risulta estremamente attiva nei confronti del pool batterico. 3.4. Valutazione dell’attivita inibitoria su Legionella pneumophila Come
gia
esposto
nel
paragrafo
antibatterica “Materiali e metodi”, l’attivita stata dei preparati su L. pneumophila e valutata tramite il metodo della diffusione in agar di Kirby-Bauer. Le diluizioni minime attive (alone di inibizione > 0) sono state di 117 ppm per i formulati
[(Fig._5)TD$IG]Fig. 5
con argento e di 59 ppm per il perossido puro (fig. 5). antibiofilm 3.5. Attivita La misura del biofilm, formatosi dopo 7 giorni di incubazione in presenza del disinfettante, ha mostrato i risultati esposti qui di seguito. 3.5.1. Ceppi di Pseudomonas aeruginosa La Minimum Biofilm Inhibitory Concen pari a 1/29, ovvero al fortration (MBIC) e mulato diluito 512 volte (fig. 6). A dosi subinibitorie del principio attivo (fig. 6)
Fig. 4a-c Riduzione della conta batterica in un pool di sette differenti specie batteriche Fig. 5 L. pneumophila: misura degli aloni di inibizione dopo 4 giorni di crescita in presenza dei disinfettanti a base di H2O2 Fig. 6 Studio dell’inibizione del biofilm con H2O2 utilizzando due stipiti di P. aeruginosa
102
| DENTAL CADMOS | 2/2012
[(Fig._6)TD$IG]Fig. 6
antibatterica di formulati a base di perossido di idrogeno e sali d’argento Attivita
[Ag+] a 5 ppm al disinfettante con
[(Fig._7)TD$IG]Fig. 7
[Ag+] a 10 ppm.
4. Discussione I risultati sopra esposti evidenziano, in generale, un potenziamento dell’attivita antibatterica del perossido di idrogeno con sali d’argento, rispetto al formulato contenente il solo perossido. In particolare, l’aggiunta di argento in S. aureus coltivato in sospensione sposta di un valore di diluizione la MIC e la MBC; cio potrebbe essere dovuto alla capacita Fig. 7 Diminuzione della velocita di formazione del biofilm di un isolato clinico di P. aeruginosa sottoposto a disinfettanti a base di H2O2 con diverse concentrazioni di argento
dell’insieme Ag + H2O2 di contrastare l’effetto delle catalasi prodotte dal batterio tramite una maggiore formazione di
l’isolato clinico (LIC1) ha un’attitudine a
3.5.2. Ceppo di Enterococcus
formare biofilm 4 volte superiore rispetto
faecalis
al ceppo di collezione ATCC 27853. risulta potenziata in presenza di L’attivita
In E. faecalis (fig. 8a,b) la riduzione della di formazione del biofilm risulta velocita
Non si rilevano differenze tra le due con-
argento, intorno a 3 volte rispetto al
argento-dipendente e diminuisce di
La riduzione della conta batterica nel
perossido senza aggiunte (fig. 7).
3 volte passando dal preparato con
tempo mostra comportamenti estrema-
radicali H-O, dovuta all’azione catalitica dell’argento sul perossido di idrogeno. centrazioni di argento saggiate (fig. 1).
mente differenti a seconda del microrganismo saggiato, per esempio se si tratta [(Fig._8a,b)TD$IG]Fig. 8a,b
di un Gram positivo o negativo, oppure se i preparati vengono saggiati su sospensioni mono o polimicrobiche. In P. aeruginosa, una riduzione di 5 log si osserva dopo 30 minuti di esposizione con i preparati contenenti H2O2 a 600 ppm. In questo esperimento la presenza di Ag non sembra determinante batnell’influenzare la riduzione di vitalita terica; al contrario, svolge un ruolo decisivo la concentrazione del perossido di idrogeno (fig. 2a,b). Invece, per S. aureus, diversamente dai risultati ottenuti per P. aeruginosa, il ruolo dell’argento e determinante: il perossido puro presenta una riduzione di 5 log solo a 600 ppm dopo 40 minuti di esposizione. A
Fig. 8a,b Quantita di biofilm (a) e diminuzione della velocita di formazione del biofilm (b) di un isolato clinico di E. faecalis sottoposto a disinfettanti a base di H2O2 con diversi preparati
300 ppm risultano efficaci soltanto i preparati con Ag: complessivamente,
DENTAL CADMOS
| 2012;80(2):96-107 | 103
S. Del Nero et al.
l’aggiunta di questo elemento riduce i di almeno 10-15 minuti; tempi di attivita
disinfezione
in
continuo
nei
riuniti
e proporzionale entro 20 minuti l’attivita
voluta sagIn questo lavoro, inoltre, si e dei preparati nei confronti di giare l’attivita
(600 ppm).
inibitoria del perossido di idroall’attivita geno con le differenti concentrazioni osservare che la fund’argento. Si puo
Una situazione come quella simulata con improbabile in un riunito il pool batterico e
un ceppo di L. pneumophila; i dati di let-
zione dell’argento nell’inibire la forma intorno a 3 volte rispetto zione di biofilm e
teratura sulla presenza del patogeno nei
al perossido senza aggiunte.
verificarsi (fig. 4a-c); potrebbero pero
riuniti, e sul possibile rischio di contami-
L’isolato clinico (GO2) di E. faecalis
rare situazioni di pluricontaminazione
nazione in ambiente odontoiatrico, risul-
mostra un andamento paragonabile a
dovute a:
tano scarsi e incompleti, in particolare per dei disinfettanti, quanto riguarda l’attivita
quello osservato per P. aeruginosa.
alla sua concentrazione (fig. 3a,b).
*
distacco di biofilm da grossi serbatoi
Come
evidenziato
nei
grafici
della
di forfigura 8, la riduzione della velocita
contaminazioni accidentali da rete
Nel presente lavoro si evidenza un buon del perossido in tutte le range di attivita
fognaria.
formulazioni saggiate. Considerando che
Ag+ a 5 ppm e a ben 6 volte con Ag+ a
la concentrazione di esercizio in continuo di 600 ppm, un possibile rilanel riunito e
10 ppm.
eccezionale indicatore biologico; in situazioni estreme le diverse specie sono in
scio di tale microrganismo nel sistema
grado di mettere in atto un complesso
idrico del riunito, con successiva coloniz-
network protettivo capace di contrastare
zazione delle tubature, dovrebbe essere,
efficacemente l’azione dei disinfettanti. evidenziato Un aspetto di quest’azione e
secondo i dati esposti, insolito (fig. 5). mostrato nei risultati, l’attivita Come gia
Tutti gli esperimenti eseguiti confermano
nella figura 4a, dove il perossido di idro-
antibiofilm risulta ceppo e clone-dipen-
geno a 300 ppm risulta debolmente attivo e in un range di esposizione di 50 minuti
dente; in particolare, mostra range di atti differenti se si considerano ceppi di vita
nei confronti dei diversi ceppi batterici saggiati, cosı com’era stato dimostrato
non si osservano variazioni dovute alla
laboratorio o isolati clinici.
gruppo [4].
presenza di argento. L’utilizzo del peros-
Il comportamento di P. aeruginosa nella
Nell’insieme, gli esperimenti con diversi
sido a 600 ppm cambia lo scenario ed
formazione di biofilm a dosi subinibitorie completadi perossido di idrogeno e
patogeni evidenziano un effetto dose-
idrici siti a monte del riunito; *
Inoltre, il pool batterico rappresenta un
mazione del biofilm si attesta a 3 volte con
5. Conclusioni
l’efficacia del perossido di idrogeno
in un precedente lavoro del nostro
mente diversa con i due ceppi saggiati.
dipendente per quanto riguarda la concentrazione di ioni argento, a parita
sono paragonabili a quelli ottenuti con
Mentre il ceppo di collezione viene inibito
di concentrazione del perossido di
Pseudomonas spp., con una riduzione
anche a diluizioni molto elevate di peros-
idrogeno.
di 5 log a 40 minuti in presenza di Ag
sido, l’isolato clinico mostra, alle stesse
significativi appaiono quelli di I risultati piu
(fig. 4b).
concentrazioni, una spiccata tendenza a
seguito elencati.
voluta In queste condizioni estreme si e valutare anche l’attivita del perossido di
formare un biofilm misurabile; in tali con dizioni (assenza di argento) la MBIC e
*
evidenzia una differente e maggiore atti in presenza di argento: i risultati vita
9
Pool batterico (fig. 4b). A 40 minuti, con il solo perossido di idrogeno a
idrogeno al 3%, per verificare se si potes-
pari a 1/2 , ovvero al formulato diluito
600 ppm, si ottiene una riduzione della
sero osservare riduzioni nei tempi di
512 volte (fig. 6). La fig. 6 evidenzia le rette di regressione indicanti la velocita
conta batterica totale pari a circa
di formazione del biofilm man mano che
con i preparati contenenti perossido
sizione, indipendentemente dalla con-
diminuisce la concentrazione del princi-
di idrogeno e argento la riduzione
centrazione di Ag. Dai risultati esposti in
pio attivo. L’isolato clinico (LIC1) presenta
questo paragrafo sul calcolo della ridu-
un incremento in biofilm di circa 4 volte
ammonta a 5 log. In termini pratici, significa che in un riunito in cui circio
zione della conta batterica, il vantaggio evidel ricorso ai composti d’argento e
rispetto al ceppo di collezione ATCC
colano diluizioni del preparato di peros-
27853. In una seconda prova (fig. 7), l’iso stato sottoposto lato clinico (LIC1) e
sido di idrogeno e argento alle concen-
esposizione. La fig. 4c evidenzia una a 10 minuti di esporiduzione di 7 log gia
dente alla concentrazione usata per la
104
| DENTAL CADMOS | 2/2012
2-3 log rispetto al valore iniziale, mentre
trazioni, rispettivamente, di 600 ppm
come H2O2 e che viene lasciato fermo per un tempo di 40 minuti, si realizza la una riduzione della disinfezione, cioe conta batterica paragonabile a quanto si ottiene di solito con il solo perossido di idrogeno al 3% in 10 minuti. Questo rappresenta una grande sicurezza per gli utilizzatori del riunito: i preparati contenenti perossido di idrogeno e argento non si limitano a realizzare la batteriostasi, ma determinano una riduzione del titolo batterico tale da configurarsi come disinfezione. *
Legionella pneumophila. Alle concentrazioni saggiate, il perossido di idrogeno si dimostra attivo nei confronti di un risultato L. pneumophila. Questo e molto interessante in considerazione della
*
scarsa
letteratura
esistente
sull’argomento [19]. antibiofilm. Dal momento che Attivita dalla letteratura risulta evidente come i condotti idrici del riunito vengano colonizzati dal biofilm, il risultato di questa porzione degli esperimenti appare estremamente interessante. Entrambi i set di esperimenti eseguiti su P. aeruginosa ed E. faecalis evidenziano come il biofilm esposto ai preparati contenenti argento presenti una di ricrescita decisamente infevelocita riore, una volta che il disinfettante e stato rimosso, rispetto al biofilm esposto al solo perossido di idrogeno. Anche tale risultato si traduce in un aspetto pratico importante: la presenza di ioni argento inibisce la ricre di scita del biofilm nel lume dei tubi piu quanto faccia il solo perossido di idrogeno.
Conflitto di interessi Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.
Finanziamento dello studio stato finanziato da CEFLA Lo studio e S.C. Bibliografia 1. Walker JT, Bradshaw DJ, Bennett AM, Fulford MR, Martin MV, Marsh PD. Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol 2000;66(8):3363–7. 2. Barbeau J, Tanguay R, Faucher E, Avezard C, Trudel L, C^ote L, et al. Multiparametric analysis of waterline contamination in dental units. Appl Environ Microbiol 1996;62(11):3954–9. 3. Kohn WG, Harte JA, Malvitz DM, Collins AS, Cleveland JL, Eklund KJ. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for infection control in dental health care settings—2003. J Am Dent Assoc 2004;135(1):33–47. 4. Orru G, Del Nero S, Tuveri E, Laura Ciusa M, Pilia F, Erriu M, et al. Evaluation of antimicrobial-antibiofilm activity of a hydrogen peroxide decontaminating system used in dental unit water lines. Open Dent J 2010;4:140–6. 5. Syed MA, Babar S, Bhatti AS, Bokhari H. Antibacterial effects of silver nanoparticles on the bacterial strains isolated from catheterized urinary tract infection cases. J Biomed Nanotechnol 2009;5(2):209–14. 6. Miola M, Ferraris S, Di Nunzio S, Robotti PF, Bianchi G, Fucale G, et al. Surface silver-doping of biocompatible glasses to induce antibacterial properties. Part II: Plasma sprayed glass-coatings. J Mater Sci Mater Med 2009;20(3):741–9. 7. Challacombe SJ, Fernandes LL. Detecting Legionella pneumophila in water systems: a comparison of various dental units. J Am Dent Assoc 1995;126(5):603–8. 8. Atlas RM, Williams JF, Huntington MK. Legionella contamination of dental-unit waters. Appl Environ Microbiol 1996;62(4):1491. 9. Napoli C, Fasano F, Iatta R, Barbuti G, Cuna T, Montagna MT. Legionella spp. and legionellosis in Southeastern Italy: disease epidemiology and environmental surveillance in community and health care facilities. BMC Public Health 2010;10:660. 10. Veronesi L, Capobianco E, Affanni P, Pizzi S, Vitali P, Tanzi ML. Legionella contamination in the water system of hospital dental settings. Acta Biomed 2007;78(2):117–22. 11. Barben J, Schmid J. Dental units as infection sources of Pseudomonas aeruginosa. Eur Respir J 2008;32(4):1122–3. 12. Saitou K, Furuhata K, Kawakami Y, Fukuyama M. Biofilm formation abilities and disinfectantresistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from cockroaches captured in hospitals. Biocontrol Sci 2009;14(2):65–8.
13. Barreto S, Zambrano M, Araque M. Phenotypic variations of susceptibility in Klebsiella pneumoniae strains of nosocomial origin and their association with biofilm formation. Invest Clin 2009; 50(2):221–9. 14. Boddicker JD, Ledeboer NA, Jagnow J, Jones BD, Clegg S. Differential binding to and biofilm formation on, HEp-2 cells by Salmonella enterica serovar Typhimurium is dependent upon allelic variation in the fimH gene of the fim gene cluster. Mol Microbiol 2002;45(5):1255–65. 15. Denotti G, Piga R, Montaldo C, Erriu M, Pilia F, Piras A, et al. In vitro evaluation of Enterococcus faecalis adhesion on various endodontic medicaments. Open Dent J 2009;3:120–4. 16. Koneman EW, Allen SD, Janda WM. Introduzione alla microbiologia diagnostica. Roma: Delfino Antonio, 1996. 17. Sepandj F, Ceri H, Gibb A, Read R, Olson M. Minimum inhibitory concentration (MIC) versus minimum biofilm eliminating concentration (MBEC) in evaluation of antibiotic sensitivity of Gramnegative bacilli causing peritonitis. Perit Dial Int 2004;24(1):65–7. 18. Lehtola MJ, Pitk€anen T, Miebach L, Miettinen IT. Survival of Campylobacter jejuni in potable water biofilms: a comparative study with different detection methods. Water Sci Technol 2006; 54(3):57–61. 19. Shimizu I, Isshiki Y, Nomura H, Sakuda K, Sakuma K, Kondo S. The antibacterial activity of fragrance ingredients against Legionella pneumophila. Biol Pharm Bull 2009;32(6):1114–7.