Die Permeabilität biologischer Membranen

II. H O R M O N W I R K U N G D U R C H PERMEABILITÄTSÄNDERUNG H O R M O N E A C T I O N BY CHANGES IN PERMEABILITY

K. HECKMANN, Frankfurt/Main

Die Permeabilität biologischer Membranen Die detaillierte Kinetik der Diffusion von Teilchen durch biologische Membranen ist trotz großen Arbeitsaufwandes bisher in keinem einzigen Falle aufgeklärt worden, und es erscheint mir nützlich, die wesentlichen Gründe für diesen unbefriedigenden Zustand einmal aufzuzählen und zu diskutieren. Im ersten Teil des Vortrages werde ich also kurz über einige Schwierigkeiten bei der experimentellen Bestimmung von Membranpermeabilitäten und über die begrenzte Anwendbarkeit des Begriffes „Permeabilität" in komplizierten Diffusionssystemen sprechen. Sodann möchte ich einige Bemerkungen über mathematische Modelle machen und zeigen, daß einerseits die Aufklärung von Diffusionsprozessen durch biologische Membranen zur Aufstellung von solchen mathematischen Modellen zwingt, daß aber andererseits die herkömmlichen mathematischen Hilfsmittel nicht ausreichen, um den Rechenaufwand zu bewältigen, der mit der Konstruktion von einigermaßen vollständigen Modellen verbunden ist. Im zweiten Teil des Vortrages werde ich ein spezielles mathematisches Diffusionsmodell diskutieren, nämlich die Gleichungen für Carrier-vermittelte, passive Diffusion, und anhand dieses bekannten Beispieles zeigen, daß selbst sehr erfolgreiche Modelle keinen Anspruch auf „Richtigkeit" ihrer Prämissen stellen dürfen. Wenn im Folgenden von biologischen Membranen geredet wird, dann sind damit Zellmembranen gemeint und keine membranförmigen Anordnungen von Zellen, wie beispielsweise die Bauchhaut des Frosches, obwohl einige der Überlegungen natürlich auch für solche membranförmigen Organe gelten. Die Permeabilität biologischer Membranen ist nur in wenigen sehr übersichtlichen Fällen angebbar. Das hat im wesentlichen vier Gründe, von denen man drei schnell erkennt, wenn man sich die gebräuchliche Definition der Permeabilität besieht. Die Permeabilität ist eine nur indirekt meßbare Größe und durch Gleichung 1) definiert. 1)

Φι = P! ( S i ' ~ S D

; [Mol - cm-2 · sec"*]

Si' und Si" seien die Konzentrationen der betrachteten Teilchensorte pi unmittelbar links und rechts der Membranoberflächen und Φι sei der dazugehörige Nettofluß. Der Quotient Pi aus Fluß und Konzentrationsdifferenz heißt „Permeabilität" der Membran für die Teilchensorte pi; seine Dimension ist [cm-sec -1 ]. Es ist üblich, durch Gleichung 1)

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nur solche Systeme zu beschreiben, bei denen Φι mit ASi = (Si'—Si") verschwindet. Gelegentlich wird Pi sogar als „Permeabilitätskonstante" bezeichnet. Jedenfalls wird die Permeabilität allgemein als eine passive Membraneigenschaft angesehen. Bei der Bestimmung einer Permeabilität wird in der Regel eine Konzentrationsdifferenz vorgegeben und ein Fluß gemessen. Die erste Schwierigkeit bei der Bestimmung der Permeabilität biologischer Membranen besteht darin, daß ASi häufig nicht genau bekannt ist, da man in biologischen Systemen nicht für hinreichende Konvektion zu beiden Seiten der Membranen sorgen kann. Der Konzentrationsabfall ASi liegt — außer im Falle sehr kleiner Membranpermeabilität — nicht vollständig über der Membran, sondern reicht zu beiden Seiten noch eine gewisse Strecke in die angrenzenden Lösungen hinaus. Die Dicke des von der Konvektion nicht erfaßten Flüssigkeitsfilmes, der sogenannten Nernst'schen Diffusionsschicht, ist auf der Innenseite einer Zellmembran kaum anzugeben. Bei Zelldurchmessern von weniger als rund 50 μ ist das Zellinnere wahrscheinlich überhaupt nicht gerührt. Die Nernst'sche Schicht erstreckt sich dann über die ganze Zelle. Auf der Außenseite der Zellmembran kann man die Dicke der Nernst'schen Schicht in einigen Fällen, z. B. bei Zellsuspensionen, relativ gut abschätzen. Sie beträgt bei Zellsuspensionen je nach Intensität der Rührung 10"2 bis 10~3 cm. (Zum Vergleich: Dicke einer Zellmembran etwa 10~6 cm). Die Konzentrationen Si' und Si" ließen sich angeben, wenn u.a. die Dicke der Nernst'schen Schicht und die Permeabilität der Membran für die Substanz pi bekannt wären. Man sieht also, daß es Fälle geben kann, in denen die Information über das System für eine Permeabilitätsbestimmung nicht ausreicht. Übersichtliche Verhältnisse hat man nur dort, wo der Fluß von der Stärke der Konvektion praktisch unabhängig ist, wo also die Diffusionsgeschwindigkeit der Teilchen in der Membran wesentlich kleiner ist als in der Nernst'schen Schicht und daher die Konzentrationsdifferenz ASi ausschließlich über der Membran abfällt (5, 13). Die zweite Schwierigkeit bei der Bestimmung der Permeabilität biologischer Membranen ist, daß Flußmessungen über alle im betrachteten Flächenelement nebeneinanderliegenden DifTusionsmechanismen mittein und infolgedessen parallele Diffusionswege mit verschiedenen Permeabilitäten nicht voneinander trennen können. Eine Ausnahme können hier Permeabilitätsbestimmungen mit Hilfe von Impedanz-Messungen machen (1, 2). Die dritte Schwierigkeit ist — im Gegensatz zu den beiden ersten, vorwiegend experimentellen Komplikationen — theoretischer Natur und betrifft die Definition und die Verwendbarkeit des Begriffes „Permeabilität". Die relativ komplizierte Struktur biologischer Membranen sorgt nämlich dafür, daß die Beziehung 1) selbst bei Kenntnis von Si' und Si" nur in besonderen, einfachen Fällen sinnvoll angewandt werden kann. Die Membranstruktur bewirkt zunächst, daß Pi sehr häufig keine Konstante, sondern eine komplizierte Funktion der Konzentrationen aller im System vorhandenen Teilchensorten ist. Gleichung 1) sollte darum besser heißen: 2)

Φι = Pi (S/ ; St" ; S2' ; S 2 " ; . . . . S n ' ; Sn") · (Si'-Si")

und etwa dann gelten, wenn für alle Teilchensorten pi,(i 4= 1) Si' = Si" ist. Werden die Konzentrationen der pi,(i 4= 1) auf beiden Seiten der Membran verschieden, dann gilt 2) nur noch, wenn die Si,(i 4= 1) gegenüber den Si zu vernachlässigen sind. Im allgemeinen

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sind die Bedingungen jedoch komplizierter: Die Bewegungen aller im System vorhandenen Teilchensorten sind über die Membranstruktur (und eventuell über das Membranpotential) so miteinander gekoppelt, daß jede Teilchensorte vom Gradienten jeder anderen Teilchensorte getrieben wird. In solchen Fällen kann man zwar immer noch den gemessenen Fluß Φι proportional zu ASi, der eigenen oder sogenannten konjugierten Kraft, analog zu 2) hinschreiben und auf diese Weise Fluß und konjugierte Kraft über einen Koeffizienten (Pi) miteinander verbinden, aber die Funktion Pi = Φι/ASi ist dann nur noch formal als Permeabilität zu verstehen, weil Pi jetzt fremde, „nichtkonjugierte" Kräfte enthält und infolgedessen das wesentliche Merkmal einer passiven Membraneigenschaft verloren hat.*) Nichtkonjugierte Kräfte machen sich am deutlichsten dadurch bemerkbar, daß der Fluß einer betrachteten Teilchensorte endlich bleibt, wenn seine konjugierte Kraft verschwindet (die Flußrichtung kann dabei positiv oder negativ sein). Man hilft sich in solchen komplexen Fällen dadurch, daß man den Fluß in eine Reihe von Gliedern aufspaltet, deren jedes das Produkt aus einer Triebkraft und einem charakteristischen Kopplungskoeffizienten ist. Da die Kopplungsmechanismen der verschiedenen Flüsse in biologischen Membranen bisher praktisch unbekannt sind, läßt sich die Teilchendiffusion hier (von wenigen Ausnahmen abgesehen) vorläufig nur phänomenologisch beschreiben. In Gleichgewichtsnähe wird ein solches komplexes System zweckmäßigerweise durch die sogenannten phänomenologischen Gleichungen der irreversiblen Thermodynamik dargestellt (7, 8, 9): 3)

Ji = LnXi + L12X2 + J2

=

L21X1 +

L22X2 +

Jn = LniXi + Ln2X2 +

+ LinXn +

L211X11

+ L nn X n

In diesen Gleichungen bedeuten die Ji bzw. Xi geeignet definierte „Flüsse" bzw. deren konjugierte „Triebkräfte". Die Triebkräfte können relativ willkürlich gewählt werden und beispielsweise Differenzen von Konzentrationen, Molenbrüchen, chemischen Potentialen oder elektrochemischen Potentialen sein. Die Großen LÜ und Lik werden „phänomenologische Koeffizienten" genannt (LÜ: gerade Koeffizienten, Lik: Kreuzkoeffizienten); sie sind zwar formal als „Permeabilitäten", „Durchlässigkeiten", „Leitfähigkeiten" usw. zu lesen, von einer Permeabilität Pi der Membran für die Substanz pi im Sinne der Gleichungen 1) und 2) kann aber nicht mehr gesprochen werden. Statt durch die Permeabilitäten Pi bis Pn werden die voneinander abhängigen Teilchenbewegungen wegen (Lik = Lki) durch eine Permeabilitätsmatrix aus n (n + l)/2 Koeffizienten dargestellt. Die Beschreibung von sogenannten „aktiven" Transportvorgängen geschieht — je nach der Definition des Begriffes „aktiver Transport" — entweder durch alle Glieder der betrachteten Flußgleichung mit Kreuzkoeffizienten Lik bzw. nichtkonjugierten Kräften (12) oder nur durch solche Glieder, deren Koeffizienten sich auf die Kopplung des betrachteten Flusses mit Stoffwechselreaktionen in oder an der Oberfläche der Membran beziehen (9). „Passiver Transport" wird dann umgekehrt entweder nur durch Glieder mit *) In Anlehnung an die in Elektrochemie und Elektrotechnik zur formalen Charakterisierung von Strom-Spannungs-Kurven benutzte Definition eines differentiellen Widerstandes läßt sich auch d Φι eine différentielle Permeabilität Pi* = . „ definieren.

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geraden Koeffizienten LÜ beschrieben oder aber durch alle diejenigen Glieder mit den Koeffizienten LÜ und Lik, deren Triebkräfte keine Stoffwechselreaktionen, sondern nur Konzentrations-, Temperatur-, Druck- und Potentialdifferenzen über der Membran sind. Die Beschreibung der Membranpermeabilität mit Hilfe der phänomenologischen Gleichungen der irreversiblen Thermodynamik ist naturgemäß unanschaulich. Die irreversible Thermodynamik gestattet zwar die formale Darstellung von Flußkopplungen, und sie macht auch Voraussagen über unbekannte Beziehungen zwischen Flüssen und Triebkräften; sie kann aber über das detaillierte kinetische Geschehen bei der Diffusion von Teilchen durch eine Membran nichts aussagen (7). Wir wollen uns daher an dieser Stelle nicht weiter mit den phänomenologischen Flußgleichungen befassen. Ich habe sie nur erwähnt, um an einem bekannten Beispiel zu zeigen, auf welche Weise man im Prinzip komplizierte Diffusionssysteme beschreiben kann, wenn die Verwendung des Begriffes „Permeabilität" unvernünftig wird. Die umfassendste Darstellung der Permeabilitätseigenschaften von Membranen ist ein mathematisches Modell der betrachteten Diffusionsprozesse. Befindet sich das zu beschreibende System in Gleichgewichtsnähe, so kann man dem Modell die phänomenologischen Gleichungen 3) zugrunde legen. Die eigentliche Leistung bei der Aufstellung des Modells besteht dann darin, die gemessenen phänomenologischen Koeffizienten physikalisch zu interpretieren und diese physikalischen Vorstellungen mathematisch zu formulieren. Soll das Modell die Eigenschaften des Systems auch in größerer Entfernung vom Gleichgewicht beschreiben, so können die Gleichungen 3) nicht verwandt werden. Trotzdem läßt sich das Modell häufig analog zu 3) als ein System von Flußgleichungen hinschreiben, deren jede in eine Reihe von Termen zerfällt, die dann ihrerseits Produkte aus einer Triebkraft und einem Koeffizienten sind. Zwischen dem Gleichungssystem eines detaillierten Modells und dem Gleichungssystem 3} bestehen zwei wesentliche Unterschiede: a) Die Triebkräfte in den Flußgleichungen des Modells brauchen keine ersten Potenzen von Konzentrations-, Druck- oder Potentialdifferenzen etc. zu sein. Es können auch Glieder höherer Ordnung, wie (Si'—Si")2, auftreten. b) Die Kopplungskoeffizienten in den Flußgleichungen des Modells sind analytische Funktionen der Parameter des Systems und gestatten daher in günstigen Fällen die Berechnung der kinetischen und energetischen Konstanten, die das Verhalten des Systems bestimmen. Obwohl die Flußgleichungen eines Modells mathematisch sehr ungezwungen in einzelne Terme zerfallen können, sind die Kopplungskoeffizienten dieser Terme in den meisten Fällen so kompliziert, daß man sich „anschaulich" nichts darunter vorstellen kann. Diese Unanschaulichkeit ist aber — im Gegensatz zur Unanschaulichkeit der phänomenologischen Koeffizienten des Gleichungssystems 3) — nicht prinzipieller Natur. Die phänomenologischen Flußgleichungen 3) und die Flußgleichungen mathematisch-kinetischer Modelle beschreiben natürlich nicht nur komplizierte Diffusionssysteme mit mehreren Triebkräften, sondern sie gehen für einfache Fälle automatisch in Gleichungen vom Typ 1) bzw. 2) über.

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Wir wollen das Problem der begrenzten Brauchbarkeit des Permeabilitäts-BegrifTes noch einmal zusammenfassen: Wird die Permeabilität einer Membran für die Teilchensorte pi als Quotient Pi von Fluß Φΐ und Konzentrationsdifferenz ASi definiert, dann muß die Größe Pi in komplizierten Fällen eventuell so viele Eigenschaften aufnehmen, daß sie sich für eine physikalisch sinnvolle Beschreibung der Diffusion von pi nicht mehr eignet. Möchte man aber die DifTusion von pi in komplizierten Fällen physikalisch vernünftig beschreiben, so muß Φΐ in eine Summe von Termen zerlegt werden, von denen nur einer die Konzentrationsdifierenz ASi enthält. Der Fluß ist dann durch eine ganze Anzahl von Koeffizienten (z. B. Lii bis Lin), aber nicht mehr durch die Permeabilität Pi allein charakterisiert. Den Rest meiner Zeit möchte ich benutzen, um über mathematische Diffusionsmodelle, speziell über das Carrier-Modell, zu sprechen. Zuvor jedoch will ich einige sehr triviale, dem Physiker und Chemiker geläufige erkenntnistheoretische Bemerkungen über mathematische Modelle machen, da erfahrungsgemäß das Denken in mathematischen Modellen leider immer wieder als nicht ganz adäquates Verfahren zur Erforschung komplizierter biologischer Systeme angesehen wird, vermutlich aus dem Gefühl heraus, daß die üppige Vielfalt des biologischen Geschehens — im Gegensatz zur Physik und Chemie, die für relativ einfach gehalten werden — durch die Mathematisierung bis zur Unkenntlichkeit verstümmelt werde. In praxi ist aber die Mathematisierung für das „Verständnis" um so wichtiger, je komplizierter das betrachtete System wird. Selbst dort, wo die Wirklichkeit für eine optimale Mathematisierung zu komplex ist, gestatten häufig die Aufstellung und Analyse eines primitiven mathematischen Modells immer noch einen tieferen Einblick in die Systemeigenschaften als die „anschauliche Vorstellung". Diese Behauptung läßt sich durch einige pragmatische Überlegungen beweisen: Jeder Planung eines Experimentes gehen Gedanken, meist bildliche Vorstellungen, über das betrachtete System und die zu erwartenden Ergebnisse des Experimentes voraus. Leider ist aber die anschauliche Vorstellung nicht in der Lage, mehr als drei oder vier Parameter eines Systems zu überblicken, und da selbst einfache biologische Systeme durch wesentlich mehr als drei oder vier Parameter bestimmt sind, muß man entweder das Gesamtsystem experimentell aufbrechen und Teilsysteme daraus isolieren, um die Anzahl der Parameter zu verringern und dadurch das Objekt, in Einzelteile zerlegt, der anschaulichen Vorstellung wieder zugänglich zu machen (hierin besteht häufig die Tätigkeit des Biochemikers), oder aber man muß das Gesamtsystem gedanklich zu zerpflücken versuchen und dann mathematisch wieder zusammensetzen. Hierzu ist man immer dann gezwungen, wenn sich ein kompliziertes System experimentell nicht weiter zerlegen läßt und darum als Ganzes anschaulich nicht mehr zu überblicken ist. Diese zweite Methode ist identisch mit der Aufstellung eines mathematischen Modells: Man macht einige vernünftige Annahmen über das Funktionieren gedachter, anschaulich übersehbarer Teilsysteme, steckt diese Annahmen als Prämissen in einen mathematischen Ansatz und überläßt dann die Ausrechnung des Ansatzes, also die Synthese der gedachten Teilsysteme zum Gesamtsystem, dem logisch zuverlässigen Automatismus der Mathematik. Aus der so gewonnenen, meist unanschaulichen, weil komplizierten, mathematischen Darstellung des Gesamtsystems lassen sich dann manchmal Systemeigenschaften herauslesen, die experimentell bestätigt oder widerlegt werden können. Meist stellt sich heraus, daß die Prämissen noch einige Male modifiziert werden müssen. Am

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Ende wünscht man sich Gleichungen, die am besten alle, zumindest aber die wesentlichen interessierenden Eigenschaften des natürlichen Systems auch bei Variation aller Parameter möglichst gut beschreiben. Wenn es geglückt ist, solche Gleichungen aufzustellen, dann sagt man, daß man das System bis zu einem gewissen Grade „verstanden" habe. Es kann dabei der abenteuerliche Fall eintreten, daß man in den Endgleichungen eine Fülle von Eigenschaften des Gesamtsystems entdeckt, an die man bei der Aufstellung der Prämissen entweder nur sehr verwaschen oder überhaupt nicht gedacht hatte, und nach denen man daher ohne Konstruktion eines Modells im Experiment auch nicht gesucht hätte. Bei der experimentellen Kontrolle eines mathematischen Modells sollte man versuchen, die Anzahl der frei verfügbaren Parameter mit Rücksicht auf den mathematischen Aufwand so klein wie möglich zu halten, dagegen aber jeden der freien Parameter so weit wie möglich zu variieren, sich also aus dem Geltungsbereich (Gleichgewichtsnähe) der Gleichungen 3) so weit zu entfernen, wie das System es zuläßt. Eine breite experimentelle Parametervariation ist wünschenswert, weil die mathematischen Modelle häufig gerade in Grenzfällen besonders charakteristische Aussagen über das System machen. Die viel geschmähten „unphysiologischen" Versuchsbedingungen können also in diesem Zusammenhange besonders wertvoll sein. Das mathematische Modell dient also zwei Zwecken: Es dient erstens der Schärfung des relativ verschwommenen natürlichen Anschauungsvermögens, um den Experimentator in komplizierten Situationen überhaupt erst in die Lage zu versetzen, gezielte Versuche zu planen. Diese sollen dann ihrerseits die von der Vorstellung entworfenen Prämissen des Modells entweder widerlegen oder bestätigen. Das mathematische Modell dient zweitens, soweit es nämlich die Eigenschaften des natürlichen Systems wiedergibt, dessen quantitativer Beschreibung. Die Beziehung zwischen Modell und Wirklichkeit ist allerdings nie ein-eindeutig, d. h. die Wirklichkeit enthält zwar alle Eigenschaften des Modells, das Modell enthält aber nicht die Eigenschaften der Wirklichkeit. Schließlich darf man eine Gefahr nicht vergessen, in die der Umgang mit mathematischen Modellen führen kann: Die intellektuelle Befriedigung über die Aufstellung eines brauchbaren mathematischen Modells kann dazu verführen, den erfolgreichen Ansatz als „den richtigen" anzusehen. Das ist natürlich ein Trugschluß, denn einmal ist die experimentelle Meßgenauigkeit selten so gut, daß in die Fehlerbreiten der gemessenen Funktionen neben den sogenannten richtigen, berechneten Funktionen nicht auch noch andere berechenbare Funktionen hineinpaßten, zum anderen ist es aber auch möglich, daß voneinander verschiedene anschauliche Vorstellungen von Teilsystemen selbst bei voneinander verschiedenen mathematischen Ansätzen zu identischen mathematischen Darstellungen der Gesamtsysteme führen. Im ersten Fall ist es vielleicht möglich, die Meßgenauigkeit zu erhöhen und ein experimentum crucis zu finden, das aus verschiedenen ähnlichen Modellen das beste auswählt. Im zweiten Fall ist es denkbar, daß eine Entscheidung prinzipiell nicht zu fällen ist und damit der Streit zwischen den verschiedenen Modellen sinnlos wird. Es könnte sich bei einer kritischen Analyse auch herausstellen, daß die Prämissen der Modelle nur scheinbar voneinander verschieden sind und sich ineinander überführen lassen. In der Regel sollte es aber entweder möglich sein, auf Grund der verschiedenen Vorstellungen, auf denen die Modelle aufgebaut worden sind, einen vollständig neuen experimentellen Zugang zu dem Problem zu finden, oder es

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sollte zumindest gelingen, durch einen Vergleich der Prämissen — beispielsweise auf Hypothesenfreiheit hin — eines der Modelle wahrscheinlicher und die anderen unwahrscheinlicher zu machen. Bevor man also ein erfolgreiches Modell für „richtig" halten darf, hat man zu zeigen, daß nicht andere Vorstellungen zu sehr ähnlichen oder sogar formal identischen mathematischen Modellen führen. Diese Aufgabe ist mit Sicherheit schwieriger als die Aufstellung eines einzelnen guten Modells. Nach diesen allgemeinen Bemerkungen über den Wert des Modelldenkens möchte ich zu den speziellen mathematischen Modellen für Diffusionsprozesse durch biologische Membranen zurückkehren: Die biologischen Membranen sind typische Beispiele für physikalisch-chemisch höchst komplizierte Systeme, die sich experimentell nicht weiter zerlegen lassen, ohne ihre spezifischen Eigenschaften zu verlieren, die also so hingenommen werden müssen, wie sie sind. Wir sind daher bei der Untersuchung von bestimmten Permeationsmechanismen einfach zum mathematischen Modelldenken gezwungen. Das eigentliche Dilemma, in dem sich die Permeabilitätsforschung momentan befindet, ist, daß die natürlichen Systeme für einen fairen kritischen Vergleich mit den bisher aufgestellten mathematischen Modellen viel zu kompliziert sind und sich die mathematischen Modelle mit Hilfe der herkömmlichen Rechenverfahren unter vertretbarem Zeitaufwand nicht weiter vervollständigen lassen."") Selbst das Hinzuziehen von elektronischen Rechenanlagen hilft nur bedingt weiter, wenn man den Ehrgeiz hat, das Resultat der Rechnung in analytischer Darstellung und nicht als Bibliothek von Kurvenscharen zu besitzen. Die bisher aufgestellten mathematischen Modelle für die Membrandiffusion sind infolgedessen — verglichen mit der vermutlichen Komplexität der natürlichen Systeme — ziemlich primitiv. Das enorme Pensum an Rechenarbeit, das bei der Aufstellung von mathematischen Diffusionsmodellen evtl. erledigt werden muß, ist die letzte der vier Schwierigkeiten bei der Bestimmung von Membranpermeabilitäten bzw. der Aufklärung von Diffusionskinetiken, die ich hier erwähnen wollte. Sie wiegt meines Erachtens schwerer als die eingangs gestreifte experimentelle Unzugänglichkeit der Membranen, weil die experimentellen Komplikationen grundsätzlich bei der Aufstellung eines Modells berücksichtigt werden können. Im zweiten Teil des Vortrages möchte ich ein spezielles Diffusions-Modell kritisch diskutieren, das sich als außerordentlich erfolgreich erwiesen hat, weil es zahlreiche experimentelle Befunde qualitativ und quantitativ beschreiben kann, nämlich die Gleichungen für die Diffusion über einen beweglichen Carrier. Dabei möchte ich mich bewußt auf solche Typen der Carrier-vermittelten Diffusion beschränken, an denen der Stoffwechsel nicht unmittelbar beteiligt ist, da unsere Vorstellungen über das detaillierte Zusammenwirken von Stoffwechsel und Transport trotz einer Reihe von im Prinzip recht bemerkenswerten Hypothesen noch so unklar sind, daß sich die Einbeziehung des Stoffwechsels in *) Beispielsweise müssen zur Berechnung des Flusses einer Teilchensorte durch eine enge Pore, in die maximal m Teilchen hintereinanderliegend hineinpassen, bei Gegenwart von insgesamt n verschiedenen Teilchensorten (n + 1)™ Gleichungen mit ebenso vielen Unbekannten gelöst werden. Für kleine Werte von m ist die Koeffizienten-Matrix dieses Gleichungssystems etwa zur Hälfte bis zu einem Drittel mit Größen ungleich Null gefüllt, wenn nur unimolekulare Diffusionsschritte erlaubt sind; werden höhermolekulare Diffusionsschritte zugelassen, dann sind praktisch alle Elemente der Matrix von Null verschieden.

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eine mathematische Modell-Darstellung der Membrandiifusion nicht lohnt. Ein mathematisches Modell hierfür aufzustellen, ist erst dann sinnvoll, wenn gezeigt worden ist, welche der für den Transport verantwortlichen Stoffwechselreaktionen in oder an der Membran ablaufen. Dieses Stadium haben wir meines Erachtens aber noch nicht erreicht. Das Carrier-Konzept ist so erfolgreich gewesen, daß über die Eindeutigkeit der Beziehung zwischen Modell und Wirklichkeit — von gelegentlichen skeptischen Bemerkungen abgesehen — garnicht mehr diskutiert wird und daher der Eindruck entstehen könnte, die Existenz des beweglichen Carriers sei bewiesen. Dieser Zustand ist bedrückend, weil die Phantasie erlahmt, wenn die Diskussion einschläft und weil daher Experimente unterbleiben, die eine tiefere Einsicht in die wirklichen Zusammenhänge verschaffen könnten. Die Existenz eines beweglichen Carriers wird aus einer Reihe von Gründen für plausibel gehalten, von denen hier nur die wichtigsten aufgezählt werden sollen und zwar nach Befund und daraus gezogener Konsequenz getrennt: 1. Die Transportkapazität der Membran ist begrenzt. Flüsse streben bei einseitiger Konzentrationserhöhung gegen einen Grenzwert: In der Membran befindet sich eine nur begrenzte Anzahl von Bindungsstellen, über die der Transport läuft. Die Bindungsstellen befinden sich möglicherweise am Carrier. 2. Die Diffusion des Substrates zeigt ausgeprägte Struktur- und Stereo-Spezifität: Die Substratspezifität ist eine Eigenschaft der Bindungsstellen und damit eventuell des Carriers. 3. Einige Eigentümlichkeiten der Teilchenflüsse, die nur bei Gegenwart mehrerer verschiedener Substrate beobachtet werden können und als Ausdruck kompetitiver Reaktionen angesehen werden müssen, lassen sich zwanglos durch die Annahme von beweglichen Carriern erklären: Das Auffinden eben dieser kinetischen Phänomene beweist die Existenz von beweglichen Carriern (6, 11, 16, 17). Hierzu ist zu sagen: ad 1: Die Transportsättigung erfolgt irgendwo in der Membran; ob auf Grund einer begrenzten Anzahl von Bindungsstellen oder einer begrenzten Löslichkeit des Substrates in der Lipoidphase, bleibt offen. ad 2: Die Stereospezifität zeigt (eher als die Strukturspezifltät), daß der Transport wahrscheinlich unter anderem auch über Bindungsstellen läuft. ad 3: Das Carrier-Modell steht mit den experimentellen kinetischen Befunden in Einklang. Die kinetischen Phänomene bewiesen die Existenz des beweglichen Carriers erst dann, wenn nachgewiesen werden könnte, daß sie sich auf andere Weise nicht erklären lassen. Dieser Nachweis ist nicht geführt worden. Die Punkte 1 und 2 sagen nichts über die Beweglichkeit der Bindungsstellen aus und sind auch nie als Beweise, sondern nur als Anhaltspunkte für die Existenz eines beweglichen Carriers angeführt worden. Zu Punkt 3 soll im Folgenden gezeigt werden, daß sich

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tatsächlich ein physikalisch vernünftiges Alternativmodell finden läßt, das zumindest qualitativ die gleichen kinetischen Besonderheiten wie das Carrier-Modell besitzt. Es ist wahrscheinlich, daß es noch andere Modelle gibt, die Ähnliches leisten. Zur Diskussion des Punktes 3 möchte ich die Flußgleichungen für Carrier-vermittelte Diffusion ohne Stoff Wechselbeitrag in einer einfachen Form hinschreiben:

4)

e, = -£j_ {Sl'-sn

S' = S^ + S 2 ';

+

2N(B

B

+2C)(s^-Sl-s2o

S" = Si" + S 2 "

Diese Gleichungen gelten für den stationären Nettofluß θ ι [sec -1 ] der Substanz pi (Konzentrationen Si' u. Si") in Gegenwart der Substanz p2 (Konzentrationen S2' u. S2") und vice versa: Sie geben die Anzahl von Teilchen an, die pro Sekunde über ein Carriermolekül die Membran durchqueren. Die Prämissen der Gleichungen 4) sind: a) Die Substanzen pi und p2 sind elektrisch ungeladen, chemisch identisch und physikalisch voneinander unterscheidbar. b) Die Membran kann nur über den Carrier durchquert werden. c) Der Carrier nimmt maximal ein Teilchen auf. d) Der Carrier diffundiert zwischen den beiden Membranoberflächen mit der mittleren Häufigkeit C [sec -1 ] hin und her. Die Wanderungsgeschwindigkeit des Carriers ist also unabhängig davon, ob er beladen ist oder nicht. e) Die Größe A [Ltr.-Mol~ 1 -sec _1 ] bedeutet die mittlere Häufigkeit, mit der Teilchen, die sich auf einer der Außenseiten der Membran befinden, auf das freie Carriermolekül an der Membranoberfläche springen. B [sec"1] ist die mittlere Häufigkeit, mit der Teilchen den Carrier an der Membranoberfläche wieder verlassen (das durch die Gleichungen 4) beschriebene Modell setzt also eine Symmetrie der Membran voraus). Ein Sprung vom Carrier in die Außenlösung wird durch die Gegenwart anderer Teilchen in der Außenlösung nicht beeinflußt (B ist eine Konstante). f) Teilchen können nur auf den freien Carrier springen: Ein direkter bimolekularer Austausch zwischen Teilchen auf dem Carrier und Teilchen im Außenraum ist nicht erlaubt. Die Übergangshäufigkeiten AS, B und C werden durch Abb. 1 noch einmal erläutert. Die Gleichungen 4) sind für gasförmige pi und p2 abgeleitet worden. Sie stellen aber auch die Diffusion von gelösten pi und p2 dar, wenn man annimmt, daß das Lösungsmittel auf beiden Seiten der Membran die gleiche Aktivität hat und sein Einfluß auf die Diffusionskinetik durch die Konstanten A, B und C vollständig beschrieben wird. 4 Karlson, Mechanisms of Hormone Action

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Abb. 1. Mittlere Ubergangshäufigkeiten im Carrier-Modell (Gleidiungen 4)). AS'

1 B

i i

I I

i

As<

; c_

— I I

-

R

Die Gleichungen 4) sagen nichts darüber aus, ob der Carrier eine individuelle Molekel ist und — in der Membran gelöst — frei diffundieren kann, ob er irgendwo an der Membranstruktur verankert ist und zwischen den Membranoberflächen hin und her pendelt oder ob er eine rotierende Gruppe ist. Das Wesentliche und Gemeinsame dieser drei Möglichkeiten ist, daß ein diffundierendes Teilchen sich mit einem beweglichen Bestandteil der Membran verbindet und mit diesem zusammen durch die Membran hindurchwandert. Andere Carrier-Diffusionsmechanismen, bei denen sich Teilchen und Carrier nur über eine kürzere Strecke im Innern der Membran gemeinsam bewegen, enthalten das durch die Gleichungen 4) beschriebene Diffusionselement — eventuell etwas verändert — zusammen mit anderen Diffusionselementen und werden infolgedessen durch entsprechend kompliziertere Gleichungen beschrieben. Andere zusätzliche Komplikationen, beispielsweise eine Unsymmetrie der Membran oder verschiedene Beweglichkeiten des Carriers im beladenen und unbeladenen Zustand, verlängern die Flußgleichungen nur noch weiter, ändern aber an den kinetischen Merkmalen, die nach Punkt 3) für die Carrier-vermittelte Diffusion charakteristisch sein sollen, im Prinzip nichts. Diese beiden kinetischen Merkmale sind „Gegendiffusion" und „Gegenbeschleunigung" genannt worden (17): „Gegendiffusion" bezeichnet das Phänomen, daß der Fluß Θι nicht zusammen mit ASi verschwindet, sondern proportional der Konzentrationsdifferenz der zweiten Teilchensorte wird und dem Konzentrationsgefälle der p2 entgegen läuft. Einsetzen der Bedingung (Si' = Si" = Si) in die Gleichungen 4) ergibt: 5)

0! =

BC Si (S2' 2N (B + 2C)

N -

S' +

B

s2')

+

2B S' + S" + ■

„Gegenbeschleunigung" soll bedeuten, daß der Fluß Θι bei konstanten Si' und Si", (Si' φ Si"), durch Anheben der auf beiden Seiten der Membran gleichen Konzentration der p2 in gewissen Konzentrationsbereichen vergrößert werden kann. Für (S2' = S2" = S2) erhält man aus den Gleichungen 4):

Die Permeabilität biologischer Membranen 6)

0! = N

BC 2NA

-(S'

+

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■(Si'-Si")

X)(S^+-T)+X(S,

+ S,,+

-X)

Dieser Effekt wird besonders deutlich, wenn (Si' » S27) und (Si" » S2//), da dann der Nenner N unabhängig von S2 und somit konstant wird. Es ist jetzt zu zeigen, daß die Phänomene „Gegendiffusion" und „Gegenbeschleunigung" nicht an die Vorstellung eines beweglichen Carriers gebunden sind: Bei der Diskussion der Flußgleichungen für „single filea-Diifusion durch Poren mit zwei hintereinanderliegenden Plätzen fiel auf, daß das Aufheben des Vertauschungsverbotes für die mittlere Barriere der Pore zu Flußgleichungen führt, die den Gleichungen 4) bis auf das Fehlen des Faktors 2 in den Nennern vollständig gleichen (3). Durch diese rein mathematische Operation wurde neben den schon vorher erlaubten monomolekularen Sprüngen von Teilchen auf benachbarte leere Plätze noch eine rotatorische bimolekulare Reaktion, eben der Platztausch zweier nebeneinander liegender Teilchen im Innern der Pore, eingeführt. Diese Reaktion wurde der Einfachheit halber durch die gleiche Reaktionsgeschwindigkeitskonstante C gekennzeichnet wie der Sprung eines einzelnen Teilchens über dieselbe Barriere auf eine benachbarte Leerstelle. Ob dieses Modell, der unvermittelte rotatorische Platztausch zweier benachbarter Teilchen in einer sehr engen Pore, auf irgendeine wirkliche Situation paßt, ist fraglich; sicher ist aber, daß diese neue Flußgleichung wieder ein Carriermodell beschreibt, ohne daß der Carrier — anders als bei den Gleichungen 4) — explizit in den Ansatz hineingesteckt worden wäre. (Der Carrier könnte in diesem Fall beispielsweise eine rotierende Gruppe mit zwei einander gegenüberliegenden Haftstellen sein.) Auf diesen Befund hin drängte sich natürlich die Frage auf, ob bimolekulare rotatorische Platzwechselreaktionen, die in diesem speziellen Beispiel möglicherweise nur in Gegenwart eines Carriers ablaufen können, nicht in etwas anderer geometrischer Anordnung auch allein, ohne Anwesenheit eines Carriers, in den Diffusionsprozeß eingeschaltet sein und zumindest qualitativ ähnliche kinetische Merkwürdigkeiten zuwege bringen können, wie es ein Carrier tun würde. Bimolekulare Substitutionsreaktionen, die hierfür als Vorbild dienen könnten, sind bekannt und auch schon als mögliche Erklärung für die „Gegendiffusion" genannt worden (4). Durch Einführung von bimolekularen rotatorischen Platzwechselreaktionen zwischen Teilchen auf Plätzen in den Membranoberflächen einerseits und Teilchen in den Außenräumen andererseits gelang die Konstruktion von mathematischen Modellen, die den Gegendiffusionseffekt allein enthalten. „Gegendiffusion" und „Gegenbeschleunigung" zusammen lieferten die Modelle aber nur dann, wenn die Platzwechselreaktion nicht an der Oberfläche, sondern im Innern der Membran untergebracht worden war. Da uns die Platzwechselreaktion in engen Poren nicht plausibel erschien, verlegten wir sie von den Grenzflächen Membran/Außenraum an die Grenzflächen Proteinschicht/Lipoidschicht. Dem bisher besten Alternativmodell liegt im wesentlichen das Bild von der Davson-Danielli'schen Einheitsmembran zugrunde: ein bimolekularer Film von lipoidem Material, an beiden Seiten von einer dünnen Schicht von Protein überzogen. Vom Lipoidfilm weiß man, daß der Ordnungszustand der Kohlenwasserstoffgruppen mehr oder

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weniger flüssig und eventuell schwach anisotrop ist. Diffusion durch den Lipoidfllm sollte sich also in erster Näherung als Diffusion durch eine Flüssigkeit darstellen lassen. Diese Flüssigkeit hat obendrein ein nur begrenztes Lösungsvermögen für das diffundierende Substrat. Im Gegensatz zum Lipoidfilm sind die beiderseits aufliegenden Proteinschichten, zusammen mit den polaren Gruppen der Lipoide, mit Sicherheit nicht als Flüssigkeit anzusehen. Die Diffusion läuft hier höchstwahrscheinlich durch enge Poren und über Bindungsstellen. Das einfachste Modell, das man aus diesen Vorstellungen ableiten kann und das sowohl „Gegendiffusion" als auch „Gegenbeschleunigung" liefert, approximiert den Lipoidfilm durch eine flüssige Phase mit endlichem Lösungsvermögen für das Substrat und die beiden Proteinschichten durch Siebe, deren Maschenweite etwa gleich dem Durchmesser des diffundierenden Substrates sind. Die Diffusion durch das Sieb wird durch einen einfachen Leerstellenmechanismus angenähert, und die bimolekularen, rotatorischen Platzwechselreaktionen sollen nur über die Diffusionsbarrieren zwischen Protein und Lipoid hinweg ablaufen. Das Substrat kann also sowohl über eine bimolekulare Platzwechselreaktion als auch über normale monomolekulare Sprünge vom Protein in den Lipoidfilm gelangen."*) Andere bimolekulare Reaktionen sollen zunächst bewußt weggelassen werden, um das Bild nicht zu verkomplizieren und das Prinzip möglichst deutlich zu machen. Man sollte annehmen, daß rotatorische Platzwechselreaktionen vom hier beschriebenen Typ zusätzlich an der Grenzfläche Protein/Außenraum ablaufen können und daß noch ein linearer Typ von bimolekularer Platzwechselreaktion auftritt, bei dem ein Teilchen ein anderes vor sich herschiebt und so aus dessen Platz verdrängt. Die gröbste Vereinfachung gegenüber der Wirklichkeit besteht bei diesem Modell wahrscheinlich in der Annahme einfacher Bindungsstellen oder Plätze in den Proteinschichten. Vermutlich hat man es beim Durchtritt von Teilchen durch das Protein in Wirklichkeit mit einer komplizierten Mischung von freier, behinderter und ,,single-file"-Diffusion zu tun, die sich mathematisch garnicht oder nur sehr gezwungen formulieren läßt. Weitere Vereinfachungen bestehen darin, daß im Innern des Lipoidfilmes Mischbarkeit der verschiedenen Substrate und beliebig schnelle Gleichgewichtseinstellung senkrecht zur Diffusionsrichtung vorausgesetzt werden und daß man jeder Pore in der linken Proteinschicht eine Pore in der rechten Proteinschicht zuordnen kann. Sodann wird — um bei der Berechnung des Flusses das Lösen einer Gleichung 3. Grades in Θι zu vermeiden — vorausgesetzt, daß das Substrat auf den Plätzen in den Proteinschichten sich im *) Als Grund für das Auftreten von bimolekularen Platzwediselreaktionen könnte beispielsweise angenommen werden, daß das Substrat auf den Plätzen im Protein über Dipol- oder Wasserstoffbrückenbindungen relativ fest (und gegebenenfalls spezifisch) gebunden ist und das Ablösen einer Substrat - Molekel von der Bindungsstelle leichter erfolgt, wenn die Bindungen von einem zweiten Molekül des Substrates simultan wieder geknüpft werden. Monomolekulare Sprünge sind dann dadurdi zu erklären, daß die Bindungsstellen nidit notwendigerweise von einer zweiten Substratmolekel gesdilossen werden müssen sondern audi vom Lösungsmittel besetzt werden können. Monomolekulare Übergänge in diesem System sind dann im Grunde ebenfalls Reaktionen höherer Molekularität, nur äußert sich das wegen des großen Überschusses von Lösungsmittel gegenüber Substrat nicht in der Reaktionsordnung. Es ist möglich, daß an den rotatorischen Platzwechselreaktionen Paare von Substratmolekeln im Lipoidfilm beteiligt sind, deren einer Partner in einer Simultanreaktion gegen eine Substratmolekel in der Proteinschicht ausgetauscht wird.

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Gleichgewicht"") mit dem Substrat in den jeweils angrenzenden Außenräumen befindet (C, D, w « SA, B; siehe Abb. 2). Schließlich wird angenommen, daß das Lösungsmittel zu beiden Seiten der Membran die gleiche Aktivität hat und die Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten die Beteiligung des Lösungsmittels an den DifTusionsmechanismen vollständig beschreiben. Die einzelnen Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten oder Übergangshäufigkeiten des Modells sind durch Abb. 2 definiert.

Ai

A'S'

B

ϋ

Abb. 2. Mittlere Übergangshäufigkeiten im Substitutionsmodell (Gleichung 7).

Die auf ein Porenpaar bezogene Flußgleichung für die Teilchensorte pi in Gegenwart des Isotops p2 lautet dann: 7)

rK

rO

θ ι = - j j - (Si'-Sx") + - j j - (Si'S 8 "-Si"S 2 ') ; [sec"»]

N = (S' + K)(S" + K) + r

(S' + K*)(S" + K*) + -r Q =

wobei

_

+

_ )

/S"

+ ( S '' +

K*\

K)(^ ,

+

— )

/S'

Γ /S" K*\ /S' (S' + K*)(S" + K*) + r [(S' + K*> ( ^ + j ^ j + (S" + K*) ( V

K*\

+

K*\ D7" )

B'D' B"D" K = -£7^7 = - ^ τ ^ ; [Mol. · Ltr."*] Si', Si" , S 2 ', S 2 " ; [Mol..Ltr.-i] Si' + S2' = S' ; Si" + S 2 " = S"

*) Systeme, bei denen beispielsweise der Eintritt in die Membran eine relativ hohe Aktivierungs énergie benötigt (kleines A), werden durch das Modell nicht beschrieben.

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A ' , A" ; [Ltr. · ΜοΓ* · sec"*]. B ' , B" , C , C" , D ' , D" , w ' , w" , d ; [sec"*] C C" k = —- = —- ; dimensionslos w w K* = K k ; r=

d n— 1

;

[Mol.-Ltr.-i] [sec *]

Die Ableitung und eine eingehende Diskussion der Gleichung 7) müssen hier unterbleiben und sollen daher an anderer Stelle veröffentlicht werden. Es genügt hier zu wissen, daß die Funktionen N und Q positiv sind. Die Existenz der beiden Phänomene „Gegendiffusion" und „Gegenbeschleunigung" in diesem Modell läßt sich dann sofort zeigen: „Gegendiffusion": Einsetzen von (Si' = Si" = Si) in 7) ergibt: 8)

0!=

^Sl(S2''-S2')

„Gegenbeschleunigung": Einsetzen von (S-/ = S2" = S2) in 7) liefert unter der zusätzlichen vereinfachenden Annahme (k = 1):

9)

rK

θ!=—

/

S2 \

(Sl'-sn(i + l r )

Man sieht sofort, daß auch hier — ebenso wie in Gleichung 6) — die „Gegenbeschleunigung" besonders deutlich zutage tritt, wenn (Si' » S2') und (Si" » S2") wird, da dann N eine Konstante ist. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die beiden kinetischen Effekte „Gegendiffusion" und „Gegenbeschleunigung", die als typische Eigenschaften der Carrier-vermittelten Diffusion angesehen wurden, auch in Carrier-freien Modellen gefunden werden können und infolgedessen nicht durch Diffusion des Substrates über einen beweglichen Carrier gedeutet werden müssen. „Gegendiffusion" und „Gegenbeschleunigung" können mindestens zwei Ursachen haben: den beweglichen Carrier und bimolekulare rotatorische Platzwechselreaktionen im Innern der Membran. Die Beweisführung für die Existenz des beweglichen Carriers, die sich auf das Vorkommen der beiden genannten kinetischen Effekte beruft, ist also nicht schlüssig. Das Carriermodell selbst ist damit natürlich nicht widerlegt! Das Alternativmodell, das wir „Substitutionsmodell" nennen möchten, ist in Form von Gleichung 7) noch so unvollständig, daß es nur sehr extreme Situationen zu beschreiben vermag (Gleichgewicht des Substrates zwischen Protein und Außenraum wegen ( C , D ' ,

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w' « S'A' , B' ; C" , D " , w" « S"A" , B"), Fehlen von linearen Substitutionsreaktionen etc.). In mindestens einem Falle stimmt es aber mit experimentell bestimmten Flüssen gut überein. Es ist dies der Grenzfall sehr kleiner Werte von r, für den Gleichung 7) in den Grenzfall sehr kleiner Werte von C in Gleichung 4) übergeht, wenn man von der verschiedenen Bedeutung der Konstanten in beiden Modellen einmal absieht. Für diesen Spezialfall wurde nämlich bei einer Reihe von Systemen quantitative Übereinstimmung von Gleichung 4) mit experimentellen Daten gefunden (10, 15, 19). Die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte sind hier die Diffusion des Substrates allein (r in 7)) bzw. die Diffusion des beladenen oder unbeladenen Carriers (C in 4)) durch den Lipoidfilm der Membran. Das Substitutionsmodell in Form von Gleichung 7) kann schließlich sogar ohne jede Änderung als ein Carrier-Modell aufgefaßt werden, wenn man annimmt, daß die bimolekularen Übergänge des Substrates zwischen Protein und Lipoidfilm Carrier-vermittelt sind und man die Bedeutung der Konstanten O , D ' und w' etc. entsprechend modifiziert. Es ist sogar denkbar, daß nicht nur das hier beschriebene Substitutionsmodell sondern jedes Alternativmodell für die Carrier-vermittelte Diffusion sich durch Hinzudenken des Carriers in ein Carrier-Modell überführen läßt und umgekehrt jedes Carrier-Modell durch Hinwegdenken des Carriers zu einem anderen Modell, beispielsweise zu einem Substitutionsmodell wird. Eine Entscheidung zwischen verschiedenen Diffusionsmodellen wäre dann auf dem Wege über eine Analyse kinetischer Daten allein nicht zu fällen. Die Auswahl eines Modells sollte dann möglich sein, wenn die physikalische Interpretation der kinetisch gewonnenen Konstanten durch unabhängige Experimente kontrollierbar ist. Als Beispiel hierfür sei wiederum der einfache Fall der formalen Identität der Gleichungen 4) und 7) (für sehr kleine Werte von C bzw. r) angeführt: Die Konstanten B/A in Gleichung 4) und K in Gleichung 7) stellen — entsprechend den Prämissen der beiden Modelle — bis auf einen bestimmbaren Normierungsfaktor die Verteilungsquotienten des Substrates zwischen Wasser und Carrier bzw. Wasser und Carrier-freiem Lipoidfilm dar. Diese beiden Annahmen können eventuell durch Vergleich der kinetisch ermittelten Zahlenwerte dieser Konstanten mit direkt gemessenen Verteilungsquotienten des Substrates zwischen Wasser und geeignet gewählten lipoiden Phasen überprüft werden. Sollten die aus Verteilungsexperimenten gewonnenen und die aus kinetischen Untersuchungen ermittelten Verteilungsquotienten für eine Reihe von Substanzen stark oder sogar unsystematisch voneinander abweichen, dann sind die Experimente nicht schlüssig, da die Diskrepanzen sowohl auf der Gegenwart von spezifischen Carriern im Lipoidfilm der Membran als auch auf möglichen Unterschieden im Lösungsvermögen zwischen dem eventuell Carrier-freien Lipoidfilm der Membran und der im Verteilungsexperiment benutzten lipoiden Phase beruhen können. Sollten die Verteilungsquotienten jedoch gut miteinander übereinstimmen oder zumindest auf vernünftige Weise (z. B. über einen linearen Zusammenhang) miteinander korreliert sein, dann würde dadurch das Substitutionsmodell gegenüber dem CarrierModell das größere Gewicht erlangen, da die im Verteilungsexperiment benutzte lipoide Phase den Carrier nicht enthält und eine systematische gegenseitige Kompensation der beiden Effekte, die als Ursache einer eventuellen Diskrepanz zwischen den Verteilungsquotienten genannt wurden, unwahrscheinlich ist; zumindest könnte man schließen, daß der Carrier sich nicht im Lipoidfilm der Membran befindet. Sollte er sich aber an einer anderen Stelle

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— ζ. Β. in den Proteinschichten — aufhalten, dann müßten die der Gleichung 4) zugrundeliegenden Prämissen entsprechend modifiziert werden. Die Zusammenhänge zwischen Durchtrittsvermögen durch Zellmembranen und Verteilungsquotient Wasser/Öl sind für eine Reihe von Substanzen schon eingehend untersucht worden (14, 18). Im Hinblick auf die hier angeschnittenen Fragen wäre es aber lohnend, solche Messungen noch einmal zu wiederholen und dabei die für die Stabilität bimolekularer Lipoidfilme wesentlichen stöchiometrischen Zusammenhänge bei der Wahl der lipoiden Phasen zu berücksichtigen. Dabei kann man natürlich nicht von vornherein erwarten, daß der hydrophobe, schwach anisotrope Kern eines bimolekularen Lipoidfilmes und eine diesem Kern in der chemischen Zusammensetzung optimal nachgebildete isotrope Lipoidphase im Lösungsvermögen genau übereinstimmen (14). Sollten sich auf die eben an einem Beispiel erläuterte Weise die Prämissen eines Modells als denen anderer Modelle überlegen erweisen, dann ist damit natürlich — das sei zum Schluß noch einmal ausdrücklich betont — die „Richtigkeit" dieser Prämissen nicht bewiesen; das gilt für das Carrier-Modell ebenso wie für das hier skizzierte Substitutionsmodell sowie für jedes andere Alternativmodell.

Summary The details of the kinetics of particle diffusion through biological membranes have not yet been clarified for even a single case. The first part of this report enumerates and discusses the primary reasons for this unsatisfactory state of affairs. Firstly, two difficulties encountered in the experimental determination of membrane permeability are described; these are the Nernst diffusion layers and the parallel diffusion paths with various flow mechanisms. Secondly, it is indicated that the frequently used concept of „permeability" is not suitable for representing these complex diffusion systems provided permeability is considered as a passive property of a membrane; the complex system should be described either in terms of the phenomenological flow equations of irreversible thermodynamics or, even more appropriately, by a mathematical model. It is shown that the formulation of a mathematical model for representation and understanding of complex diffusion processes occurring through biological membranes is indispensible, although frequently the computations involved are too complex to be tackled by conventional methods. The second part of the report presents a critical evaluation of a special model, that is, the diffusion flow equation involving a mobile carrier. It seems that the phenomena of „counter-transport" and „counter-acceleration" — whose appearance in a system is frequently considered as a proof of the presence of mobile carriers — are merely an expression of a rotatory bimolecular substitution reaction. The latter, however, can proceed either with or without a mobile carrier. It thus appears that the existence of mobile carriers cannot be proved or disproved by kinetic data alone. It is proposed that new and careful studies be made to interpret the kinetic constants of the obviously ambiguous flow equations. Such studies should include the determination of the distribution ratios between lipoid and aqueous phases.

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Literatur 1. Fatt, P.: Proc. Roy. Soc. B 159 (1964), 606. 2. Falk, G., P. Fatt: Proc. Roy. Soc. B 160 (1964), 69. 3. Heckmann, K.: Funktionelle und morphologische Struktur der Zelle. Springer, Berlin 1963. 4. Heinz, E.: Amino acid pools. Elsevier, New York 1962. 5. Helfferich, F.: Ionenaustauscher, Bd. I. Verlag Chemie, Weinheim 1959. 6. Jacquez, J. A.: Proc. nat. Acad. Sei. (Wash.) 47 (1961), 153. 7. Katchalsky, A.: Membrane transport and metabolism. Academic Press, New York 1960. 8. Kedem, O., A. Katchalsky: Biochim. biophys. Acta (Amst.) 27 (1958), 229. 9. Kedem, O.: Membrane transport and metabolism. Academic Press, New York 1960.

10. Regen, D. M.y H. E. Morgan: Biochim. biophys. Acta (Amst.) 79 (1964), 151. 11. Rosenberg, T., W. Wilbrandt: J. gen. Physiol. 41 (1957), 289. 12. Schlögl, R.: Habilitationsschrift. Göttingen 1957. 13. Vielstich, W'.: Z. Elektrochemie 57 (1953), 646. 14. Wartiovaara, V., R. Collander: Protoplasmatologia, Bd. II. Springer, Wien 1960. 15. Widdas, W. F.: J. Physiol. (Lond.) 118 (1952), 23. 16. Wilbrandt, W., T. Rosenberg: Pharmacol. Rev. 13 (1961), 109. 17. Wilbrandt, W'.: Funktionelle und morphologische Struktur der Zelle. Springer, Berlin 1963. 18. Wilbrandt, W.: Ergebn. Physiol. 40 (1938), 204. 19. Wilbrandt, W.: Biochemie des aktiven Transportes. Springer, Berlin 1961.

Diskussion RÄNDLE: YOU would agree that the question of counterflow is the crucial point of evidence in relation to the mobile carrier theory? HECKMANN: Yes, insofar as counterflow is a necessary consequence of diffusion via a mobile carrier. But this argument cannot be reversed: Diffusion via a mobile carrier is not a necessary consequence of counterflow. GIBIAN: You made a model of this rotational exchange; you thought of two identical molecules, in which case there is no net difference before the rotation and afterwards. How can you now speak of a flux in this system, only a dynamic equilibrium? HECKMANN: The rotational exchange of two identical molecules does not contribute to the net flux, it does however produce a flux of either a tracer or a different molecular species. RASMUSSEN: In the case of a difference in glucose concentration across the membrane, do you get a different mechanism? Can't you have passive transport in which you do not necessarily have this bimolecular exchange? HECKMANN: Yes, in addition to bimolecular reactions (w in Fig. 2) the model also allows for monomolecular reactions (A, B, C, D in Fig. 2). The bimolecular reactions are predominant at high substrate concentrations, the monomolecular reactions at low concentrations. HECHTER: May not one say that the exchange mechanism you have discussed is in some way similar to the situation which one obtains in an ion exchanger? In the case of a cation-exchanger, there are specific sites available for cations; the cations which serve as counterions to the exchanger resin have the possibility for mobility, but this mobility is determined by the fact that unless another cation takes its place, to satisfy electrostatic forces, the counterion cannot „jump". HECKMANN: Yes.

HECHTER: If now — instead of electrostatic forces — one used hydrogen bonding sites and distributed them in a long-file pore, this is somewhat analogous to the mobility of an ion in an ion exchanger, and might correspond to an exchange diffusion process in these sites. HECKMANN: I agree.

HECHTER: Perhaps I might make an additional comment. In your discussion of the phenomenological equations of irreversible thermodynamics, you stated that one runs into very difficult

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Diskussion

mathematical relationships which limit the applicability of this approach. Now, it is my understanding that A. KATCHALSKY and O. KEDEM, using the ONSAGER relationship, have in effect derived relatively simple mathematical formulations where the phenomenological equations have coefficients which are expressed in terms of frictionai coefficients. HECKMANN: From a mathematical point of view the phenomenological equations are simple. When I talked of difficult mathematical relationships, I meant detailed mathematical models and not the phenomenological equationsHECHTER: IS this not a satisfactory approach, starting from fundamental principles then to direct experimental investigation? HECKMANN: There are three things to be said here: firstly, it is a disadvantage of the phenomenological equations that they operate only very close to equilibrium; secondly, to talk of ,friction' coefficients means that one is also introducing a model into the phenomenological equations, although not a very detailed one; finally the term ,friction' would have to be heavily loaded with additional attributes in order to explain such a specific phenomenon as counterflow. HECHTER: Well, my unterstanding is that the friction relates to interactions, solvent-solvent, solute-solvent, and so on. It is necessary to make a model of the macromolecules involved in the „pores" and it is at this level, where the difficulty really develops. HECKMANN: Yes, the more information in terms of chemical kinetics one wants to extract from the measured phenomenological coefficients, the more detailed and the more complicated are the models one has to construct to compare with the phenomenological equations. HECHTER: T O return to Dr. RANDLE'S question about counterflow, it would be very helpful if you could draw a more detailed model of how you visualize glucose translocation in a pore. It is not clear, at least in my mind, how an exchange mechanism can account for the counterflow data. If you could provide us with a formal mechanism, that satisfactorily accounts for the counterflow independent of a mobile carrier, this would be most important. As I see it, the drawing that you have made seems to be incomplete. HECKMANN: Let me answer with another little drawing, which is even less complete but perhaps easier to understand. Let us assume a permeable membrane consisting of a single energy barrier with sites on either side which can adsorb particles. Now the particles can move in 6 different ways that determine the flux. They can — from left to right — 1) enter a site from the outside, 2) leave the site again, 3) traverse the membrane and jump on to a vacancy on the other side, 4) traverse the membrane and thereby knock another particle out of its site, 5) enter a site from outside by simultaneously pushing another particle across the membrane, 6) enter a site from the outside by simultaneously squeezing another particle back into the reservoir. Reactions of still higher molecularity could also take place but are to be neglected here in order not to complicate things further. The three first reactions are monomolecular, the three last reactions arc bimolecular. It is the last reaction (No. 6) which can in principle produce counterflow. Whether it does so or not depends on the relative size of the velocity constants of the reactions 4) to 6). This model is the incomplete one I mentioned in my lecture. It can only show

Fig. 3. Monomolecular and bimolecular processes for crossing a single energy barrier.

Diskussion

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counterflow, „Gegendiffusion", but not „Gegenbeschleunigung". The reactions 4) to 6) are formally very similar to the SN2 mechanisms one finds in chemical kinetics. One example of a bimolecular exchange reaction taken from biochemistry is the cleavage of ThPP-acetaldehyde. It has been observed by Hölzer that in ThPP-acetaldehyde, the bimolecular exchange of the aldehyde sticking to the T h P P for another molecule of aldehyde is even faster than dissociation of ThPP-aldehyde into T h P P and aldehyde. So here you have a situation where the activation energy for a replacement is smaller than the activation energy for simple dissociation. RÄNDLE: The problem I have in understanding counterflow on this basis is due to my inability to think in purely mathematical terms; I have also to think in rather mechanistic terms. If one is to think in terms of a pore which will only accept one molecule because of its dimensions, it is difficult for me to see how there may be effective movements in opposite directions. I can understand the carrier hypothesis, because I can visualize what might be taking place. I can draw a diagram on the board that explains counterflow on the carrier hypothesis. HECKMANN: I agree with you. It is difficult to visualize the exchange reactions occuring in narrow pores, and therefore I placed the exchange reaction in the interphase protein/lipid or protein/water respectively. RÄNDLE: First of all, perhaps, I should explain to people what happens at counterflow. If one takes erythrocytes and incubates them in the presence of D-xylose at a particular concentration, and measures the concentration of xylose in the red cell as a function of time, the intracellular concentration of xylose eventually becomes constant at a concentration approximating to that outside. There is no net movement of sugar in either direction at this point. Now, if at this point one adds glucose, the intracellular concentration of xylose falls which means that sugar is being moved from inside the cell to outside the cell, i.e. xylose is being transported against the concentration gradient and this is what is meant by counterflow. The explanation on the carrier hypothesis is this (Fig. 4): In the membrane, there is a mobile carrier, and on the extracellular face of the membrane you have glucose and xylose competing for the carrier· So that in this experiment glucose is preferentially transported and you get carrier taking the glucose into the cell. Inside the cell, the carrier releases the glucose - and the glucose is immediately removed by reaction with ATP, yielding G-6-P. So at the internal surface of the cell you have only xylose available, so that xylose will combine with the carrier on the inside surface, and the carrier-xylose moves across the membrane and then releases xylose on the outside. That is the explanation of counterflow on the basis of a mobile carrier.

) -l/^C-Gy^G

Hexokinase, ATP - G-6-P

Fig. 4. Explanation of counterflow by the Carrier hypothesis. (C = Carrier).

HECKMANN: May I just add, that the participation of metabolic reactions, e.g. the removal of glucose by A T P at the inner surface of the membrane, is not necessary to produce counterflow. The minimum requirement for counterflow is two distinguishable species of particles. But now let me write the carrier model in a slightly different way. Carriers are not necessarily things that move across membranes, they can equally well be visualized as being roundabouts, as I mentioned in the lecture. Let me draw two other membranes with rotational carriers or roundabouts in addition to the carrier membrane you chose and which is identical with the carrier

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Diskussion

model of figure 1 and model a) of figure 5. Model a) and b) in figure 5 have identical flux equations and the flux equation of model c) differs from that of a) and b) by a factor of 2 only; but in the cases of the rotating carriers b) and c) one can visualize the rotational exchange reaction much easier than in model a). The only thing to do in order to convert the carrier-model into the substitution-model is to wipe out the roundabout and let the particles travel alone, as you see in d) or more realistically in e).

Fig. 5. Comparison between carrier-mediated diffusion (a, b, c) and bimolecular exchange reaction (d, e). RÄNDLE: Ah yes, in the carrier theory the carrier is put in the center of the picture, and the carrier bears the reactive groups; in the pore theory a hole is in the center of the picture; and the reactive groups are on the periphery. Now, my difficulty is to understand what advantage is to be gained from concentrating on the space and not on the reactive groups. HECKMANN: In the carrier theory you concentrate on the carrier, on its reactive sites and its movement. I have set out to show that the movement of the substrate is of primary importance and the mediation of this movement by a mobile carrier unnecessary and therefore of secondary importance. RÄNDLE: SO the basic difference between the two theories is that the carrier theory proposes a macromolecule with specific reactive groups and capable of movement, whereas in the modified pore theory the reactive groups are on the side of a hole and the molecules themselves move; is this correct? HECKMANN: Yes, and because traditional chemical kinetics is able to explain phenomena like counterflow, if only one uses bimolecular reactions in addition to monomolecular reactions, I therefore believe that there is some advantage to be gained from replacing an unknown device by an ubiquitous and well understood type of reaction, (or from concentrating on the hole in the middle, to use your phrase) if only to revive critical discussion.