Effets de l'actinomycine sur le développement embryonnaire

DEVELOPMENTAL

Effets

BIOLOGY,

de

9, 458-472

( 1964)

I’actinomycine

sur

le dkveloppement

embryonnaire II. Etude autoradiographique : influence de I’actinomycine sur la synth&e des acides nu&iques H. DENISE Facultk

Laboratoire de Morphologic des Sciences de 1’UniversiG libre Accept6

le 29 janvier

animal+ de Brurelles,

Belgique

1964

INTRODUCTION

Un ensemble d’observations permet d’attribuer g l’actinomycine une action bien Winie sur le mkabolisme des acides nuclkiques : cet antibiotique forme un complexe avec le DNA et rend ce dernier incapable de servir comme matrice pour la synthese du RNA. Jusqu’a p&sent, toutefois, cet effet de l’actinomycine n’a ktt5 constat que chez les bact&ies et les cellules de mammifkre en culture (cellules de HeLa, fibroblastes de souris). Bien que ces types cellulaires soient fort diffkrents l’un de l’autre et que l’actinomycine y exerce une influence apparemment semblable, rien ne prouve a priori que l’action de cet antibiotique sur les tissus embryonnaires soit la m&me que sur les bactkries ou les cellules cultivkes. 11 importait done de vdrifier si l’actinomycine produit une inhibition aussi totale de la synthBse du RNA dans les cellules embryonnaires que dans les cellules diffkren&es. C’est pourquoi nous avons exam& pendant l’ontogknkse du pleurod&le l’effet de l’actinomycine sur l’incorporation d’un nucldoside dans les acides nuclkques. Les stades de dkveloppement Ctudiks couvrent toute la pkriode pendant laquelle l’influence morphostatique de l’actinomycine a BtC observke (Brachet et Denis, 1963). ’ ChargB de recherches du FNRS. Adresse permanente : laboratoire de Morphologie animale, Institut Ed. Van Beneden, Universite de LiBge, Belgique. Adresse actuelle : Carnegie Institution of Washington, Department of Embryology, 115 West University Parkway, Baltimore, Maryland.

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EFFETS

MATERIEL

DE

L’ACTINOMYCINE

ET

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METHODES

La m&hode autoradiographique mise au point par Ficq (1961) a Qtk employ&e. L’uridine marquke au tritium a kt& choisie comme prkcurseur commun du RNA et du DNA. En raison de la grande impermkabilitb des oeufs de pleurod&le vis-a-vis de ce traceur (Bieliavsky et Tencer, 1960), l’incorporation a &t& suivie en explantat, ce qui met la face interne des cellules, non protBg&e par le “coat”, en contact direct avec le produit marquk. Les &hantillons de tissu suivants ont kt& p&lev& dans des conditions st&iles : --au stude 8-9 (debut de la gastrulation) : (1) un fragment d’ectoderme pr&omptif provenant de la partie animale de l’oeuf; (2) la l&e dorsale du blastopore; (3) un fragment d’endoderme pr&omptif provenant de la zone v&g&ative de l’oeuf. ----au stade 12 (milieu de la gastrulation) : ( 1) un rectangle d’ectoderme neural pr&omptif auquel adhkre le toit de l’archenteron; (2) un fragment d’endoderme provenant de la partie ventrale de la gastrula. -au sta’de 15 (d&but de la neurulation : plaque neurale bien dessinke) : les m&mes tissus qu’au stade 12. -au stade 21 (neurulation terminke : b’ourrelets neuraux jointifs) : (1) le tube nerveux (dkbarrassi: autant que possible de 1’6piderme qui le recouvre), auquel adh&re l’axe chordo-somitique; (2) un fragment d’endoderme. --au stade 24 (bourgeon caudal en formation) et au stade 27 (premiers battements cardiaques) : les m&mes tissus qu’au stade 21. Les fragments de tissu, au nombre de 3 pour chaque catkgorie, sont plac& dans 1 ml de milieu de Niu et Twitty stdrile addition& soit de 10 microcuries (PC) d’uridine tritike (titmoins), soit de 10 & d’uridine tritike (activitk spkcifique : 1080 PC par millimole) + 10 pg d’actinomycine D. Deux durees d’incorporation ont &t& utili&es : 6 et 20 heures, ?I la tempkrature ordinaire. Les explantats s& journent pendant tout ce temps B l’obscuritk pour 6viter la dkgradation de l’actinomycine par la lumi&e. Une fois l’incorporation terminke, les fragments de tissu sont rincks dans le milieu de culture normal, puis fix& soit d l’alcool-acktique froid (4”C), soit par la m6thode de la congklation-substitution de Lison (1953). Aprks dilshydratation et inclusion par les pro&d& habituels, les pi&es de tissu sont coup&es a 10~ et r&parties alternativement sur 5 porteobjets. Dans chaque s6rie de 5 lames, une premi&re subit une digestion a la RNase (1 heure B 37”C), une seconde subit une digestion ?I

460

H.

DENIS

la DNase, une troisi&me est trait&e pendant 1 heure B 37°C par la solution-tampon (pH 7,5) utiliske pour la digestion B la DNase. Les deux dernikres lames ne sont pas incubkes. Apr& dkparaffinage et rkhydratation, les lames sont plackes pendant 1 heure a 4°C dans une solution d’uridine 0,l M non marquke afin d’entrainer le prkcurseur non incorpork Quatre Porte-objets de chaque s&ie (3 incubes + 1 non incub&) sont alors couverts d’une fine couche d’6mulsion Ilford K2. La cinquikme lame de chaque s&ie ne re$oit pas d’6mulsion et sert de tCmoin pour le comptage des grains de miilanine. Au bout de 28 jours d’exposition, les lames sont dkveloppkes et colorees ?I l’Unna. Comptage

des traces

La prksence de nombreux grains de mklanine dans le cytoplasme des oeufs de pleurod&le rend difficile l’kvaluation de la radioactivitk. Les traces de tritium ont, en effet, un trajet t&s court dans l’kmulsion et se pritsentent comme des grains fort semblables B ceux de la m6lanine. Ce fait rend impossible toute estimation quantitative de la radioactivitk cytoplasmique, en particulier dans les tissus dorsaux, et complique m&me l’kvaluation de l’activit4 nuclkaire. En effet, si le noyau est sit& sous la surface de la coupe et est done surmontk d’une mince couche de cytoplasme, des grains de pigment peuvent s’ajouter aux traces produites par la radioactivitk nuckkire et fausser la mesure de celle-ci. Pour pallier cet inconvknient, les traces ont Bt6 comptkes, d’une part, au-dessus de 100 noyaux couverts d’kmulsion et, d’autre part, au-dessus de 100 noyaux non recouverts. En soustrayant le nombre de coups obtenus par noyau dans le second comptage de celui du premier, on arrive a une estimation approchke de la radioactivitk nuckaire. RESULTATS

A. Influence de ractinomycilze s-w la synthdse d’es acides nuclbiques dans %ectodeme neural pksomptif et le tissu nmeux 1. Radioactivite’ nucl&re. La figure 1 montre l’influence de l’actinomycine sur Sincorporation nuclkaire d’uridine apr&s 6 heures et 20 heures de contact avec le traceur. Chaque point est la moyenne du nombre de coups d&elks au-dessus de 100 noyaux. Apr&s 6 heures d’incorporation en l’absence d’actinomycine, le marquage nuclCaire augmente assez rdguli&rement depuis le d&but de la gastrulation

EFFETS

DE

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L’ACTINOMYCINE

jusqu’au stade 27. Dans les tissus trait&, la radioactivitk est si faible qu’il est a peine possible de l’evaluer, etant donnee l’imprecision des comptages due a la presence de pigment. Toutefois, il semble que l’inhibition de l’incorporation d’uridine augmente legerement au tours de Pontogenese : elle est de 75% au stade 8-9 et de 80% au stade 27. Mais, cet accroissement est loin d’etre significatif. colps/noyau

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stades

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FIG. 1. Influence de I’actinomycine sur l’incorporation nu&aire tritike dans les noyaux du tissu nerveux. Six heures d’incorporation et en l’absence d’actinomycine (10 fig/ml).

d’uridine en prksence

Les figures 2 et 3 illustrent I’influence de l’actinomycine sur le marquage nuclkaire. Les noyaux de tissu nerveux non trait& (fig. 2) sont bien color& a I’Unna et sont assez fortement marques. Les noyaux du m&me tissu, ayant skjourne 6 heures dans I’actinomycine,

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H.

DENIS

sont extrkrnement pales et leur radioactivite est presque nulle (l-2 sauf pour l’un d’entre eux, qui pritsente une vingtaine de traces (partie superieure de la photographie). Apres 20 heures de contact avec le traceur, le marquage des noyaux est plus intense qu’aprbs 6 heures d’incorporation. La radioactivite nucleaire s’accroPt assez fortement depuis le stade 8-9 jusqu’au stade 27. @ant aux tissus trait& a l’actinomycine pendant 20 heures, ils sont en voie de dksagregation et les noyaux qui ne montrent pas encore de signes de pycnose ne sont pas du tout radioactifs (fig. 1, partie superieure) . 2. Radioactivite’ cytoplasmique. Un marquage cytoplasmique sensible a la RNase peut Btre d&elk Q partir de la gastrulation dans l’ectoderme neural prksomptif (fig. 2). Le marquage cytoplasmique est beaucoup plus prononce apres 20 heures qu’apres 6 heures de contact avec le traceur. L’actinomycine diminue grandement la radioactivite extra-nucleaire, mais ne semble pas l’abolir tout a fait. COUPS),

FIG. 2. Tissu nerveux de stade 27 mis au contact d’uridine tritiee (10 &/ml) pendant 6 heures. Coupe Q 10 p couverte d’kmulsion K2 et expode pendant 28 jours. Incorporation nucliaire assez forte. Les grains visibles dans le cytoplasme sont des grains de pigment et des traces de tritium. Grossissement : x 1080.

EF’FETS

DE

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FIG. 3. M&me tissu que sur la figure 2 mis au contact d’uridine (10 &/ml) et d’actinomycine ( 10 g/ml). Incorporation nuckaire t&s faible sauf pour un noyau sit& au-dessus et vers le milieu de la photographie. Incorporation cytoplasmique rkduite kgalement. Grossissement : x 1080.

B. Influence dans lu smites

de l’a’ctinomycine sur la synthdse des acides nucleiques dorsale du blastopore, le toit de ra,rchenteron et les

Edvre

1. Radioactivit6 nucltkzire. Comme le montre la figure 4, la radioactivitd nucleaire est plus faible dans le mesoderme que dans le tissu nerveux aussi bien apres 6 heures qu’apres 20 heures de contact avec le precurseur. Au bout de 6 heures d’incorporation en l’absence d’actinomycine, on peut d,enombrer 10 a 25 coups par noyau suivant le stade. Si l’incorporation a kte faite en presence de l’antibiotique, le nombre de traces est rkduit a peu pres de moitie entre les stades 8-9 et 21 et d’environ 70% au stade 27. L’inhibition est plus forte aprits 20 heures de traitement par l’actinomycine : elle passe de 70-80% au tours de la gastrulation a 99% au stade 27. 11 importe de noter que, dans les explantats ayant subi un contact prolong& avec l’antibiotique, la partie mesodermique est en beaucoup

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H.

DENLS

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FIG. 4. Influence de l’actinomycine sur l’incorporation d’uridine tritibe dans les noyaux somitiques. Six heures et 20 heures d’incorporation en prksence et en l’absence d’actinomycine ( 10 pg/ml).

meilleur &tat que la partie nerveuse. Dam certains explantats provenant d’embryons Ages, le tube neural s’est dbagrege en grande partie et ne laisse subsister que la chorde et les somites, dont la face superieure apparaPt ainsi denudee. 2. Radiwctivite’ cytoplasmique. Un marquage cytoplasmique s’instaure dans le mesoderme au tours de la gastrulation. Son intensite s’accrolt pendant l’ontogenese, mais n’est jamais aussi intense que dans le tissu nerveux. Le traitement a l’actinomycine diminue la radioactivitk du cytoplasme, mais il ne semble pas la supprimer tout a fait. C. Influence de l’actinomycine sur la synthdse des acides nuclkiques dans le tissu ve’ge’tatif de la gastrula et dans l’endoderme 1. Radioactivite’ nucldaire. Les noyaux endodermiques ont une radioactivite moms forte que ceux du mesoderme et du tissu nerveux

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(fig. 5). Le marquage nucleaire est si faible, apres 6 heures d’incorporation, qu’il est impossible de l’evaluer avec quelque precision avant le stade 21, en particulier quand les cellules ont ktk trait&es a l’actinomycine. Aux stades 24 et 27, l’antibiotique rkduit d’environ 50% la radioactivite des noyaux. coupslnoyau30

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24

FIG. 5. Influence de l’actinomycine sur l’incorporation d’uridine les noyaux endodermiques. Six heures et 20 heures d’incorporation et en l’absence d’actinomycine (10 pg/ml).

----

---.

tra,ti

27

stades

tritike dans en prksence

Les noyaux sont mieux marques aprbs 20 heures de sejour dans le traceur, surtout apres la fin de la neurulation. L’actinomycine reduit de man&e croissante la radioactivite nuclkaire a mesure que les tissus vieillissent : l’inhibition passe de 40% au tours de la gastrulation a 75% au stade 27. Les figures 6 et 7 illustrent l’effet dun sejour de 20 heures dans l’actinomycine sur le marquage des noyaux endodermiques. 11 convient de noter le peu d’influence qu’a exerce l’antibiotique sur I’aspect des deux noyaux visibles sur la figure 7. Ceux-ci sont encore assez fortement color& a l’Unna et n’ont pas du tout l’aspect turgescent que l’on observe dans les tissus dorsaux trait& a I’actinomycine.

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H.

DENIS

2. RadiowtWt~ cytoplmrnique. Jusqu’au dernier stade examine (27), aucune radioactivite notable n’a Bte observee dans le cytoplasme des cellules endodermiques, aussi bien en l’absence qu’en presence d’actinomycine (figs. 6 et 7).

FIG.

pendant marqu&

6. Endoderme de stade 24 mis au contact d’uridine tritibe (10 &/ml) 20 heures. Le seul noyau visible sur la photographie est assez fortement Incorporation cytoplasmique nulle. Grossissement : x 1080.

D. Proportion

d’uridilne

incorporbe

duns le RNA et le DNA

La comparaison des coupes digerees a la RNase et a la DNase permet de se rendre compte de la proportion d’uridine incorporee dans le DNA et le RNA. En general, le nombre de traces nucleaires decelees aprbs une incubation de 1 heure a 37°C dans un tampon de pH 7,5 est a peu p&s &gal (B f 26% pres) au total du nombre de coups qui subsistent apres une digestion a la RNase et une digestion A la DNase. L’uridine s’incorpore dans le RNA et le DNA suivant un rapport qui varie dun tissu a Pautre et dun stade de dkveloppement g l’autre. Au debut de la gastrulation, les noyaux incorporent le nucleoside en proportion d’autant plus Blevee dans le RNA et en proportion d’autant plus faible dans le DNA qu’ils sont d’origine plus animale (fig. 8). Dans la suite du dkveloppement, de plus en plus d’uridine s’incorpore

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dans le RNA et de moins en moins dans le DNA; mais les tissus ventraux continuent, plus que les tissus dorsaux, & utiliser le prkcurseur pour la synthkse du DNA. 11 faut noter que les don&es de la figure 8 reprksentent la moyenne des comptages effect& sur un grand nom&gale du nombre de coups entre le bre de noyaux. Une repartition RNA et le DNA ne signifie pas que chaque noyau a utilisi: un nombre kgal de mokules d’uridine pour la synthkse de chaque acide nuclkique. Au contraire, la comparaison des coupes dig&&es a la RNase et

FIG. 7. M&me tissu que sur la figure G mis au &/ml) et d’actinomycine ( 10 &ml). Incorporation nulle. Les nuclColes ne sont pas visibles. Grossissement

contact d’uridine tritike nuclkaire et cytophsmiqw : x 1080.

(10

g la DNase montre que les cellules incorporent le prkcurseur soit dans le RNA, soit dans le DNA, mais pas dans les deux acides nuclkiques g la fois. La proportion globale d’uridine qui s’incorpore dans le RNA et le DNA dkpend done du nombre de noyaux qui utilisent le prkcurseur pour la synthkse de l’un OXI de l’autre acide nu&ique. 11 serait important de savoir dans quelle mesure la synth&se de chacun des acides nucEiques est affectke par l’actinomycine. Pour le

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stades

FIG. 8. Proportion d’uridine tritike incorporke dans le RNA et le DNA nuclbaires de 4 tissus en cows de diffkrenciation. Le pourcentage du nombre de coups attribuhs au RNA et au DNA est don& par le rapport du nombre de traces subsistant apr&s une digestion h la DNase et aprks une digestion ?t la RNase.

determiner, il aurait fallu etudier comment se repartissent, entre le RNA et le DNA, les traces nucleaires denombrkes apres une incorporation en presence de l’antibiotique. En raison de la t&s faible radioactivite des noyaux, apres un traitement a Pactinomycine, cette evaluation n’a pu etre faite de faGon systematique. Toutefois, dans les quelques cas oh la distribution des traces entre le RNA et le DNA a pu &tre determinee, le marquage nuclkaire subsistant apres un sejour de 6 heures dans l’actinomycine etait dQ presqu’entierement au DNA.

EFFETS

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DISCUSSION

Les resultats qui viennent d’etre d,&rits montrent que l’actinomycine agit sur les cellules embryonnaires comme un puissant inhibiteur de la synthese des acides nuclkiques. Cette inhibition explique les modifications observees preckdemment dans la co.orabilite des noyaux par le melange dUnna : disparition rapide des nucleoles et palissement prononce du sue nucleaire. L’inhibition de la synthese des acides nucleiques est plus forte dans les tissus dorsaux que dans les tissus ventraux. Cette difference va de pair avec une resistance meilleure des tissus ventraux a des traitements prolong& a l’actinomycine. En 24 heures, cette derniere provoque une desagregation partielle de l’ectoderme. L’endoderme, de son cot&, resiste pendant plusieurs jours a une dose d’actinomycine de 10 pg/ml. Si, comme il est probable, I’uridine ne s’incorpore en presence d’actinomycine que dans le DNA, cela signifie que la synthese du RNA est totalement bloquee par l’antibiotique et que celle du DNA ne l’est que partiellement. Bien que cette conclusion ne repose que sur des observations faites dans des conditions difficiles (faible marquage nucleaire), elle concorde t&s bien avec les don&es de la litterature : Kirk ( 1960), Goldstein et ~011. ( 1960), Harbers et Mueller ( 1962)) Hurwitz et COB. (X%2), Hurwitz et August (1963), et Perry (1963) ont constate Bgalement que l’actinomycine inhibe beaucoup moins la synthese du DNA que celle du RNA. Cette derniere peut etre totalement a&tee alors que les nucleosides continuent a s’incorporer dans le DNA (Reich et toll., 1962). La sensibilite plus grande de la polymerase du RNA a l’actinomycine explique pourquoi la radioactivitk nucldaire est plus affect&e par l’antibiotique dans les tissus ages que dans les tissus jeunes (figs. 1, 4 et 5). En effet, a mesure que le developpement progresse, le precurseur est utilise en proportion de plus en plus grande pour la synthese du RNA (fig. 8). D ‘un stade de dkveloppement a l’autre, de moins en moins d’uridine s’incorpore dans le DNA et kchappe a l’action inhibitrice de l’antibiotique. Le passage dune activite essentiellement mitotique (clivage) a une phase ou la difierenciation debute (gastrulation) s’accompagne dun changement progressif dans le metabolisme nuclkique des cellules embryonnaires. Au tours de la segmentation, l’uridine t&&e marque uniquement le DNA (Bieliavsky et Tencer, 1960). A partir de la

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H.

DENIS

gastrulation, le precurseur commence a s’incorporer dans le RNA aussi bien cytoplasmique que nuckaire. Nos resultats confirment ceux des auteurs precitks et permettent de preciser que le marquage du RNA par l’uridine, de m&me que le marquage cytoplasmique, s’instaurent suivant le gradient dorso-ventral decrit par Brachet (1942). Des la fin de la gastrulation, le cytoplasme de la future plaque neurale est nettement plus radioactif que celui du toit de l’archenteron et, surtout, que celui de l’endoderme. En outre, la proportion d’uridine qui pknetre dans le RNA est plus &levee dans la partie dorsale que dans la partie ventrale de l’embryon (fig. 8). Cette double difference entre les tissus dorsaux et ventraux se maintient jusqu’au dernier stade examine (27). Les ebauches en differentiation active sont done caractkrisees par une synthese de RNA p&pond&ante et par un marquage du RNA cytoplasmique. Les experiences prksentes ne peuvent determiner la nature du RNA dont la synthese est fortement inhibee par l’actinomycine dans les cellules embryonnaires. 11 pourrait s’agir du RNA messager. Mais il est possible que l’influence de l’actinomycine s’exerce aussi bien sur la synthese du RNA de forme stable que sur celle du RNA messager. Seules des experiences biochimiques pourraient confirmer cette supposition. RESUME L’influence de l’actinomycine sur la synthese du RNA et du DNA a et& Ctudiee dans les tissus embryonnaires du pleurodele par la En 6 heures de traitement, l’actinomethode autoradiographique. mycine reduit de man&-e considerable l’incorporation d’uridine tritiee dans les noyaux. L’inhibition a tendance a croitre au tours du developpement et elle est plus forte dans les tissus animaux ou dorsaux que dans les tissus vegetatifs ou ventraux. Aprils 20 heures de traitement, le marquage nuclkaire disparaPt ,totalement dans le tissu nerveux et presqu’entiitrement dans les autres tissus. La synthese du RNA semble plus fortement affect&e par l’antibiotique que celle du RNA. A partir de la gastrulation, les tissus dorsaux (plaque neurale, chorde et somites) utilisent l’uridine de plus en plus pour la synthese du RNA et de moins en moins pour celle du DNA. Vers le m&me stade, apparaPt un marquage cytoplasmique, qui s’intensifie au tours du developpement. Le tissu endodermique conserve jusqu’au stade 27 (premiers battements cardiaques) une incorporation stricte-

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DE

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ment nuclkaire et le synthbse du RNA y demeure peu active cornparke B celle du DNA. L’actinomycine ne semble pas abolir tout B fait le marquage cytoplasmique dans les tissus dorsaux. SUMMARY

The inffuence of actinomycin upon the synthesis of RNA and DNA has been studied in the embryonic tissues of Pleurodeles by means of autoradiography. After 6 hours of treatment, actinomycin strongly reduces the inco’rporation of tritiated uridine into the nuclei. The inhibition tends to increase as development proceeds and is stronger in animal (or dorsal) tissues than in vegetative (or ventral) ones. After 20 hours of treatment, nuclear incorporation totally disappears in nervous tissue and almost completely in the other tissues. The synthesis of RNA seems to be more strongly affected by actinomycin than that of DNA. From the middle of gastrulation on, the dorsal tissues (neural plate, notochord, and somites) use uridine more and more for the synthesis of RNA and less for that of DNA. At the same time, cytoplasmic incorporation sets in and increases steadily. Until stage 27 (first heart beats), the endodermal tissue retains a strictly nuclear incorporation and a relatively low level of RNA synthesis compared with that of DNA. Actinomycin does not seem completely to suppress cytoplasmic labeling in dorsal tissues. (Te travail a BtB rendu possible grke B l’aide financi&e de l’Euratom (contrat 016-61-10

ABIB),

auquel

nous

adressons

nos vifs

remerciements.

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