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Étude spectrophotométrique et extraction chloroformique pour le dosage de la bilirubinamnie et des pigments associés
VII° Congrbs National de Transfusion Sanguine
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fltude spectrophotomdtrique et extraction chloroformique pour le dosage de la bilirubinamnie et d es pig ments assocles " p a r A. SENDRAIL, S. BIERME, R. CABANNES et J.-F. de B O I S S E Z O N Centre R6gional de Transfusion Sanguine de Toulouse
Introduction
p , l'$tude
LUSIEURS
mSthodes [4, 5, 6, 7, 8, 9, 14] ont 6t~ pro pos~es pour de la bilirubine et des pigments as soci6s clans ]e liquide
amniotique. La technique de FLEMING et WOOLF [4] utilise une formule ing~nieuse grfice h ]aquelle quatre lectures spectrophotom6triques : h 700, 623, 576 et ~62 m/~ suffisent p o u r l'estimation quantitative de la b i l l rubine, de l'oxyh~moglobine et de la m6thSmalbumine. LILEY [10, 11, 12, 13] p o u r sa part, a propos$ sur la courbe pr~c~dente une seule mesure : celle de la diff6rence de densit4 optique .1 4'5'0 m/~ (absorption m a x i m u m de la bilirubine) entre la courbe et une droite tra.c~e du point situ~ fi 365 m/~ jusqu'au point de convexit~ m a x i m u m vers 550 m/x. Cette diff6rence de densit6 optique (A DO) p e r m e t de situer le liquide clans l'une des zones, I, H, et I I I de LILE¥. Nous avons quant ~ nous employ6 depuis plusieurs annSes en pa-
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ALLO.IMMUNISATION F(ETO.MATERNELLE
r a l l ~ l e la m 6 t h o d e de FLEMING et WOOLF q u i d o n n e , p a r u n calcu] en p o u r c e n t a g e , le t a u x d e b i l i r u b i n e et l a m e s u r e de la A ,DO qui, r e p o r t6e sur l e d i a g r a m m e de LILEY, d o n n e d ' i n d i s p e n s a b l e s indi, c a t i o n s th6rapeutiques.
011"
Madame Bi... Bilirubine=01495 mg %
0,,3"
ADo = 01252
LIQUIDE AMNIOTIQUE SOUILLE DE METHEMALBUMINE ET
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D'OXYHEMOGLOBINE
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FIG. 1. - - Liquide amniotique souill6 de m6th6malbumine et d'oxyh6moglobine. (BLA,.. 25-3-68). Ces d e u x m 6 t h o d e s nous r e n d e n t de g r a n d s services, et n o u s les e m p l o y o n s d e p u i s pros de q u a t r e ans a u C e n t r e d e T r a n s f u s i o n San-
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guine de T o u l o u s e ; nous les avons utilis&es pour l'&tude de .plus de 400 liquides amniotiques. Dans £ensemb]e, elles donnent une id6e suffisamment exacte du taux de bilirubine, donc appr6cient grossi~rement la gravit6 de l'atteinte du ~¢etus au cours des iso-immunisations foeto-maternelles Rhesus, et permettent de suivre l'6volution de l'6tat du liquide amniotique au cours des quatre derniers mois .de la gestation. Cependant, beaucoup d'auteurs [,12, 15, 16, 1'9, 20] sont d'accord pour les critiquer ; si elles donnent des r&sultats satisfaisants lorsque la bilirubinamnie est isol6e (qu'elle soit faible ou importante), elles sont beaucoup moins exactes lorsque le liquide est souill6 d'oxyh6moglobine, de m&,conium ou de vernix '(/ig. 1). Dans certains cas m~me, i l e s t impossible de calculer la diff&ren, ce de densit6 optique & 450 m~. 'C'est pour cette raison que nous avorrs tents de doser la bilirubine isolSe, apr~s extraction chloroformique. Materiel et t e c h n i q u e s Les amniocent&ses sont r6a]is&es chez des femmes Rhesus n6gatif immunis6es, au cours des quatre derniers mois de grossesse (432 liquides ont 6t6 examin6s). Dans les cas d'immunisation importante, elles sont r#p~t&es environ tousles dix jours.
400
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f
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~
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M a d a m e S ......
M6th~malbumin=e0 Oxyh6moglobine=0 Bilirubine=0~183mg~ ADo=01112 ~
012"
LIQUIDE AMNIOTiQUENE CONTENANT QUe DE LA. BILIRUBINE 0,3-
FI6. 2. - -
L i q u i d e a m n i o t i q u e ne c o n t e n a n t que de Ia b i l i r u b i n e (SE... 22-1-68).
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Les liquides tr6s souill6s repr6sentent environ le cinqui6me des liquides 6tudi6s ~84 6chantillons). Une centrifugation rapide (15 000 t o u r s / m i n u t e durant 15 h 20 minutes en centrifugeuse r6frig6r6e) 61imine en g6n6ral te vernix. Persistent n6anmoins : m6eonium et pigments h6miniques. Nous pratiquons alors deux examens : 1) Une lecture directe, c o m m e darts les ,cas habituels, en pla~ant le liquide clans la cure d'un spectrophotom6tre D K 2A de B e c k m a n
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Madame BI
Or05
- ' '
°
16re extraction:Bil.=0,234 mg % 26me extraction:Bil-=O,O75mg % 36me extraction:Bil.=0,028 mg %
Ol|"
Bilirubine Totale= 0,337 mg %
TRIPLE EXTRACTION CHLOROFORMIQUE
I
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f
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Fro_ 3. - - Triple extraction chloroformique, (BLA.,. 25-3-68)
par r a p p o r t h u n blanc d'eau distil'16e (fig. 2). Une dilution au 1/2, au 1/4, ou m~me au 1/10 est ici souvent n6cessaire. Sur la courbe obtehue entre 700 et 350 m/~ nous mesurons la bilirubine et les pigments associ6s p a r la formule de FLE.MING ainsi que la diff6rence de densit6 optique h 450 m~ selon L/LEY. (Ces mesures peuvent ~tre faites avec n ' i m p o r t e quel spectrophotom~tre aux quatre longueurs d'ondes pr6cit6es). 2) Une lecture de la bilirubine isol6e des pigments parasites apr~s extraction chloroformique (fig. 3, 4 et 5). P o u r cela nous ajoutons 8 un volume de liquide anmiotique un volume 6gal de chloroforme. Apr~s agitation et centrifugation, la phase chloroformique est recueillie et examin6e aux longueurs d'ondes habituelles par r a p p o r t ~t un blanc de ehloroforme. L'extraction est r6p6t6e trois lois.
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DOSAGE DE LA B I L I R U B 1 N A M N I E
Sur c h a c m t des e x t r a i t s est calcul6e : - - la b i l i r u b i n e selon FLEMING et WOOLS, - - ]a diff6renee de densit6 o p t i q u e ~ 450 m/~. I1 est a d m i s que l a s o m m e des t a u x de b i l i r u b i n e des :trois e x t r a i t s r e p r 6 s e n t e la quasi t o t a l i t 6 de la b i l i r u b i n e c h } o r o f o r m o - e x t r a c t i b l e .
Madame T ..... \
lereextraction:Bil.= 0,662 mg %
0,1.
2c~meext raction:Bil. = 0,063 mg % 3eme extraction: Bil.= 0,030 mg % Bilirubine Totale= 0,755 mg % ~, Do = 0. 53 SUR LA cOURBE ENTIERE: Bilirubine Totale =0, 849 mg %
0.2,
,~Do=0.52
TRIPLE
EXTRACTION
CHLOROFORMIQUE
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FIG. 4. - - Triple extraction chloroformique (Tgo...) D a n s les cas d e l i q u i d e s tr6s m 6 c o n i a u x il est 6 v i d e n t que la b i l i r u b i n e m 6 c o n i a l e e l l e - m S m e e x t r a ' c t i b l e p a r le c h l o r o f o r m e s ' a j o u t e h la b i l i r u b i n e p r o v e n a n t de l'h'6molyse f m t a l e , ce q u i c o n s t i t u e u n e difficult6
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ALLO.IMMUNISATION F~ETO.MATERNELLE
non encore r6solue. Seul le dosage des enzymes sp6cifiques du m6corrium (phosphatases alealines) p o n r r a i t faire la p a r t de ce snrcrolt de pigments.
Madame Br .....
0tl-
Extrait Chloroformique Bilirubine = lt681 m9 %
EXTRACTION CHLOROFORMIQUE o,2-
O,3-
O,4-
'l°~ 7
7 °l~ ~°°?
FiG. 5. - - Extraction chloroformique (Bao..., enfant mort in utero 27-12-67)
R4sultats La courbe obtenue lors de l'extraction chloroformique est une courbe pure, ,caract6ristiqne du pigment biliaire. La p r e m i e r e extraction enl~ve h peu pros 75 % (70 ~ 80 ~%) de la
DOSAGE DE LA B1LIRUBINAMNIE
3.11
bilirubine chloroformo-extractible ; 10 h 25 % sont extraits aprSs la deuxi~me eentrifugation ; la troisiSme extraction ne recueille que tr~s peu de bilirubine. Nous avons remarqu$ que : 1) Le chiffre de bilirubine totale donn$ p a r la s o m m e des trois extractions chloroformiques est toujours infSrieur ~ celui calcul6 sur la courbe selon FLEMING et WOOLr" (lorsque cela est possible) en pla~ant direetement le liquide dans la c u r e du spectrophotombtre. La bilirubine chloroformo-extractible ne repr~sente que 50 ~ 6'0 % de la bilirubine donnSe par le calcul de FLEMING. 2) La somme des diffSrences de densit~ optique des trois extraits est tr~s voisine de la difference de densit6 optique obtenue h partir de la eourbe totale lorsqu'il est, 1~ encore, possible de l'$valuer. C o m m e n t a i r e s et c o n c l u s i o n Ces remarques appellent quelques commentaires : 1) Le fait clue le chiffre de bilirubine totale aprSs triple extraction est toujours inf6rieur ~ celui donn6 par la courbe habituelle laisserait supposer : --soit que les souillures du liquide (par l'oxyh'$moglobine surtout) surestiment le taux de la bilirubine selou FLEMING et WOOLF. C'est ce que pensent les auteurs lyonnais [17, 18] qui enx, utilisent l'extraction benz6nique, -soit que toute la bilirubine du liquide amniotique ne soit pas extractible par le chloroforme. P o u r notre part, nous nous rangeons plut6t ~ la premiSre hypoth~se. En effet, nous avons calcul$ (fig. 6) selon FLEMING et WOOLr la bilirubine d'un liquide avant et aprbs triple extraction chloroformique.
Le chiffre obtenu aprSs triple extraction est, semble-t-il exeessif, alors que m a n i f e s t e m e n t la plus grande pattie de la bilirubine paralt avoir $t6 61iminSe. 2) 'La somme des diffSrences de densit6 optique c MculSes sur les trois extraits Stant voisine de la diff6rence ¢le den'sit$ optique mesur6e sur l a courbe entibre, il est possible grace ~ l'extraction, d'6tablir le d i a g r a m m e de 'LILEY mSme p o u r des liquides dits ininterpr~tables, fr6quents au cours de certaines grossesses tr~s pathologiques.
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ALLO.IMMUNISATION F(ETO.MATERNELLE
3) 'L'6claircissement d'un liquide amniotique demande douze '~ quinze j mlrs ; en effet des St udes parall~'les sur des liquides c6phalorachidiens recueillis lots d'hSmorragies mSning6es p e r m e t t e n t de pr6ciser le catabolisme de l'h~moglobine dans les cavit~s doses et p e u v e n t s'appliquer aux liquides amniotiques souillSs. E n effet, une 6rude spectrophotom6trique portant sur 350 6chantilions de L.C.R. pr$1ev~s sur 60 malades atteints d'h6morragie mSning6e (vasculaire, t r a u m a t i q u e ol1 post-chirurgicale) nous a montr6 que
LIQUIDE AMNIOTIQUE AVANT- ET APRES EXTRACTION -
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FIe. 6.
le p r e m i e r p i g m e n t & a p p a r a i t r e Stair l'oxyirSmoglobine, pr6sente d~s la 2~ heure de l'h6morragie m6ningSe [3]. Elle atteint son t a u x maxim u m vers le 3~ ou 4 ° jour et disparait en 9 ou 10 jours p o u r se transformer progressivement in situ en bilirubine.
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Cette derni~re, d6celable vers le 2~ ou 3e jour, atteint son taux m a x i m u m vers le 5e ou 7e jour et d$crolt tr~s l e n t e m e n t jusque ~ers le 20 ~ j o u r (Bilirubiue .libre presque exclusivement). I1 semble p r o b a b l e qu'il en soit de m~me clans la cavit~ amniotique lorsque le liquide a $t$ souill$ a,ccidentenement de sang (au cours de la piqfire d'un vaisseau p a r exemple). Le ,catabolisme local de l'hSmoglobine produirait de la bilirubine qui se surajouterait h .celle p r o v e n a n t de l'h6mo.lyse foetale. Un d61ai d'une quinzaine de jours au m i n i m u m est n$cessaire ~ la disparit~on de ,cette bilirubina,mirie additi'onnelle qui faussera aussi longtemps l'interprStation de la courbe, et risquera de faire surestimer la gravit6 de l'6tat de l'enfant. L'extraction chloroformique est donc une technique simple et rap i d e puisqu'en pratique r o n p e u t se contenter d'une seu.le centrifugation en supposant qu'elle enlbve 75 % de la bilirubine chloroformoextra etible (le chiffre obtenu 6rant multipli$ par le coefficient d'extraction). EHe repr6sente un compl~ment int6ressant dans l'6tude des liquides amniotiques fortement souill~s. P a r ailleurs, il faut insister sur la valeur de la mesure de la difference de 'D'O ( A DO) qu'il est possible de ealculer sur l'extrait et dont les rSsultats sont plus reproductibles, surtout en cas de liquide souill$, que ceux donn6s p a r le calcul de FLEMING et WOOLF. RI~SUMI~ Les auteurs r a p p o r t e n t une exp6rience p o r t a n t sur 4,32 liquides amniotiques de femmes immunis6es par le facteur Rh. A partir de la courbe 6tablie au spectrophotom~tre, le pourcentage de bilirubine est calcu16 selon la f o r m u l e de FLEMING et WOOLF ainsi que celui des pigments interf6rents : oxyh6mo'globin'e et m6th6malbumine. L'extra'ction chloroformique de la bflirubine pratiqu'$e simultangm e n t isole ,ee p i g m e n t dans les liquides souill6s de sang, de m$conium ou de Vernix. Une p r e m i e r e extraction enl~ve 75 % environ (70 80 % ) de la bilirubine chloroformo-extractible. 10 ~ 25 % sont extraits au cours de la deuxi~me, la troisib, me extraction ne recueiltant que trbs peu de bilirubine. Le calcul de la diffSrence de densit$ o p t i q u e p e u t se faire sans difficuh6 sur la courbe d'extraction ; elle est, en r~gle, Sgale h ,celle caleul6e sur la courbe enti~re, ceci p e r m e t t a n t d',$tablir le d i a g r a m m e de LILEY m~me pour les liquides dits ininterpr6~ab!es. .7
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D e s 6 t u d e s p a r a l l ~ l e s s u r les l i q u i d e s e $ p h a l o - r a c h i d i e n s r e c t t e i l l i s lors d'h6morra'gies m~ning6es ont permis de pr6ciser le catabolisme de l'h6moglobine des liquides amniotiques souill$s. La bilirubine produite s e s u r a ~ j o u t e ~ c e l l e p r o v e n a n t d e l ' h ' ~ m o l y s e f o e t a l e , ,ce q u i p e u t f a i r e surestimer la gravit6 de l'6tat de l'enfant. Le temps de disparition de l a b i l i r u b i n e a d d i t i o n n e l l e e s t e s t i r n 6 ~ 12-15 j o u r s . D r A. SENDRAIL C e n t r e de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e C.H.U. P u r p a n , 31-Toulouse
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[16] PALL1EZ I:{., GOtYDEMAND M., DELECOUR M., GRAILLOT G. et MO~NrEa J,-C. - Los indications th6rapeutiques tir6es de l'6tude du liquide amniotique dans les formes graves de la maladie h6molytique n6o-natale. C.R. du VI e Cong. Nation. de Transf. Sang. (Tours ]966), La Simarre Ed (Tours), p. 7'01, 1968. [17] PI6EAUD H. et BETHOUX R. - - ]nt6r6t des amnioeent~ses pour le pronostie de l'atteinte ~etale en eas de grossesse h6t6ro-sp6cifique, Gyn~c. Obst., 64, 517, 1965. []8] PIGEAUD H. et BETHOUX R. - - Etude du liquide amniotique ct particuli~rement de la bilirubinamnie dans eertains cas de grossesse pathologique. Rev. Lyon, Med., 1, 53, 1968. [19] PINON F. et ANDR~ R, - - Interpr6tation des eourbes speetrophotom6triques de liquide amniotique clans l'iso-immunisation Rh en fonetion des m6thodcs utilis6es pour l'6tablir. C.R. du VI e Congr. Soe. Transf. Sang. (Tours 1966), La Simarre Ed. (Tours), p. 689, 1965. [20] STREIFF A., PETERS A., GILGENKRATZ S. et GENETET B. - - Etude spectrophotomctrique du liquide amniotique et groupage sanguin ~ t a | h propos de 56 cas. C.R. du VI e Congr. Soc. Nat. Transl. Sang. (Tours 1966), La Simarre Ed. (Tours), p. 693, 1968.
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fltude spectrophotomdtrique et extraction chloroformique pour le dosage de la bilirubinamnie et d es pig ments assocles " p a r A. SENDRAIL, S. BIERME, R. CABANNES et J.-F. de B O I S S E Z O N Centre R6gional de Transfusion Sanguine de Toulouse
Introduction
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LUSIEURS
mSthodes [4, 5, 6, 7, 8, 9, 14] ont 6t~ pro pos~es pour de la bilirubine et des pigments as soci6s clans ]e liquide
amniotique. La technique de FLEMING et WOOLF [4] utilise une formule ing~nieuse grfice h ]aquelle quatre lectures spectrophotom6triques : h 700, 623, 576 et ~62 m/~ suffisent p o u r l'estimation quantitative de la b i l l rubine, de l'oxyh~moglobine et de la m6thSmalbumine. LILEY [10, 11, 12, 13] p o u r sa part, a propos$ sur la courbe pr~c~dente une seule mesure : celle de la diff6rence de densit4 optique .1 4'5'0 m/~ (absorption m a x i m u m de la bilirubine) entre la courbe et une droite tra.c~e du point situ~ fi 365 m/~ jusqu'au point de convexit~ m a x i m u m vers 550 m/x. Cette diff6rence de densit6 optique (A DO) p e r m e t de situer le liquide clans l'une des zones, I, H, et I I I de LILE¥. Nous avons quant ~ nous employ6 depuis plusieurs annSes en pa-
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FIG. 1. - - Liquide amniotique souill6 de m6th6malbumine et d'oxyh6moglobine. (BLA,.. 25-3-68). Ces d e u x m 6 t h o d e s nous r e n d e n t de g r a n d s services, et n o u s les e m p l o y o n s d e p u i s pros de q u a t r e ans a u C e n t r e d e T r a n s f u s i o n San-
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guine de T o u l o u s e ; nous les avons utilis&es pour l'&tude de .plus de 400 liquides amniotiques. Dans £ensemb]e, elles donnent une id6e suffisamment exacte du taux de bilirubine, donc appr6cient grossi~rement la gravit6 de l'atteinte du ~¢etus au cours des iso-immunisations foeto-maternelles Rhesus, et permettent de suivre l'6volution de l'6tat du liquide amniotique au cours des quatre derniers mois .de la gestation. Cependant, beaucoup d'auteurs [,12, 15, 16, 1'9, 20] sont d'accord pour les critiquer ; si elles donnent des r&sultats satisfaisants lorsque la bilirubinamnie est isol6e (qu'elle soit faible ou importante), elles sont beaucoup moins exactes lorsque le liquide est souill6 d'oxyh6moglobine, de m&,conium ou de vernix '(/ig. 1). Dans certains cas m~me, i l e s t impossible de calculer la diff&ren, ce de densit6 optique & 450 m~. 'C'est pour cette raison que nous avorrs tents de doser la bilirubine isolSe, apr~s extraction chloroformique. Materiel et t e c h n i q u e s Les amniocent&ses sont r6a]is&es chez des femmes Rhesus n6gatif immunis6es, au cours des quatre derniers mois de grossesse (432 liquides ont 6t6 examin6s). Dans les cas d'immunisation importante, elles sont r#p~t&es environ tousles dix jours.
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L i q u i d e a m n i o t i q u e ne c o n t e n a n t que de Ia b i l i r u b i n e (SE... 22-1-68).
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Les liquides tr6s souill6s repr6sentent environ le cinqui6me des liquides 6tudi6s ~84 6chantillons). Une centrifugation rapide (15 000 t o u r s / m i n u t e durant 15 h 20 minutes en centrifugeuse r6frig6r6e) 61imine en g6n6ral te vernix. Persistent n6anmoins : m6eonium et pigments h6miniques. Nous pratiquons alors deux examens : 1) Une lecture directe, c o m m e darts les ,cas habituels, en pla~ant le liquide clans la cure d'un spectrophotom6tre D K 2A de B e c k m a n
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Madame BI
Or05
- ' '
°
16re extraction:Bil.=0,234 mg % 26me extraction:Bil-=O,O75mg % 36me extraction:Bil.=0,028 mg %
Ol|"
Bilirubine Totale= 0,337 mg %
TRIPLE EXTRACTION CHLOROFORMIQUE
I
",-J
500
576
623
I
/
f
70(
Fro_ 3. - - Triple extraction chloroformique, (BLA.,. 25-3-68)
par r a p p o r t h u n blanc d'eau distil'16e (fig. 2). Une dilution au 1/2, au 1/4, ou m~me au 1/10 est ici souvent n6cessaire. Sur la courbe obtehue entre 700 et 350 m/~ nous mesurons la bilirubine et les pigments associ6s p a r la formule de FLE.MING ainsi que la diff6rence de densit6 optique h 450 m~ selon L/LEY. (Ces mesures peuvent ~tre faites avec n ' i m p o r t e quel spectrophotom~tre aux quatre longueurs d'ondes pr6cit6es). 2) Une lecture de la bilirubine isol6e des pigments parasites apr~s extraction chloroformique (fig. 3, 4 et 5). P o u r cela nous ajoutons 8 un volume de liquide anmiotique un volume 6gal de chloroforme. Apr~s agitation et centrifugation, la phase chloroformique est recueillie et examin6e aux longueurs d'ondes habituelles par r a p p o r t ~t un blanc de ehloroforme. L'extraction est r6p6t6e trois lois.
309
DOSAGE DE LA B I L I R U B 1 N A M N I E
Sur c h a c m t des e x t r a i t s est calcul6e : - - la b i l i r u b i n e selon FLEMING et WOOLS, - - ]a diff6renee de densit6 o p t i q u e ~ 450 m/~. I1 est a d m i s que l a s o m m e des t a u x de b i l i r u b i n e des :trois e x t r a i t s r e p r 6 s e n t e la quasi t o t a l i t 6 de la b i l i r u b i n e c h } o r o f o r m o - e x t r a c t i b l e .
Madame T ..... \
lereextraction:Bil.= 0,662 mg %
0,1.
2c~meext raction:Bil. = 0,063 mg % 3eme extraction: Bil.= 0,030 mg % Bilirubine Totale= 0,755 mg % ~, Do = 0. 53 SUR LA cOURBE ENTIERE: Bilirubine Totale =0, 849 mg %
0.2,
,~Do=0.52
TRIPLE
EXTRACTION
CHLOROFORMIQUE
4
I
/
0,3-
0,4.
500
576
623
0 5-
I
I
I
+
FIG. 4. - - Triple extraction chloroformique (Tgo...) D a n s les cas d e l i q u i d e s tr6s m 6 c o n i a u x il est 6 v i d e n t que la b i l i r u b i n e m 6 c o n i a l e e l l e - m S m e e x t r a ' c t i b l e p a r le c h l o r o f o r m e s ' a j o u t e h la b i l i r u b i n e p r o v e n a n t de l'h'6molyse f m t a l e , ce q u i c o n s t i t u e u n e difficult6
310
ALLO.IMMUNISATION F~ETO.MATERNELLE
non encore r6solue. Seul le dosage des enzymes sp6cifiques du m6corrium (phosphatases alealines) p o n r r a i t faire la p a r t de ce snrcrolt de pigments.
Madame Br .....
0tl-
Extrait Chloroformique Bilirubine = lt681 m9 %
EXTRACTION CHLOROFORMIQUE o,2-
O,3-
O,4-
'l°~ 7
7 °l~ ~°°?
FiG. 5. - - Extraction chloroformique (Bao..., enfant mort in utero 27-12-67)
R4sultats La courbe obtenue lors de l'extraction chloroformique est une courbe pure, ,caract6ristiqne du pigment biliaire. La p r e m i e r e extraction enl~ve h peu pros 75 % (70 ~ 80 ~%) de la
DOSAGE DE LA B1LIRUBINAMNIE
3.11
bilirubine chloroformo-extractible ; 10 h 25 % sont extraits aprSs la deuxi~me eentrifugation ; la troisiSme extraction ne recueille que tr~s peu de bilirubine. Nous avons remarqu$ que : 1) Le chiffre de bilirubine totale donn$ p a r la s o m m e des trois extractions chloroformiques est toujours infSrieur ~ celui calcul6 sur la courbe selon FLEMING et WOOLr" (lorsque cela est possible) en pla~ant direetement le liquide dans la c u r e du spectrophotombtre. La bilirubine chloroformo-extractible ne repr~sente que 50 ~ 6'0 % de la bilirubine donnSe par le calcul de FLEMING. 2) La somme des diffSrences de densit~ optique des trois extraits est tr~s voisine de la difference de densit6 optique obtenue h partir de la eourbe totale lorsqu'il est, 1~ encore, possible de l'$valuer. C o m m e n t a i r e s et c o n c l u s i o n Ces remarques appellent quelques commentaires : 1) Le fait clue le chiffre de bilirubine totale aprSs triple extraction est toujours inf6rieur ~ celui donn6 par la courbe habituelle laisserait supposer : --soit que les souillures du liquide (par l'oxyh'$moglobine surtout) surestiment le taux de la bilirubine selou FLEMING et WOOLF. C'est ce que pensent les auteurs lyonnais [17, 18] qui enx, utilisent l'extraction benz6nique, -soit que toute la bilirubine du liquide amniotique ne soit pas extractible par le chloroforme. P o u r notre part, nous nous rangeons plut6t ~ la premiSre hypoth~se. En effet, nous avons calcul$ (fig. 6) selon FLEMING et WOOLr la bilirubine d'un liquide avant et aprbs triple extraction chloroformique.
Le chiffre obtenu aprSs triple extraction est, semble-t-il exeessif, alors que m a n i f e s t e m e n t la plus grande pattie de la bilirubine paralt avoir $t6 61iminSe. 2) 'La somme des diffSrences de densit6 optique c MculSes sur les trois extraits Stant voisine de la diff6rence ¢le den'sit$ optique mesur6e sur l a courbe entibre, il est possible grace ~ l'extraction, d'6tablir le d i a g r a m m e de 'LILEY mSme p o u r des liquides dits ininterpr~tables, fr6quents au cours de certaines grossesses tr~s pathologiques.
312
ALLO.IMMUNISATION F(ETO.MATERNELLE
3) 'L'6claircissement d'un liquide amniotique demande douze '~ quinze j mlrs ; en effet des St udes parall~'les sur des liquides c6phalorachidiens recueillis lots d'hSmorragies mSning6es p e r m e t t e n t de pr6ciser le catabolisme de l'h~moglobine dans les cavit~s doses et p e u v e n t s'appliquer aux liquides amniotiques souillSs. E n effet, une 6rude spectrophotom6trique portant sur 350 6chantilions de L.C.R. pr$1ev~s sur 60 malades atteints d'h6morragie mSning6e (vasculaire, t r a u m a t i q u e ol1 post-chirurgicale) nous a montr6 que
LIQUIDE AMNIOTIQUE AVANT- ET APRES EXTRACTION -
462
500
576
623
FIe. 6.
le p r e m i e r p i g m e n t & a p p a r a i t r e Stair l'oxyirSmoglobine, pr6sente d~s la 2~ heure de l'h6morragie m6ningSe [3]. Elle atteint son t a u x maxim u m vers le 3~ ou 4 ° jour et disparait en 9 ou 10 jours p o u r se transformer progressivement in situ en bilirubine.
DOSAGE DE LA B I L I R U B I N A M N I E
313
Cette derni~re, d6celable vers le 2~ ou 3e jour, atteint son taux m a x i m u m vers le 5e ou 7e jour et d$crolt tr~s l e n t e m e n t jusque ~ers le 20 ~ j o u r (Bilirubiue .libre presque exclusivement). I1 semble p r o b a b l e qu'il en soit de m~me clans la cavit~ amniotique lorsque le liquide a $t$ souill$ a,ccidentenement de sang (au cours de la piqfire d'un vaisseau p a r exemple). Le ,catabolisme local de l'hSmoglobine produirait de la bilirubine qui se surajouterait h .celle p r o v e n a n t de l'h6mo.lyse foetale. Un d61ai d'une quinzaine de jours au m i n i m u m est n$cessaire ~ la disparit~on de ,cette bilirubina,mirie additi'onnelle qui faussera aussi longtemps l'interprStation de la courbe, et risquera de faire surestimer la gravit6 de l'6tat de l'enfant. L'extraction chloroformique est donc une technique simple et rap i d e puisqu'en pratique r o n p e u t se contenter d'une seu.le centrifugation en supposant qu'elle enlbve 75 % de la bilirubine chloroformoextra etible (le chiffre obtenu 6rant multipli$ par le coefficient d'extraction). EHe repr6sente un compl~ment int6ressant dans l'6tude des liquides amniotiques fortement souill~s. P a r ailleurs, il faut insister sur la valeur de la mesure de la difference de 'D'O ( A DO) qu'il est possible de ealculer sur l'extrait et dont les rSsultats sont plus reproductibles, surtout en cas de liquide souill$, que ceux donn6s p a r le calcul de FLEMING et WOOLF. RI~SUMI~ Les auteurs r a p p o r t e n t une exp6rience p o r t a n t sur 4,32 liquides amniotiques de femmes immunis6es par le facteur Rh. A partir de la courbe 6tablie au spectrophotom~tre, le pourcentage de bilirubine est calcu16 selon la f o r m u l e de FLEMING et WOOLF ainsi que celui des pigments interf6rents : oxyh6mo'globin'e et m6th6malbumine. L'extra'ction chloroformique de la bflirubine pratiqu'$e simultangm e n t isole ,ee p i g m e n t dans les liquides souill6s de sang, de m$conium ou de Vernix. Une p r e m i e r e extraction enl~ve 75 % environ (70 80 % ) de la bilirubine chloroformo-extractible. 10 ~ 25 % sont extraits au cours de la deuxi~me, la troisib, me extraction ne recueiltant que trbs peu de bilirubine. Le calcul de la diffSrence de densit$ o p t i q u e p e u t se faire sans difficuh6 sur la courbe d'extraction ; elle est, en r~gle, Sgale h ,celle caleul6e sur la courbe enti~re, ceci p e r m e t t a n t d',$tablir le d i a g r a m m e de LILEY m~me pour les liquides dits ininterpr6~ab!es. .7
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ALLO.IMMUNISATION F~ETO.MATERNELLE
D e s 6 t u d e s p a r a l l ~ l e s s u r les l i q u i d e s e $ p h a l o - r a c h i d i e n s r e c t t e i l l i s lors d'h6morra'gies m~ning6es ont permis de pr6ciser le catabolisme de l'h6moglobine des liquides amniotiques souill$s. La bilirubine produite s e s u r a ~ j o u t e ~ c e l l e p r o v e n a n t d e l ' h ' ~ m o l y s e f o e t a l e , ,ce q u i p e u t f a i r e surestimer la gravit6 de l'6tat de l'enfant. Le temps de disparition de l a b i l i r u b i n e a d d i t i o n n e l l e e s t e s t i r n 6 ~ 12-15 j o u r s . D r A. SENDRAIL C e n t r e de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e C.H.U. P u r p a n , 31-Toulouse
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