La localisation d'enzymes de déphosphorylation dans les oeufs de quelques Invertébrés

DEVELOPMENTAL

BIOLOGY,

La localisation

7,

d’enzymes

les oeufs

de

A. M. Laboratoire

457-487

de dkphosphorylation quelques

DALCQ

d’Embryologie

( 1963)

dans

Invert&b&s1

ET J. J. PASTEELS’

humaine,

Unicersite’ de Bruxelles,

Accept& le 2 novembre

Belgique

1962

INTRODUCTION En 1961, nous avons montri: que si des oeufs de Pholade sont fixes au formol, law&s dans H,O puis incubes en presence d’ATP et de (NO,),Pb au pH 7.2, on peut mettre en evidence une liberation enzymatique de groupes “phosphate” selocalisant, de faGon preferentielle, dans les granules /3 oh se manifeste la metachromasie in wiuo. Nous nous sommes maintenant propose d’examiner si ce phenomene se retrouverait dans les oeufs d’autres Invert&b&s et de voir, a la fois chez ces autres especeset chez la Pholade, comment il se presenterait avec d’autres mononucleotides que l’ATP. Cette enquete a revel6 que nos constatations anterieures ne portaient que sur un aspect limit& dun tableau plus complexe qui permet de mieux saisir, saris cependant en elucider encore toutes les modalites, l’evolution du systeme des enzymes de dephosphorylation. 11ne peut s’agir, nous l’indiquons expressement, que de celles qui r&tent a une courte fixation par le formal. MATERIEL

ET

TECHNIQUE

Les oeufs et spermatozofdes de Barnes candida (Pholade), de Psammechinus miliaris ( Oursin), d’dscidiella scabra ( Ascidie) et de SabeZZariaalveolata (Hermelle) ont et& obtenus a partir d’animaux r&oh& au laboratoire de Wimereux et maintenus en bon &tat physiologique dans l’aquarium marin de notre Institut d’Anatomie. Nous ‘Ces investigations ont Btk effect&es en partie grace a une subvention du Fonds National de la Recherche Scientifique, auquel nous exprimons tome notre gratitude. ’ Adresse actuelle : Laboratoire d’hnatomie et d’Embryologie humaines, Faculte de MCdecine, Universitk de Bruxelles, 97, rue aux Lames, Bruxelles 1, Belgique. 457

458

DALCQ

ET

PASTEELS

adressons nos vifs remerciements j R/I. le Professeur Defretin, directeur de la Station biologique de Wimereux, pour les possibilitks de rkolte faunistique qu’il nous a obligeamment ass&es. Les fkondations artificielles &ant r&ah&es au d&but de la journke, des lots d’oeufs ont & fix& a divers stades dans un mAlange, refroidi B 2”C, de 1 p. de form01 dans 9 p. d’eau de mer, le pH &ant corrigi: a 8.6 par addition de NaOH (N/10). Apr& 1 heure de fixation, les oeufs ktaient rincks dans H,O bidistillile B 2°C puis lavks dans 30 ml de ce milieu jusqu’8 17 h 30, toujours B 2°C. 11s ont &i: alors transf,krks, selon une technique d&iv&e de Wachstein et Meisel (1956), dans les milieux d’incubation ainsi constituks: (a) tampon “Tris” (au pH 7.2) 8,5 ml + (NO,) ,Pb lo-:’ M 1 ml + MgSO, lo-” hl 0,5 ml; (b) ce m&me milieu plus le mononuclkotide choisi de manike B rkaliser pour celui-ci une concentration de lo-’ M. L’incubation B 38°C a &k prolong&e pendant 17 a 18 heures (des tests prkliminaires ayant montrir que des incubations plus courtes B cet ordre de concentrations ne donnent pas de rksultat perceptible). La combinaison chronologique adopt&e a l’avantage de s’adapter au rythme de l’activite normale, avec la possibilitk de rkpkter les expkriences de 2 en 2 jours aprks avoir pris sommairement connaissance du rendement de l’exp6rience prkkdente. Une incubation aussi prolong&e n’est cependant pas indispensable. Dans le cas de la Pholade, il a kt8 constatii par aprtls que d’excellents rksultats sont obtenus en fixant 30 minutes, lavant 2 heures et incubant 4 B 5 heures B 38°C dans une concentration de substrat double ou triple de celle mention&e ci-dessus. Qualitativement, les rksultats ne sont nullement modifiks. Les substrats utilisks ont ktk: adknosine-5’-triphosphate mokulaire 605 adknosine-5’-diphosphate poids molkculaire adknosine-5’-phosphate mokulaire 521 inosine-5’-triphosphate molkculaire 672 cytidine-S-triphosphate molkculaire 617 uridine-5’-triphosphate mokulaire 540

de soude, corrigk ( ATP) de soude, corrigi: 503 (ADP) de soude, corrig& (AMP) de soude, corrigk (Inos.TP) de soude, corrigk (Cyt.TP) de soude, corrigk (Urid.TP)

B 3 HaO, Sigma, poids k 3 H,O,

Sigma et Pabst,

B 4 H,O

Sigma,

poids

B 6 H,O,

Sigma,

poids

a 5 H,O,

Sigma,

poids

B 3,5 H,O,

Sigma,

poids

PHOSPHOHYDROLASES

OVULAIRES

459

Tous ces produits ktaient conservks dans un exsiccateur et a 2°C. Dans certains cas, des stades bien distincts ont &&, apr&s la fixation, rkunis dans un m$me lot, afin que leur traitement global fasse ressortir les diffkrences dues au stade. La lecture des rksultats peut se faire de deux man&es. D’abord en reportant simplement dans la solution a les oeufs soumis au substrat et en les montant clans ce milieu entre lame et lamelle; les localisations les plus marqukes du (PO,) ZPb, form& peuvent ainsi &re nettement perques. Ensuite, en prockdant rll la r&&lation dans (NH,) ?S ainsi que suit : rinGage dans le tampon a&ate a pH 4.95, puis 30 a 45 secondes de lavage dans ce tampon; transfert dans 5 ml H,O avec 1 goutte de (NH,),S concentrk, 1 minute; 2 bains H,O de 1 minute; montage B la glycerin-jelly. Dans la prksente &de, le premier pro&d&, qualifii: d’exu:amen direct, ne sera utilisi: que dans un seul cas, celui des oeufs de Pholade rkcemment f&ond&. Outre l’incubation en milieu (a) saris substrat, des expkriences d’inhibition par NaF lo-’ M ont Btk faites en achevant d’abord le lavage dans cette solution aqueuse de fluorure, puis en rkalisant l’incubation en prksence de cette m&me concentration de NaF. Aprks nous ktre rendus compte des r&actions ainsi observables dans les oeufs normaux, nous avons examini: les conskquences de la centrifugation. Cette intervention a &tit &alike sur les oeufs indivis (stade des pronuclki) ou segment& en II, h l’aide de la centrifugeuse ti refroidissement Martin Christ, a la tempkrature de lO”C, pendant 15 minutes g 25.000 g, conditions qui assurent une stratification typique saris I&ion inopportune. L’analyse des images a ktk faite au microscope Laborlux Leitz, kventuellement 6quipk du dispositif de contraste de phase et fond noir Heine. Photographies au Leica sur film Isopan Agfa et Scientia Gevaert 39-C-56. Les diverses manipulations par pipettage ont &tB rkaliskes par M. R. Huygens, technicien du Laboratoire, avec un soin et une prkcision dont nous lui sommes reconnaissants. OBSERVATIONS

PERSONNELLES

Les don&es recueillies cet Btk ont encore, en grande partie, le caractkre incomplet d’une exploration prkliminaire. Pour chaque espkce, le plan des expkriences prBvoyait une comparaison entre les effets des six mononucl&otides employ&. En fait, diverses raisons, le

460

DALCQ ET PASTEELS

souvent un incident dans des manipulations toujours delicates, nous ont prives des preparations qu’aurait dO procurer l’un ou l’autre milieu d’incubation. Les grandes lignes du phenomene ne s’en dessinent pas moms t&s clairement. Une premiere observation g&kale est que, pour ces quatre especes d’oeufs fecondes, la prolongation de l’incubation dans les tri- et diphosphates conduit a une impregnation complete par le PbS.

plus

A. OEUFS DE &mea La difference technique entre ces nouveaux resultats et ceux de l’an dernier est que le lavage precedant l’emploi du sulfure a Bti: fait au tampon acetate acide au lieu de H,O. I1 en est resultit une suppression presque complete des “localisations” nucleaires. 1. Oeufs non centrifuge’s Le point saillant n’est pas tant ici les differences de reaction aux divers substrats que l’kvolution des manifestations dans I’ATP aux divers stades. Sans qu’on puisse affirmer que toute granulation positive a une origine vitelline, la participat i 0n des plaquettes a l’elaboration de l’enzyme est patente et considerable. C’est dans leur substance et autour d’elles qu’apparaissent des corpuscules positifs trks petits. Ce processus se discerne le mieux dans les oeufs fecondes. 11s’installe en phiphkrie et progresse vers le centre. De tels aspects existent deja, mais peu frequemment, dans les oeufs vierges. On y trouve aussi quelques granules positifs libres. Si les oeufs entrent en maturation sans ktre fecondes, ils ne paraissent pas s’enrichir en enzyme. La fecondation dkclenche des changements complexes dont le detail ne pourra etre etudie ici. Lorsque la membrane nucleaire se flktrit, le sue nucleaire devient Ikgerement positif et les endroits oil il se disperse sont visiblement actives. Parallelement, un changement survient au point de fkcondation. La t&e spermatique reste negative, mais on discerne souvent trois ou quatre grains positifs repondant aux mitochondries de la piece intermkdiaire (Pasteels et de Harven, 1968a). Le fait remarquable est qu’une plage superficielle de petits granules de PbS se constitue tout autour. Cet aspect reste observable pendant tout le tours de la maturation, tandis que le pronucleus, luim&me nkgatif, gonfle peu a peu. A l’examen direct, sans que le sulfure soit intervenu, la zone du pronucleus mile se distingue comme une

FIGS.

1 B 4.

Oeufs

de Barnes.

Fro. 1. Aspect, a l’examen direct, d’oeufs fixes 30 minutes apres la fkcondation et incub& dam ATP-Mg-Pb. U ne zone rendue plus dense par depot de phosphates (fl&ches) signale l’emplacement de la t&e spermatique. (a) Un oocyte ( x ) non encore entre en maturation, (c) Un oeuf segmente en 2 blastomirres; sa presence est due 8 ce que, apres la fixation, des lots successifs ont 6th melanges pour favoriser la comparaison des reactions aux divers stades. FIG. 2. Mktaphase de la premike division ( ATP-Mg-Pb). La zone de chorion soulevi: par les globules polaires indique le pBle animal. Granulations positives diverses, certaines d&passant la taille d’une plaquette vitelline. Ces gros elements sont plus nombreux au centre, oti ils dessinent la silhouette du diaster. A la peripherie, garniture de petites granulations. FIG. 3. Partie moyenne dun oeuf du m&me lot que le precedent, mais fix& pendant sa division. De part et d’autre, au niveau de l’encoche ( fl&ches), on voit les granules positifs du cortex rest&s adherents au chorion (voir texte). Le reste de l’oeuf est semblable B l’aspect de la Fig. 2. FIG. 4. Partie moyenne dun oeuf du m&me lot surpris a la formation du sillon. Mise au point sur la surface de l’oeuf. Une trainee dense de granulations positives (fkches) son-gne le tra& du sillon. Le reste de l’oeuf ne diff&re pas de la Fig. 2. 461

462

DALCQ

ET

PASTEELS

condensation de plaquettes assombries par un prkcipith de (PO,) 2Pb, (Fig. 1). Pendant les miioses de maturation, on assiste B une certaine recrudescence des &actions et l’on retrouve d proximitk ,des asters les gros corpuscules positifs dkja ident&% par nous aux m&a-granules P. De-ci, De-la, ,des plaquettes entrent en activitk en klaborant des grains positifs. La conjugaison des pronucki entraine une intensification considkrable des &actions. C’est dans tout le cytoplasme, dans de nombreuses plaquettes et entre elles, un foisonnement de grains de toute taille dans lesquels se reconnaissent des granules du type ,B. Cependant, la majoritk des plaquettes reste rkgative, ainsi clue les pronucliri. Lorsque le premier diaster est ktabli, il existe une garniture continue de granules corticaux positifs (Fig. 2). 11s si&gent vraisemblablement a la base des villositks que l’un de nous vient de dtrcrire (cf. Pasteels et de Harven, 1962b). Lorsque le sillon se forme, une localisation particuli&re le souligne. Au dkbut de l’inflexion corticale, on observe a son niveau des grains serrks tapissant le chorion en regard du sillon (Figs. 3 et 4). I1 ne semble toutefois pas qu’une localisation particulikre des activitks enzymatiques signale prkalablement la zone de cytodikrkse. La continuation du clivage s’accompagne des mhmes processus tant vitellins que granulaires, notamment avec les gros granules du type ,8 p&s des noyaux et des figures mitotiques. On recueille l’impression de variations cycliques, mais elles sont difficiles a ktablir formellement. Au point de vue des autres mononucl&otides, un seul triphosphate, InosTP, nous a don& une information valable avec un effet nkgatif. AMP procure au contraire une r&action d’abord faible, puis intensifike. Au d&but de la segmentation, seules rkagissent deux ou trois dizaines de grains du calibre des plaquettes vitellines. Lorsque l’kpibolie gastrulkenne s’est produite, les grosses cellules internes kagissent seules, ou B peu prks, avec de nombreuses granulations qui semblent iitre des plaquettes en voie de &sorption (Fig. 5). Cette diffkrence entre les deux stades a Citk constatke dans deux pontes diffkrentes. Ajoutons enfin que l’expkrience d’inhibition par le NaF a &k refaite avec un effet radical, comme en 1961, et que les divers lots tkmoins trait& sans substrat se sont montrks nirgatifs. Dans les deux cas, un examen attentif permet de discerner, par leur rkfringence, les granulations du type fl et les plaquettes, mais il n’y a aucun d&pat de PbS.

PHOSPHOHYDROLASES

463

OVULAIRES

d FIG. 5. Oeufs de Barnen. Intensification de la r&ction obtenue par incubation dam AMP-Mg-Pb, en passant du stade VIII h la jeune gastrula. (a) et (b) Deux coupes optiques du m
:

Dans le vitellus, on discerne nettement les petites cavil& qui se creusent dans divers elements et leur donnent, eventuellement, un aspect cribk 2. Oeufs centrifugds Les effets de la centrifugation n’ont eti: examines que dans le cas de I’ATP (Fig. 6). 11s sont de deux types qui paraissent correspondre a deux stades d’evolution des oeufs utilises. Dans une minorit des cas, la &action est relativement faible et pratiquement limit&e a une bande intermediaire qui fait suite a la cape proximale de lipides, totalement negatifs. Cette bande hyaline contient des granules de petite taille et d’autres corps, d’aspect variable, qui paraissent &tre d’origine nuclkaire; parfois meme une vesicule germinative est encore intacte, mais aplatie, et a pris une coloration brune. La moitie distale (centrifuge) est occupbe par les spherules vitellines qui peuvent 2tre soit toutes nega-

464

DALCQ

ET

PASTEELS

FIG. 6. Effets de la centrifugation sur l’oeuf indivis de Barncu. Incubation dans ATP-Mg-Pb. (a) Oocyte; (b) oeuf fecondi: au stade des pronuclei. Dam (a) la nature des corps positifs a la limite profonde de l’amas lipidique est rest&! enigmatique. En (b) les grains positifs couvrant le pole centripete sont uniquement corticaux. En (a) et (b), l’assombrissement de la zone hyaline est dil a une teinte brune (&action faible diffuse).

tives, soit parsemees de plaquettes partiellement ou totalement positives (Fig. 6a). Ce type de reaction r&pond done a des oeufs rest& vierges. Les autres oeufs, en majoritt?, ont reagi plus intensement, bien qu’a des degri: divers. La zone proximale (centripke) reste reservee aux lipides, et le peu ,de corpuscules positifs qu’elle montre sont des constituants superficiels englues dans le cortex. En bordure proximale de la bande hyaline (souvent brunie par une reaction diffuse) se prksentent de nombreuses granulations punctiformes puis viennent des grains plus volumineux, du type P. Vers la limite distale de cette bande, se manifestent les plaquettes positives qui vont former un semis plus ou moins important dans la masse de vitellus. Le pole distal lui-m&me est, en regle g&r&ale, totalement negatif. Ajoutons que, dans les deux types d’oeufs, il existe dans le cortex un semis de granulations positives rest&es sur place.

PHOSPHOHYDROLASES

B.

OEUFS

DE

OVULAIRES

46!5

SabeZhia

Ce materiel, deja utilise par Faure-Fremiet (1924), par Hatt (1931, 1932) et par Novikoff ( 1938, 1939)) est caracterise par l’abondance de spheres vitellines relativement volumineuses qui en limitent la transparence. Heureusement, ces plaquettes ne retiennent pas indument le (NO,) ,Pb et des images bien electives ont pu &tre obtenues. La r&site de la fecondation artificielle varie, surtout quant au synchronisme du developpement. 11 arrive B un certain nombre d’oeufs de ne pas depasser les premiers stades et a cela correspond saris doute quelque variabilitk des reactions enzymatiques. L’kvolution g&i&ale ne s’en degage pas moins avec clartk. 1. Oeufs normaux Posons d’abord que dans plusieurs essais il a ete v&if% que les oeufs incubes en l’absence de substrat restent integralement nkgatifs. Dans le seul test reussi avec le fluorure, une attenuation poussee de la reaction a et& obtenue par rapport au lot incube dans Inos-TP-MgPb. L’inhibition complete serait saris doute atteinte avec une dose un peu plus forte de NaF. Les reactions obtenues aux divers stades sur 6 pontes differentes permettent de decrire comme suit le comportement des oeufs d’Hermelle. a. Incubation duns ATP-Mg-Pb. Les oocytes vierges se caracterisent par une vesicule germinative t&s chargee en PbS-sous reserve dinterpr&ation!-et un cytoplasme legerement teinte par une reaction globale, avec seulement quelques grains positifs, la plupart corticaux. Quelques plaquettes contiennent des granules analogues. Compte tenu de ce que vont montrer les oeufs fecondes, on peut considerer qu’une production discrete de granules nantis dune activite enzymatique dephosphorylante est deja amorcee dans l’oeuf vierge. Si les oocytes sont amen& a entrer en maturation par simple sejour dans l’eau de mer, leur reaction ne s’accentue nullement, du moins a l’egard de I’ATP. La fecondation entraine rapidement une reaction plus vive du cytoplasme. La tonaliti: g&r&ale devient plus foncee, des plaquettes vitellines de plus en plus nombreuses engendrent des grains actifs (Fig. 7). Cet enrichissement se poursuit de la zone corticale a la profondeur. 11 est deja trks sensible au stade des pronuclei (Fig. 13))

FIGS.

7 1 11.

Oeufs

de

SabelZurh.

FIG. 7. Oeuf incub dans ATP-Mg-Pb avec les amas positifs et lcs granules se constituant, au moins en majorit&, aux d&pens des plaquettcs vitellines. Mist au point sur la surface de la portion centrale de l’oeuf. FIG. 8. Oeuf (mitose de maturation?) incub dans Cyt. TP-Mg-Pb. Petites granulations &parses dans le cytoplasme entre les grains vitellins (gCn&alement nhgatifs); grains plus gros entre les rayons de I’aster (A&he). FIG. 9. Oeuf en fin de maturation, incub& dans Urid. TP-Mg-Pb; presque saris &action. On y distingue les sphbres intervitellines, B paroi parfois lCg&rement positives ( fl&ches ). Stade du diaster, incubk dans ATP-Mg-Pb, avec groupe de “boules” FIG. 10. positives autour de la zone &quatoriale. Le reste de l’oeuf n’a que des granulations eparses. FIG. 11. Oeuf incubi! clans ADP-Mg-Pb. Couronne de masses positives autour du diaster. Le reste de I’oeuf montrerait des granules assez rares.

se maintient-sous &serve de variations cycliques possibles!-pendant les premikres &tapes du clivage (Figs. 14 et 19) et s’accentue considkrablement dans les morulas (Fig. 12). Dans ces complexes un peu aplatis d’une vingtaine ou d’une trentaine de blastomhes, les microm&es sont plus actifs. Les stades ultkrieurs, pour autant qu’on les ait examin&, ne paraissent rkagir que faiblement.

PHOSPHOHYDROLX3ES

OVULAIRES

467

Cette evolution generale comporte des particularites notables. Le lieu de fecondation est le siege dune activite marquee, mais dont les modalites doivent iitre reservees pour une etude ulterieure. 11 ne paraPt pas y avoir de granules corticaux positifs comme ceux vus dans l’oeuf de Pholade. Par ailleurs, les edifices mitotiques restent libres de granules actifs. Le lobe polaire reagit intensement (Figs. 12-15) dune man&e a la fois granulaire et continue; ces signes resistent a une prolongation de lavage precedant l’intervention du sulfure; ils sont done authentiques. En general, les sillons et espaces interblastomkriclues restent negatifs (Figs. 19-31) ; mais certains stades II (Figs. 12 et 14) ont fait exception a cette regle en manifestant une condensation granulaire le long du sillon. Au stade IV, on discerne frequemment des differences entre les blastomeres avec des variantes provenant vraisemblablement de l’age du germe. Tantot on observe des plaquettes en resolution plus nombreuses dans le blastomkre A que dans B, et plus nombreuses aussi dans C que dans D (Fig. 19). Chez d’autres specimens, l’activite cytoplasmique differe moins mais les noyaux reagissent de facon distincte (Fig. 20). La diversite devient plus marquee dans les jeunes morulas, ou l’on trouve c&e a c&e des noyaux au repos, soit negatifs soit remplis de granules, soit masques par des grosses vesicules positives ou encore formant un bloc compact, et cela h c&k de stades mitotiques non moins singuliers. Tout bien consider&, il n’y a pas lieu d’attribuer ces modalites des manifestations nucleaires h des retentions fortuites du (NO,) ,Pb. Le phenomene, qui nous a fort intrigues, resulte en realite d’une collaboration inedite entre le cytoplasme et le noyau. D’aprks nos donnees actuelles, elle nous apparait sous les aspects que voici. Si l’on examine attentivement des oeufs indivis incub& saris substrat, ou en presence dun substrat peu actif a ce stade (cas de la Fig. 9), on y decouvre parmi les plaquettes de grosses vesicules spheriques, de diametre 3, 4 OLI 5 fois plus grand. Nous n’avons PLI, jusqu’ici, que noter leur presence; leur constitution devrait &tre l’objet d’essais cytochimiques. Elles sont relativement peu nombreuses. Dans le cas de la Fig. 9, il en a et6 dknombre 13 ou 14. Dans les oeufs soumis a I’ATP (ou a l’ADP), on rencontre ces m&mes vesicules group&es en profondeur, esquissant une couronne ou une sphere, et reagissant intensement (Fig. 10). Visiblement, ces formations sont en quelque man&e associees a la mitose, mais il serait difficile d’y voir les chromosomes. Ceux-ci ont et6 observes par Fame-Fremiet (1924),

468

FIGS.

DALCQ

12 B 18.

Oeufs

de

ET

PASTEELS

Sabelkuria.

FIG. 12. Stade indivis, stade II et jeune morula voisinant dans une m&me prkparation ( ATP-Mg-Pb). Difference d’intensitk et de localisation de la &action selon le stade. Le lobe polaire du stade II est fortement positif et le sillon est soulign& FIG. 13. Stade du diaster de premihre segmentation, avec &action g&kale ( ATP-Mg-Pb) mais accent&e autour de l’kdifice mitotique, et le lobe polaire, tr&s positif, en formation. FIG. 14. Stade II g reaction mod&+e ( ATP-Mg-Pb), inthressant le sillon et le lobe polaire, t&s positif.

PHOSPHOHYDROLASES

OVULAIRES

469

ils sont au nombre de 16 au premier fuseau de maturation; s’ils presentaient ce veritable gigantisme, cet auteur l’aurait surement signal& Cependant, le nombre de nos “boules” positives est, regulierement, du m&me ordre de grandeur et une image, que nous invoquerons ici bien qu’elle concerne l’ADP (Fig. ll), suggere des “t&trades” de premiere maturation, encore que renforcees. Pour l’oeuf indivis, nous n’en savons momentanement pas plus, &ant don& que le manque de synchronisme entre les oeufs expose, avec notre technique, a la confusion entre les fuseaux de maturation et de premiere segmentation. Le stade II ne nous a, jusqu’ici, rien montre d’extraordinaire au point de vue nucleaire, mais a partir du stade IV des images speciales ont de nouveau attire notre attention. Les grosses boules &parses dans le vitellus ont et& parfois rencontrees. A un certain stade, probablement prophasique, les noyaux prennent l’allure dun paquet de “boules” ou d’ovoides positifs (Fig. 20) difficiles a denombrer mais qui depassent la vingtaine et m&me la trentaine. 11 ne serait pas exclu qu’elles repondent aux 32 chromosomes, mais nous supposons qu’elles les entourent ou les accompagnent. Certaines images suggerent de nouveau que ces corps sont Venus du cytoplasme pour se grouper autour du materiel nuclkaire. Dans des morulas riches en mitoses (Fig. 21) nous avons vu un ensemble granulaire empater le groupe des chromosomes en anaphase ou en telophase; ces constituants paraissent bien participer au cycle mitotique. Au total, une version plausible des presentes constatations serait que des vesicules form&es en petit nombre dans le cytoplasme de l’oeuf indivis viennent se grouper autour de son edifice mitotique et deviennent capables de dephosphoryler I’ATP et I’ADP ainsi que, peut-etre, d’autres mononuclkotides. Un processus analogue, n’excluant pas certaines differences, se deroule pendant le troisikme FIG. 15. Oeuf segmenti: en deux avec forte reaction (ATP-Mg-Pb) dam lr polaire. FIG. 16. Localisation de la reaction ( ATP-Mg-Pb) dans un oeuf centrifuge au stade des pronuclei. Partie centripete B droite. FIG. 17. Localisation de la reaction dans un oeuf centrifuge et incube dans AMP-Mg-Pb. La teinte sombre de la partie centripete (p.c.) est simplement due ?I la refringence des hpides. Rares granules dans la partie hyaline et entre les grains vitellins. FIG. 18. Effet, sur un oeuf centrifuge, de l’incubation saris substrat. Les details sombres sont dus B la rkfringence. lobe

DALCQ

ET

PASTEELS

20 -

FIGS. 19 Q 21. Oeufs de Suhellaria. FIG. 19. Stade IV, a reaction mod&r&e ( ATP-hlg-Pb), laissant percevoir une inkgalitk de charge enzymatique entre les blastomeres. Compte term des divers plans, A est plus charge que B; D, plus que C. FIG. 20. Exemple de stade IV avec reaction (ATP-Mg-Pb) tres i&gale des noyaux. A et B sont un aspect poussiereux, C montre les corps positifs associes aux chromosomes, D a un noyau compact. Les reactions cytoplasmiques sont de petits granules. FIG. 21. Jeune morula avec telophase dans la plupart des blastomeres. Apres ATP-Mg-Pb, les groupes de chromosomes (fleches) sont charges de matkriel amen6 par les spheres positives. Les deux noyaux n1 et n? se retrouvent SW les deux figures a des niveaux difkents. et les suivants. Nous espkrons pouvoir en l’ktude. Signalons enfin que si, comme cela ne manque pas de se produire,

cycle

poursuivre

de

segmentation

PHOSPHOHYDROLASES

OVULAIRES

471

des oeufs artificiellement fecondes s’arretent a un stade prevu du clivage, leur enrichissement en granules positifs, par activation des plaquettes, continue dans une large mesure. 6. Incubation en pre’sence d’autres mononucle’otides. Les resultats ci-dessus ont pu etre compares avec les triphosphates de l’inosine, de la cytidine et de l’uridine. Leurs effets respectifs sont t&s semblables entre eux, mais, toujours moindres que ceux ,de l’ATP. 11s ne concement guere qu’une formation mod&e de granules aux d&pens des plaquettes. Ces grains sont encore rares durant la maturation; ils peuvent s’insinuer dans les rayons asteriens (Fig. 8). A l’approche de la segmentation, la reaction devient plus franche. Cette progression a etk enregistree pour les trois corps ici en cause. L’ADP donne une liberation de phosphates se rapprochant nettement de celle obtenue avec 1’ATP. Une comparaison semi-quantitative sera realisable. On retrouve en tous cas : l’activation plurigranulaire et progressive des plaquettes; la reaction des spherules perimitotiques, souvent aussi volumineuses qu’avec 1’ATP, parfois plus reduites (Fig. 11) ; la reaction intense des micromeres, qui tranchent en noir sur le massif grisltre des macromeres. Les nombreuses images obtenues avec l’ADP sont specialement electives et engagent a utiliser les diphosphates pour une analyse plus approfondie. Enfin, l’AMP n’a fait apparaitre que de rares granules dissemines entre les plaquettes. 2. Oeufs centrifuge’s Une bonne experience a pu etre realiske avec des oeufs n’ayant pas d&passe le stade des pronuclki. La comparaison entre les images obtenues apres incubation dans l’AMP, l’Urid.TP, la Cyt.TP, l’Inos.TP et l’ATP verifie les differences signal&es pour les oeufs normaux. Avec tout mononuclkotide autre que l’ATP, on a juste un semis de granules positifs dans la partie hyaline et vitelline (Fig. 17, comparer au tkmoin, Fig. 18). L’ADP n’a pu etre etudie. Apres emploi de l’ATP, le resultat n’est pas absolument uniforme. L’exemple de la Fig. 16 r&pond a un effet moyen. II y a toujours bon nombre de grains suspendus dans la partie hyaline, mais les variantes portent sur la masse vitelline qui peut, soit &tre entreprise totalement, soit, a la limite, ne reagir qu’au niveau de plaquettes &parses. L’effet ATP reste cependant nettement superieur a celui des autres substrats. Ces differences sont probablement en relation avec le stade individuel des oeufs.

472 C.

DALCQ

OEUFS

DE

ET

PASTEELS

Psammechinus

Dans les oeufs d’oursin, l’analyse des activitks dkphosphorylantes est favorike par le synchronisme de leur dkveloppement, leur volume

FIGS.

22 g 25.

Oeufs

de Psammechinus.

FIG. 22. Oeufs vierges incubks (a) dans ATP-Mg-Pb; (b) dam Inos.TPMg-Pb. FIG. 23. Oeufs fCcond&s incub& dam Inos.TP-Mg-Pb : (a) oeuf avec membrane soulevke d’un c⁢ la &he indique la t&e spermatique, fortement positive; (b) d&tail de la zone oh les v&icules corticales se sent rompues; (c) la zone oppos&e, & vksicules corticales intactes. Elles sont negatives dans les deux cas. FIG. 24. Le pronuckus 8 en voie d’expansion. Incubation Inos.TP-Mg-Pb. Remarquer l’aspect granuleux ( p&iph&iel ) de ce jeune noyau. A proximitk, plusieurs plaquettes claires recklant un grain positif du type ,8. FIG. 25. M&me pkparation que dans la Fig. 24. Phase de rapprochement des pronucl&. Le plus petit noyau tr& positif, est le pronuclkus 6. Le pronuclkus 0 a une &action plus diffuse. Tout autour, s&ieuse reaction granulaire et vitelline.

PHOSPHOHYDROLASES

FIGS.

26

B 28.

Oeufs

de

Psammechinus.

FIG.

26. Oeuf fkcondi: et gastrula incub& 27. Blastomke du stade II aprk granules positifs encapsulant kritablement le division. Grains fins libres B la pbiphkrie; en du type “vitellin.” FIG. 28. M&mes conditions que dans la droite) d’un stade I; (b) region subcorticale y a dans ce cas moins de granules positifs et FIG.

et I’absence

prospection

1. Oeufs

473

OVULAIRES

de tassement de leurs devra &tre compl&e

ensemble dans ATP-Mg-Pb. incubation dans ATP-Mg-Pb. Les diaster prhparatoire & la deuxiBme profondeur, nombre de corpuscules Fig. 27. (a) (g gauche) ils sont plus

plaquettes

sur divers

Partie subcorticale (A d’un blastomere II. 11 petits.

vitellines.

Cette premi&e

points.

normaux

Nos fixations ont seulement compris d’une part les oeufs vierges et les oeufs fkondks jusqu’au stade IV, d’autre part des gastrulas et de jeunes prismes de 24 heures. Divers stades d’un vif i&r&t n’ont pas encore 636 explorks. Les informations disponibles portent sur trois triphosphates (ATP,

474

DALCQ

FIGS.

29 a 30.

Oeufs

et prisme

ET

PASTEELS

de Psammechinus.

FIG. 29. (a) Stade IV apres incubation ATP-Mg-Pb. (b) Stade IV apres incubation dam Inos.TP-Mg-Pb. Granules divers. Renforcement de la r&action dans l’un des blastomeres. (c) Incubation d’un stade IV dans les m&mes conditions. Reaction plus forte dans deux des quatre blastom&res. (d) Incubation dun stade IV dans AMP-Mg-Pb. Reaction disperske, surtout p&iphCrique, interessant lkg&rement deux des sillons ( fkches) . FIG. 30. Fragment de larve prismatique apr&s incubation dans ATP-Mg-Pb. Rkaction g&kale presque negligeable mais effet positif dans les noyaux du mesenchyme primaire (&he). Ect., ectoblaste; End., endoblaste. Inos.TP, cet

I’ADP

Cyt.TP)

ordre.

Tout

et

I’AMP.

renseignement

Leurs sur

effets sont

l’Urid.TP

fait

dkcroissants

selon

malheureusement

d6faut. Les

effets

obtenus

avec

I’AMP

sont de loin les

plus

rhduits

et se

PHOSPHOHYDROLASES

OVULAIRES

475

bornent souvent g quelques granules form& par des plaquettes a la p&iph&ie des blastomkres. L’exemple de la Fig. 29d est l’un des plus corks qu’on puisse rencontrer. Les deux sillons les plus rkcemment form& ( flkches), montrent quelque r&action. Cette indication serait B exploiter. Grande est la diffkrence avec les rksultats dus B l’Inos.TP (Fig. 29, b et c) et surtout l’ATP (Fig. 29a). Dans ce dernier cas, le volume des granulations est remarquable et contraste avec les grains fins en majoriti: dus a l’Inos.TP. Avec ce corps, il y a tendance a une r&action plus intense dans un (Fig. 29b) ou deux (Fig. 29c) des blastom&res. L’activiti: qui se manifeste ainsi se retrouve pratiquement stationnaire dans la jeune gastrula (Fig. 26). A cette r&action, de niveau apparemment uniforme, s’oppose la rhponse toute minime des jeunes prismes dans lesquels rkagissent, trks discr&tement, les klkments du mksenchyme primaire avec un noyau nettement positif. Pour prkciser quelques points de d&ail, nous nous rkfkrerons aux prkparations r&ultant des incubations dans I’ATP et surtout dans l’Inos.TP. Nous pensons cependant que divers aspects qui n’ont encore Bti: observks qu’avec ce dernier substrat, s’obtiendraient tout aussi bien avec l’ATP. Dans les oeufs vierges, l’ATP est hydrolysk au niveau de granules t&s fins, de calibre un peu variable, dispersks “entre”( ?) les grains vitellins (Fig. 22a). L’emploi de l’Inos.TP y a donnk des granules plus gros (Fig. 22b). La fkcondation provoque une &action dont il faudra suivre ultkrieurement les premi&es &apes. Au moment de notre fixation la plus prkcoce (25 minutes apr& l’inskmination), elle ktait d&ja pleinement r&alike. Elle intkresse j la fois le pronuclkus d et la zone adjacente du cytoplasme. Fait notable, les noyaux se montrent positifs, le pronucks d intenskment (Figs. 24 et 25), le pronuckus o plus mod&+ment (Fig. 25). On voit au d&but (Fig. 24) la localisation intraplaquettaire des grains actifs. La m&me prkparation contenait quelques oeufs fix& au moment oh la membrane ne s’ktait pas encore soulevke d’un c8tb (Fig. 23a). On peut ainsi comparer l’ktat du cortex avant (Fig. 23~) et aprils (Fig. 23b) la rupture des vksicules corticales; dans l’un et l’autre cas, elles sont nkgatives en elles-m&mes, mais on voit nettement combien la partie “fkcondke” a produit plus de granules que l’autre. Cette activation s’ktend naturellement B l’ensemble de l’oeuf, de la surface B la profondeur; elle est locaMe sur des grains irrkguliers et de calibres divers. Le cortex de l’oeuf indivis est plus directement intkressk (Fig, 28a) par cette activiti: que celui des deux premiers blastomkres (Fig.

476

DALCQ

ET

PASTEZELS

28b). Dans ceux-ci, chaque diaster est veritablement encapsulk, ou mieux, pris dans une sorte de corset resserre a l’kquateur du fuseau (Fig. 27). De menus grains se montrent au sein des centrospheres. En tout ceci, temoins sans substrat et lots oh le NaF a et& ajouti! au substrat sont totalement negatifs. 2. Oeufs centrifugks Si les differences resultant de l’emploi retrouvent dans le cas des oeufs centrifuges,

des divers substrats se il s’y ajoute une don&e

FIG. 31. Oursin. Oeufs centrifuges 15 minutes a conditions d’incubation (ATP-Mg-Pb) que dans les (a) Oeufs indivis centrifuges aux stade des pronuclei. l’amas lipidique; rares grains dam la couche hyaline. petits et moyens. Puis arcade de grains vitellins. Rien (b) Partie centrifugee dun blastomere d’un stade II. dam le vitellus, puis couronne peu chargke. Rien dans

25.000 g et 10°C. Memcs oeufs des Figs. 27 et 28. Absence de reaction dam Ensuite, zone a grains dans l’amas vitellin distal. Semis de granules positifs le pole centrifuge.

importante. Dans la principale experience, le lot mis B centrifuger B l’apparition des stades II contenait encore un certain nombre de stades indivis. La comparaison a done pu s’ktablir, toutes conditions strictement egales, pour ATP, Inos.TP, Cyt.TP, et m&me AMP; celui-ci est toutefois negligeable vu la faiblesse de la reaction (Fig. 32). Or, comme le montrent les Figs. 31, 32 et 34, apres emploi des deux

PHOSPHOHYDROL.GES

FIGS.

32 a 34.

Oeufs

centrifuges

FE. 32. Oeuf fkonde limitke a de rares granules FIG. 33. (a) Stade I gmnde partie des grains + divisk a plus fortement rkagi FIG 34. (a) Comparaison un stade II, avec incubation stade indivis. Au stadc II, Autre stade II du m&me lot,

OVULAIRES

477

de Psammechinus.

(pronucl6i) incubi: dans AMP-Mg-Ph. R&action proches de la region la plus centrifuge. (prom&i). (I,) Stade II. Cyt.TP-Mg-Ph. La plus forme un anneau Bpais au pole centrifuge. L’oeuf rpre l’oeuf indivis. des effets de la centrifugation sur un stade I et dans Inos.TP-Mg-Pb. Reaction plus massive au inkgaliti: de reaction entre les deux blastomeres. (b) reaction un peu moins i&gale des deux blastomeres.

premiers substrats, la reaction, vraiment forte au stade I, s’att&me notablement au debut du stade II. Avec le Cyt.TP, il semble bien que l’inverse se produise (Fig. 33).

Les oeufs d’Ascidie sont, pour ce genre de recherches, un materiel plutot ingrat. Outre les aleas de la fecondation artificielle, on doit compter avec l’involucre des cellules choriales et la capsule des cellules testales. Les premieres se dktachent dans les rkactifs mais les secondes masquent en partie la surface de l’oeuf. Heureusement, elles ne re-

478

DALCQ

ET

PASTEELS

agissent pratiquement pas, de sorte que la lecture des effets enzymatiques reste possible. Nous nous bornerons a noter ici quelques constatations. SOUS reserve de ce que peut presenter l’oeuf vierge, l’activiti: dephosphorylante se manifeste d’abord, apres la fkcondation, au niveau des plaquettes vitellines de la pkripherie (Fig. 35b). Celles-ci se creusent de petites cavites dont chacune presente un grain de PbS. C’est avec I’ATP que les reactions sont les plus knergiques. Elles mettent en evidence des granules de taille un peu variee, dont la disposition ne peut se voir que si l’on arrete B temps l’incubation ou si l’on explore, par exemple, le bord des sillons. La pellicule corticale reste negative. De fines granulations remplissent toute la zone periphkrique; des particules plus grosses enserrent les appareils mitotiques. Un stade IV apparaitra ainsi comme la juxtaposition de quatre masses sombres accumulant de nombreuses granulations. Cet effet parait bien spkcifique de I’ATP. Les autres triphosphates n’ont pratiquement pas reagi. Des aspects remarquables ont et6 releves avec l’AMP. Aux stades jeunes, ce substrat tatoue electivement les zones des centrospheres (Fig. 35a). Dans les morulas, la reaction est fortement accent&e au niveau de granulations perinucleaires ainsi que, SOLIS les reserves d’usage, dans les noyaux eux-memes (Fig. 36). DISCUSSION Chez les quatre especes, de groupes zoologiques differents, dont Ies oeufs fix&s au form01 ont ktk examines ici quant a la localisation des enzymes dephosphorylant certains mononucleotides, des resultats coherents ont Btk obtenus. Chez toutes, l’incubation dans I’ATP a, dans des conditions identiclues, ou peu s’en faut, des effets assez semblables. Tandis que les oeufs vierges reagissent peu, les oeufs fitcondes le font avec une activite croissante, qui se maintient pendant la segmentation avec des episodes divers, pour s’attenuer quand s’installe la morphogenese. Apres la fecondation, la source majeure-peut-etre exclusive-d’enrichissement reside dans le vitellus. Des plaquettes klaborent en leur substance ou g leur surface des granules actifs qui seront lib&es dans le cytoplasme. Cette maturation enzymatique se produit en ordre disperse, de la surface B la profondeur, et se poursuit pendant la segmentation, vraisemblablement avec des variations periodiques; elle n’est pas necessairement supprimke si le tours du developpement vient B s’arreter.

PHOSPHOHYDROLASES

FIGS.

35

et 36.

Oeufs

OVULAIRES

479

d’Ascidie.

FIG. 35. (a) Stade IV incube dans AMP-Mg-Pb. Entre les globules lipidiques des cellules testales, on apercoit les quatre amas de granules (fleches) entourant les centrospheres. (b) Partie de l’oeuf indivis incube dans ATP-Mg-Pb, ou des plaquettes montrent la gem&e des enzymes; ces plaquettes plurigranulaires se distinguent aiskment des gouttelettes comprises dans les cellules testales. FIG. 36. Morula awn&e dam AMP-Mg-Pb. La reaction, nulle dans les stades plus jeunes, est devenue positive, noyaux compris.

Les corpuscules issus des plaquettes peuvent rester isol& ou se regrouper, voire s’associer en corpuscules plus gros. Les figures mitotiques sont &guli&rement entourhes d’un complexe de granules de

480

DALCQ

ET

PASTEELS

divers calibres, dont certains d’un type plus individualis& La fixation des oeufs centrifugks montre ces corpuscules suspendus en partie dans la portion hyaline, souvent plus condensks vers son niveau centrifuge, en partie associks aux couches centripktes de l’amas vitellin; la zone centrifuge de celui-ci est le plus gknkralement nkgative. Ces divers effets ne sont pas l’apanage du seul ATP. En incubant dans d’autres substrats on obtient des effets analogues, mais avec des diffkrences apprkiables. Chez Bafnea, nous avons seulement pu voir que l’Inos.TP n’est pas hydrolysk mais que l’AMP, qui ne donne qu’une &action faible durant la segmentation, est plus fortement clivk g la gastrulation, surtout par les grandes cellules enveloppkes. Chez Sabellaria, les triphosphates autres que l’ATP, du moins ceux de l’inosine, de la cytidine et de l’uridine, sont sensiblement moins attaquks clue l’ATP, surtout pendant la maturation. Quand la segmentation s’installe, l’effet s’accentue; il n’est pas exclu qu’il soit diffkrent pour ces trois substrats. L’incubation dans l’ADP donne, & concentration et temps &gal, des images remarquables, plus analysables qu’avec l’ATP, sans doute parce que la proportion de phosphates lib&& a ktk comparativement moindre. L’AMP n’est, au contraire, hydrolysi? qu’au niveau d’un petit nombre de particules. Chez Psummechinus, l’kquipement enzymatique est particulikrement complexe. 11hydrolyse k la fois l’ATP, l’Inos.TP, le Cyt.TP, l’ADP mais a un taux de plus en plus rkduit. L’AMP n’est attaque que par quelques rares granulations appartenant B des plaquettes corticales. Des diff krences cytologiques peuvent &tre relevkes entre les oeufs incub& dans les divers triphosphates, ce qui semblerait suggitrer une pluralitk des enzymes en cause. Chez Ascidiella, nous avons au moins une diffkrence marq&e entre l’activitk exercke sur I’ATP et sur l’AMP, pour lequel nous retrouvons la progression observke chez la Pholade. Une telle kvolution est importante d noter, elle indique que l’enzyme dkphosphorylant l’AMP a un rBle r&e1 dans le dkveloppement. De ce point de vue, la palme revient d’ailleurs toujours B l’ATP, vis B vis duquel s’observent les activik les plus constantes et les plus marqukes. En terminant ce rappel des faits, soulignons que les aspects dkrits ne reprksentent probablement qu’une partie des activitks dkphosphorylantes dont l’oeuf est capable sur ces divers substrats. 11 est vraisemblable que la fixation au form01 inhibe certaines de ces enzymes, notamment au niveau des mitochondries qui ne sont visiblement pas

PHOSPHOHYDROLASES

OVULAIRES

481

les &lkments que notre technique r&Ye dans les oeufs apr&s centrifugation. 11 est difficile d’interprkter les effets de la surincubation. La rkaction totale obtenue alors pourrait rksulter soit d’une surcharge de chaque particule, amenant pratiquement leur fusion, soit de la prksence d’enzyme( s) mains active(s) diffuse(s) dans le cytoplasme “fondamental.” Par ailleurs, le probkme de la participation des noyaux reste ouvert. Naturellement, la pr&ence de PbS dans les noyaux peut toujours rksulter d’un processus de focalisation. Elle est alors quand m&me rkvklatrice d’une forte activitk enzymatique prksente dans le cytoplasme immkcliatement voisin. Toutefois, cette explication n’exclut pas que le noyau possirde nkanmoins des enzymes dt?phosphorylantes, mais la technique utiliske ne suffit pas B le prouver. 11 faut cependant reconnaitre que certains aspects, tels ceux des oocytes de Pholade entrant en maturation (6tude en prkparation) et surtout ceux des pronuclki d’Oursin (Figs. 24 et 25) sont assez suggestifs. 11 vient s’y ajouter le singulier comportement des “boules” positives de 1’Hermelle et de ses mitoses de segmentation. On a d’abord ici l’impression d’une sorte de ravitaillement affluant vers l’appareil mitotique puis, par la suite, d’une activiti: proprement nuclkaire. Le rBle du noyau dans la gen&se des enzymes dkphosphorylantes doit done rester une de nos prkoccupations. Avant d’envisager d’autres questions, arr&ons-nous, au sujet de la Pholade, B certaines difkences entre notre premiBre Qtude et les rksultats actuels. En 1961, nous avons obtenu des r&actions nuclkaires g&kalement positives, qui manquent a p&sent, tandis que les localisations cytoplasmiques ktaient plus simples et kvoquaient nettement l’allure des m&a-granules p. Cette diffkrence a une raison technique. B&kficiant de l’expkrience acquise par l’un de nous sur l’oeuf des Mammif&res, nous avons utilisk cette an&e des milieux moins riches : la concentration en (NO:,) ,Pb a ktk trois fois moindre, celle en SO,Mg vingt fois moindre, en substrat dix ou cinq fois moindre selon les cas. Par ailleurs, l’incubation prolong&e a favorisi: l’expression compkte des activit6 enzymatiques. Nous nous sommes toutefois assurks de ce qu’une incubation trois ou quatre fois plus courte donne les m&mes rksultats, a condition de renforcer proportionnellement la concentration de substrat. On pourrait se demander si les rksultats ne diffkreraient pas en opkrant a un pH plus alcalin, 8.6 par exemple. L’essai en a kt6 fait sur les oeufs de Pholade et d’Hermelle, en utilisant la mkthode de

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DALCQ

ET

PASTEELS

v. Kossa modifiee (Dalcq, 1962a). Le rendement est infiniment moins bon mais certaines particular&% meriteront d’etre d&rites ulterieurement. Une de nos preoccupations, en elargissant ainsi l’enquete, etait de voir mieux reagir les sillons, si actifs chez les Mammiferes. I1 n’en a rien et& Seul l’oeuf de Pholade a continue a montrer un effet discret, tel qu’observe en 1961, au niveau des sillons (Figs. 3 et 4). La meilleure qualite des images a permis de mieux les comprendre, surtout a la lumibre d’informations de microscopic electronique acquises depuis lors (Pasteels et de Harven, 1962b). En effet, cette accumulation de granules positifs dans les encoches de clivage ne resulte pas d’une production locale d’enzyme, mais bien dun effet mecanique du a l’adherence des villositds au chorion et a leur etirement dans le plan du sillon. A part cela, les se& cas d’enrichissement enymatique relatif du sillon sont ceux de 1’Hermelle (Figs. 12 et 14) et de l’oursin (Fig. 29d). 11 y aura lieu de le r&examiner. Avec les triphosphates et l’ADP, les oeufs d’Invertebr& ne montrent done pas l’energique reaction dans les sillons que ceux des Mammiferes presentent. Sans entrer ici dans la discussion complexe de la cytodi&se, il est bon d’etre attentif au phenomene que montre bien la microscopic electronique (Pasteels et de Harven, 1962a). Dans la formation du sillon, le cortex de la region inter-es&e n’effectue pas de contraction mais realise au contraire une expansion vers l’interieur (passive ou active?), expansion tellement considerable (5 a 6 fois la surface initiale) que des apports Venus du dedans doivent se produire. Les enzymes dephosphorylantes participent vraisemblablement a ce processus, mais selon des modalites qui nous kchappent encore. Cette recherche a commence Q mettre en lumibre une intervention des enzymes dephosphorylantes comme consequence de la fecondation. L’analyse de ces phenomenes visiblement importants n’a pu dtre qu’effleuree et illustree de quelques documents. Elle devrait devenir l’objet d’experiences aisles a concevoir. Leur inter& est d’autant plus grand que l’un de nous (Dalcq, 1962b) vient de constater la m&me activation locale de ces enzymes chez la Souris, a partir du point de penetration du spermatozolde. Trois des especes utilisees ici ont fait l’objet d’une etude attentive des m&ta-granules (Pasteels et Mulnard, 1957, chez Barnes et Psammechinus; Pasteels, 1959, chez Psammechinus, egalement, Dalcq, 1966, chez Ascidiellu). Chez Sabellaria, ces elements ne peuvent dtre observes in viva qu’apres centrifugation. On trouve alors des granules

PHOSPHOHYDROLASES

OVULAIRES

483

metachromatiques dans la zone hyaline, ainsi que d’autres grains repartis saris stratification nette dans la cape vitelline. Ces aspects sont semblables a ceux que donnent les metagranules P connus chez les autres especes. A la lumiere des faits ici decrits, il apparait, en raison des similitudes de topographie et d’kvolution, que les meta-granules sont compris dans le systeme de granulations a enzymes dephosphorylantes, mais qu’ils n’en constituent qu’une categoric restreinte. 11 s’agit probablement des corpuscules qui s’associent a des mucopolysaccharides acides et acquierent ainsi l’aptitude a capter certains colorants et a produire, si la nature de ceux-ci s’y p&e, le phenomkne de m&achromasie. De tels corpuscules sont vraisemblablement les plus riches en enzyme(s) notamment en ATPase. Ainsi s’explique saris doute que dans nos recherches de 1961 les granules ,8 aient paru etre mis electivement en evidence. Ne perdons pas de vue, en outre, que ces memes granules contiennent aussi de la phosphatase acide, ce qui accentue leur individualite. On pourrait, a la rigueur, se demander si les resultats decrits ne reposeraient pas sur un artefact dO notamment a ce que des enzymes contenues dans les mitochondries auraient diffuse au tours de la fixation ou du lavage pour aller se deposer sur les sites de reaction qui nous sont apparus. Connaissant exactement l’emplacement des mitochondries dans les oeufs centrifuges de Barnea et de Psammechinus par les recherches anterieures de l’un de nous (Pasteels, 1959) nous avons attentivement examine cette hypothese et crayons pouvoir l’exclure. Dans une pareille kventualite, les relations topographiques ne seraient pas celles observees et il devrait y avoir des gradients d’intensite a partir de la couche mitochondriale, ce qui n’est pas le cas. La notion nouvelle qu’apportent les faits ici dkcrits est que les plaquettes vitellines engendrent des corpuscules capables de dkphosphoryler divers mononucleotides. Or, il y a au moins un cas, encore inedit, ou la microscopic electronique fait voir la genese de corps d&finis 21 partir de certaines plaquettes. II concerne preciskment les oeufs de Bauzea ou l’un de nous (J. Pasteels) a vu des plaquettes donner naissance a de nombreuses vksicules entourees par une double membrane; la plaquette se transforme ainsi en un corps mu&u&cdaire, lui-m&me susceptible de se dksagrkger. Peut-on rapprocher ce processus de la production des granules enzymatiquement actifs? Les meta-granules or et ,G seraient-ils des produits de plaquettes? Ceux du second type seraient-ils des corps multivesiculaires? Leur richesse en

484

DALCQ

ET

PASTEELS

phosphatase acide impliquerait-elle une parent6 avec les lysosomes de Duve (cf. 1958), kventualitk d’autant plus plausible que l’itvolution zymogCn6tique des plaquettes implique des phknom&nes de lyse locale? A ces questions en suspens s’ajoute encore le problkme que pose, au moins chez la Pholade et l’oursin, ce fait bien ktabli que les granules /3 ne sont pas directement colorables, mais seulement aprks que les granules or l’ont d’abord &. Une nouvelle s&ie de questions surgissent d’ktre part quant B l’origine prkalable des granules actifs qui se dkgagent graduellement des plaquettes. Seraient-ils des &ments inframicroscopiques p&form&s du jeune oocyte qui auraient 6tB englob& lors de la vitellogknkse. 2 Ou bien, seraient-ils constituks en m&me temps que le vitellus, comme les produits de certains gbnes, ce qui reviendrait B y voir des instruments de l’information gitnktique? Est-ce au contraire seulement dans l’oeuf mcr, et surtout dans l’oeuf f6cond6, que des produits gkniques viendraient se fixer, tels des messagers, sur ou dans certains plaquettes? On ne peut qu’knoncer ces interrogations. 11 est en tous cas assurk que la fixation au form01 permet l’analyse de constituants enzymatiques formant un systkme passablement complexe et qui s’inscrit en marge de l’enzymologie classique. I1 ne nous est encore connu que par son activitk B l’kgard de substrats varib. En ce qui concerne les mononuclkotides, les enzymes en cause pourraient &tre qualifihes, d’aprks la nomenclature internationale qui vient d’ktre prkoniske (Report of the Commission on Enzymes, 1961), de mononuclkotides-phosphohydrolases. L’AMPase y semble bien individualike. Au contraire, I’ATP et l’ADP ont, dans leurs effets, des ressemblances qui suggkrent une enzyme unique, scindant indiffkremment ces deux types de mokkules entre le premier et le deuxi&me groupe phosphate comme cela a pu &tre reconnu pour l’enzyme polyvalente des sillons (Dalcq, 1961). Dans la plupart des cas examin& ici, les autres mononuclkotides sont soit inactifs soit gknkrateurs d’effets diffkrents. I1 semble bien que les composb de l’adknine aient a ce point de we, comme dans tant d’autres circonstances, une valeur physiologique insigne. Ainsi, les recherches ici exposkes viennent une fois de plus r&&ler que le vitellus n’est pas seulement une r&serve trophique mais un 6Mment essentiel et t&s prkcocement actif du dynamisme germinal. Elles montrent aussi que diverses phosphohydrolases entrent en jeu d&s le d&but du dkveloppement avec des particularit& inhkrentes g

PHOSPHOHYDROLASES

OVULAIRES

485

enzymatique de leurs oeufs est chacune des espkces. L’kquipement done bien un des facteurs principaux de leur individualitit. Cette notion g&&ale pouvait saris doute &tre formul&e B priori, mais il n’est pas indiffkrent qu’elle se d&gage de plus en plus d’une analyse cytochimique effective. RESUME

La localisation des enzymes dkphosphorylant divers mononuclitotides a ktk Btudike dans les oeufs, fix& au formol, d’un Bivalve, d’une Annklide, d’un Oursin et d’une Ascidie. Les conditions techniques (duke de fixation, de lavage, d’incubation, de concentration des substrats) qui donnent un rksultat optimum sont sensiblement les m&mes chez les quatre esp&ces ktudikes. Les corpuscules chargks d’enzyme ont principalement leur origine dans les plaquettes vitellines. Leur klaboration se produit dkja, mais tr&s mod&kment, dans l’oeuf vierge, elle s’accentue brusquement lors de la fkcondation, se maintient ou plus souvent progresse pendant la segmentation et s’attknue quand s’installe la morphog&%e. Les granulations actives-qui ne sont pas les mitochondries-vont de la limite de la visibilitk jusqu’8 environ 2 p. Elles encapsulent wkitablement les bdifices mitotiques et sont abondantes pr&s des noyaux en intercinkse. La r&action des sillons, quand elle existe, est t&s disc&e. La teneur des blastom&res est souvent in&gale. Le lobe polaire de Sabelluria est particulikrement riche en enzyme(s). La centrifugation localise une partie des granules en cause dans la partie hyaline, une autre dans la rkgion adjacente de la cape lipidique. Les enzymes ainsi d&elks paraissent former un syst&me appartenant aux mononuckotides-phosphohydrolases. Elles semblent comprendre une AMPase, une enzyme hydrolysant a la fois 1’ATP et l’ADP, une ou plusieurs autres s’attaquant aux autres triphosphates utilisks. La relation de ces Gments avec les granules a et ,8, mktachromatiques in vivo, est disc&e. L’importance de l’kquipement enzymatique des oeufs et de sa spkcialisation dans les divers groupes est soulignke. SUMMARY

The sites of the enzymes dephosphorylatinq various mononucleotides have been investigated in the formalin-fixed eggs of a bivalve, an annelid, a sea urchin, and an ascidian. The technical conditions

486

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ET

PASTEELS

(times of fixation, washing and incubation, substrate concentration) which give an optimal result are approximately the same for the four species studied. Enzyme-bearing inclusions originate mainly in the yolk platelets. Their production already takes place, though moderately, in the unfertilized egg; it is maintained, or often enhanced, during cleavage and decreases at the beginning of morphogenesis. The active granulations-which are not mitochondria-range from the limit of visibility up to 2 p. They surround the mitotic figures and are abundant near the interphase nuclei. The reaction of the furrows, when present, is very discrete. The activity of the blastomeres is often unequal. The polar lobe of SabeZZuria is particularly rich in enzyme(s). Centrifugation sediments the active granules partly in the hyaline zone, partly in the layer immediately adjacent to the lipid cap. The enzymes detected seemingly form a system of the mononucleotide-phosphohydrolase type. They apparently comprise: an AMPase, an enzyme which hydrolyzes both ATP and ADP, and one or more others acting on the other triphosphates that were used. The relationship of these elements with the in oivo metachromatic a and P granules, is discussed. The importance of the enzymatic equipment of the eggs as well as its specialization in the different groups is emphasized. BIBLIOCRAPHIE

DALCQ, A. M.

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