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Le courant calcique ICa,L et sa régulation normale
PHYSIOPATHOLOGIE CARDIOVASCULAIRE
Le courant calcique ICa,L et sa régulation normale J. Leroy1,2, J.-P. Benitah1,2 Signalisation et physiopathologie cardiaque, Inserm UMR-S 769, LabEx Lermit, DHU Torino, Châtenay-Malabry Faculté de pharmacie, IFR141, Université Paris-Sud, Châtenay-Malabry [email protected] 1 2
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epuis les travaux de S. Ringer à la fin du 19e siècle, il est reconnu que le Ca2+ est le point nodal des voies multiples qui régissent les fonctions et les dysfonctions des cellules cardiaques. Cela nécessite une fine régulation des mouvements de Ca2+ dont la majeure partie se concentre dans le milieu extracellulaire (~2 mM versus ~100 nM dans le cytoplasme), gradient de concentration générant une forte force d’entraînement pour le Ca2+ qui tend à se déplacer dans la cellule. Si au repos les cellules cardiaques sont relativement imperméables au Ca2+, l’ouverture des canaux Ca2+ de type L (pour « long lasting » en anglais, en allusion à leur cinétique lente d’ouverture et de fermeture, LTCC, encore nommés récepteurs aux dihydropyridines du fait de leur sensibilité à ces drogues) lors de la dépolarisation permet cet influx de Ca2+ (ICa,L) responsable de la phase ascendante du potentiel d’action dans les nœuds sinusal et atrio-ventriculaire et jouant un rôle important dans la détermination du plateau du potentiel d’action dans les autres types de cellules cardiaques. Ces canaux sont en outre responsables du lien entre l’excitation et la contraction, induisant la libération de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (RS), et participent à la régulation de la charge en Ca2+ intracellulaire. De cette façon, ils déterminent l’activité d’un certain nombre d’enzymes cytoplasmiques et mitochondriales sensibles au Ca2+ et participent à la régulation de l’expression des gènes via le couplage excitation-transcription.
Structure-fonction Les LTCCs se composent d’une sous-unité principale D1, centrée autour de sous-unités auxiAMC pratique
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liaires E, J et D2G dont les principales fonctions sont de moduler l’expression membranaire de la sous-unité D1, son comportement biophysique ainsi que ses propriétés pharmacologiques (figure 1). La sous-unité D1 constitue le pore du canal par l’accolement de 4 domaines transmembranaires hydrophobes. Chacun de ces domaines contient 6 segments transmembranaires (dénommés S1 à S6) et ce sont les 4 boucles situées entre S5 et S6 qui forment le pore. Les segments S4, riches en résidus basiques arginines et lysines, constituent le senseur de potentiel. S’il existe 4 types de sousunité D1, CaV1.1-1.4, CaV1.2 (codée par le gène CACNA1C) est la principale sous-unité exprimée dans les myocytes ventriculaires, alors que CaV1.3 est principalement exprimée dans les cœurs fœtaux, dans les nœuds sino-auriculaire et atrio-ventriculaire et les tissus atriaux chez l’adulte. Aucune fonction pour CaV1.4 et 1.1 n’a été encore signalée dans le cœur, même si CaV1.1 a été détecté dans des cultures de cardiomyocytes néonataux. En plus d’un important épissage alternatif jouant un rôle unique dans la physiologie, la pharmacologie et les maladies cardiovasculaires, 2 formes (240 et 210 kDa) issues de la protéolyse de la région C-terminale de CaV1.2 sont présentes dans le muscle cardiaque, ce 'Ct contrôlant l’expression de CaV1.2. Il est généralement admis que deux sous-unités auxiliaires s’associent avec CaV1.2 dans un rapport 1:1:1 : une sous-unité E intracellulaire (principalement CaVE2a, codée par le gène CACNB2A), protéine appartenant à la famille des MAGUK (membrane associated guanylate kinase) se liant à la boucle intracellulaire reliant les domaines I et II de CaV1.2 et une sous-unité dimérique D2-G (principalement D2G-1, codée par le gène CACNA2D1), clivée de façon post-traductionnelle pour donner une partie G ancrant à la membrane par une liaison © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés
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Figure 1. Représentation schématique de la structure du canal calcique cardiaque CaV1.2 et de ses sous-unités auxiliaires (CaVβ2a et α2-δ). Les sites de phosphorylation par la protéine kinase dépendante du GMPc (PKG), par la protéine kinase C (PKC), par la protéine kinase activée par le complexe CaM/Ca2+ (CaMKII) et par la kinase dépendante de l’AMPc (PKA) sont indiqués. La régulation par PKA est facilitée par sa fixation à une AKAP (A-kinase anchoring protein) liée à la partie C-terminale de CaV1.2 qui est clivée par protéolyse ('CT) et réassociée au canal. Cette régulation par PKA dépend également de la présence de la protéine géante du cytosquelette AHNAK qui interagit avec la sous-unité CaVE2a. Le Ca2+ intracellulaire en se fixant au motif « EF » et par l’intermédiaire de la calmoduline (CaM) fixée au motif « IQ » de la partie C-terminale de CaV1.2, augmente son inactivation.
disulfure la partie D2 extracellulaire. La présence et le rôle de sous-unités J entièrement membranaires ne sont pas encore clairement établis.
Propriétés biophysiques Les LTCCs s’ouvrent (s’activent) pour des dépolarisations >-40 mV (canaux à haut seuil d’activation) avec un décours sigmoïde (traduisant un processus en plusieurs étapes) augmentant avec la dépolarisation pour atteindre un maximum aux environs de 0 mV (figure 2). Au niveau du canal unitaire, 3 modes d’activité sont observés : le mode 0 est caractérisé par de rares ou l’absence totale d’ouverture ; dans le mode 1, le canal présente de courtes ouvertures (< 1 ms) et fermetures (de 0,2 à 2 ms) répétitives, formant des salves d’activité consécutives pouvant être regroupées en cluster ; le mode 2 qui se produit en présence d’activateurs ou après stimulation des récepteurs E-adrénergiques (E-AR) est caractérisé par des temps d’ouverture plus longs. Si les LTCCs sont 500 à 1 000 fois plus 30
perméables aux cations divalents (Ca2+ ou le Ba2+) qu’aux cations monovalents, les métaux de transition (Ni2+, Co2+, Cd2+, Mg2+, Mn2+ et Zn2+) les bloquent. Leur conductance unitaire est de 3-5pS lorsque le Ca2+ est le porteur de charge. Cette sélectivité est assurée par deux sites de liaison dans le pore du canal auquel participent 4 résidus glutamate (motif EEEE) ainsi qu’un ensemble de résidus chargés situés dans la moitié supérieure du canal pointant vers le pore (motif DCS pour divalent cation selectivity). De même que les canaux Na+ mais de façon plus lente, les canaux Ca2+ se ferment avec le temps. Cette inactivation des LTCCs est dépendante à la fois du potentiel (VDI) et du Ca2+ (CDI) expliquant l’évolution complexe de la décroissance du courant et la présence d’un creux dans la courbe d’inactivation en fonction du potentiel (figure 2B) : l’inactivation est de moitié aux environs de -20 à -30 mV, est maximale à ~0 mV et diminue de nouveau à des potentiels plus positifs. La CDI limite la dépolarisation membranaire induite par ICa,L et contribue au maintien de l’homéostasie Ca2+ en évitant toute surcharge calcique aux AMC pratique
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effets délétères pour le cardiomyocyte. La contribution relative de la CDI à l’inactivation totale est encore discutée, mais il est communément admis que la phase d’inactivation rapide représente la composante CDI. Si la boucle I-II intracellulaire de CaV1.2 et CaVE sont essentielles pour la VDI, ils régulent aussi la CDI qui pourrait ainsi être un frein préexistant pour la VDI. Toutefois, les mécanismes précis qui sous-tendent la CDI ne sont pas totalement élucidés. Il est généralement admis qu’en présence de Ca2+ (entrant par le canal et libéré par le RS), la calmoduline (CaM) liée à la queue C-terminale de CaV1.2 sur un motif isoleucine-glutamine (motif IQ), constitue le détecteur de Ca2+ et que son change-
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ment de conformation induit par la fixation du Ca2+ promeut la fermeture du canal. Plusieurs autres structures semblent aussi être impliquées dans la CDI telles qu’un motif « EF-hand » (domaine protéique structuré en hélice-boucle-hélice capable de fixer l’ion Ca2+ avec une forte affinité) dans l’extrémité C-terminale de CaV1.2 et son extrémité N-terminale alors que la région du pore serait impliquée dans l’inactivation lente. Les courbes d’activation (d)et d’inactivation (f en fonction du potentiel montrent un remarquable chevauchement de -40 à 0 mV (figure 2B). Dans cette fenêtre de la gamme du plateau du potentiel d’action où les LTCCs peuvent naviguer entre les états fermé,
Figure 2. Propriétés biophysiques du courant calcique de type L et sa régulation par une stimulation β-adrénergique. A. Pour un potentiel de membrane inférieur à -40 mV, le canal est dans un état fermé. Lors d’une dépolarisation, provoquée par un saut de potentiel comme ici en patch-clamp à 0 mV, les canaux passent de l’état fermé à l’état ouvert conducteur, suivi par l’état « inactivé » lorsque la dépolarisation se prolonge. L’application d’un agoniste E-adrénergique non sélectif, l’isoprénaline augmente l’amplitude du courant ICa,L. B. Courbes d’activation (df) et d’inactivation (ff) d’ICa,L en fonction du potentiel. On observe un chevauchement de ces courbes entre -40 à 0 mV correspondant au courant de fenêtre (grisé). Dans cette gamme de potentiel, les canaux peuvent naviguer entre les états fermé, ouvert et inactivé. Lors d’une stimulation E-adrénergique, ces courbes et plus particulièrement la courbe d’activation, sont déplacées vers des potentiels hyperpolarisés. Le courant de fenêtre est ainsi augmenté, traduisant une entrée plus importante de Ca2+ dans le cardiomyocyte lors du potentiel d’action.
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ouvert et inactivé, des réouvertures sont possibles, générant un courant de fenêtre qui représente ~10 % de l’influx Ca2+ en état stable participant à la recharge du RS et à la survenue de post-dépolarisations précoces [1]. Cette dépendance vis-à-vis à la fois du potentiel et du Ca2+ participe aussi à une augmentation de l’amplitude du courant et un ralentissement de l’inactivation des LTCCs quand la fréquence de stimulation augmente (le RS se vidant de son contenu en Ca2+), suite à une première dépolarisation à hauts potentiels ou lors de la récupération de l’inactivation (réactivation) [2]. Ce phénomène appelé « facilitation » participe ainsi à l’effet inotrope positif induit par l’augmentation de la fréquence cardiaque observé chez certaines espèces dont l’Homme. A l’échelle du canal unitaire, cette facilitation se caractérise par une augmentation de sa probabilité d’ouverture avec une plus grande proportion de longues ouvertures (mode 2) et une augmentation du nombre de canaux fonctionnels. Ce phénomène est encore loin d’être totalement compris, mais comme la CDI, il dépend de la présence de CaM fixée à la partie C-terminale de CaV1.2 et fait intervenir la protéine kinase activée par le complexe CaM/Ca2+, la calmoduline kinase II (CaMKII), qui phosphoryle la sous-unité CaVE et/ou la partie C-terminale de CaV1.2 (figure 1).
Régulations Parmi les nombreuses voies de régulation de ICa,L, la mieux décrite est sa stimulation E-adrénergique qui contribue aux effets inotropes positifs des catécholamines. A ce jour, 3 récepteurs E-adrénergiques (E-AR) ont été clonés (E1-AR, E2-AR et E3-AR) mais les effets des catécholamines sur le cœur humain sont généralement attribués aux deux premiers, les E1-AR y étant majoritairement exprimés. Cette voie de signalisation classique implique l’activation de l’adénylate cyclase via une protéine G stimulatrice, GDs, entraînant une augmentation des taux d’AMPc intracellulaire, bien que les E2-AR puissent également se coupler à une protéine G inhibitrice (GDi). La principale cible de l’AMPc est la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA) qui phosphoryle les CaV1.2 entre autres protéines 32
clés du couplage excitation-contraction, pour augmenter l’entrée de Ca2+ dans le cardiomyocyte lors du potentiel d’action. Leur phosphorylation par la PKA favorise leur activité en mode 2. En conséquence, l’amplitude d’ICa,,L est augmentée de 2 à 3 fois et sa dépendance vis-à-vis du potentiel est légèrement décalée vers les potentiels négatifs (figure 2B). La stimulation E-adrénergique accroit ainsi le courant de fenêtre en raison de l’effet de la phosphorylation par la PKA sur l’activation du canal. Parce qu’une stimulation E-AR augmente l’entrée du Ca2+ par ce canal, elle accélère également son inactivation. Si les principaux effets de la stimulation E-AR sur la dépendance d’ICa,L vis-à-vis du potentiel et son amplitude sont bien documentés, le ou les sites de phosphorylation de CaV1.2 par la PKA qui entraînent l’augmentation de son activité demeurent controversés. La phosphorylation de sérines présentes sur CaVE2a avait été suggérée mais a été depuis exclue. Néanmoins, CaVE2a peut s’associer à la protéine géante du cytosquelette de 700 kDa nommée AHNAK, qui est apparue comme un acteur important de la régulation E-adrénergique de ICa,L [3] (figure 1). Grâce à son interaction avec CaVE2a, AHNAK servirait de frein à ICa,L, frein qui serait levé par la phosphorylation par PKA de CaVE2 et AHNAK. La ser1928 présente dans la partie C-terminale de CaV1.2 est phosphorylée par PKA lors d’une stimulation E-AR et a longtemps été considérée comme le résidu indispensable aux effets observés sur ICa,L. Néanmoins, comme pour CaVE2a, son importance dans la régulation E-AR a été depuis réfutée. Le rôle critique de la partie C-terminale de CaV1.2 a cependant été confirmé par l’identification du résidu ser1700 comme étant le site qui, lorsqu’il est phosphorylé par la PKA, conduirait à l’augmentation d’ICa,L, mais ceci reste à être confirmé dans les cardiomyocytes [4]. Il existe une réelle difficulté à reconstituer cette régulation par PKA dans les systèmes de surexpression hétérologues et plusieurs tentatives ont ainsi échoué conduisant à l’hypothèse qu’au moins un partenaire manquerait dans ces cellules pour permettre la modulation des CaV1.2. Mis à part AHNAK, un autre partenaire indispensable pourrait être une protéine d’ancrage de la PKA (AKAP), l’AKAP15/18 et/ou l’AKAP79/150 qui, en se AMC pratique
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fixant à un domaine riche en leucines de la partie C-terminale de CaV1.2, permet d’associer la kinase afin d’assurer une phosphorylation spécifique et rapide du canal. Les AKAPs ont en commun leur capacité à se lier à PKA, mais cette famille de protéines appartient également à un système de protéines d’échafaudage pour d’autres acteurs des voies de signalisation, comme les adénylates cyclases (AC), les phosphodiestérases (PDE), les phosphatases 1 et 2, dont PP2A qui s’associe au CaV1.2. La présence de PDE et de phosphatases dans ces macrocomplexes de protéines permet le contrôle spatiotemporel de la signalisation AMPc/PKA [5]. Les PDEs cardiaques qui dégradent l’AMPc appartiennent à 5 familles (PDE1-4 et PDE8) et se distinguent par des propriétés enzymatiques et pharmacologiques distinctes. Leur rôle est non seulement d’assurer la terminaison des signaux AMPc, mais aussi de restreindre la propagation dans la cellule de ce second messager hautement diffusible. En le maintenant compartimenté, les PDEs assurent ainsi la spécificité de réponse du cardiomyocyte à divers stimuli hormonaux qui utilisent l’AMPc comme messager intracellulaire de leurs effets. Parmi celles-ci, les PDE3 sont majoritairement exprimées chez l’Homme et constituent l’activité majeure contrôlant ICa,L. Néanmoins, les PDE4 et les PDE2, bien que moins exprimées, contrôlent également sa régulation E-adrénergique, y compris dans les cardiomyocytes humains [6]. La PKA n’est pas la seule kinase régulant l’activité de CaV1.2 qui présente également des sites potentiels de phosphorylation par la PKC, notamment dans sa partie N-terminale. L’activation de divers récepteurs couplés à une protéine Gq, comme les récepteurs D1-adrénergiques, muscariniques, à l’endothéline, à l’angiotensine II conduit à l’activation de la phospholipase C qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en inositol triphosphate et en diacylglycérol (DAG). Ce dernier conjointement avec la phosphatidylsérine et parfois avec le Ca2+ active la PKC pour réguler l’amplitude de ICa,L. Néanmoins, les conséquences de l’activation de la PKC sur ICa,L restent à éclaircir puisque des effets stimulateurs, inhibiteurs et même biphasiques de la PKC sur ce courant ont été rapportés [7]. De AMC pratique
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même, sa régulation par une autre kinase activée par le GMPc, la PKG, reste ambigüe. Selon les espèces, le type cellulaire étudié (myocyte ventriculaire, atrial, adulte ou néonatal) et les conditions expérimentales employées, ICa,L a tour à tour été décrit comme étant augmenté ou inhibé par PKG. L’inconsistance des effets de cette voie GMPc/ PKG sur l’activité du canal s’explique probablement par les effets multiples du GMPc dans le cardiomyocyte. En effet il peut activer ou inhiber diverses phosphodiestérases (respectivement PDE2 et PDE3) qui contrôlent la régulation E-adrénergique d’ICa,L [8].
Pharmacologie Différentes molécules ayant pour cible les LTCCs ont été développées pour traiter l’hypertension artérielle, l’angine de poitrine et les arythmies. Trois classes d’agents pharmacologiques sont ainsi utilisées pour moduler l’entrée de Ca2+ via ces canaux : il s’agit des dihydropyridines (DHP), des phénylalkylamines (PAA) et benzothiazepines (BZT) qui se fixent à différents sites de CaV1.2 pour en modifier l’activité [9]. La plupart des dérivés des DHPs comme la nifédipine, la nitrendipine, la nicardipine, sont des bloqueurs de ces canaux mais certaines molécules comme le (-) Bay K 8644 augmentent leur activité et sont donc considérés comme des « activateurs » des LTCCs. Quant aux PAAs (vérapamil) et BZTs (dilitiazem), elles inhibent l’entrée de Ca2+ par les LTCCs et sont donc exclusivement des bloqueurs d’ICa,L. La fixation de ces trois classes de bloqueurs calciques dépend du potentiel de membrane, les PAAs et BZTs s’associant au canal dans son état ouvert tandis que les DHPs s’associent préférentiellement au canal lorsqu’il est inactivé. Ceci explique la sélectivité vasculaire des DHPs et leur emploi comme antihypertenseur, le potentiel de repos des cellules musculaires lisses étant dépolarisé, les LTCCs y sont le plus souvent inactivés. Conflits d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêt en relation avec cet article. Références [1] Benitah JP, Alvarez JL, Gomez AM. L-type Ca2+ current in ventricular cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol 2010;48:26-36.
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[2] Richard S, Perrier E, Fauconnier J, et al. Ca2+-induced Ca2+ entry or how the L-type Ca2+ channel remodels its own signalling pathway in cardiac cells. Prog Biophys Mol Biol 2006;90:118-35. [3] Haase H. Ahnak, a new player in beta-adrenergic regulation of the cardiac L-type Ca2+ channel. Cardiovasc Res 2008;73:19-25. [4] Bannister RA, Ohrtman JD. Reassessing the molecular mechanism of beta-adrenergic stimulation of cardiac L-type Ca2+ current. Channels (Austin) 2009;3:146-8. [5] Scott JD, Santana LF. A-kinase anchoring proteins: getting to the heart of the matter. Circulation 2010;121:1264-71.
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Le courant calcique ICa,L et sa régulation normale J. Leroy1,2, J.-P. Benitah1,2 Signalisation et physiopathologie cardiaque, Inserm UMR-S 769, LabEx Lermit, DHU Torino, Châtenay-Malabry Faculté de pharmacie, IFR141, Université Paris-Sud, Châtenay-Malabry [email protected] 1 2
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epuis les travaux de S. Ringer à la fin du 19e siècle, il est reconnu que le Ca2+ est le point nodal des voies multiples qui régissent les fonctions et les dysfonctions des cellules cardiaques. Cela nécessite une fine régulation des mouvements de Ca2+ dont la majeure partie se concentre dans le milieu extracellulaire (~2 mM versus ~100 nM dans le cytoplasme), gradient de concentration générant une forte force d’entraînement pour le Ca2+ qui tend à se déplacer dans la cellule. Si au repos les cellules cardiaques sont relativement imperméables au Ca2+, l’ouverture des canaux Ca2+ de type L (pour « long lasting » en anglais, en allusion à leur cinétique lente d’ouverture et de fermeture, LTCC, encore nommés récepteurs aux dihydropyridines du fait de leur sensibilité à ces drogues) lors de la dépolarisation permet cet influx de Ca2+ (ICa,L) responsable de la phase ascendante du potentiel d’action dans les nœuds sinusal et atrio-ventriculaire et jouant un rôle important dans la détermination du plateau du potentiel d’action dans les autres types de cellules cardiaques. Ces canaux sont en outre responsables du lien entre l’excitation et la contraction, induisant la libération de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (RS), et participent à la régulation de la charge en Ca2+ intracellulaire. De cette façon, ils déterminent l’activité d’un certain nombre d’enzymes cytoplasmiques et mitochondriales sensibles au Ca2+ et participent à la régulation de l’expression des gènes via le couplage excitation-transcription.
Structure-fonction Les LTCCs se composent d’une sous-unité principale D1, centrée autour de sous-unités auxiAMC pratique
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liaires E, J et D2G dont les principales fonctions sont de moduler l’expression membranaire de la sous-unité D1, son comportement biophysique ainsi que ses propriétés pharmacologiques (figure 1). La sous-unité D1 constitue le pore du canal par l’accolement de 4 domaines transmembranaires hydrophobes. Chacun de ces domaines contient 6 segments transmembranaires (dénommés S1 à S6) et ce sont les 4 boucles situées entre S5 et S6 qui forment le pore. Les segments S4, riches en résidus basiques arginines et lysines, constituent le senseur de potentiel. S’il existe 4 types de sousunité D1, CaV1.1-1.4, CaV1.2 (codée par le gène CACNA1C) est la principale sous-unité exprimée dans les myocytes ventriculaires, alors que CaV1.3 est principalement exprimée dans les cœurs fœtaux, dans les nœuds sino-auriculaire et atrio-ventriculaire et les tissus atriaux chez l’adulte. Aucune fonction pour CaV1.4 et 1.1 n’a été encore signalée dans le cœur, même si CaV1.1 a été détecté dans des cultures de cardiomyocytes néonataux. En plus d’un important épissage alternatif jouant un rôle unique dans la physiologie, la pharmacologie et les maladies cardiovasculaires, 2 formes (240 et 210 kDa) issues de la protéolyse de la région C-terminale de CaV1.2 sont présentes dans le muscle cardiaque, ce 'Ct contrôlant l’expression de CaV1.2. Il est généralement admis que deux sous-unités auxiliaires s’associent avec CaV1.2 dans un rapport 1:1:1 : une sous-unité E intracellulaire (principalement CaVE2a, codée par le gène CACNB2A), protéine appartenant à la famille des MAGUK (membrane associated guanylate kinase) se liant à la boucle intracellulaire reliant les domaines I et II de CaV1.2 et une sous-unité dimérique D2-G (principalement D2G-1, codée par le gène CACNA2D1), clivée de façon post-traductionnelle pour donner une partie G ancrant à la membrane par une liaison © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés
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Figure 1. Représentation schématique de la structure du canal calcique cardiaque CaV1.2 et de ses sous-unités auxiliaires (CaVβ2a et α2-δ). Les sites de phosphorylation par la protéine kinase dépendante du GMPc (PKG), par la protéine kinase C (PKC), par la protéine kinase activée par le complexe CaM/Ca2+ (CaMKII) et par la kinase dépendante de l’AMPc (PKA) sont indiqués. La régulation par PKA est facilitée par sa fixation à une AKAP (A-kinase anchoring protein) liée à la partie C-terminale de CaV1.2 qui est clivée par protéolyse ('CT) et réassociée au canal. Cette régulation par PKA dépend également de la présence de la protéine géante du cytosquelette AHNAK qui interagit avec la sous-unité CaVE2a. Le Ca2+ intracellulaire en se fixant au motif « EF » et par l’intermédiaire de la calmoduline (CaM) fixée au motif « IQ » de la partie C-terminale de CaV1.2, augmente son inactivation.
disulfure la partie D2 extracellulaire. La présence et le rôle de sous-unités J entièrement membranaires ne sont pas encore clairement établis.
Propriétés biophysiques Les LTCCs s’ouvrent (s’activent) pour des dépolarisations >-40 mV (canaux à haut seuil d’activation) avec un décours sigmoïde (traduisant un processus en plusieurs étapes) augmentant avec la dépolarisation pour atteindre un maximum aux environs de 0 mV (figure 2). Au niveau du canal unitaire, 3 modes d’activité sont observés : le mode 0 est caractérisé par de rares ou l’absence totale d’ouverture ; dans le mode 1, le canal présente de courtes ouvertures (< 1 ms) et fermetures (de 0,2 à 2 ms) répétitives, formant des salves d’activité consécutives pouvant être regroupées en cluster ; le mode 2 qui se produit en présence d’activateurs ou après stimulation des récepteurs E-adrénergiques (E-AR) est caractérisé par des temps d’ouverture plus longs. Si les LTCCs sont 500 à 1 000 fois plus 30
perméables aux cations divalents (Ca2+ ou le Ba2+) qu’aux cations monovalents, les métaux de transition (Ni2+, Co2+, Cd2+, Mg2+, Mn2+ et Zn2+) les bloquent. Leur conductance unitaire est de 3-5pS lorsque le Ca2+ est le porteur de charge. Cette sélectivité est assurée par deux sites de liaison dans le pore du canal auquel participent 4 résidus glutamate (motif EEEE) ainsi qu’un ensemble de résidus chargés situés dans la moitié supérieure du canal pointant vers le pore (motif DCS pour divalent cation selectivity). De même que les canaux Na+ mais de façon plus lente, les canaux Ca2+ se ferment avec le temps. Cette inactivation des LTCCs est dépendante à la fois du potentiel (VDI) et du Ca2+ (CDI) expliquant l’évolution complexe de la décroissance du courant et la présence d’un creux dans la courbe d’inactivation en fonction du potentiel (figure 2B) : l’inactivation est de moitié aux environs de -20 à -30 mV, est maximale à ~0 mV et diminue de nouveau à des potentiels plus positifs. La CDI limite la dépolarisation membranaire induite par ICa,L et contribue au maintien de l’homéostasie Ca2+ en évitant toute surcharge calcique aux AMC pratique
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effets délétères pour le cardiomyocyte. La contribution relative de la CDI à l’inactivation totale est encore discutée, mais il est communément admis que la phase d’inactivation rapide représente la composante CDI. Si la boucle I-II intracellulaire de CaV1.2 et CaVE sont essentielles pour la VDI, ils régulent aussi la CDI qui pourrait ainsi être un frein préexistant pour la VDI. Toutefois, les mécanismes précis qui sous-tendent la CDI ne sont pas totalement élucidés. Il est généralement admis qu’en présence de Ca2+ (entrant par le canal et libéré par le RS), la calmoduline (CaM) liée à la queue C-terminale de CaV1.2 sur un motif isoleucine-glutamine (motif IQ), constitue le détecteur de Ca2+ et que son change-
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ment de conformation induit par la fixation du Ca2+ promeut la fermeture du canal. Plusieurs autres structures semblent aussi être impliquées dans la CDI telles qu’un motif « EF-hand » (domaine protéique structuré en hélice-boucle-hélice capable de fixer l’ion Ca2+ avec une forte affinité) dans l’extrémité C-terminale de CaV1.2 et son extrémité N-terminale alors que la région du pore serait impliquée dans l’inactivation lente. Les courbes d’activation (d)et d’inactivation (f en fonction du potentiel montrent un remarquable chevauchement de -40 à 0 mV (figure 2B). Dans cette fenêtre de la gamme du plateau du potentiel d’action où les LTCCs peuvent naviguer entre les états fermé,
Figure 2. Propriétés biophysiques du courant calcique de type L et sa régulation par une stimulation β-adrénergique. A. Pour un potentiel de membrane inférieur à -40 mV, le canal est dans un état fermé. Lors d’une dépolarisation, provoquée par un saut de potentiel comme ici en patch-clamp à 0 mV, les canaux passent de l’état fermé à l’état ouvert conducteur, suivi par l’état « inactivé » lorsque la dépolarisation se prolonge. L’application d’un agoniste E-adrénergique non sélectif, l’isoprénaline augmente l’amplitude du courant ICa,L. B. Courbes d’activation (df) et d’inactivation (ff) d’ICa,L en fonction du potentiel. On observe un chevauchement de ces courbes entre -40 à 0 mV correspondant au courant de fenêtre (grisé). Dans cette gamme de potentiel, les canaux peuvent naviguer entre les états fermé, ouvert et inactivé. Lors d’une stimulation E-adrénergique, ces courbes et plus particulièrement la courbe d’activation, sont déplacées vers des potentiels hyperpolarisés. Le courant de fenêtre est ainsi augmenté, traduisant une entrée plus importante de Ca2+ dans le cardiomyocyte lors du potentiel d’action.
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PHYSIOPATHOLOGIE CARDIOVASCULAIRE
Le courant calcique ICa,L et sa régulation normale
ouvert et inactivé, des réouvertures sont possibles, générant un courant de fenêtre qui représente ~10 % de l’influx Ca2+ en état stable participant à la recharge du RS et à la survenue de post-dépolarisations précoces [1]. Cette dépendance vis-à-vis à la fois du potentiel et du Ca2+ participe aussi à une augmentation de l’amplitude du courant et un ralentissement de l’inactivation des LTCCs quand la fréquence de stimulation augmente (le RS se vidant de son contenu en Ca2+), suite à une première dépolarisation à hauts potentiels ou lors de la récupération de l’inactivation (réactivation) [2]. Ce phénomène appelé « facilitation » participe ainsi à l’effet inotrope positif induit par l’augmentation de la fréquence cardiaque observé chez certaines espèces dont l’Homme. A l’échelle du canal unitaire, cette facilitation se caractérise par une augmentation de sa probabilité d’ouverture avec une plus grande proportion de longues ouvertures (mode 2) et une augmentation du nombre de canaux fonctionnels. Ce phénomène est encore loin d’être totalement compris, mais comme la CDI, il dépend de la présence de CaM fixée à la partie C-terminale de CaV1.2 et fait intervenir la protéine kinase activée par le complexe CaM/Ca2+, la calmoduline kinase II (CaMKII), qui phosphoryle la sous-unité CaVE et/ou la partie C-terminale de CaV1.2 (figure 1).
Régulations Parmi les nombreuses voies de régulation de ICa,L, la mieux décrite est sa stimulation E-adrénergique qui contribue aux effets inotropes positifs des catécholamines. A ce jour, 3 récepteurs E-adrénergiques (E-AR) ont été clonés (E1-AR, E2-AR et E3-AR) mais les effets des catécholamines sur le cœur humain sont généralement attribués aux deux premiers, les E1-AR y étant majoritairement exprimés. Cette voie de signalisation classique implique l’activation de l’adénylate cyclase via une protéine G stimulatrice, GDs, entraînant une augmentation des taux d’AMPc intracellulaire, bien que les E2-AR puissent également se coupler à une protéine G inhibitrice (GDi). La principale cible de l’AMPc est la protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA) qui phosphoryle les CaV1.2 entre autres protéines 32
clés du couplage excitation-contraction, pour augmenter l’entrée de Ca2+ dans le cardiomyocyte lors du potentiel d’action. Leur phosphorylation par la PKA favorise leur activité en mode 2. En conséquence, l’amplitude d’ICa,,L est augmentée de 2 à 3 fois et sa dépendance vis-à-vis du potentiel est légèrement décalée vers les potentiels négatifs (figure 2B). La stimulation E-adrénergique accroit ainsi le courant de fenêtre en raison de l’effet de la phosphorylation par la PKA sur l’activation du canal. Parce qu’une stimulation E-AR augmente l’entrée du Ca2+ par ce canal, elle accélère également son inactivation. Si les principaux effets de la stimulation E-AR sur la dépendance d’ICa,L vis-à-vis du potentiel et son amplitude sont bien documentés, le ou les sites de phosphorylation de CaV1.2 par la PKA qui entraînent l’augmentation de son activité demeurent controversés. La phosphorylation de sérines présentes sur CaVE2a avait été suggérée mais a été depuis exclue. Néanmoins, CaVE2a peut s’associer à la protéine géante du cytosquelette de 700 kDa nommée AHNAK, qui est apparue comme un acteur important de la régulation E-adrénergique de ICa,L [3] (figure 1). Grâce à son interaction avec CaVE2a, AHNAK servirait de frein à ICa,L, frein qui serait levé par la phosphorylation par PKA de CaVE2 et AHNAK. La ser1928 présente dans la partie C-terminale de CaV1.2 est phosphorylée par PKA lors d’une stimulation E-AR et a longtemps été considérée comme le résidu indispensable aux effets observés sur ICa,L. Néanmoins, comme pour CaVE2a, son importance dans la régulation E-AR a été depuis réfutée. Le rôle critique de la partie C-terminale de CaV1.2 a cependant été confirmé par l’identification du résidu ser1700 comme étant le site qui, lorsqu’il est phosphorylé par la PKA, conduirait à l’augmentation d’ICa,L, mais ceci reste à être confirmé dans les cardiomyocytes [4]. Il existe une réelle difficulté à reconstituer cette régulation par PKA dans les systèmes de surexpression hétérologues et plusieurs tentatives ont ainsi échoué conduisant à l’hypothèse qu’au moins un partenaire manquerait dans ces cellules pour permettre la modulation des CaV1.2. Mis à part AHNAK, un autre partenaire indispensable pourrait être une protéine d’ancrage de la PKA (AKAP), l’AKAP15/18 et/ou l’AKAP79/150 qui, en se AMC pratique
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J. Leroy, J.-P. Benitah
fixant à un domaine riche en leucines de la partie C-terminale de CaV1.2, permet d’associer la kinase afin d’assurer une phosphorylation spécifique et rapide du canal. Les AKAPs ont en commun leur capacité à se lier à PKA, mais cette famille de protéines appartient également à un système de protéines d’échafaudage pour d’autres acteurs des voies de signalisation, comme les adénylates cyclases (AC), les phosphodiestérases (PDE), les phosphatases 1 et 2, dont PP2A qui s’associe au CaV1.2. La présence de PDE et de phosphatases dans ces macrocomplexes de protéines permet le contrôle spatiotemporel de la signalisation AMPc/PKA [5]. Les PDEs cardiaques qui dégradent l’AMPc appartiennent à 5 familles (PDE1-4 et PDE8) et se distinguent par des propriétés enzymatiques et pharmacologiques distinctes. Leur rôle est non seulement d’assurer la terminaison des signaux AMPc, mais aussi de restreindre la propagation dans la cellule de ce second messager hautement diffusible. En le maintenant compartimenté, les PDEs assurent ainsi la spécificité de réponse du cardiomyocyte à divers stimuli hormonaux qui utilisent l’AMPc comme messager intracellulaire de leurs effets. Parmi celles-ci, les PDE3 sont majoritairement exprimées chez l’Homme et constituent l’activité majeure contrôlant ICa,L. Néanmoins, les PDE4 et les PDE2, bien que moins exprimées, contrôlent également sa régulation E-adrénergique, y compris dans les cardiomyocytes humains [6]. La PKA n’est pas la seule kinase régulant l’activité de CaV1.2 qui présente également des sites potentiels de phosphorylation par la PKC, notamment dans sa partie N-terminale. L’activation de divers récepteurs couplés à une protéine Gq, comme les récepteurs D1-adrénergiques, muscariniques, à l’endothéline, à l’angiotensine II conduit à l’activation de la phospholipase C qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en inositol triphosphate et en diacylglycérol (DAG). Ce dernier conjointement avec la phosphatidylsérine et parfois avec le Ca2+ active la PKC pour réguler l’amplitude de ICa,L. Néanmoins, les conséquences de l’activation de la PKC sur ICa,L restent à éclaircir puisque des effets stimulateurs, inhibiteurs et même biphasiques de la PKC sur ce courant ont été rapportés [7]. De AMC pratique
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même, sa régulation par une autre kinase activée par le GMPc, la PKG, reste ambigüe. Selon les espèces, le type cellulaire étudié (myocyte ventriculaire, atrial, adulte ou néonatal) et les conditions expérimentales employées, ICa,L a tour à tour été décrit comme étant augmenté ou inhibé par PKG. L’inconsistance des effets de cette voie GMPc/ PKG sur l’activité du canal s’explique probablement par les effets multiples du GMPc dans le cardiomyocyte. En effet il peut activer ou inhiber diverses phosphodiestérases (respectivement PDE2 et PDE3) qui contrôlent la régulation E-adrénergique d’ICa,L [8].
Pharmacologie Différentes molécules ayant pour cible les LTCCs ont été développées pour traiter l’hypertension artérielle, l’angine de poitrine et les arythmies. Trois classes d’agents pharmacologiques sont ainsi utilisées pour moduler l’entrée de Ca2+ via ces canaux : il s’agit des dihydropyridines (DHP), des phénylalkylamines (PAA) et benzothiazepines (BZT) qui se fixent à différents sites de CaV1.2 pour en modifier l’activité [9]. La plupart des dérivés des DHPs comme la nifédipine, la nitrendipine, la nicardipine, sont des bloqueurs de ces canaux mais certaines molécules comme le (-) Bay K 8644 augmentent leur activité et sont donc considérés comme des « activateurs » des LTCCs. Quant aux PAAs (vérapamil) et BZTs (dilitiazem), elles inhibent l’entrée de Ca2+ par les LTCCs et sont donc exclusivement des bloqueurs d’ICa,L. La fixation de ces trois classes de bloqueurs calciques dépend du potentiel de membrane, les PAAs et BZTs s’associant au canal dans son état ouvert tandis que les DHPs s’associent préférentiellement au canal lorsqu’il est inactivé. Ceci explique la sélectivité vasculaire des DHPs et leur emploi comme antihypertenseur, le potentiel de repos des cellules musculaires lisses étant dépolarisé, les LTCCs y sont le plus souvent inactivés. Conflits d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêt en relation avec cet article. Références [1] Benitah JP, Alvarez JL, Gomez AM. L-type Ca2+ current in ventricular cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol 2010;48:26-36.
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[2] Richard S, Perrier E, Fauconnier J, et al. Ca2+-induced Ca2+ entry or how the L-type Ca2+ channel remodels its own signalling pathway in cardiac cells. Prog Biophys Mol Biol 2006;90:118-35. [3] Haase H. Ahnak, a new player in beta-adrenergic regulation of the cardiac L-type Ca2+ channel. Cardiovasc Res 2008;73:19-25. [4] Bannister RA, Ohrtman JD. Reassessing the molecular mechanism of beta-adrenergic stimulation of cardiac L-type Ca2+ current. Channels (Austin) 2009;3:146-8. [5] Scott JD, Santana LF. A-kinase anchoring proteins: getting to the heart of the matter. Circulation 2010;121:1264-71.
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[6] Mika D, Leroy J, Vandecasteele G, et al. PDEs create local domains of cAMP signaling. J Mol Cell Cardiol 2012;52:323-9. [7] Kamp TJ, Hell JW. Regulation of cardiac L-type calcium channels by protein kinase A and protein kinase C. Circ Res 2000;87:1095-102. [8] Fischmeister R, Castro L, Abi-Gerges A, et al. Species- and tissue-dependent effects of NO and cyclic GMP on cardiac ion channels. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 2005;142:136-43. [9] Striessnig, J. Pharmacology, structure and function of cardiac L-type Ca2+ channels. Cell Physiol and Biochem 1999;9:24269.
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