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Purinstoffwechsel und Riboflavinbildung in Mikroorganismen
Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd. 164, S. 135-141 (1973) Sektion Biowissenschaften der Martin-Luther-Universitiit Halle- Wittenberg Fachbereich Biochemie, Biologische Abteilung
Purinstoffwechsel und Riboflavinbildung in Mikroorganismen IX. Der Einflu6 von Eisen auf den Glucoseumsatz von Candida guilliermondii (Cast.) Lang. et G.
Von K. zuR NIEDEN, D. ScHLEE und H. REINBOTHE (Eingegangen am 1. September 1972)
Purine Metabolism and Riboflavin Formation in Microorganisms IX. Influence of iron on the course of glucose catabolism in Candida guillierrnondii (Cast.) Lang. et G.
Summary The influence of iron (4 mg FeCI 3 • 6 H 2 0/l culture solution) upon the course of glucose catabolism in Candida guielliermondii (CAST.) LANG. et G. has been investigated. Iron deficiency (5 ftg ironfl culture broth) is correlated with riboflavin overproduction and with an increased oxygen consumption (measured as {tl 0 2 /hrfmg dry weight). This is in contrast to the riboflavin non-overproducing Candida utilis showing the highest values of oxygen uptake in the presence of iron. C0 2 -evaluation from glucose- U- 14 C is significantly increased in iron-deficient Candida cells when compared with cells grown in iron-containing media. From glucose-l-14 C more 14 C0 2 is released than from glucose-6- 14 C unter iron-deficiency in comparison to iron-grown cells. Estimations of enzyme activities of glucose-6-phosphate dehydrogenase ("key enzyme" of the HMP-pathway) and phosphohexoisomerase ("key enzyme" of the EMP-pathway) from cells of both cultivation conditions show a slight decrease of the glycolytic enzyme and a sharp increase in the HMP related glucose-6-phosphate dehydrogenase. We assume that under iron deficiency glucose catabolism following the oxidative phosphogluconate pathway is favoured thus directing glucose to the synthesis of ribose and to ribityl side ch
I. Einleitung
Eisen spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel und greift in recht komplexer Weise in das metabolische Geschehen mikrobieller Zellen ein(lO). Es beeinflu.Bt u. a. auch in charakteristischer Weise die Biosynthese von verschiedenen sekundaren Naturstoffen (5, 22). 10*
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Die Hefe Candida guilliermondii produziert unter Eisenmangelbedingungen groBe Mengen Flavinverbindungen und scheidet vorwiegend freies Riboflavin in die NahrlOsung aus. Uber die Bedingungen fiir diese ,Flavinogenese" wurde von uns mehrfach berichtet (6, 16, 18). In normal mit Eisen versorgten Kulturen ist die Riboflaviniiberproduktion reprimiert. In einer friiheren Arbeit hatten wir vermutet, daB Eisen EinfluB auf die enzymatische Aktivitat der schwermctallhaltigen Xanthinoxydase nimmt, die im oxidativen Abbau der Purine katalytisch wirksam ist (14). Purine diencn als Vorstufen des Pteridinringes im Isoalloxazinkern des Riboflavins. Andere Autoren postulierten, daB Eisen (17) oder ein Eisen-Flavoproteid (3) als Repressor der Riboflavinsynthese fungiert. Ncben dem Purinstoffwechsel miinden Reaktionen des Kohlenhydratstoffwechsels in die Riboflavinbiosynthese. Ribose kann nach Reduktion zu Ribitol die Ribitscitenkette des Vitamins liefern (8). Diacetyl, das aus Pyruvat stammt, gcht in die Synthese der Riboflavinvorstufc 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin ein (15). In der vorliegenden Arbeit wurde der EinfluB des Eisens auf den Glucoseumsatz durch C. guilliermondii untersucht. Es war bekannt, daB Eisenmangelkulturen einen deutlich hoheren Sauerstoffverbrauch im Vergleich zu eisenversorgten Kulturen haben (16). KAUPPINEN ( 4) hatte gezeigt, daB unter Eisenmangel angezogene Zellen von C. guilliermondii mehr Glucose zur Bildung der gleichen Zellmasse als eisenhaltige Kulturen verbrauchen. II. Material und Methoden Die Anzucht des Untersuchungsmaterials, die Entfernung des Eisens aus der Niihrliisung, die Trockengewichts- und Riboflavinbestimmung sind bei ScHLEE et al. (14) ausfiihrlich beschrieben. Die Untersuchungen wurden in Eisenmangel- (-Fe; Eisengehalt etwa 5 {.lg/l) und eisenhaltigen Nahrliisungen (+Fe; 4 mg Eisen als FeCl 3 • 6 H 2 0/l) von Candida guilliermondii durchgefiihrt. Als Impfsuspension wurde eine 24 Std. alte Fhissigkeitskultur in der jeweiligen Niihrliisungsvariante verwendet. Die Animpfdichte betrug stets 0,15 mg Trockengewicht (TG)fml. Fiir Candida utilis (HENNEBERG) LoDDER et v. Ru entsprechen die Anzuchtbedingungen denen von C. guilliermondii. Der Proteingehalt wurde nach LowRY et al. (17), die Glucosekonzentration der Niihrliisung mit der Anthronmethode nach MoRRIS (19) und der Eisengehalt der Niihrlosung mit dem Biochemica-Testbesteck TC-FE der Fa. Boehringer und Soehne (Mannheim) bestimmt. Die manometrischen Untersuchungen wurden im Rundwarburg V 85 der Fa. Braun (Melsungen) nach der Methode von WARBURG (19) durchgefiihrt. Die Versuchstemperatur betrug in allen Fallen 30 oc. Ansatz zur Bestimmung der aktuellen Atmung: HauptgefiiB - 0,2 ml Hefesuspension (auf 1 mg TG eingestellt) und 2,6 ml zellfreie Niihrliisung (es wurde jeweils die Nahrliisung nach der angegebenen Kulturdauer verwendet), ZentralgefiiB - 0,2 ml20%ige KOH.
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Die Bestimmung der relativen Anteile des Embden-Meyerhof-Parnas- (E:VIP-) Weges und des Hexosemonophosphat- (liMP-) Weges erfolgte in Anlehnung an die radiorespirometrische Methode nach WANG eta!. (21) und WooD et al. (23) durch Parallelversuche mit D-Glucose-1-14 0 und D-Glucose-6-14 C. Dabei wurde die Aufnahme der markierten Glucose durch die Zellen und die Radioaktivitat des gebildeten 14 C0 2 gemessen. Die Inkubation erfolgte in WarburggefiiBen bei 30 oc fiir 2 Std. mit folgendem Ansatz: HauptgefaB - 2,2 ml einer 24 Std. alten Zel!suspension (auf 1 mg TG eingestellt); (Die Nahrlosungen beider Kulturvariantcn enthalten zu diesem Zeitpunkt 18 mg Glueosejml). ZentralgefaB - 0,1 ml o%ige KOH zur Adsorption des 14 CO •. 1. Seitenarm - 0,5 ml radioaktive Glucoselosung (Endkonzentration 10- 2 M; die Radioaktivitat pro GebB betrug fiir Glucose-1- 14 C 525 x 103 , fiir Glucose-6- 14 C 375 x 103 und fiir Glucose-U- 14 C 1037 x 103 Ipm; Zugabe bci Versuchsbeginn). 2. Seitenarm - 0,2 ml1,6
~
HC!0 4 zum Abstoppen des Versuches.
Zur vollstandigen Absorption des gebildetcn 14 C0 2 wurde nach Versuchsende noch 1 Std. geschiittelt. AnsrhlieBend wurde znr Vermeidung des C0 2 -Austausches die KOH mit 0,1 ml gesattigter Sodalosung versetzt. Zur Radioaktivitatsmessung wurden ali quote Teile der Nahrliisung und 50 11! des K 2 14 C0 3 nach Trocknung in ,unendlich diinner Schicht" unter einem Endfensterzahlrohr (VA-Z 310) am StrahlungsmeBplatz VA-l\1 15 D (Vakutronik, Dresden) zur l\fessung gebracht. I-Ierstellung ze!lfreier Extrakte: Die Hefezellen wurden nach 2maligem Waschen mit TrisI-ICl-Puffcr (pH 7 ,6, 0,05 M) mit Alcoa A 305 (5fache l\Ieng;e des eingesetzten Trockengewichts) 15 Min. in der Kalte zerrieben, in Tris-1-ICl-Puffer wieder aufgenommen und bei 20000 x gin einer Phywe- Kiihlzentrifuge 30 Min. zentrifugiert. Der tTberstand diente zur Bestimmung der Aktivitaten von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und Phosphoglucose-isomerase mittels optischcn Tests: Die Extinktion wurde im selbstregistrierenden Spektralphotometer "C"NICAM SP 800 (Cambridge) in 1-cm-Kiivetten bei 30 oc und einer Wellenlange von 340 nm gemessen. Der Start der Reaktion erfolgte durch Zngabe von 0,1 ml Rohenzymliisung (1,6-2 mg Protein). Glucose-G-phosphat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.4H): 2,6 ml 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,6i 0,2 ml MgCl 2 (0,1 :V£); 0,1 ml Glucose-6-phosphat (0,025l'II); 0,1 ml NADP+ (10 mgjml). Phosphoglucose-Isomerase (E.C. 5.3.1.H): 2,55 ml 0,05l'II Tris-HCl-Puffer, pH 7,6; 0,2 ml MgCl 2 (0,1 M); 0,1 ml Fructose-6-phosphat (13 mgjm!); 0,1 ml NADP+ (10 mgjm!); 0,02 ml Glncose-6phosphat-Dehydrogenase (1 mg/ml). Die spezifischen Enzymaktivitaten wurden in Einheitenjmg Protein nach BucHER ausgedriickt. Verwendete Chemikalien: Glucose-6-phosphat, Fructose-6-phosphat, NADP und Glucose-6phosphat-Dehydrogenase wurden von Boehringer und Soehne (Mannheim) bezogen. Glucose-U-, Glucose-1- und Glucose-6- 14 C waren Produkte des Radiochemical Centre Praha (CSSR).
III. Ergebnisse und Diskussion Messung des Sauerstoffverbrauches Manometrische Messungen der Atmungsintensitat (aktuelle Atmung) von C. guilliermondii ergeben, da13 Eisenmangelzellen einen deutlich erhi:ihten Sauerstoffverbrauch (Q 0 , =Ill 0 2/Std.jmg TG) gegeniiber eisenversorgten Zellen aufweisen.
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Dieser Unterschied bleibt wahrend der gesamten Kulturdauer bestehen (16.) Bei der zum Vergleich untersuchten Hefe C. utilis, die kein Riboflavin iiberproduziert, zeigen dagegen eisenhaltige Kulturen einen hi:iheren Sauerstoffverbrauch als Eisenmangelkulturen (Tabelle 1). Tabelle 1 Sauerstoffverbrauch (Qo,) von Eisenmangel- und eisenhaltigen ( 4 mg Fe+++ als FeCl3 • 6 H 2 0/l Nahrliisung) Kulturen von C. guilliermondii und C. utilis nach 24 Std. Kulturdauer Organism us
Kulturvariante
Qo, (rtl 0 2 /Std.fmg Trockengewicht)
C. guilliermondi'i
+ Fe - Fe + Fe - Fe
140 192 101 69
C. utilis
Bei C. guilliermondii liegt unter Eisenmangelbedingungen die Zellsubstanzsynthese a us Glucose ( 4g /Liter) deutlich niedriger als bei optimal mit Eisen versorgten Kulturen (16). Offensichtlich wird ein gri:iBerer Anteil der Kohlenstoffquelle veratmet. Die ,i:ikonomische Konstante" (Verhaltnis von produzierter Trockenmasse zu verbrauchter Glucose) liegt fUr C. guilliermondii nach Angaben von KAUPPINEN (4) bei eisenhaltigen Anzuchtbedingungen wesentlich hoher als bei Eisenmangelkulturen. Manometrische Bestimmung der C0 2 -Bildung aus Glucose ergaben zunachst keine Unterschiede zwischen den heiden Kulturvarianten. Bezieht man aber auf die Glucoseaufnahme (Versuche mit Glucose- U- 14 C), die unter eisenhaltigen Bedingungen deutlich gesteigert ist, oxydieren Eisenmangelkulturen 62% mehr Glucose zu C0 2 als eisenhaltige Kulturen (Tabelle 2). Tabel!e 2
Stoffwechsel von D-Glucose-U-HC (Radioaktivitat pro WarburggefiiB 1037 x1()3 lpm; 10- 2 M Endkonzentration) in Eisen mangel (-Fe) und eisenversorgten (+Fe) Kulturen von C. guilliermondii. Alter der Kultur 24 Std.; Inkubationszeit 2 Std. Kulturvariante - Fe + Fe Aufnahme durch die Zel!en (lpmfmg Protein) 4507 Oxydation zu C0 2 (Ipm/mg Protein) 1514 Oxydierte Antei!e in % der aufgenommenen Glucose 33,1
9041 1847
20,4
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Glucoseumsatz Untersuchungen von BRADLEY (2) und RAo et al. (12, 13) wicsen in C. stellatoidea bzw. C. albicans den Hcxosemonophosphatweg und das Glykolyseschema als Glucose-Abbauwege nach. In Saccharomyces cerevisiae iiberwog der EMP-Weg mit 88% am Gesamtumsatz der Glucose deutlich den Abbau tiber den HMP-Weg, der nur 12% betrug (21). Untersuchungen an insgesamt neun verschiedenen Mikroorganismen gestatten die Verallgemeinerung, daB fUr die Glucosedissimilation jeweils nur zwei Hauptreaktionswege bevorzugt werden (21). Mittels positionsmarkierter Glucose (Glucose-1- 14C und Glucose-6- 14 C) werden die relativen Anteile der verschiedenen Abbauwege an der Gesamtverwertung der Glucose in C. guilliermondii erfaBt. Im Zuge des HMP- Weges wird das C-1 der Glucose bevorzugt gegeniiber den anderen Kohlenstoffatomen zu C0 2 oxydiert (C1 > C6 ). Dagegen katabolisiert der EMP- Weg die heiden von uns betrachteten C-Atome der Glucose iiber die Endoxydation im Tricarbonsaurecyclus gleichwertig (C 1 = C6 ). Der Vergleich der C0 2 -Bildung aus C-1 und C-6 bei Einsatz von positionsmarkierter Glucose kann damit einen Anhaltspunkt fiir die unterschiedliche Verwertung des Zuckers lief ern (20, 21 ).
Aus Glucose-1-14 C wird signifikant mehr 14 C0 2 gebildct als aus Glucose-6- 14 C. Dabei liegt das Verhaltnis von ,C-1 zu C-6" bei Eisenmangelbedingungen mit 1,7 deutlich iiber dem bei eisenhaltigen (1,3) (Tabelle 3). Dies spricht fUr cine Bevorzugung des HMP-W eges unter Eisenmangel. 'fabelle 3
Bildung von radioaktivem C0 2 aus 1-14 C- und 6-14 C-Glucose durch 24 Std. alte Eisenmangel- und eisenhaltige Zellen von C. guillierrnondii Kulturvariante
% 14C0 2 bezogen auf Gesamtaufnahme von 1-14 C-Glucose u. 6-14 C-Glucose
Verhaltnis der oxyd.
- Fe + Fe
55,6 34,4
1, 7 1,3
32,8 26,6
Unter Eisenmangel- und eisenhaltigen Anzuchtbedingungen wurde die Aktivitat je cines ,Schliisselcnzyms" des EMP- und HMP-Weges bestimmt:
Phosphoglucose) 19 somerase (E .C. 5 .3 ..
EMP: D-Glucose-6-P I
Glucose-6-phosphat-
D-Fructosc-6-P
HMP: D-Glucose-6-P - - - - - - - - - - - - - + Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.49)
D-Gluco+Iacton-6-P
Unter Eisenmangel liegt die spezifische Aktivitat (Einheitjmg Protein, vgl. Material und Methoden) der Phosphoglucose-Isomerase bczogen auf die Aktivitii.t
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unter eisenhaltigen Bedingungen urn 20% niedriger, die der Glucose-6-phosphatDehydrogenase urn 54% hoher (Tabelle 4). In Candida wird die Kapazitat des HMP-Weges durch die Glucose-6-phosphatDehydrogenase kontrolliert (11). Tabelle 4
Spezifische Aktivitaten (F.jmg Protein) der Glucose-6-phosphat-Dehydrogeaase (G-6-P-DH) und der Phosphoglucose-Isomerase (PGI) von 16 Std. alten Eisenmangelund eisenhaltigen Kulturen von C. guilliermondii Kulturvariante
G-6-P-DH
- Fe + Fe
88
86
57
107
PGI
Die Stirnulierung des HMP-W eges des Glucoseabbaus gegenuber dern EMPWeg konnte fUr die Riboflavinuberproduktion (Anlieferung der C-5-Seitenkette des Riboflavins) von Bedeutung sein und kann den erhtihten Sauerstoffverbrauch unter Eisenrnangelbedingungen erklaren. Dabei erfolgt in C. guilli.;rmondii bei Ei8enrnangelanzucht der Elektronendurchsatz tiber eine bezuglich ihres Cytochromspektrurns qualitativ nicht signifikant veranderte Atrnungskette. Sowohl bei cisenhaltigen als auch bei Eisenmangelbedingungen wurden die Cytochromkornponenten a 3 , P-Banden von b und c, c, b und a nachgewicsen (18). Unter Eisenrnangel ( etwa 5 flg Eisenfl Nahrlosung) wird also ein vollstandiges und funktionstuchtiges Cytochrornspektrurn ausgebildet. Zusammenfassung Es wird der Einflufi des Eisens auf den Glucoseumsatz der unter Eisenmangelbedingungen Riboflavin iiberproduzierenden Hefe Candida guilliermondii (CAsT.) LANG. et G. untersueht. Eisenmangelzellen zeigen wahrend der gesamten Kulturdauer einen hoheren Sauerstoffverbrauch (p,l 0 2 /Std.jmg TG). Bei der nicht ,flavinogenen" C. uti!is werden dagegen bei eisenhaltigen Anzuchtbedingungen (4 mg Eisen als ~FeCI 3 • 6 H 2 0/! ~ahrlosung) die hochsten Werte im Sauerstoffverbrauch bestimmt. Eisenmangelkulturen (5 /kg Fejl Nahrlosung) von C. guilliermondii oxydieren, wie Versuche mit Glucose- U -14 C zeigen, 62% mehr Glucose zu C0 2 als eisenhaltige Kulturen. Traceruntersuchungen mit positionsmarkierter Glucose ergeben, daB unter Eisenmangelbedingungen 1,7mal mehr 14 C0 2 aus Glucose-1- 14 C als aus Glucose-6-14 C gebildet wird. Es wird die spezifische Aktivitat (Einheitjmg Protein) von ,Schliisselenzymen" der Glneosedissimilation in einem Rohenzym-Extrakt von 16 Std. alten C. guilliermondii-Zellen bestimmt. Die Aktivitat der Phosphorglucose-Isomerase ist bei Eisenmangelanzucht im Vergleich zu eisenhaltigen Bedingungen urn 20% erniedrigt, die der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase urn 54% gesteigert. Die Befunde werden als Stimulierung des HMP-Weges des Glucoseumsatzes gegeniiber dem EMP- Weg diskutiert. Diese konnte fiir die vermehrte Anlieferung von Pentosen zur Synthese der Ribitylseitenkette des Riboflavins von Bedeutung sein.
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Anschrift der Verfasser: Dr. K. zuR ~IEDE?i, VVB Agrochemie und Zwischenprodukte, Zentralstelle fiir Anwendungsforschung, 7101 Cunnersdorf, Prof. Dr. H. REJNBOTHE und Dr. sc. D. ScHLEE, Sektion Biowissenschaften, Bioi. Abt., 402 Halle, Neuwerk 1.
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Purine Metabolism and Riboflavin Formation in Microorganisms IX. Influence of iron on the course of glucose catabolism in Candida guillierrnondii (Cast.) Lang. et G.
Summary The influence of iron (4 mg FeCI 3 • 6 H 2 0/l culture solution) upon the course of glucose catabolism in Candida guielliermondii (CAST.) LANG. et G. has been investigated. Iron deficiency (5 ftg ironfl culture broth) is correlated with riboflavin overproduction and with an increased oxygen consumption (measured as {tl 0 2 /hrfmg dry weight). This is in contrast to the riboflavin non-overproducing Candida utilis showing the highest values of oxygen uptake in the presence of iron. C0 2 -evaluation from glucose- U- 14 C is significantly increased in iron-deficient Candida cells when compared with cells grown in iron-containing media. From glucose-l-14 C more 14 C0 2 is released than from glucose-6- 14 C unter iron-deficiency in comparison to iron-grown cells. Estimations of enzyme activities of glucose-6-phosphate dehydrogenase ("key enzyme" of the HMP-pathway) and phosphohexoisomerase ("key enzyme" of the EMP-pathway) from cells of both cultivation conditions show a slight decrease of the glycolytic enzyme and a sharp increase in the HMP related glucose-6-phosphate dehydrogenase. We assume that under iron deficiency glucose catabolism following the oxidative phosphogluconate pathway is favoured thus directing glucose to the synthesis of ribose and to ribityl side ch
I. Einleitung
Eisen spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel und greift in recht komplexer Weise in das metabolische Geschehen mikrobieller Zellen ein(lO). Es beeinflu.Bt u. a. auch in charakteristischer Weise die Biosynthese von verschiedenen sekundaren Naturstoffen (5, 22). 10*
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Die Hefe Candida guilliermondii produziert unter Eisenmangelbedingungen groBe Mengen Flavinverbindungen und scheidet vorwiegend freies Riboflavin in die NahrlOsung aus. Uber die Bedingungen fiir diese ,Flavinogenese" wurde von uns mehrfach berichtet (6, 16, 18). In normal mit Eisen versorgten Kulturen ist die Riboflaviniiberproduktion reprimiert. In einer friiheren Arbeit hatten wir vermutet, daB Eisen EinfluB auf die enzymatische Aktivitat der schwermctallhaltigen Xanthinoxydase nimmt, die im oxidativen Abbau der Purine katalytisch wirksam ist (14). Purine diencn als Vorstufen des Pteridinringes im Isoalloxazinkern des Riboflavins. Andere Autoren postulierten, daB Eisen (17) oder ein Eisen-Flavoproteid (3) als Repressor der Riboflavinsynthese fungiert. Ncben dem Purinstoffwechsel miinden Reaktionen des Kohlenhydratstoffwechsels in die Riboflavinbiosynthese. Ribose kann nach Reduktion zu Ribitol die Ribitscitenkette des Vitamins liefern (8). Diacetyl, das aus Pyruvat stammt, gcht in die Synthese der Riboflavinvorstufc 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin ein (15). In der vorliegenden Arbeit wurde der EinfluB des Eisens auf den Glucoseumsatz durch C. guilliermondii untersucht. Es war bekannt, daB Eisenmangelkulturen einen deutlich hoheren Sauerstoffverbrauch im Vergleich zu eisenversorgten Kulturen haben (16). KAUPPINEN ( 4) hatte gezeigt, daB unter Eisenmangel angezogene Zellen von C. guilliermondii mehr Glucose zur Bildung der gleichen Zellmasse als eisenhaltige Kulturen verbrauchen. II. Material und Methoden Die Anzucht des Untersuchungsmaterials, die Entfernung des Eisens aus der Niihrliisung, die Trockengewichts- und Riboflavinbestimmung sind bei ScHLEE et al. (14) ausfiihrlich beschrieben. Die Untersuchungen wurden in Eisenmangel- (-Fe; Eisengehalt etwa 5 {.lg/l) und eisenhaltigen Nahrliisungen (+Fe; 4 mg Eisen als FeCl 3 • 6 H 2 0/l) von Candida guilliermondii durchgefiihrt. Als Impfsuspension wurde eine 24 Std. alte Fhissigkeitskultur in der jeweiligen Niihrliisungsvariante verwendet. Die Animpfdichte betrug stets 0,15 mg Trockengewicht (TG)fml. Fiir Candida utilis (HENNEBERG) LoDDER et v. Ru entsprechen die Anzuchtbedingungen denen von C. guilliermondii. Der Proteingehalt wurde nach LowRY et al. (17), die Glucosekonzentration der Niihrliisung mit der Anthronmethode nach MoRRIS (19) und der Eisengehalt der Niihrlosung mit dem Biochemica-Testbesteck TC-FE der Fa. Boehringer und Soehne (Mannheim) bestimmt. Die manometrischen Untersuchungen wurden im Rundwarburg V 85 der Fa. Braun (Melsungen) nach der Methode von WARBURG (19) durchgefiihrt. Die Versuchstemperatur betrug in allen Fallen 30 oc. Ansatz zur Bestimmung der aktuellen Atmung: HauptgefiiB - 0,2 ml Hefesuspension (auf 1 mg TG eingestellt) und 2,6 ml zellfreie Niihrliisung (es wurde jeweils die Nahrliisung nach der angegebenen Kulturdauer verwendet), ZentralgefiiB - 0,2 ml20%ige KOH.
Purinstoffwechsel und Riboflavinbildung in 1\fikroorganismen
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Die Bestimmung der relativen Anteile des Embden-Meyerhof-Parnas- (E:VIP-) Weges und des Hexosemonophosphat- (liMP-) Weges erfolgte in Anlehnung an die radiorespirometrische Methode nach WANG eta!. (21) und WooD et al. (23) durch Parallelversuche mit D-Glucose-1-14 0 und D-Glucose-6-14 C. Dabei wurde die Aufnahme der markierten Glucose durch die Zellen und die Radioaktivitat des gebildeten 14 C0 2 gemessen. Die Inkubation erfolgte in WarburggefiiBen bei 30 oc fiir 2 Std. mit folgendem Ansatz: HauptgefaB - 2,2 ml einer 24 Std. alten Zel!suspension (auf 1 mg TG eingestellt); (Die Nahrlosungen beider Kulturvariantcn enthalten zu diesem Zeitpunkt 18 mg Glueosejml). ZentralgefaB - 0,1 ml o%ige KOH zur Adsorption des 14 CO •. 1. Seitenarm - 0,5 ml radioaktive Glucoselosung (Endkonzentration 10- 2 M; die Radioaktivitat pro GebB betrug fiir Glucose-1- 14 C 525 x 103 , fiir Glucose-6- 14 C 375 x 103 und fiir Glucose-U- 14 C 1037 x 103 Ipm; Zugabe bci Versuchsbeginn). 2. Seitenarm - 0,2 ml1,6
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HC!0 4 zum Abstoppen des Versuches.
Zur vollstandigen Absorption des gebildetcn 14 C0 2 wurde nach Versuchsende noch 1 Std. geschiittelt. AnsrhlieBend wurde znr Vermeidung des C0 2 -Austausches die KOH mit 0,1 ml gesattigter Sodalosung versetzt. Zur Radioaktivitatsmessung wurden ali quote Teile der Nahrliisung und 50 11! des K 2 14 C0 3 nach Trocknung in ,unendlich diinner Schicht" unter einem Endfensterzahlrohr (VA-Z 310) am StrahlungsmeBplatz VA-l\1 15 D (Vakutronik, Dresden) zur l\fessung gebracht. I-Ierstellung ze!lfreier Extrakte: Die Hefezellen wurden nach 2maligem Waschen mit TrisI-ICl-Puffcr (pH 7 ,6, 0,05 M) mit Alcoa A 305 (5fache l\Ieng;e des eingesetzten Trockengewichts) 15 Min. in der Kalte zerrieben, in Tris-1-ICl-Puffer wieder aufgenommen und bei 20000 x gin einer Phywe- Kiihlzentrifuge 30 Min. zentrifugiert. Der tTberstand diente zur Bestimmung der Aktivitaten von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und Phosphoglucose-isomerase mittels optischcn Tests: Die Extinktion wurde im selbstregistrierenden Spektralphotometer "C"NICAM SP 800 (Cambridge) in 1-cm-Kiivetten bei 30 oc und einer Wellenlange von 340 nm gemessen. Der Start der Reaktion erfolgte durch Zngabe von 0,1 ml Rohenzymliisung (1,6-2 mg Protein). Glucose-G-phosphat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.4H): 2,6 ml 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,6i 0,2 ml MgCl 2 (0,1 :V£); 0,1 ml Glucose-6-phosphat (0,025l'II); 0,1 ml NADP+ (10 mgjml). Phosphoglucose-Isomerase (E.C. 5.3.1.H): 2,55 ml 0,05l'II Tris-HCl-Puffer, pH 7,6; 0,2 ml MgCl 2 (0,1 M); 0,1 ml Fructose-6-phosphat (13 mgjm!); 0,1 ml NADP+ (10 mgjm!); 0,02 ml Glncose-6phosphat-Dehydrogenase (1 mg/ml). Die spezifischen Enzymaktivitaten wurden in Einheitenjmg Protein nach BucHER ausgedriickt. Verwendete Chemikalien: Glucose-6-phosphat, Fructose-6-phosphat, NADP und Glucose-6phosphat-Dehydrogenase wurden von Boehringer und Soehne (Mannheim) bezogen. Glucose-U-, Glucose-1- und Glucose-6- 14 C waren Produkte des Radiochemical Centre Praha (CSSR).
III. Ergebnisse und Diskussion Messung des Sauerstoffverbrauches Manometrische Messungen der Atmungsintensitat (aktuelle Atmung) von C. guilliermondii ergeben, da13 Eisenmangelzellen einen deutlich erhi:ihten Sauerstoffverbrauch (Q 0 , =Ill 0 2/Std.jmg TG) gegeniiber eisenversorgten Zellen aufweisen.
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K. zuR NIEDEN, D. ScHLEE und H. REINBOTHE
Dieser Unterschied bleibt wahrend der gesamten Kulturdauer bestehen (16.) Bei der zum Vergleich untersuchten Hefe C. utilis, die kein Riboflavin iiberproduziert, zeigen dagegen eisenhaltige Kulturen einen hi:iheren Sauerstoffverbrauch als Eisenmangelkulturen (Tabelle 1). Tabelle 1 Sauerstoffverbrauch (Qo,) von Eisenmangel- und eisenhaltigen ( 4 mg Fe+++ als FeCl3 • 6 H 2 0/l Nahrliisung) Kulturen von C. guilliermondii und C. utilis nach 24 Std. Kulturdauer Organism us
Kulturvariante
Qo, (rtl 0 2 /Std.fmg Trockengewicht)
C. guilliermondi'i
+ Fe - Fe + Fe - Fe
140 192 101 69
C. utilis
Bei C. guilliermondii liegt unter Eisenmangelbedingungen die Zellsubstanzsynthese a us Glucose ( 4g /Liter) deutlich niedriger als bei optimal mit Eisen versorgten Kulturen (16). Offensichtlich wird ein gri:iBerer Anteil der Kohlenstoffquelle veratmet. Die ,i:ikonomische Konstante" (Verhaltnis von produzierter Trockenmasse zu verbrauchter Glucose) liegt fUr C. guilliermondii nach Angaben von KAUPPINEN (4) bei eisenhaltigen Anzuchtbedingungen wesentlich hoher als bei Eisenmangelkulturen. Manometrische Bestimmung der C0 2 -Bildung aus Glucose ergaben zunachst keine Unterschiede zwischen den heiden Kulturvarianten. Bezieht man aber auf die Glucoseaufnahme (Versuche mit Glucose- U- 14 C), die unter eisenhaltigen Bedingungen deutlich gesteigert ist, oxydieren Eisenmangelkulturen 62% mehr Glucose zu C0 2 als eisenhaltige Kulturen (Tabelle 2). Tabel!e 2
Stoffwechsel von D-Glucose-U-HC (Radioaktivitat pro WarburggefiiB 1037 x1()3 lpm; 10- 2 M Endkonzentration) in Eisen mangel (-Fe) und eisenversorgten (+Fe) Kulturen von C. guilliermondii. Alter der Kultur 24 Std.; Inkubationszeit 2 Std. Kulturvariante - Fe + Fe Aufnahme durch die Zel!en (lpmfmg Protein) 4507 Oxydation zu C0 2 (Ipm/mg Protein) 1514 Oxydierte Antei!e in % der aufgenommenen Glucose 33,1
9041 1847
20,4
Purinstoffwechsel und Riboflavinbilduug in Mikroorganismen
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Glucoseumsatz Untersuchungen von BRADLEY (2) und RAo et al. (12, 13) wicsen in C. stellatoidea bzw. C. albicans den Hcxosemonophosphatweg und das Glykolyseschema als Glucose-Abbauwege nach. In Saccharomyces cerevisiae iiberwog der EMP-Weg mit 88% am Gesamtumsatz der Glucose deutlich den Abbau tiber den HMP-Weg, der nur 12% betrug (21). Untersuchungen an insgesamt neun verschiedenen Mikroorganismen gestatten die Verallgemeinerung, daB fUr die Glucosedissimilation jeweils nur zwei Hauptreaktionswege bevorzugt werden (21). Mittels positionsmarkierter Glucose (Glucose-1- 14C und Glucose-6- 14 C) werden die relativen Anteile der verschiedenen Abbauwege an der Gesamtverwertung der Glucose in C. guilliermondii erfaBt. Im Zuge des HMP- Weges wird das C-1 der Glucose bevorzugt gegeniiber den anderen Kohlenstoffatomen zu C0 2 oxydiert (C1 > C6 ). Dagegen katabolisiert der EMP- Weg die heiden von uns betrachteten C-Atome der Glucose iiber die Endoxydation im Tricarbonsaurecyclus gleichwertig (C 1 = C6 ). Der Vergleich der C0 2 -Bildung aus C-1 und C-6 bei Einsatz von positionsmarkierter Glucose kann damit einen Anhaltspunkt fiir die unterschiedliche Verwertung des Zuckers lief ern (20, 21 ).
Aus Glucose-1-14 C wird signifikant mehr 14 C0 2 gebildct als aus Glucose-6- 14 C. Dabei liegt das Verhaltnis von ,C-1 zu C-6" bei Eisenmangelbedingungen mit 1,7 deutlich iiber dem bei eisenhaltigen (1,3) (Tabelle 3). Dies spricht fUr cine Bevorzugung des HMP-W eges unter Eisenmangel. 'fabelle 3
Bildung von radioaktivem C0 2 aus 1-14 C- und 6-14 C-Glucose durch 24 Std. alte Eisenmangel- und eisenhaltige Zellen von C. guillierrnondii Kulturvariante
% 14C0 2 bezogen auf Gesamtaufnahme von 1-14 C-Glucose u. 6-14 C-Glucose
Verhaltnis der oxyd.
- Fe + Fe
55,6 34,4
1, 7 1,3
32,8 26,6
Unter Eisenmangel- und eisenhaltigen Anzuchtbedingungen wurde die Aktivitat je cines ,Schliisselcnzyms" des EMP- und HMP-Weges bestimmt:
Phosphoglucose) 19 somerase (E .C. 5 .3 ..
EMP: D-Glucose-6-P I
Glucose-6-phosphat-
D-Fructosc-6-P
HMP: D-Glucose-6-P - - - - - - - - - - - - - + Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.49)
D-Gluco+Iacton-6-P
Unter Eisenmangel liegt die spezifische Aktivitat (Einheitjmg Protein, vgl. Material und Methoden) der Phosphoglucose-Isomerase bczogen auf die Aktivitii.t
140
K.
ZUR
NrEDEN, D. ScHLEE und H. REINBOTHE
unter eisenhaltigen Bedingungen urn 20% niedriger, die der Glucose-6-phosphatDehydrogenase urn 54% hoher (Tabelle 4). In Candida wird die Kapazitat des HMP-Weges durch die Glucose-6-phosphatDehydrogenase kontrolliert (11). Tabelle 4
Spezifische Aktivitaten (F.jmg Protein) der Glucose-6-phosphat-Dehydrogeaase (G-6-P-DH) und der Phosphoglucose-Isomerase (PGI) von 16 Std. alten Eisenmangelund eisenhaltigen Kulturen von C. guilliermondii Kulturvariante
G-6-P-DH
- Fe + Fe
88
86
57
107
PGI
Die Stirnulierung des HMP-W eges des Glucoseabbaus gegenuber dern EMPWeg konnte fUr die Riboflavinuberproduktion (Anlieferung der C-5-Seitenkette des Riboflavins) von Bedeutung sein und kann den erhtihten Sauerstoffverbrauch unter Eisenrnangelbedingungen erklaren. Dabei erfolgt in C. guilli.;rmondii bei Ei8enrnangelanzucht der Elektronendurchsatz tiber eine bezuglich ihres Cytochromspektrurns qualitativ nicht signifikant veranderte Atrnungskette. Sowohl bei cisenhaltigen als auch bei Eisenmangelbedingungen wurden die Cytochromkornponenten a 3 , P-Banden von b und c, c, b und a nachgewicsen (18). Unter Eisenrnangel ( etwa 5 flg Eisenfl Nahrlosung) wird also ein vollstandiges und funktionstuchtiges Cytochrornspektrurn ausgebildet. Zusammenfassung Es wird der Einflufi des Eisens auf den Glucoseumsatz der unter Eisenmangelbedingungen Riboflavin iiberproduzierenden Hefe Candida guilliermondii (CAsT.) LANG. et G. untersueht. Eisenmangelzellen zeigen wahrend der gesamten Kulturdauer einen hoheren Sauerstoffverbrauch (p,l 0 2 /Std.jmg TG). Bei der nicht ,flavinogenen" C. uti!is werden dagegen bei eisenhaltigen Anzuchtbedingungen (4 mg Eisen als ~FeCI 3 • 6 H 2 0/! ~ahrlosung) die hochsten Werte im Sauerstoffverbrauch bestimmt. Eisenmangelkulturen (5 /kg Fejl Nahrlosung) von C. guilliermondii oxydieren, wie Versuche mit Glucose- U -14 C zeigen, 62% mehr Glucose zu C0 2 als eisenhaltige Kulturen. Traceruntersuchungen mit positionsmarkierter Glucose ergeben, daB unter Eisenmangelbedingungen 1,7mal mehr 14 C0 2 aus Glucose-1- 14 C als aus Glucose-6-14 C gebildet wird. Es wird die spezifische Aktivitat (Einheitjmg Protein) von ,Schliisselenzymen" der Glneosedissimilation in einem Rohenzym-Extrakt von 16 Std. alten C. guilliermondii-Zellen bestimmt. Die Aktivitat der Phosphorglucose-Isomerase ist bei Eisenmangelanzucht im Vergleich zu eisenhaltigen Bedingungen urn 20% erniedrigt, die der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase urn 54% gesteigert. Die Befunde werden als Stimulierung des HMP-Weges des Glucoseumsatzes gegeniiber dem EMP- Weg diskutiert. Diese konnte fiir die vermehrte Anlieferung von Pentosen zur Synthese der Ribitylseitenkette des Riboflavins von Bedeutung sein.
Purinstoffwechsel und Riboflavinbildung in Mikroorganismen
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Anschrift der Verfasser: Dr. K. zuR ~IEDE?i, VVB Agrochemie und Zwischenprodukte, Zentralstelle fiir Anwendungsforschung, 7101 Cunnersdorf, Prof. Dr. H. REJNBOTHE und Dr. sc. D. ScHLEE, Sektion Biowissenschaften, Bioi. Abt., 402 Halle, Neuwerk 1.