Typage des papillomavirus humains génitaux: détection du genome par amplification génique ≪ consensus ≫ et typage par hybridation en milieu liquide sur microplaque

lmmunoanal 0 Elsevier,

Biol Sptk Paris

(1995)

10, 307-311

307

Techniques

au quotidien

Typage des papillomavirus humains g6nitaux : detection du gknome par amplification g6nique G consensus N et typage par hybridation en milieu liquide sur microplaque M Coste-Burel, Laboratoire

de virologie,

V Aubineau-Ferrb,

BM Imbert-Marcille,

CHRU de Nantes, lnstitut de biologie, (Requ le 6 avril 1995 ; accept6

T Bompoil, B Besse, S Billaudel

9, quai Moncousu,

44035 Nantes Cedex, France

le 15 juin 1995)

R&urn6 - Certains types de papillomavirus humains gbnitaux (HPV) sont Btroitement associks au dkveloppement du cancer cervical. Le typage des HPV est actuellement une technique lourde A mettre en ceuvre. Nous avons d&eloppk une mkthode originale associant la recherche du gknome par une PCR consensus et son typage par une hybridation en milieu liquide sur microplaque. Cette technique poss& de des avantages de praticabilit6, reproductibilit6 et rapidit6, tout en conservant une bonne spkcificitk et sensibilitk.

HPVI PCR / hybridation

I automatisation

Summary - HPV DNA typing method: genomic detection with a consensus polymerase chain reaction and DNA typing by a colorimetric microtiter plate hybridization assay. Some WV types are strongly associated with cervical cancer. The HPV DNA typing method is actually a complicated procedure. We developed an original method using a consensus polymerase chain reaction and a calorimetric microtiter plate hybridization assay to automate detection of amplified PCR products. This methodology has a good sensibility and specificity and improve the practicability, reproducibility and rapidity of WV DNA typing assay.

HPV / PCR / hybridization

/ automation

Introduction Durant les 10 dernikres annees, des Etudes cliniques et kpidkmiologiques ont demontrk I’association ktroite de certains types de papillomavirus humains (HPV) gbnitaux avec le cancer du col ut&in [7]. Parmi plus de 70 types caractkisks, 30 ont actuellement kti? retrouvks au niveau du tractus genital feminin [3]. Les HPV16, 11, 42, 43 et 44 sont d(?tect& plus frkquemment dans les l&ions bbnignes (condylomes) ; les HPV31, 33, 35, 51, 52 et 58 sont souvent assock% aux dysplasies leg&es (CIN 1 : cervical intraepithelial neoplasia 1) alors que les HPV16, 18, 45 et 56 prkdominent dans les dysplasies moyennes g s&&es et dans les carcinome in situ (CIN 2 et CIN3) [9]. L’HPVl6, qui est un des types le plus frkquemment isolk dans nos regions, est consid& re comme un facteur de risque d’kvolution vers

une lesion maligne [6]. Actuellement, la recherche des HPV, virus non cultivables, s’oriente vers I’utilisation de la technique d’amplification gknique g I’aide de la polymerase chain reaction (PCR). Les amorces peuvent etre choisies au niveau de regions conservees du gknome (Ll , El, E6 ou E7) afin de rbaliser une PCR dite c( consensus )> [ll]. Le typage fait appel soit & I’utilisation d’amorces permettant I’amplification par PCR d’une sequence spkifique de type, soit & une PCR consensus r&Ge par hybridation spkifique de type sur membrane [lo, 12-141. Le typage est actuellement dans tous les cas une technique trks lourde. L’objectif de cette mise au point Btait de simplifier ce diagnostic en effectuant une seule amplification g&ique consensus suivie d’une hybridation spkifique de certains types en milieu liquide avec r&klation enzymatique et lecture colorimktrique.

308

M Code-Burel

Mat&iels

HPVll

et methodes

HPV6

Pr&vements La recherche de genome HPV est realisee sur des microbiopsies cervicales. Celles-ci sont prelevees au niveau de lesions evocatrices de dysplasie ou de lesions virales lors de I’examen colposcopique.

Extraction

Amplification ete syn-

PCR consensus

- Les amorces Les amorces utilisees (MY09 et MYll) permettent d’amplifier une sequence d’environ 450 paires de bases sit&e dans la region Ll du genome, tres bien conservee chez tous les types d’HPV [lo]. Les amorces ont ete synthetisees a partir des sequences publiees par Bauer [2]. MY09 : 5’GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3’ MY1 1 : S’CGTCCMARRGGAWACTGATC 3’ - La polymerase chain reaction La reaction est realisee sous un volume final de 50 ul. Dans un tube eppendorf de 500 ul sont deposes 2 ul d’ADN extrait, chaque desoxyribonucleotide (dNTP) a la concentration de 200 umol/l, 1 pmol de chaque amorce (MY09 et MYIl), 1,5 mmol/l de mgCI,, 50 mmol/l de KCI et 1,25 unite de Taq DNA polymerase (Pharmacia). Apres addition d’une goutte d’huile minerale afin d’eviter toute evaporation, le tube est place dans I’appareil a PCR (thermal reactor, Hybaid, EtatsUnis). A la suite dune denaturation de 7 min a 94°C succedent 35 cycles comprenant 30 s de denaturation a 94°C 1 min a 52°C pour I’hybridation des amorces et 1 min d’extension a 72°C. Le dernier cycle se termine par une extension finale de 5 min a 72°C. l

PCR type specifique

Six PCR specifiques de type ont ete effect&es parallelement sur les prelevements : HPVll, 16, 18 [14],HPV6 [12], HPV31 et 33 [13]. Les sequences des amorces utiIi&es sont les suivantes : HPV16 HPV18 HPV31 HPV33

A B A B A B A B

5’5’5’5’5’5’5’5’.

TCA CGT ACC CGT ATG GTA ATG GCA

AAA Gl7 l7A CGT GTG G-IT ATA CAC

GCC Cl7 ATG TGG ATG GCA GAT TCC

ACT GAT AAA AGT TAC GGA GAT ATG

GTG GAT AAC CGT ACA CAA GTA CGT

TCC CTG CAC TCC ACA CTG ACG ATC

TG CA GA TG CC AC CC AG

-3’ -3’ -3’ -3’ - 3’ -3’ -3’ -3’

5’5’. 5’5’.

CGC AGA GAT ATA AGT TCT AAG CAA AGA CCA GlT GTG GCA CGT CTA AGA

TGC ATA TG -3’ CAG GCA CA -3’ CAA GAC GTr TAA -3’ TGT C-i7 Gn TAG - 3’

de I’amplification sur membrane

Hybridation

en milieu liquide sur microplaque

specifique de type et de a ete d&rite precedem-

Les sondes

Les hybridations sont realisees avec six sondes specifiques de type dont les sequences, publiees par Bauer [2], figurent ci-dessous : HPV6 HPVl 1 HPV16 HPV18 HPV31 HPV33

S’CATCCGTAACTACATCTKCA S’TCTGTGTCTAAATCTGCTACA 5’CATACACCTCCAGCACCTAA 5’GGATGCTGCACCGGCTGA S’TTGCAAACAGTGATACTACATT 5’AAAAACAGTACCTCCAAAGGA

3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’

Chacune d’entre elles est marquee a la biotine en 3’ suivant le protocole du kit cc 3’ end labelling kit >a (Amersham) a I’aide de ddUTP-biotine (Boehringer).

Hybridation

l

Les amorces et les sondes utilisees ont toutes thetisees sur I’appareil Applied Biosystems.

A B A B

La technique I’hybridation ment [5].

l

La biopsie est traitee selon le protocole suivant : le prelevement est depose dans un tampon de lyse renfermant 05% de SDS (Prolabo Gen-Apex) et 0,l mg/ml de proteinase K (Sigma). Le contact est maintenu une nuit sous agitation et a temperature ambiante. L’ADN est ensuite extrait du lysat par la methode au phenolchloroforme et precipite par l’ethanol absolu en presence d’acetate d’ammonium 3M (Prolabo Gen-Apex). Apres centrifugation, le culot est lave par I’ethanol a 70%, puis s&he et repris dans 50 ul d’eau distillee sterile.

l

et al

et r&k/ation

en microplaque

L’hybridation realisee en microplaque est une adaptation du protocole operatoire de la technique DEIA (DNA enzyme immunoassay) des Laboratoires Sorin au typage des HPV (fig 1). Cent microlitres de sondes specifiques biotinylees diluees dans du TE (Tris 1 OmM, EDTA 1 mM, PH 8) pour une concentration finale de 10 rig/ml sont deposes dans des puits precoates a la streptavidine (Eti-lema, Sorin). Les six sondes sont fixees dans la plaque a raison d’une par rangee de 12 puits ; ceci permet de reveler I’ensemble des types sur la meme microplaque. Celle-ci est ensuite incubee une nuit a +4”C puis lavee quatre fois avec la solution de lavage Sorin sur I’automate Behring Elisa Processor II. Les produits de PCR, ou amplicons, sont denatures par chauffage a 95°C pendant 5 min et deposes dans la microplaque a raison de 5 ul par puits. Deux puits par type d’HPV recherches sont reserves I’un pour le temoin negatif, I’autre pour le temoin positif. Dix echantillons sont done reveles par plaque. Apres une incubation de 1 h a 50°C permettant I’hybridation de la sonde avec le brin d’ADN complementaire, les puits sont laves a I’aide de la solution de lavage du kit. La revelation des hybrides s’effectue ensuite en 2 h 30. Les etapes de la revelation sont les suivantes : incubation 1 h a temperature ambiante avec un anticorps monoclonal de souris anti-double brins d’ADN, puis revelation enzymatique incluant une incubation de 1 h a temperature ambiante avec un anticorps de lapin anti-souris marque a la peroxydase et de 30 min avec un substrat chromogene. Apres arret de la reaction par de I’acide sulfurique IN, I’intensite de la coloration est mesuree a 450 nm sur le lecteur Auto Reader III Ortho.

R6sultats itude l

de la sensibilit6

D&termination

Nous avons colorimetrique.

du cut-off

cherche a definir un seuil de lecture Pour cela, une moyenne (MN)

Typage

Fig 1. Btapes

du test DEIA : (A) sonde biotinylee amplifie denature, (C) incubation avec un anticorps a la peroxydase, (E) reaction chromogenique.

des

papillomavirus

humains

fixee sur la phase anti-double brins

des densites optiques obtenues sur 107 cupules negatives a ete calculee : MN = 0,039 + 0,016 Le seuil a ete fixe arbitrairement, au vu du peu de dispersion des resultats negatifs, a MN + 6 deviations standard, c’est-a-dire 0,135. Nous avons egalement defini une zone grise encadree par le cut-off et la DO de MN + 3 deviations standard (DO = 0,087). Les prelevements dont la DO se situe dans cet intervalle sont control& dans une serie ulterieure et eventuellement trait&s selon la technique classique (PCR specifique de type et hybridation sur membrane). l Comparaison de sensibilit6 avec I’hybridation sur membrane L’evaluation de la sensibilite a ete effect&e a partir d’une gamme des dilutions de raison 5 d’un echantillon positif pour l’HPV31. La PCR specifique de type, dont la sensibilite a deja ete determinee par ailleurs [5], a permis de detecter le genome jusqu’a la dilution de 4.10m2. L’hybridation sur membrane ameliore 25 fois (1,6.1 OA3) cette sensibilite.

309

genitaux

solide coatee & la streptavidine, (B) hybridation avec I’ADN d’ADN, (D) incubation avec un anticorps anti-souris marque

Les densites optiques mesurees apt-es PCR consensus et hybridation en plaque sont au-dessus du cut-off jusqu’a la dilution de 8.1 Om3. Etude de la spkificite Des ADN d’HPV6, 11, 16, 18, 31 et 33 ont ete hybrid& avec les sondes specifiques de chaque HPV selon la technique en microplaque. Les DO obtenues figurent dans le tableau I. ivaluation de la technique de r&elation plaque sur une s&ie d’&hantillons

en

Nous rappot-tons ici I’analyse de 15 echantillons (tableau II). La revelation des produits de PCR issus de ces prelevements a ete effect&e selon les deux techniques de revelation (hybridation en microplaque et sur membrane). Cinq echantillons ne revelent pas la presence d’HPV ; sur les dix autres, I’hybridation en plaque a permis de diagnostiquer six HPVl6, un HPVll, un HPV6 et deux HPV31. Ce typage a ete confirme par des PCR specifiques de type.

310

M Coste-Bureletal

L’electrophorese sur gel de polyacrylamide des produits de la PCR consensus a revele pour I’echantillon no2 une bande specifique des HPV ; ce papillomavirus n’a pu etre ulterieurement type et a ete appele HPV X.

specificite des sondes utilisees. La sensibilite de notre technique, &al&e parallelement a la PCR specifique de type et a I’hybridation sur membrane, a montre un gain par rapport a la revelation sur gel mais un leger deficit vis-a-vis de l’hybridation sur membrane. La methode originale que nous proposons presente par ailleurs differents avantages. Tout d’abord dans le domaine de la securite, I’utilisation d’un seul produit d’amplification permet d’eviter les nombreuses PCR specifiques de type et limite les problemes de contamination lies aux amplicons. En ce qui concerne la praticabilite, I’hybridation en milieu liquide sur microplaque permet non seulement de s’affranchir des nombreuses manipulations liees a la revelation sur membrane, mais egalement de raccourcir le temps de revelation qui passe de 24 h avec I’hybridation sur membrane a 4 h 30 en microplaque. Enfin, I’exploitation des resultats est facilitee, d’une part, par la bonne reproductibilite de cette technique a laquelle contribue I’automatisation des differentes etapes sur un automate d’immuno-enzymologie et, d’autre part, par la possibilite d’archiver les densites optiques obtenues pour chaque plaque. Un kit existe actuellement sur le marche incluant les reactifs pour I’amplification et la revelation des produits de PCR des HPV genitaux par

Discussion La presence de cet-tains types d’HPV au niveau genital est maintenant reconnue comme le facteur de risque majeur d’evolution vers un cancer du col uterin. Dans ce contexte, les laboratoires de virologie ont dir developper des techniques non seulement de recherche des HPV dans les prelevements cervicaux mais egalement de typage. La methodologie classique de diagnostic associe des PCR consensus et/au specifiques de type, suivies de revelation par hybridation sur membrane. Ces techniques sont lourdes a mettre en ceuvre. L’utilisation de sonde froide lors de I’etape d’hybridation avait deja contribue A la simplification de la technique [l]. Notre objectif dans cette etude etait d’alleger encore le protocole du typage des HPV avec pour souci de preserver une specificite et une sensibilite identiques a la technique classique. Les resultats des hybridations croisees realisees a pat-tir de prelevements positifs pour differents types d’HPV ont confirme la

Tableau I. &&ation

de la sp&%icit~ de I’hybridation

liquide sur microplaque. sondes HP v33

HPv6

HPVl

HPV6

1,125

0,028

0,041

0,037

0,023

0305

HPVI 1

0,058

1,042

0,078

O,Q37

0,032

0,035

HPVlG

0,043

0,023

1,525

0,046

0,027

0,043

HPV18

0,024

0,025

0,054

1,547

0,027

0,038

HW31

0,125

0,031

0,029

0.073

1,487

0,04

HP!!33

0,025

0,058

0,027

-- 0,034

0,028

1,23

Tableau II. Densit& pour 15 &chantillons.

7

#WV1 8

ADN

HPv76

optiques obtenues apr&s PCR consensus et

en milfeu liquide sur microplaque

=..

1

2

3

4

5

WV8

0.025

0,046

0$41

0,046

HPVtl

ND

0,(x

ND

HPV16

OASS

0,044

HWl8

w@6

tPv3f HPV33 ND:nondbmin&

m6 spkifiques

&hanMo&

Sot-&s spilc~ues

tiPV37

6

7

8

0,061

0,054

0,075

0,043

0,043

0,044

o,tMt

L&26

41pr

0,038

0,061

0,036

u&5

0,s

0,044

1,61

‘3,@8

0,043

0,036

O,W?

o,o+z

9

10

11

12

13

14

15

o,a32

u,w

0.03

0,03t

0,03

0,024

I,24

0,035

0,039

O,O?k?

0,03

0,029

0,033

0,033

0#9e

0,03

0,036

$75

1P

w@

:%+#a

0,034

o*oB

0,042

0384

0,033

191

0,047

0,046

o,Lw

0,032

op27

f&a31

0,035

#,W

0,031

0,027

0,03

0,028

tub36

a,039

w32

0,032

0,028

0,089

0,036

w43

0,042

0,036

0,u.s

'I'>

: B&32

0,m ~~~

Typage

des

papillomavirus

chimiluminescence (hybrid capture system HPVDNA, Murex) [8] ; ce kit permet la classification de I’HPV mis en evidence dans le groupe a haut risque ou a bas risque. L’utilisation de ce kit commercial majore bien sQr le cot3 du test et, si un typage imprecis peut Btre suffisant pour le clinicien, il n’est pas satisfaisant dans les etudes epidemiologiques. De plus, notre methode n’est pas limitative quant au nombre de sondes utilisees et permet grace a I’utilisation d’une PCR consensus de mettre en evidence la presence d’HPV non typable. En conclusion, la technique d’hybridation en milieu liquide sur microplaque des produits d’amplification dune PCR consensus a repondu aux objectifs que nous nous etions fixes, a savoir, une simplification de ce diagnostic tout en conservant une sensibilite et une specificite equivalentes aux methodes classiques.

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