Sous-typage lymphocytaire en cas de rhume des foins : hypersensibilité asymptomatique, étude du lavage bronchoalvéolaire (LBA) et du sang

: ous-typage lymphocytaire en cas de rhumedes foins: hypersensibilit6asymptomatique,6tude du lavage bronchoalv6olaire(LBA)et du sang J. D O M A G A L A - K U L A W I K *, D. B R Z O S T E K *, R. K R E N K E G. H O S E R **, J. K A W I A K **e t W. D R O S Z C Z *

*,

RF:SUM(:

SUMMARY

Les auteurs rapportent le sous-typage lyrnphocytaire du liquide bronchoalv~olaire (LBA) et du sang par la cytom6trie en flux chez des rnalades souffrant de rhume des foins, pendant la saison pollinique. Les anticorps rnonoclonaux anti-CD3, CD4, CDS, CD16, CD19, CD25, CD45, CD56 et HLA-DR ~taient utilis6s. Les auteurs ont trouv6 une diminution du pourcentage des lymphocytes CD4 et du rapport CD4/CD8 dans le LBA et dans le sang des rnalades en cornparaison avec les t6rnoins. Le pourcentage des autres sous-types de lyrnphocytes n'6tait pas rnodifi&

We have examined the lyrnphocytes phenotype in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and peripheral blood (PB) in the patients with allergic rhinitis during pollenic season.

For the analysis of lymphocyte subsets by flow cytornetry the following monoclonal antibodies were used : CD3, CD4, CDS, CD16, CD19, CD25, CD45, CD56 and HLADR. We have found decreased proportion of CD4+ lyrnphocytes and decrease CD4 to CD8 ratio in the BALF and PB from patients when compared with healthy persons. The other lymphocyte subsets did not differ when compared these groups.

MOTS-CLES

KEY-WORDS

rhurne des loins - lavage bronchoalv6olaire - sous-typage lymphocytaire - cytom~trie en flux.

allergic rhinitis - bronchoalveolar lavage - lymphocyte subsets - flow cytornetry.

Introduction L'asthme et le rhume des foins sont des maladies tr~s populaires dans notre pays. On sait que, pendant la saison pollinique, l'hyperr6activit6 bronchique est augment6e chez les malades souffrant de rhume des foins. Elle est diminu6e ou absente pendant les autres saisons. Le m6canisme de la r6action d'hypersensibi° lit6 bronchique au cours du rhume des foins n'est pas connu. Nombre de jeunes malades souffrant de rhume des foins pr6sentent des sympt6mes d'asthme ato° pique apr/~s quelques ann6es. Nous nous demandons si une hypersensibilit6 asymp° tomatique bronchique au cours du rhume des foins r6sulte de la m~me r6action immunologique, allergique et (ou) inflammatoire, si6geant au niveau des voies respiratoires distales, que chez les patients asthmatiques. Revuefrangaise des laboratoires, janvier 1996, N ° 281

Darts notre travail, nous analysons le liquide de lavage bronchoalv6olaire (LBA) et le sang des malades pr6sentant des r6actions d'hyperr6activit6 bronchique positive et des sympt6mes de rhinite et de conjonctivite allergique. Nous pr6sentons les r6sultats des examens cytoloo giques du LBA et du sous-typage lymphocytaire du L B A et du sang.

* Klinika pneumonologii-Akademii Medycznej - Warszawa. *~Zaklad cytologii klinicznej - C.M.K.P.-Warszawa. TIR~S A PART : Mine le Dr J. DOMAGALA-KULA WIK Klinika pneumonologii UI. Banacha la VARSOVIE 02 0 9 7 - Pologne

article regu le 18 octobre, accept6 le 7 novembre 1994. 37

TABLEAU I A n t i c o r p s m o n o c l o n a u x utilis~s p o u r le s o u s - t y p a g e l y m p h o c y t a i r e du LBA

A. B. C. D. E. F. G.

CD45 IgG1 CD3 CD4 CD3 CD3 CD25

(FITC) / (FITC) / (FITC) / (FITC) / (FITC) / (FITC) / (FITC)

I. Mat4riel et m4thodes Nous avons examin6 cinq hommes non fumeurs d'Sge moyen 20,4 ans (18 & 25) souffrant de rhume des foins, sans sympt6mes d'asthme, lls ont subi les examens fonctionnels respiratoires et les tests d'hyperr6activit6 bronchique avec histamine : PC 20 H (la dose d'histamine apr6s laquelle les 6preuves fonctionnelles sont abaiss6es ~ 20 pour cent) (7). lls n'ont pas 6t~ trait6s pendant 7 jours avant les examens. Nous avons examin6 cinq adultes non fumeurs : trois femmes et deux h o m m e s d'Sge moyen 32 ans, comme t6moins. Le LBA 6tait effectu6 chez des patients pr6m6diqu6s au cours d'une bronchofibroscopie (17, 19). Nous avons lay6 le lobe moyen avec 200 ml de NaC1 h 0,9 % ~ 37 °C. Le liquide 6tait pr6par6 le plus rite possible selon les r6gles (11). Apr6s une filtration sur gaze st4rile et mesure du volume, le liquide 6tait centrifug6 (1 000 g / 1 0 rain). Le culot cellulaire 6tait remis en suspension dans 300 lal de PBS. Nous avons color6 les lames par le Bleu Trypan pour comptage de la celtularit6 et de la viabilit6 et par le May-Grtinwald-Giemsa pour examen cytologique et comptage des 616ments cellulaires. Le sous-typage lymphocytaire 6tait r4alis4 par cytom6trie en flux. 50 lal de suspension cellulaire 6talent mis en contact avec 6 lal d'anticorps monoclonal anti CD3, CD 4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD45, CD56 et HLA-DR conjugu6s ~ u n fluorochrome : fluoresc6ine (FITC) ou phyco6rythrine (PE) (Becton-Dickinson et Dako) (tableau I). Apr~s 30 min d'incubation & 4 °C ~ ['obscurit6, les cellules 4taient trait6es par 1 ml d'une solution commerciale (Lysing Solution, BectonDickinson), lav6es deux fois avec le PBS et mises en suspension dans 300 gl de PBS & 0,5 % dans du formald6hyde. Le sang frais 6tait pr4par6 de la m~me mani~re /~ temp6rature ambiante. Nous avons analys6 les pr616vements sur le cytom6tre FACStrac (Becton-Dickinson) avant 24 heures (figures 1, 2 et 3). Au moins 8 000 cellules de chaque pr616vement ont 4t4 analys6es (10).

CD14 (PE) IgG2a (PE) - t6moin CD19 (PE) CD8 (PE) HLA-DR (PE) CD16+CD56 (PE)

A ~ F : Becton-Dickinson

G : Dako T A B L E A U II LBA de malades souffrant de rhume des foins

B.T. (18)

2,8

2

85

1

K.K. (22)

5

0

86

1

W.P. (26)

2,7

0

40

1

R.P. (18)

3,5

1

70

1

J.G. (18)

17,4

0

87

2

T A B L E A U II! LBA des adultes non fumeurs

S.T. (35)

5,8

B.D. (32)

2,1

0

69

1

J.D. (38)

3,1

0

70

2

B.K. (26)

6,5

0

79

1

c.J. (3o)

3,6

79

2. R4sultats Tous les examens fonctionnels respiratoires 6talent normaux. Les r6actions d'hypersensibilit6 bronchique 6talent inten-

80

T A B L E A U IV Sous-typage lymphocytaire du LBA des malades souffrant de rhume des foins

B.T. (18)

37

45

0,82

0,43

0,53

4

5

0

K.K. (22)

22

65

0,34

0,25

0,75

5

3

1

W.P. (18)

18

17

1,06

0,45

0,42

8

3

0

R.P. (18)

28

45

0,62

0,4

0,64

6

2

0

J.G. (18)

36

42

0,86

0,41

0,48

12

8

4

3

2

TABLEAU V Sous-typage lymphocytaire du LBA des adultes non fumeurs

B.D. (32)

49

12

0,71

0,17

14

J.D. (38)

31

30

1,1

0,44

0,42

8

2

B.K. (26)

63

23

2,7

0,8

0,29

18

3

2

C.J. (30)

58

22

2,6

0,72

0,27

12

4

0

NK : natural killer (CD16/CD5~ - T : lymphocytes T - HLA-DR/CD3 : cellules activ6es (lymphocytes) 38

Revue frangaise des laboratoires, janvier 1996, N ° 281

TABLEAU V I Sous-typage lymphocytaire du sang des malades souffrant de rhume des foins

B.T. (18)

57

14

27

37

0,73

0,47

0,65

5

19

0

K.K. (22)

65

12

23

39

0,59

0,35

0,6

2

7

1

W.P. (26)

48

15

26

33

0,79

0,54

0,7

4

32

0

R.P. (18)

63

15

29

36

0,81

0,46

0,6

3

18

1

J.G. (18)

51

14

28

41

0,68

0,54

0,8

23

21

0

T : lymphocytes T B : lymphocytes B

NK : natural killer (CDI6/CD56) HLA-DR/CD3 : cellules activ~es (lymphocytes)

sifi&es : la PC 20 H ~tait 0,19 mg/ml (0,08 & 0,22)• La cellularit~ du LBA n'~tait pas modifi~e. Nous n'avons pas trouv~ d'augmentation des polynucl~aires ~osinophiles ni de modifications du nombre des lymphocytes (tableaux II et III). A ]'analyse ph~notypique lymphocytaire, nous avons trouv& une diminution du pourcentage des CD4 et du rapport C D 4 / C D 8 dans le liquide bronchoalv~olaire (tableaux IV et V) et dans le sang des malades (tableau VI). Nous n'avons pas remarqu& de modification du pourcentage des cellules NK, HLA-DR ni des lymphocytes activ~s par l'interleukine 2 (CD25).

FIGURE 1 Analyse cytom6trique du LBA : CD4/CD8

A malade =I

B t&moin

c:tpclysys~,10693c00.4

=I

I '~

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3. Discussion Pour expliquer le m~canisme de l'hypersensibilit~ bronchique, on recherche classiquement les modifications des biopsies bronchiques (18, 20, 21) et du LBA (26). De nouvelles techniques cytologiques (2, 6, 10) sont ~ present utilis~es dans l'~tude des r~actions immunologiques au niveau des voies respiratoires distales au cours de l'asthme (15, 22). L'examen du LBA permet d'~valuer la gravit~ de la maladie (24), en particulier la r@onse aux glucocortico'fdes et la sensibilit& aux allerg~nes (1, 13, 14, 24). On a observ~ dans le LBA de patients souffrant d'asthme s~v~re que le pourcentage des lymphocytes ~tait normal (9) ou augment& (5). II y a plus de lymphocytes CD4 (3, 23) et de lymphocytes activ~s ayant le r~cepteur pour la chaine 13 de l'interleukine 2 (CD25) (8, 24). On sait aussi que, apr&s provocation allerg~nique chez les malades asthmatiques, le nombre de cellules CD4 dans le sang est diminu~ (8, 12). L'importance clinique de cette modification n'est pas vraiment claire (4, 12, 25). F.tant donn~ que le rhume des foins est un bon exemple de r~action allergique pulmonaire, on a examin~ le LBA apr&s instillation d'allerg&ne dans les bronches et on a not~ la m@me r~action que dans l'asthme (25, 27). Nous avons aussi remarqu& la diminution des cellules CD4 dans le sang et le liquide bronchoalv+olaire, mais sans modification des autres soustypes lymphocytaires. L'hyperr+activit~ bronchique non spGcifique est peut-+tre plus complexe, d+pendant d'une part de la r+action inflammatoire des voies respiratoires, d'autre part du rOlexe naso-bronchique (28).

~.~o ..... fi, ..... ~ z ..... :(03 ..... FLlX.Leu

B4

FLI~Leu

3-->

3-->

FIGURE 2 Analyse cytom6trique du LBA : lymphocytes T ( C D 3 ) et lymphocytes B ( C D 1 9 )

A malade

B t&moin

c:S,pclysys~,10693c00.3

=I

I?

cS,pclysys~,31193003.

= I

i

1

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FIGURE 3 Analyse cytom~trique du LBA : H L A - D R / C D 3

A : malade -~-F

B

c:~,pclysys~l 0693c00.5

• ...,¢// . ..,.~-.' :,-.,a,

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I ~"

t&moin

I

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Conclusion L'analyse du L B A et du sang p a r la c y t o m ~ t r i e en flux montre une d i m i n u t i o n du p o u r c e n t a g e des cellules C D 4 et du r a p p o r t C D 4 / C D 8 chez les m a l a d e s souffrant de r h u m e des foins avec hypersensibilit~ b r o n chique positive p e n d a n t la saison pollinique. Revue franqaise des laboratoires, janvier 1996, N ° 281

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REMERCIEMENTS Les auteurs rernercient M m e le Dr C. M A R S A N qui a accept~ de revoir la traduction fran¢aise de ce travail, faite par M m e le Dr J. D O M A G A L A - K U L A W I K . 39

i.

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Revue frangaisedes laboratoires, janvier 1996, N° 281