Analyse qualitative et quantitative des 17-oxosteroides et des 20-hydroxy-21-desoxysteroides urinaires par chromatographie gaz-liquide et par spectrometrie de masse

Clinica Chimica Acta, 52 (1974) 381-405 0 Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

391

CCA 5680*

ANALYSE ET PAR DE

DES

QUALITATIVE

ET

QUANTITATIVE

DES

zo-HYDROXY-21-DESOXYSTEROIDES

CHROMATOGRAPHIE

URINAIRES

GAZ-LIQUIDE

ET

PAR

SPECTROMETRIE

MASSE

J. DESGRES,

R. J. BEGUE

avec la collaboration

ET I’.

PADIEU

technique de JI. I\lORINIERE

ET N. B0ILLEREAU

Lnbovatoive de Biochimie M~dicalr de la Faculte’ de Me’decim, nelle en Chimie Biologique, Centve Hospitalirv Univevsitaire, (Rep

17-OXOSTEROIDES

et Labovatoive d’E‘x@ovation 21 Dijon (Francp)

Foxction-

le 25 janvier 1973)

SUMMARY

To perform precise endocrinian functional assays, we have tried to set up an analytical method of r7-oxosteroids (17-0s) and zo-hydroxy-zr-desoxysteroids from urine by gas-liquid chromatography (GLC). Th ese steroids have been chosen for their interest in clinical chemistry with the aim to do an assay fulfilling the best qualitative and quantitative performance while remaining relevant to the daily requirement of a clinical laboratory. This study has been made possible because we have the use of a mass spectrometer coupled to GLC (GLC-MS) which allowed us to identify each chromatographic peak, especially androsterone, I@-hydroxy-androsterone, II~hydroxy-etiocholanolone, pregnandiol-ao/3, pregnandiol-zoa, pregnanetriol-zo/3 and pregnanetriol-zocc. We have particularly studied a fast procedure leading to the complete formation of stable trimethylsilyl derivatives. We have also looked for the best conditions for separation and identification of these 12 catabolites through the variation of the analytical parameters (isotherm, temperature programmation, carrier gas flow, etc.. .) and by using different liquid phases (OV-I, OV-17, SE-60, Dexil-300). Finally, we have kept the two liquid phases OV-I and OV-17, which are compatible with the working temperatures and complementary by their separating pattern. The application to biological specimens has been verified by the use of GLC-MS.

INTRODUCTION

L’intCr&t du dosage specifique des r7-oxosteroides urinaires majeurs par chromatographie gaz-liquide a 6tC maintes fois soulign~2~s~13~1a~1s~20, ne serait ce que pour des investigations endocriniennes minutieuses. La pluralit& des travaux publies a ce sujet, souligne la complexite de telles analyses, et trop souvent, les methodes d&rites sont, soit d’application delicate en biologie clinique, soit trop limit6 de par le nombre *Previously

published without figures in Clin. Chin

Acta. 46 (1973)

277-296

382

de ni&holites CtudiCs. Par ailleurs, un certain nombre d’entre elles, aussi satisfaisantes soient-elks sur un plan rigoureusement analytique, ne peuvent de par leur manque de rigueur quantitative Gtre utilisPes en milieu liospitalier. Cette etude analytique est d’autant plus nckessaire que les IT-osostkoides urinaircs ant une origine mixte (corticosurrkkales et gonades), sauf en ce qui concerne celie du suifate de dolt?-tlroPpiandrost~rone que 1’011peut considCrer comme Ctant unitluemcnt d’originc c(~rti~~)surr~nalienn~. I1 est done itvident que c’est l’&ude s&-if% dcs rr-dhosyet des rI-ox?--r7-oSost~ro’idcs, qui r&l&e au mieux le potenticl stdroi’tlierl tlans SW &tails, cctte Ctude de\vant pouvoir B notre a\:is,. s’effectuer avec un !~la~it~l~~ll~de prckision, tout en restant compatible avec les exigences de ‘ia biologic clinique. l+Mn, il nous a scmbl4 sbduisant d’associcr 3 une analyse des ry-osost&oi’des celle dcs zo-llvtlroxv-2r-cl~sosyst~ro’ides importants en biolngie clinique : les priignandials et les pr6gnanctriols en particulier 4,1x. Cette Ctudc a pu Ptrc envisagfh car nous disposons tlu couplage cllr~)rnato~ra~~~~~e gaz--litluitle-speftmmetrie de masse, appareillagc qui nous a permis d’identifier avec certitude chaque pit chromatographique et par lj-mhc, d’asseoir l’aspect quantitatif de chaque mCtabolite urinaire &udi6 indi\~iclucllemeIlt, avec un maximum de rigueur’“.

:7”-“I_I!D~h~dro~~~iandrostCrone (acthit sp&%que: 15.9 Ci/mmole) provenant de I~a~~iocl~c~~~icalCentre Amersham, Buck~n~l~auls~~ir~, Angleterre. _%xlrost&-one, ~tiocholarrolone, tfChydro~piandrostCrone, II-oxoandrost~rone, II-o.\;o@tiocliolanolone, IIB-hydro.u~axlclrost~r~~ne, IxB-I~ydros~Ctiocl~olan~lo~~~, prCgnanolonc, zap-pr@gnandiol, aoa-pr+gxtndiol, zo@-prkgnanetriol, et zoa-prQnanetriol, provenant de lkaplrarm (Ramat-Gan, IsraSl). cristallisable pour analyse, Ctltanol absdlu pour analyse, 2 . Sol~w~fs.- Benz& &her di~tl~~~i~ue pour analyse, cl~~orof~~rllle pour analyse, t&he solvant pour des mesures de scintillations, proviennent des laboratoires Merck, Darmstadt, Allemagne. cles colonnes), le trimPtliylchloro3. RI:nciifs. Le silyl 8 (pour la silanisation silane (TMCS) et le S,O-bis(trimCtl~ylsilylj-trifluoro-ac~tat~li~le (BSTFA), proviennent de Pierce Chemical Co., Kockford, Minois.

Tampon atide acPtique, a&ate de sodium, o,x 11, yH 5.20. Sue dig&if d’HP/ix ~0~~2~~~~(SHE’) et Mlicase (Industrie biolo~i~~u~ franqaise, 35 quai tiu Moulin de Cage, 92 Genevilliers), en solution h 10000 U/ml dans le tampon pH 5.20. Solution d’acPtate de baryum (Ncrck pour analyse) h z~Y; dans clc l’eau distillPe.

383

5. A &Y~,s iwoduits: r,4-his-z-(4 meth\-1-j-phCnyloxazolyl)-benzene (dimethyl POPOP) et le 2,5-diphenyloxazole (PPO) proviennent de Packard Instrument Company, Inc., 335 rue Broussais, Paris. Le support utilise est le Supclcoport (100-120 mesh) impregne de la phase choisie au taus de I?~. Oi:-I, OV-17, SE-Go, DEXIL-300, proviennent de Supelco, Bellefonte, Pa.

La radioactiv,ite

des steroi’des

marques

est m&wee

avec un Packard

Tri-Carb

a

scintillation liquicle (modele 33So) en melangeant une aliquote de la solution a mesurer a 14 ml d’une solution scintillante. Celle-ci est obtenue en dissolvant 5.5 g de 2,5diphenyloxazole (PPO) et 1.5 g de r,4-bis-2(4-mCthyl-~-pl~en~loxazolyl) benzene (dimethyl POPOP par litre du melange Triton X roe-toluene, I :2 (v/v). L’addition de Triton S IOO, permet d’obtenir la solubilisation des solutions aqueuses, et dans ces conditions les rendements de comptage sont compris entre 23 et 33% selon l’echantillon analyse. Le chromatographe utilise est un Research Gas Chromatograph, type Becker 420 (Becker Delft N.V., Vulcanusweg 259, postbus 519, Delft, Holland) a deux dCte
etc.). Des traces chromatographiques sunt obtenus, pour chacunc des deux colonnes, sur un cnregistreur potentiometrique Servotrace (Sefram, 74 rue de la Liberation, Paris). La vitesse de deroulement du papier est de 5 mm/min. L’azote est utilise comme gaz vecteur a un debit de 30 ml/min. Les autres parametres chromatographiques seront decrits dans le chapitre MBTHODES. Les spectres de masse des steroi’des etudies ont &A obtenus sur un spectromCtre de masse couple a un chromatographe phase gazeuse, type LKB 9000, dans les

384

n~?mcs conditions cliromatogral~l~iclues. Les tvnip~raturcs du s+aratcur ct de la source sent respwtivement fish ?t 280" et 300’. Id’&nergic des blectrons est de 70 e\. et lc cow-ant d’ionisaticm dc 00 inicro-amph-cs. .llCthotli~s c~.~~C~iilzc~~ifffl~~s 1 I’rillcipc ado/d ,hour I’(rllnl~*sc~yztnlitdiw ct qlicllltittltiw @v GIX. L’analyse clualitati\re coninie l’analyse quantitative 5‘+fectue L sur des solutions de st&odes connues et pr$ai-ks de la faqon suivantc: une solution dtl~anolique B 100 peg/nil est prfJlxu+e pour cliacun des sthokles hdik. Ikms un tube k vis de 15 ml, on lx+trc un m&tnge contenant I ml de c~l~acunc tlw solutions mhs pr&xYentes auqucl on njoutc 0.1 ml d’une solution B I mg/ml d’~picol)i-ostanol this la pyridinc. Ce tlernier sttkoltle sert d’ktalon interne pour l’anal!-w cluantitative. Le mklange final cst dvaporf? ?I set sous azotc B 50’. La r&c-tion tic silylation lout Ptre ah-s cffectde sur le rdsidu set don deux procdd& tliff~rcnts, l’un rapiclc, l’aurrc plus long: -~ dans le premier cas, le rc’sidu set cd rep-is par 20 pl de cliloroforme, I0 pl de ‘IXCS et 70 1~1de BSTITA. La solution finale est his&e 45 min A 60” puis immkliatemcnt c~l~rtrmato~ral~lli~e. I’our unc conwrvation des solutions pendant plusicurs jours, voir plusicurs mois, il est ndccssairc d’hxporer k nouveau k set sous courant d’azotc et de rt~lxendrc lc r&idue par 20 pl de chloroforme ct So pl de BS7‘1;A. ~~ this Its clcusihc cas, lc rkitlu xc cst rcpris par ce dcrnicr nidangc citk (20 ,uI dc cldoroformc~ et 80 pl dc BS’l‘FA) ct pour oldenir une rc’action de silylation ccmlpl?te, le m@lange final doil he hissi: au mains S 11 ii OoO avant d’irtre cliromatograpliie. hns ces conditions, cn l’absence clc TAICS, les ckivds silylhs se conservent lxdait~mcnt bien. lwne rt,clivrclle tics conditions ol~tiniales dc sf$aration, d’identification et de quantification tics I2 catabolites retcnus, a &tfA effectuke sur tliff&entcs phases (XI-00, I>lXII,-300, O\‘-17, O\‘-I) en faisant varier les pram&-es anal!Tiques (isothermc, prograniiii”tioii de tcmpdrature, etc.). I~inalenient, il nous cst apparu qu’cn 1”“~rainnnatioli de teiuphture seules ()\.-I ct (>\‘-I7 hnknt k la fois conipatihlcs aus tcniph-atures de travail requises, et colnl)l~incntaircs par leur fra~tioiiilciiielit. L’anal!-se ~lirornatogral~l~ique s’effectue chnc don lcs niodalit~s suivantes : tcm1xkttu.r~ de la cliamhc tl’injcction : ,255‘ ~~~temlxhturc ties ti&cteurs 27 j" ~- tlbbits respectifs de l’air ct de l’li\-drogL’ne : 2 j0 et 2 j mlhiin. - 1)roprammation de tcmpdrature tic IS0 A 240” ?i I.z”,‘min. I i 2 ~1 de cl~acluc dcliantillon solit iiijcctcs sur cliacune des 2 colonnes. Sous avow retenu pour l’analyse qualitative par cliromatograpliie gazpliquide tie c-1:ncun tics sthidcs btudik, leur valcur en unitP ni~tlrylhe (UiU)l*. Cliaqut~ sth-oi’dc de r~fkcncc est done affect6 de 2 dews en CRI, selon la phase liquicle clioisic, et leur rcproductibilitt: autorise une anal>-se qualitative satisfaisante ties stCroldcs provenant dc> milieus l~iologiques. Cependant, l’irlentificntion rigourtwse des protluits cl~romatograplii~s a tltC ohtcnue vii compar~ant Its spcctrcs tic masse des sthoidcs de rrifh-ence avec ceux obtenus hi-s de l’analysc tlrs ~cllantillons I~iologiqucs. Cette &de permet irgalement de connaitrc avcc certitude la nature dcs d&iv& volatils form&.

385

L’analyse s’effectuant en programmation de temperature, nous avons mesure la hauteur des pits chromatographiquesl pour etablir la courbe d’etalonnage des steroi’des Ctudies. Cependant, afin d’eviter toute erreur extrinseque, nous y avons associe la methode de standardisation interne, en utilisant l’epicoprostanol comme &talon. L’exploitation quantitative des traces chromatographiques obtenus s’effectue en mesurant la hauteur de chacun des pits. Le rapport: hauteur de l’etalon interne/ hauteur du steroide standard definit le coefficient de reponse (CR) de chaque produit. 2’ Pkfiaratiolt des extraits un’lzaivcs (hydrolyse, extraction, formation des derives volatils). Elle s’effectue sur une aliquote de la totalite des urines de 24 11, recueillies sur antiseptique (2 ml d’acide mercurothiosalicylique) et eventuellement conservees en chambre froide A -zoo. I1 est pratique sur chaque urine, les dosages systematiques : - de la creatinine selon la m&ode de Folin. - des r7-oxosteroides selon la technique de Zimmerman. L’hydrolyse des steroi’des conjugues a et& obtenue selon deux m&odes: l’une chimique, l’autre enzymatique. (a) La @renzikre, d&rite ci-dessous, realise une hydrolvse acide avec extraction concomitante au benzene selon une variante du procedk de Dingemansse’s8. Au vingtieme de la diurese des 24 h (I’) sont ajoutes V/IO ml d’HC1 8 -\-, et V ml de benzene. On laisse bouillir B reflux du solvant pendant 2 11.Apres refroidissement, on recueille la phase benzenique, puis la phase aqueuse est a nouveau extraite par le meme volume de benzene pendant 30 min. Les phases benzeniques reunies sont lavees deux fois avec I/IO (en volume) de SaOH S, puis a l’eau distillee, jusqu’a neutralite des eaux de lavage. La phase benzenique est ensuite sechee sur du sulfate de sodium anhyclre, puis evaporee a set, a environ 40’ sous pression reduite. Le residu set est repros 3 fois par 5 ml d’ethanol absolu. La solution obtenue Q laquelle sont ajoutes IOO ,~g d’etalon interne en solution dans la pyridine, est transferee dans un tube a vis, pour etre evapork a set sous courant d’azote a 40’. On pro&de, sur le residu set, a la formation des derives \.olatils selon la methodologie d&rite. (6) L’l~~~~vol_ysc emymatiguc. Divers echantillons urinaires ont ete soumis a l’hydrolyse enzymatique directe, et exclusive, selon la methode de Jarrigelj en utilisant le SHP (hvdrolyse enzymatique classique), et en procedant comme suit: - Le 1j20° de la diurese des 24 h (c/20) est ajuste a pH 5.20 avec de l’acide acetique a 2oq4. On ajoute I/IO en volume de tampon acetate de sodium 0.1 AI, acide acetique, pH 5.20, et 3000 unites/ml de P-glycuronidase (SHP). - Le melange est laiss& a 37’ pendant au moins 24 h au bain-marie agitant. Apres avoir ajoute de 2 & 4 g de NaCl, selon le volume urinaire initial, les steroi’des libres et les steroi’des lib&% par hydrolyse sont extraits 2 fois (respectivement pendant 60 et 30 min) par un egal volume de benzene. La suite de la manipulation est strictement identique a celle d&rite pour la methode d’hydrolyse chimique. (c) A.fl?zenzeut de la mftthode (e’tud~ des pamnzktr&). Les resultats nous ont conduits a essayer d’obtenir des rendements maxima d’hydrolyse d’une part, et d’extraction d’autre part,‘tout en conservant une duree globale d’analyse compatible avec les exigences routinieres. Dans ce but, il Ctait indispensable:

386

12s distances dc rt’tention rappxt6es au tCtraCicosanc (dr$h+), et les valeurs en L-31 dc clra~un dcs stdru’ides &udi& sent rapport&es clans le Tableau II. Ce tableau fait apparaitrc que sur la phase liquide SE-Go, les Ix-oxodtiochlanolone, lx+F;nanetriol, et 4picoprostano1, ne sent pas st’park. De mhe, la valeur en c,1I clu zos-pegnandiol varie en fonction tlu vieillisernerit de la colonne. D’autre part, sur la phase apolaire Desil-300, la sCparation entre fr-osoandrosterune, pregnauolonc, I I-oso~tiocllolxnolone et pregnandiol, est insufisante Iorsqu’on s’adresse A de5 estraits lklogiques. Enfin. 1wu5 rcmariluons que les fractionnements obtenus sur les &us phases rctcnuei; tl’OY-I et tl’O\‘-17 sont CoI~lpl~~l~entaires. En effet, sur 017-17, si les dew, 11-0x0, IF-c)xostPr&le~ ne sent pas s&w&5, ils sent prfaitement recomius sur OY-1. DC inhe, la 1 I~-h~ilrox~rirtiocholanolone et la pregnnnolone confondues sur OV-1 sent dosables sur Ok*-17 (l+kigs. I et 2). Ces r&sult& espliquent notre clioix pour to&es Ies analyses ceci d’autant que lcs dosu~cs obtenus pour la plupart des mPtabolites &udihs se trouvent confirm& sur dcus colo~mcs tliffkrntes ct physiquement compatibles.

387

Fig. 1. Separation par chromatographie gaz-liquide d’une solution 2 1 standards sous forme d’bthers de trimethylsilyls, sur une phase d’OV-1. metabolites correspondants 5 chacun des numeros sont donnes dans le conditions experimentales sont celles d&rites dans le chapitre Materiel

fig//Ade steroides Les noms des Tableau I. Les et Methodes.

Fig. 2, Separation par ebromatographie gaz-liquide d’une solution i I @g/j& de steroi’des standards sous forme d’ethers de trim&thylsilyls, sur une phase d’UV-17. La comparaison avec le trace chromatographique reproduit dans la Fig. 1 affirme la bonne complementarite de ces deux phases.

388

2 5 .j .5

54

l_j.C)S

GO

2_l.b2

LO.27 26.S6

;”

Lj

27.16 27.4s 27.S.j 27.6s 2s 29.55

30.89

24.45

91 93 I1.j I20

II

‘j.Z.+ ‘5.31

26.10 26.22 26.30 ‘7 04 Lj.38 29.12 28.7j 30.26

96 8s sx I39 I33 ‘j-l

Si I’identification de chacun des produits &pares, par les methodes precitees est suffisamment precise, il etait cependant necessaire de verifier avec rigueur leur extrapolation a des melanges biologiques complexes. Ceci a CtC possible en utilisant le couplage chromatographie en phase gazeuse-spectrometrie de masse, lequel permet de caractkriser avec certitude chaque pit urinaire etudie. Leurs spectres de masse compares a ceux des steroides de reference, permettent d’etablir leur specificite. Les Figs. 3 et 4 reproduisent a titre d’exemple les spectres de masse obtenus pour la dehydroepiandrosterone et le aoa-pregnanetriol (metabolites, particulierement interessants en biologie clinique), respectivement a partir des produits standards et des extraits urinaires. I1 apparait dans la Fig. 3 que les spectres de masse A et B sont identiques. Le pit moleculaire a m/e 360 indique que ce compose est sous forme mono-oxo-monotrimethylsilyloxy-derive. Le pit le plus important a m/e 129 reprkente la chaine a = (CH,), Si 0 k = CH-CH = CH,. Pour le calcul des intensites relatives, nous axons pris le pit de base a m/e 75. Les fragments a mje 345, 270, 255, et 231 correspondent respectivement au depart d’un groupement (CH,), (CH,), SiOH, CH, -r (CH,), SiOH et de la chaine precitee. Enfin le pit d’intensite relative importante a me 304 est caracteristique de la fonction r7-oxosteroides (fragment (RI-b) avec b = (CR,- CH,CO) Dans la Pig. 4, les spectres C et D sont egalement identiques. Le pit moldculaire a m/e 4So indique qu’il s’agit d’un derive di-trimethylsilyloxy-monohydroxy. Le pit maximum a m/e 2 jj represente le fragment JI -

[c, HOH, (CH& SiOH] avec c =

Pour le calcul des intensites

relatives

.!

nous avons pris le pit de base a m/e 119.

389

391

Les fragments d&part

B m,‘e 465, 300, 363,

d’un groupement CH,, (CH,), SiOH, Ces analyses

343,

300 et 273 correspondent

respectivcment

au

: c, (c + HOH),

ont ktd effectubes

2 x

(CH,), SiOH et c + (CH,), SiOH

sysknatiquemcnt

pour

chacun

des metabolites

f!tudi& Pour ce qui concerne l’androst&one et l’~tiocl~olanolone, les spectrcs dc masse obtenus v&rifient qu’il s’agit de d&-iv& 3-monotrim~tl~~~lsil!-los\--I7-oso de m/e 362, avec la fragmentation caractCristique 31-15, lILg0, C(c)0 f Ij), AI-b, W(b - I), la diffkrence essentielle portant sur les intensitk relatives tic chacunc de ces fragmentations. Les II-oxo-17-oxost~ro’idej ont un pit moldculaire B m/c 376 trk important pour la Ix-oxoandrost~rone. On retrouve les fragmentations caractdristiques: 11-b (insignifiant pour la II-oxo~tiocl~olano~one), AI-(b f IS), lI-C)O et AI-(90 7 Ij). Les rriJ)-l1!-drox~-r7-osostProi‘des ont un pit mol&ulaire a mje 37s avec un pit de base k rnie 73. Les deux d&iv&s ont un fragment de K(c)0 + 15) et AI-90. Soulign0ns clue le pit (JI-rj) important pour la IIP-h~drox~anclrostdrone est pratiquement inexistant pour la rrp-li?-drox\-~tiocliolanolone. Par contre cettc dernike tlonne un pit important B AI-(c + ‘)” + I). Le zoz-pregnandiol avec un pit mokulairc k m/e 464 de faible abondance relative reprksente un d&iv@ di-trim~tli\-lsil?,lox~. Le pit de base ?I m/e 117 (c) cst extremement important. On retrouve toutcs les fragmentations caractkistiqucs: 11-I j, 3I-(90 + Ij), M-c, AI-(2 >:()O) et M-(2Ygo -t_ 15). Par ailleurs, cette &tude nous a permis de retrouver Horning: quant A la nature des d&iv& form& M-00,

les rksultats

de Chanibaz

et

I’ Culc~d dzb mzdcnttmt rl’estvnstiorl. Lcs solutions initiales (urines) et lcs solutions finales ayant des “quenching” diffkents, nous calculons le rendement d’extraction en appliquant la relation suivante: A Rt = i

R2 x R~ 1

avec

A = nombre de coups par minute dans la solution initiale B = nombre de coups par minute dans la solution finale Rs et R.? = rendements de comptage de la solution initiale et de la solution finale. 2' L’dtalo~~nngc intemr. Afin dc pouvoir prockder j l’dtude quantitative tics l’existence d’une relation IinfAaire entre la quantitg inproduits chromatographiks, ject@e, et la rkponse de l’ensemble colonneedktecteur-klectromktrc-enregistreur est indispensable. Or, cette 1inkaritC est assez difficile k obtenir. En effet, diverses crreurs (aspiration dans la seringue Hamilton, concentration des solutions, changemcnt de manipulateur) perturbent la fidklit& d’une telle analyse. Nous kvitons cet inconvknient en introduisant un ktalon interne qui pcrmet de calculer le coefficient de reponse de chacun des stkroi’des @tudi&. En effet, le coefficient de rkponse est constant quelle que soit la quantitk injectke, alors que les hauteurs correspondantes varient non seulement d’un manipulateur & I’autre, mais aussi d’une anal!-se 2 l’autre, les solutions injectables Ctant sujettes A des variations de con-

ccliti-atioll tlifticilcs 2 contrOler. ;1 cc props, now avow cffectuP une hde particulii>rc tics ri-ososth-oi’clc-; 0svpWs en II, car le coefficient de rkponse de ces derniers nous a\-ait pru wjet h dcs variations importantes. En fait, au debut de nos travaux, now a\-ions rep-is la technique classique de sil!kition en solvant pyridine ct nous now ~oiiimcs ren(lus compte qu’en piheuce de ce soltwlt, il se produisait une fholisation de la fonction &tone en II et en 17, ceci uniquement pour la Ix-osoailctrost~rone et la r I-oso~tiocllolaiiolone. Dans ces conditions, l’analyse et le dosage de ces deux catabolitcs dtaient alors impossibles et les pits chromatographiqucs correspondant aux hols faussaient c’.galenient la quantification des II~~-h~dro?c~-I7-oxost~ro’ides. l’ar contre, dans les conditions de silylation que nous awns d&-rites pr&demment avcc le chloroformc comme solvant, nous obtenons une excellente stabilitk des d&-iv& triln~tll!-l~il!-l~s et lcs rkultats obtenus sont satisfaisants comme le montrent les valeurl; mcntiomldes dans le Tableau III. Sow rc’marquons : (a) qu’il est difticile en manipulation courante, de quantifier

393

sur la seule steroide etude

hauteur

precise.

Mdhode

de calcul

giques.

Connaissant

de reference,

a la solution

solution,

est don&e

=

pour

par

ailleurs,

avec

par la formule

de II

precision

A zoo/O selon

de reponse

quantitative

CR de chaque

la quantite

pow

les liquides

steroi’de

biolo-

d’etalon

interne

(Qi) present

steroi’de

dans

suivante:

(1)

du pit de l’etalon

Hauteur

du pit du steroi’de

Tableau

le

une

dans une solution

la quantite

de chaque

autorise

x__ xCR1

Hauteur (voir

l’analyse

de reponse

Ptudiee,

(variation

du coefficient

cx,

Qi Qe (pg) = (yg) ou: CR,

l’utilisation

adoptie

le coefficient

connaissant,

(Qe) ajoutee

chromatographiques

(b) par contre,

quantitative 3’

cette

des pits

consider&).

interne de reference

IV)

“ALEURS DES COEFFICIESTSDE RtPONSE DES STRRO?DESS”R ov-I

ET SUR o\‘-I,

(Moyennes sw 12 analyses) IpOXstekaes CR & DS O\‘-I O\‘-17

An

I .22

+

0.02

I.07 f

0.02

Et

DHEA

II 0 An

II 0 Et

II H .412

II H Et

I.33 & 0.01 1.16 j= 0.02

I.11 & 0.03 I.12 F0.03

I.00 * 0.03 0.91 5 0.02

I.14 & 0.01 I.03 * 0.02

0.97 * 0.02 0.87 * 0.02

I.05 * 0.02 0.91 & 0.03

zo-Hydvoxy-a~de’soxyste’roides CR + DS

PI

PG zap

PG 200(

PT

ov-I

0.90 & 0.03 0.87 * 0.03

0.97 & 0.02 0.91 * 0.02

1.15 * 0.02 1.17.*0.03

I.02 & 0.03 0.97 * 0.03

OV-17

Hauteur

CR, =

du pit

Hauteur

du pit du steroi’de finale

present

Rt = rendement 20

fraction

=

en quantite

I .oo + 0.03 1.06 _C 0.02

Qe dans

la solution

doivent

(b) etudiee,

Cette

parfois

metabolites exemple).

(a) Dans

formule

ce qui permet

d’interne

suivante:

10-a

la solution a la meme

est applicable, d’eventuelles

(4

concentration

quel

dleves

steroi’de,

necessaire

final

de la solution

d’utiliser

de proportionnalite

d’augmenter

(pregnandiol

et l’etalon

pour le calcul de CR,.

et par la m&me, kite

dans le cas ou le taux

sont particulierement

chaque

que soit le volume

dont les facteurs

11 est parfois

notamment

de reference,

dilutions

des Clectrometres

discutables.

ajoutee,

x

inconnue)

dans la relation

d’extraction

&tre exactement

t&me d’attenuation

(dans la solution

est donnee

de la diurese.

4” Renzarques. interne,

correspondant

des resultats

-f_, 20 = Qs x Rt

QbvWh)

paru

interne

20~

inconnue L’expression

avec

de l’etalon

PT

20,8

la quantite

d’excretion chez

le sysnous ont d’etalon

d’un ou de plusieurs

la femme

enceinte

par

394

(c) I%h, nous awns eu la possibility de proc~cler aus enregistreinents ties cl~roniatogrami~~~s sur bade magn6tique. La bancle inagnktique peut Ptre trait& cnsuite l)ar un ensemble intCgratcur-calculateur dent le prc~gramme de calm1 a 6ti: hbli en fonction de la indtlioclc de calcul adopt&. Les essais praticlui’s nous ont &mid tics rkultats pratiqucinent iclentiques B ceux obtenus par la ni~tl~ode nia-

11uc11e:::.

Tow lcs dosages effectds ont &! calculds, coinme il a Gtk clit pr~c&leniinent sur lcs &us plrases utilis~es. Pour un nv%h~lite Dodd, de faibles tlifftrences sont parfois variations ohcr\-ks, et ces dcrnik5 sent comprises entre 6 et Iz”‘h, les plus grades ol~scr~~~cs, concernant les II-oso-r7-osost~roides. Nous awns Cvidcmmcnt retcnu, pour clrxun cles mhahlites la valeur la plus faible. Pour cc’ clui concerne les dosages cl~romatograplliclues de la DHEA, il apparait qu’un taus tl’cscrPtion infkrieur ?i 0.5 nigiq II doit h-e accept4 avec prudence, ceci tl’autant que uous avons observil que lcs solvants et rbactifs utilisCs pouvait faire alllxuxitr~~, hur les &us colonnes une impret& dpaulant sur le pit de la DHEh. Entin, l’cscrdtion de la l~rt+ianolone btant, sauf cliez la femme enceinte nilgligcalAc, ellc 11’;~pas f!tk s~st@iiiatiqueiiieiit calculde. I. h’f,~rotizlrtihl’litt. Pour montrer qu’k partir d’un volume dkterminf! d’un mhe ikliantillon tl’urines, liytlrol~x enzymatique, extraction et calcul, permettaient d’obtcnir clcs rthultats constants, nous awns fffectuh des manipulations en double, clont les rfhltats sent relxoduits clans le Tableau 1’. Par aillwrs, les conditions espdrimentales restant lcs mhes, nous avons v&-ifik clue lcs rhultats obtenus, 5 partir de volumes cliff&rents d’un m&me &llantillon urinaire cltaicnt seml~lables. Cette manilxdation a pu Ctre effectuhe pour un khantillon apriis hydrolysc cllimique (voir Tableau \‘Ia), et pour l’autre aprhs hydrolyse enzymatique (voir Tableau \-lb).

395

COMPARAISON LA

DIURkSE

DES DE

21

RhULTATS

OBTENUS

ES

PARTANT

RESPECTIVEMEST

DU

I/IO’

ET

DU

I/20’

DE

h

.1 = volume des urines des 24 h (a) APRkS HYDROLYSE CHIMIQUE Les rCsultats sent cxprimCs en mg/z4 h.

.4n 1it DHIC.4 rr 0 An

4.48 0.83 0.61

II

0.20

0

Et

j.O*

H .In 0.12 II H Et 0.26 Total II.60 0.75 I’G 2”c( ________~ _~~ (b) APRkS HYDROLYSE EKZYMATIQUE II

1~s

rkultats

5.50 4.83 0.96 0.7’ 0.21

0.13 0.26 12.60 0.90 _~~____ CLASSIQUE

sont esprimCs en mp/r.~ h.

I.Lj

I.29

2.4-J

L.jO

0.14

0.1,

0.1,

0.20

0.18

0.24

I.77 2.15

1.60

8.10

8.20

2.20

2’ Essais ve’alis& dam I’obtcdiox de rthltats optima. Les resultats predecents, concernant la reproductibilite etant satisfaisants, il nous a semble necessaire de chercher les conditions experimentales permettant d’obtenir des taux d’excretion a la fois justes et precis. Cette mise au point nous a semble d’autant plus necessaire que le comportement des steroides etudies est different, tant en ce qui concerne leur hydrolyse que leur extraction. (a) L’hydrolyse. La comparaison des resultats obtenus apres hydrolvse chimique et apres hydrolyse enzymatique, mentionnes dans le Tableau VII etait necessaire comme preambule a une etude plus approfondie (Figs. 5 et 6). Nous remarquons que les valeurs trouvees pour tous les steroi’cles Ctudies sont en general superieures lorsqu’on utilise l’hydrolyse chimique, sauf en ce qui concerne le pregnanetriol qui est detruit & 70 - 80% par cette hydrolyse. Le probleme se posait done de savoir d’une part si I’h>~drolyse enzynatique etait bien complete, et d’autre part si les resultats obtenus en utilisant une hydrolyse acide, n’etaient pas major& par certaines decompositions des steroi‘des moins stables. Dans ce but nous avow compare les resultats obtenus d’une part avec et sans elinination d’un certain nombre d’inhibiteurs enzymatiques par l’acetate de baryum et, d’autre part, avec des preparations enzvmatiques plus riches en sulfatases (helicase). 11 apparait sur le Tableau VIII que 1: precipitation par l’acdtate de baryum permet d’obtenir une h)rdrolyse plus complete des zo-hydroxy-zI-desoxysteroi’des et de la plupart des I7-oxosteroides,

396

Fig. 5. Separation par ~hromato~aphie gaz-liquide des steroiides urinaires sous forme d’ethers de trim~thylsilyls, SW une phase d’OV-1 apres hydrolyse chimique. Le chromatogramme obtenu correspond 21l’urine U3 du Tableau VII.

Fig. 6. Separation par chromatographie gaz-liquide des steroi’des urinaires SQUSforme d’ethers de trimethylsilyls, sur une phase d’OV-1 apres hydrolyse enzymatique par le sue digestif d’H6Eix pomatie. Le chromatogramme obtenu correspond I l’urine U3 du Tabieau VII, et peut done etre compare ci.celui reproduit sur la Fig. 5. Nous remarquons: (1) que, apres I’hydrolyse enzymatique, les taux d’excretion de chaque l?-oxosteroide, sont plus faibles qu’apres l’hydrolyse chimique, sauf en ce qui concerne celui des I@-hydroxy17-oxosteroides; (2) que, le ZOa-pregnanetriol (11) est ddtruit par I’hydrolyse chimique, alors qu’il est parfaitement dosable apres hydrolyse enzymatique.

397

1

Fig. 7. Separation

par chromatographie gaz-liquide des steroides urinaires sous forme d’bthers de trimethylsilyls, sur une phase d’OV-1 apres hydrolyse enzymatique, sans precipitation prealable par l’acetate de baryum. Le chromatogramme obtenu correspond l’urine U3 du Tableau VIII.

$

Fig. 8. Separation par chromatographie gaz-liquide des steroides urinaires sous forme d’ethers de trimdthylsilyls, sur une phase d’OV-1 apres hydrolyse enzymatique precedke d’une precipitation par l’acetate de baryum. Le chromatogramme obtenu correspond a l’urine U3 du Tableau VIII, et peut done 6tre compare i celui reproduit sur la Fig. 7. NOUS remarquons que la precipitation des inhibiteurs par l’acdtate de baryum, majore significativement toutes les fractions Ctudiees, en particulier celle de la DHEA, du 20o-pregnandiol et du 20wpregnanetriol.

398

ti~li!drct~l)ialldrost~~(~ne en prticulier. Par contre, si la prPparation enz~matique d’li6licasc semhle fa\wriser l’hydrolvse du sulfate de d~h?dro~piandrost~r~)lle, elle apparait mains active sur les autres nl6tabolites ttudibs que la prCparation de sue d’HPlis ~omatia (Tableau IS). (b) L’estraction: Pour chaque urine ktudik, le rendernent d’estraction de la IIH k1.A a c’tk calculi, conm~c il a bt@ indiqub dam le chapitre MA’l%RIEL ET M~THODES. Les vnleurs niq.ennes obtenues sent les suivantes : aprh l~ydrolyse cliirnique (I2 manipulations) SI -I- 3,7O/b (co&cient de variation 4. joy,) aprb li~drolyse enzyniatique (22 nianipulatiuns) Sj & 0.1” .O (coeficient de variation 7:;) Ces rendements

nous semhlant

satisfaisauts

pour

les x7-most&aides,

il conve-

399

nait cependant de savoir s’ils &Gent applicables pour les 20-I1~d~~o~~-2~-ddsox~steroicles. Les caracteres de solubilite de ces derniers, now ont conduits tout d’abortl a effectuer une extraction supplc!mentaire par le melange ether-ethanol (3 volumes/l volume). Ceci nous a permis de verifier clue les pourcentages d’extractior, du zot(pr@gnandiol et du zoa-pregnanetriol, etaient respectivement augnientes de 12 et de 239/o (augmentation mo!-enne calculee sur 0 dclrantillons). Cette extraction suppl& mentaire etant retenue, nous awns voulu savoir si le rendement d’extraction obtenu avec ~a DHEX tritiee etait applicable aus 2o-llr_drox!-21-disox~stitro’idcs, ceci en ajoutant, a certains Cchantillons urinaires, roo,~~cgde 20x-pregnandiol et 100 yg de 20x-pregnanetriol. Les resultats obtenus ont niontri: que le pourcentagc de rkrperation de ces deux st6rokles Ctait de: Sq _’ 4q/O pour le aoa-pregnandiol 79 :_k 3:/o pour le zoz-pregnanetriol DISCCSSIOS

(10 manipulations) (6 manipulations)

ET CONCLL-SIOS

Nous Ctudierons

les differents

facteurs

influencant

l’ensemble

dc l’analyse.

L’etude des divers facteurs intervenant lors de l’liydrolyse enz>matique, conduit au commentaire suivant : I’ la repetabilite des analyses a toujours eti: excellente, les variations inchI+ duelles et totales n’ont jamais exckli: 8:;. 2” pour obtenir une hvdrolyse la plus complete possible de la fraction sulfoconjuguee des st&oi‘dcs f9udi6s, il est necessaire d’eliminer par une rndthode simple la majorite des inhibiteurs enzymatiques, ce qui evite l’extraction prealable des steroi’des conjugues par le norbutanol ou selon la methocle d’ISdwards et Kelliel” et par la meme, simplifie et diminue notablement le temps global de l’analyse. 3’ l’hydrolyse par l’helicase ne now a pas donnC d’augmentation des taux d’excretion, notamment en ce qui concerne la fraction sulfoconjuguee des metabolites urinaires CtudiCs. Par contre, en utilisant le SHP, I’hydrolyse est plus complete et plus rapide. B. L’extvnction .lvec les solvants

precipitees

utilises (benzene et melange ether-ethanol) clans les conditions les rendements obtenus sont tres satkfaisants, une eventuelle extraction

400

supplementaire respectivement par le benzene et par l’ether-ethanol n’a apporte aucune amelioration significative. Les emulsions qui peuvent apparaitre lors de ces extractions sont aisement supprimkes par centrifugation.

La formation des ethers de trimethylsilyles s’eff ectue quantitativement pour tous les steroi’des Ctudies, en milieu HCCl,-BSTFA, dans les proportions de 20/80 en 8 11a 60” ou plus rapidement en presence de TICS comme catalyseur. Les derives obtertus sont stables, des analyses cl~romato~raphiques effect&es sur des solutions standards, comme sur des extraits urinaires a 30 jours d’intervalle n’ont montre aucune variation qualitative ou quantitative significative. L’analyse de ces derives par spectrometrie de masse a permis de verifier leur structure exacte. 11 est a noter que dans les conditions que nous avons utilisees, il n’a pas et6 constate d’etherification des fonctions portees par les carbones II et 17 des r7-oxosteroides. La bonne repetabilite observee lors de nos analyses chromatographiques peut Gtre due en partie au fait que les stkroides sent inject& en solution dans TABLEAU SCHkMA

X

DE LA M$THODE

D’ANALYSE

PAR CHROMATOGRAPHIE

EN PHASE

GAZEUSE

APRkS

HYDROLYSE

CWI3?IQUE

URINES

V mnl = d/20

I ml d’une solution Cthanolique de DHEA tritiee

I-

I ml pour comptageo

J-V218 N Benzene

1

(V/IO ml) (V ml)

-Phase benzenique

Phase aqueuse-extraction par Ii ml de benzene

I

*Phase benzCnique

I Phase aqueuse-extraction par V ml d’ether-ethanol Phase aquense*

f

IPhases organiques reunies 1 Lavages 2 fois par V/r0 ml de NaOH 11’

NaOH+

+ Lavages iz fois par V/IO H,O jusqu’a neutralit

HG-

1 Sechage sur SO,Na, anhydre

ml d’

I Evaporation sous vide reprise par 3 fois j ml d’&thanoI 14 Evaporation B set Formation des derives trimdthylsilylCs .5 111comptage.

t GLC sur OV-I et OV-17

d = volume de la diurcse de 24 h.

roe pug d’ktalon interne

401

TABLEAU SCHkMA

DE

XI LA

MkTHODE

D’ANALYSE

PAR

CHROMATOGRAPHIE

EN

PHASE

GAZEUSE

APRkS

HYDROLYSE

ESZYMATIQUE URISES

Vml

= d/ro I ml d’une solution de DHE.1 tritik

1 ml pour comptage

4 a&ate i: =\juster pH 11.5 avec Na OH 2 N Centrifugation : .10 min. 3000 t/min

de baryum 250/6

(V/IO ml)

1 Surnageant pH 5.2o avec CH,COOH

I

I

I’

Tampon a&to-ac6tique pH 5.20 (V/IO ml) SHP (3000 U/ml)

2-1 k 48 h a 37’ 1 Extraction par le benzCne (I’ ml) 2 fois

-NaCl

?:{;%-16niques Phase aqueusti

Suite de la manipulation identlque ?I celle sch6matisCe dans Ie Tableau X 3 = volume de la diurk

des 24 h.

le melange silylant. Ceci nous semble avoir l’avantage de saturer en permanence les sites actifs de la colonne. En conclusion, nous pouvons comparer les deux methodes Ctudiees, et resumees, dans les Tableaux X et XI. Si la methode utilisant l’hydrolyse chimique est plus rapide (temps total de l’analyse: 48 h pour la premiere, et 72 h pour la seconde par serie de 8 manipulations) et si elle est totalement independente des inhibiteurs enzymatiques, elle donne des extraits urinaires pigment& et parfois des decompositions de certains steroides instables (pregnanetriol en particulier) entachant d’erreur l’analyse et l’expression finale des resultats. Par contre, celle utilisant l’hydrolyse enzymatique, bien que plus delicate nous est apparue comme donnant des resultats plus fiables qualitativement et quantitativement. I1 est a noter qu’une spdcificite rigoureuse de fractionnement chromatographique est obtenue a la fois sur tous les r7-oxosteroides et sur tous les zo-hydroxy-ar-desoxyst&oYdes presentant un interet clinique, tout en restant une methode juste et precise. Ces avantages sont d’autant plus appreciables qu’ils sont obtenus sans purification prealable par chromatographie liquide ou par chromatographie sur couche mince. C’est cette m&ode avec hydrolyse enzymatique qu’il nous a semble devoir retenir, et que nous appliquons a une analvse elaboree des steroi’des urinaires utilisables en routine quotidienne. Les resul-

402

403

Fig. 9. Separation par chromatographie gaz-liquide des steroides urinaires sous forme d’bthers de trimethylsilyls, sur une phase d’OV-1 apres hydrolyse enzymatique precedee d’une precipitation par l’acetate de baryum. Le trace chromatographique obtenu correspond 1 l’urine No. 15 du Tableau XII. Elle provient d’une mala(de presentant une hyperplasie corticosurrenalienne par deficit en 21-hydroxylase, signee par une excretion extrimement importante de 20wpregnanetriol (11). Les pits 14 et 22 ont et6 identifies par chromatographie gaz-liquide-spectrometrie de masse comme etant respectivement: le 5/%prCgnane3a,l7cr-diol-20-one, et le 5P-pregnane-3a,l7o,20o-triol-ll-one. Les pits 14’ et 18 n’ont pu encore 6tre identifies avec certitude. Le chromatogramme souligne l’interet du dosage simultan6 des 17-oxostCroKdes et des 20-oxy-21-deoxystkoi’des.

tats formules dans le Tableau SII reproduisent ceux obtenus par cette now pratiquons couramment depuis la mise au point de cette methode. Sous avons dans ce m&me Tableau SIT mentionnd le resultat

methode

que

des dosages

colorimetriques car le probleme s’est enfin pose de savoir s’il y avait bonne concordance entre les deux methodes. 11 apparait a l’examen de ce tableau que si cette correlation n’est pas toujours parfaite, le rapport des r7-oxosteroides totaux par GLC/r7-oxosteroi’des par colorimetric est cependant satisfaisant (valeur movenne 88 I_ IO:/,). Ceci repose le probleme de la spitcificite de la reaction de Zimmerman d&rite dans la litt6raturel~91?. Cette premiere serie de resultats montre que nous obten~ons constamment par GLC un taux d’excretion global inferieur a celui obtenu par colorimetrie. Cette discordance est a notre avis d’autant plus marquee que la concentration en chromogenes non steroidiens donnant une reaction de Zimmerman positive est plus importante. Ceci confirme les resultats obtenus par JIatthijssen et Goldzieher”, et nous autorise

404

quant B nous ?I dkfenclre la validitk des rkultats obtenus par la mkthode chromatographique que nous avons pu mettre au point. Par ses possibilitks rksolutives, cette mkthode affine les rksultats obtenus par les m&odes classiques sans pour antant les csclurc. Elk est kgalement adaptable & l’utilisation rationalike d’un ordinateur pour l’acquisition et le traitement des donnks (rkltats non publik). Enfin, cette mMlode autorise une btude exhaustive des mCtabolites apparaissant dans certains cas pathologiques, dont un exemple est donnd sur la Fig. 0, typique d’une Iiyperplasic congknitale par dkficit en 2I-liydrox~.lase. 11 n’emlkhe que l’ktude plus approfondie du bilan hormonal dans ces cas, suggk-6s par l’esamen clinique et confirm&s, wire dkcouverts par cette mkthode est cii tours de mise au point, incluant une kparation cliromatogral~liique spkifique des glycuroconjugu& et des sulfoconjugu&s.

Pour kaliser des explorations fonctionnelles endocriniennes prkcises, nous a\wns essay& de mettre au point une m~thode d’analyse simultanke par chromatographic gaz--1iquide (CL(;) des I7-oxostkroides (17 OS) et des zo-hg’drox~-2r-clesos!-stdroides urinaires a!.ant un inter&t en biologie clinique, ce dosage devant s’effectuer avec un maximum de pr@cision qualitative et quantitative tout en restant compatible avec les exigences routinikres. Cette etude a pu etre envisagke, car nous disposons du couplage chromatographie gaz-liquide-spectromktrie de masse (GLC-Shl) appareillage qui nous a permis d’identifier avec certitude chaque pit chromatographique, en particulier l’androstekone, l’ktiocholanolone, la II-oxoandrostkrone, et la II-oxoktiocholanolone, la Ix/%hydroxyandrostkrone et la rIP-hydroxyktiocholanolone, la dkhydrokpiandrostkrone, la prkgnanolone, le zap-prkgnandiol, le zoa-prCgnandiol, le 2o$-prkgnanetriol et le zoa-prkgnanetriol. La formation des d&i&s trim~th~~lsilyk, en utilisant une rkaction de silylation qui soit B la fois rapide, compkte et stable a &C particulkement &udiCe. De m&me, nous avons recherchC les conditions optimales de skparations et d’identification des 12 catabolites retenus en faisant varier les paramktres analytiques (isotherme, programmation de tempkrature, dkbit du gaz vecteur, etc.), et en utilisant diffkentes phases liquides (O\‘-I, O\--17, SE-60, Dexil-300). Finalement, nous avons retenu les deux phases liquides 017-1 et OV-17 qui sont k la fois compatibles aux tempkratures de travail et complkmentaires par leur fractionnement. L’extrapolation B cles melanges biologiques complexes a kte v@rifike en utilisant le couplage GLC-SAI. L’aspect quantitatif a ktk rkolu en introduisant un Ctalon interne qui est ici l’~l’icol)i-ostaT’o1, juste al-ant la reaction dc silylation. Le calcul est effect& j partir (1~ solutions standartls qui pcrmettent de comlaitre le coefkicient dc rbponse de chaque st@roi’de gtudif? et de pouvoir l’appliquer au dosage de ces m?mes stfkoi‘dcs dans les solutions biologiques. La m@thode de calcul utiliske aussi bien pour l’identification des pits cliromatograpllicues que pour leur quantification a pu stre programmke facilement sur un intkgrateur-calculateur que nous avons eu 5 l’essai au laboratoire. La prkparation des kchantillons urinaires, enfin, a retenu toute notre attention, toujours dans l’optique de techniques simples et se p&ant ?I la skrie. Sous avons ittudit: deux types d’h\.drolyse des stkroi‘des conjug& clans l’urine, l’une acide, l’autre enzymatique. La premiere, si elle exclut le probl+kne des inhibi-

405

teurs enzymatiques, a cependant l’inconvenient de detruire certains metabolites importants, et d’etre peu reproductible. L’hydrolyse enzymatique, par contre, par le sue d’H&‘.r pomatia (SHP) nous a don& entiere satisfaction. Sous la faisons preceder d’une elimination des sulfates et des phosphates urinaires par une solution tl’acetate de baryum, ce qui permet d’obtenir une hydrolyse convenable des derives sulfoconjuguks (d&y&-o-epiandrosterone en particulier). L’extraction des stdroi’des liberes par l’hydrolyse est ensuite realis& par deux solvants: le benzene tout tl’abord qui nous est apparu comme le meilleur solvant des IF-oxosteroides et lc mklange ether4thanol ensuite, qui complkte l’extraction des zo-hJ.drox--zr-desox~.st~ro~~les. Le rendement d’extraction a pu &tre suivi en utilisant soit des steroi’des marques au tritium (dehydroepiandrosterone en particulier), soit des surcharges. Cette methode nous apporte des resultats tres fiables avec une repetabilitd qui a toujours et6 excellente, les variations individuelles et totales n’ay.ant jamais excede 8%. Enfin, cette methode ne limite pas l’etude aux 12 metabolites d&rites, mais &alement aux autres zo-oxy-2r-desoxvsteroi’des excretes dans certains cas pathologiques et dont l’identification et le dosage permettent de confirmer ou d’affirmer le diagnostic clinique. Cette methode est done ouverte a un Clargissement tant dans le domaine du diagnostic biologique que dans celui de la recherche biologique et clinique des syndromes lies aux hormones steroi’des. Elle est aussi ouverte a I’utilisation de I’ordinateur pour la saisie et le traitement des donnees. Cet essai a et6 realise au laboratoire avec beaucoup de satisfaction. BIBLIOGR.\PHIE I W. S. BAULD, Biochm. J., 63 (1956) 488. 2 C. BERRET ET C. MCNEIL, Clan. CIwm., 12 (1966) 199 3 Ii.CARLSTROM, FLJRUHJELM, .a.ISGELMAT-SUSDBERG ET Y. D. LUXELL, ,4nzrr.J.Cyn~coZ. Obstet.,7 (1969) 12-t. 1 L. P. CAWLEY, B. 0. MUSSER ET H. A. TRETBAR, Anzrv. J. Clin. Pathol., _I>;(1967) 216. j E. ilf. CHAMBAZ ET E. C. HORNISG, Aml. Biochem, 30 (1969) 7. 6 J. X. COOPER ET B. G. CREECH, Anal. Biochrm., 30 (1969) 7. 7 E. DIxGEnf.kxssE, L. G. HEIS IN'T 1.ELD ET B. XI. DE LAAT, J. Clin. Exdocvinol., 6 (19.56) 53.5. S L<. DISGEMASSSE, I,.G. HUIS IN'T VELD ET S. I,.HAROGHKATZ, J. Clin. l~~~docn~~ol. ~lZrtab.,‘~z (19jZ) 66. 9 Ii. S. Doocsos ET B. SPESCER, Biochem J., 55 (19.53) 315. 10 R. W. H. EUWARDS ETA. E. KELLIE. LVtwzoivsof the Society Endocvinolopy, i”oZ. 2, Cambridge University Press, London, 1953, p. 53. II H.GLEISPACH, B.PODOLSKI,TV.HOHEN~ALL~ERET H.BERGER,Z. I~lzn.Che~~z.I~li~z.BiocJzem. 7 (1969) 592. 12 J. W. GOLD~IEHER ET L. R. ;\XELROD, J, Clix. Endocvinol. M&b., 22 (1962) 1234. 13 E. 0. X. HAAHTI, W. J, X. VASDESHE~VEL ET E. C. HORSIXG, Anal.Biochrm., 2 (1961) 182. 11 E. C. HORSIXG, N. IKEICAWA, E. AI. CHAMBAZ, P. I. JAAKOSMAKI ET C. J. N. BROOKS, J. Gas Chvomatog., 5 (1967) 283. 15 P. JARRIGE ET R. HEYRY,Ru~~. Sot. Chinz. Biol., 34 (1952) 873. 16 &I. .A.KIRSCHSER ET BI. B. LIPSETT, J. Cliw. Endocvinol. Metab., 22 (1963) 255. 68 (1971) 311. 17 C. MATTHIJSSEX ET J. W. GOLDZIEHER, Acta Endocvixol., 18 R. RIVERA, R. J. DORFMAX ET E. FORCHELLI, 24cta Endocvinol., jq (1967) 37. 19 D. SOLOMOS, D. STRUMXER ET P. P. NAIR, Amev. J. Clzn. Pathol.. q8 (1967) 29j. 20 A. SOLoKAKG.45, K. 0. SCHAURIAS, T. LVUKAISEX ET H. XLDERCREUTZ, .CCalZd. 1. ClilZ.Lr,b. Invest., 19 Suppl. 95 (1967) 59