Über biologische Wirkungen von Koordinationsverbindungen der Übergangsmetalle 5. Zum Einfluß von Dimethylsulfoxid auf die zytotoxischen, antiviralen und antitumoralen Eigenschaften von Cis-dichloro-diammin-platin (II): „Cis-Platin“

Zbl. Bakt. Hyg. A 257, 108-120 (1984)

Dber biologische Wirkungen von Koordinationsverbindungen der Dbergangsmetalle 5. Zum EinfluG von Dimethylsulfoxid auf die zytotoxischen, antiviralen und antitumoralen Eigenschaften von Cis-dichloro-diammin-platin (II): "Cis-Platin" On the Biological Action of Transition Metal Complexes 5. About the Influence of Dimethylsulfoxide on the Cytotoxical, Antiviral and Antitumoral Properties of Cis-Dichloro-Diammine Platinum (II)

MARION TONEW, EMIL TONEW, WALTER GUTSCHE, KLAUS WOHLRABE, AXEL STELZNER, HANS-PETER SCHROER und BODO HEYN 1 Akademie der Wissenschaften der DDR Forschungszentrum fur Molekularbiologie und Medizin Zentralinstitut fUr Mikrobiologie und experimentelle Therapie lena, DDR 1 Sektion Chemie der Friedrich-Schiller-Universitat lena, DDR

Eingegangen am 11. Oktober 1983· Angenommen am 6. lanuar 1984

Abstract In water or dimethyl sulfoxide solutions cis-platinum is subject of time depending solvolytic reactions leading to compounds with different biological effectivity. Whereas the inactivation of vaccinia, vesicular stomatitis and adeno virus type 5 was not changed if dimethyl sulfoxide or dimethyl formamide instead of destilled water were used as solvents, long time stored solutions of cis-platinum in dimethyl sulfoxide were tolerated by cells cultivated in vitro in 8-25 times higher concentrations in comparison with a freshly solved preparation. Their antiviral effectivity was maintained. On the other hand experiments with mice showed that simultaneously with the decrease of toxicity of an aged cis-platinum solution in DMSO also its antileukemic activity disappeared. In a 5 weeks old cis-platinum solution in des tilled water antitumor activity was preserved in spite of enhanced toxicity.

Zusammenfassung Wurden zur Herstellung von Cis-PlatinlOsungen Losungsmittel wie Aqua dest. oder Dimethylsulfoxid verwendet, kam es zu zeitabhangigen Austauschreaktionen, die zu Platinverbindungen mit unterschiedlichen biologischen Wirksamkeiten fuhrten. Die Inaktivierung

Cis-Platin und Dimethylsulfoxid

109

von Vaccinia-, Vesicularstomatitis- und Adenovirus Typ 5 wurde weder durch die Losungsmittel noch durch ihre Reaktionsprodukte mit Cis-Platin gegeniiber der Ausgangssubstanz verandert. DMSO-Stammlosungen von Cis-Platin wiesen aber in Abhangigkeit von der Alterung eine etwa 8- bis 25fache Erhohung der Zellvertraglichkeit in vitro auf; ihre antivirale Wirksamkeit blieb jedoch erhalten. 1m Gegensatz dazu zeigten Untersuchungen an Mausen, dag zugleich mit der Verminderung der Toxizitat einer gealterten Cis-PlatinStammlosung in DMSO die antileukiimische Wirkung vollig verschwand. In einer 5 Wochen gealterten Cis-Platinlosung in Aqua dest. blieb dagegen eine Antitumoraktivitat bei gestiegener Toxizitat erhalten.

Einleitung In einer fruheren Mitteilung (24) war uber die breite antivirale Wirkung von Cisdichloro-diammin-platin (II) ("Cis-Platin") in Zellkulturen gegenuber DNS- und RNSViren berichtet worden. Von dem Wirkstoff war hierbei eine Stammlosung in Dimethylsulfoxid (DMSO) bereitet worden, die Gebrauchslosung (mehr als 1 : 200 in physiologischen Medien) erwies sich fur die getesteten Zellsysteme noch in einer Konzentration von c = 250 !!MIl als gut vertraglich. Beim Vergleich dieser Angaben mit Hinweisen in der Literatur fie! auf, dag von anderen Autoren schon sehr geringe Cis-Platin-Konzentrationen als zytotoxisch angegeben wurden (1,2,9,11,12,17). Es erschien daher ratsam, in vergleichenden Studien den Einflug von DMSO bzw. Aqua dest. als Losungsmittel fur Cis-Platin bezuglich der zytotoxischen, antiviralen und antitumoralen Wirkung zu untersuchen.

Material und Methoden Priifung auf antivirale Wirkung

Zellkulturen, Ziichtung, verwendete Medien, Virusstamme und Titerbestimmungen wie auch die Versuchsdurchfiihrungen entsprechen den Angaben von M. Tonew et at. (22,23). Adenovirus Typ 5 wurde auf FL-Zellen geziichtet. Kurze Angaben zur Versuchsanordnung: Vacciniavirus wurde in einer gut auswertbaren Plaqueanzahl mit den Substanzen in genannter Konzentration in proteinfreier Hankslosung gemischt und nach einstiindiger Einwirkung bei Zimmertemperatur zur Plaquezahlbestimmung auf Zellkulturen von Hiihnerembryonalfibroblasten verimpft. Die Reduktion der Plaquezahl wird in Prozent der unbehandelten Kontrolle angegeben. Bei Vesicularstomatitisvirus (VSV) wie auch Adenovirus Typ 5 wurden logarithmische Virusverdiinnungen wie oben mit Substanzen behandelt und anschliegend zum Virusnachweis auf L- bzw. FL-Zellen verimpft. Die Titerreduktion wird im Vergleich mit der unbehandelten Kontrolle in loglO TCD so angegeben. Priifung auf zytotoxische Wirkung

Die angegebenen Cis-Platinkonzentrationen wurden aus den entsprechenden Stammlosungen in Erhaltungsmedium mit 2 % Kalberserum verdunnt und unmittelbar danach auf 2 Tage alte Monolayerkulturen aufgetragen. Die Zellen wurden mikroskopisch auf morphologische Veranderungen kontrolliert. Es wurden die Konzentrationen als maximal tolerierte Dosen (MTD) angegeben, die am 2. bzw. 5. Beobachtungstag gegeniiber den unbehandelten Zellkontrollen keine Veranderungen hervorriefen.

110

M. Tonew et al.

Prufung auf antileukamische Wirksamkeit

Versuchstiere und Haltungsbedingungen: Die Tiere stammten aus der institutseigenen SPF-Zucht. Fur die Passagierung der Leukamie P 388 wurden DBAl2-Jena-Inzuchtmause und fiir die Leukamie L 1210 ABD2F r Hybriden (AB Jena x DBAl2 Jena) beiderlei Geschlechts verwendet. Die Experimente wurden jedoch ausschlie81ich mit ABD2F r Hybriden durchgefiihrt. Je 6 der 7 bis 10 Wochen alten Tiere wurden in Plastkafigen (400 cm 2 Grundflache) auf Hobelspanen unter konventionellen Bedingungen ohne Kiimatisierung (Raumtemperatur 21-24 0c) bei naturlichem Tagesrhythmus gehalten. Leitungswasser und Futterpellets (Standardfutter ZIMET-H 3) standen ad libitum zur Verfiigung. Transplantation der Leukamien: Die Transplantation der Leukamie P 388 erfolgte jeweils i. p. am 7. Tag nach der vorhergehenden Obertragung mit 106 Zellen in 0,1 ml und bei L1210 am 5.-6. Tag mit 5 x 10 6 Zellen in 0,2 mlfTier. Zur Einstellung der gewiinschten Zelldichte wurde physiologische NaCI-Losung verwendet. Versuchsbedingungen und Auswertung: Die Tiere erhielten yom 2. bis 5. und 8. bis 12. Versuchstag (1. Versuchstag = Tag der Leukamieubertragung) taglich einmal eine intraperitoneale Injektion (gegen 10 Uhr) der zu testenden Probe. Ais MaBstab der Wirksamkeit diente die mitdere Verlangerung der Oberlebenszeit der behandelten Tiere gegenuber den unbehandelten Kontrollen. Sie wurde auf der Basis von Vertrauensintervallen bei 5 % Irrtumswahrscheinlichkeit auf Signifikanz gepruft. Die Versuchsdauer betrug 22 (L 1210) bzw. 30 (P 388) Tage. Bei der Berechnung der mittleren Oberlebenszeiten wurde eine bei optimalen Dosen haufig uber den Versuchszeitraum hinausgehende Oberlebenszeit nicht berucksichtigt. Der wahre Mittelwert ware also bei Berechnung der wirklichen Oberlebenszeiten bei den wirksamsten Dosen groBer als angegeben. Losungen von Cis-Platin

Cis-Platin wurde fur Untersuchungen auf Zellkulturen in gereinigtem DMSO oder fur Vergleichszwecke in Dimethylformamid (DIFO) gelost; c = 50 mMll. Aus dieser Stammlosung erfolgte die Verdunnung in physiologischen Medien mit 2 % Kalberserum 1: 200 oder mehr, so daB die Losungsmittelkonzentration ::s 0,5 % betrug. In der wassrigen "Stammlosung" (50 mM/I) war die Substanz suspendiert, da die Loslichkeit des Wirkstoffes in Wasser 1 mg/ml = 3,3 mM/1 betragt. Die Stammlosungen wurden nach dem Ansetzen bei 4°C unter LichtausschluB aufbewahrt. Fur die Tierversuche wurde Cis-Platin in folgenden Formen angewandt: 1. frisch in Aqua dest. gelost (c = 0,75 mg/ml / 2,5 mM/I), entsprechend den Dosierungen in Tab. 5 in 0,2 ml pro Tier unmittelbar danach oder 2.5 Wochen bei 4°C inkubiert und wie unter 1. angegeben in den in Tab. 6 genannten Konzentrationen verabreicht bzw. 3. in gereinigten DMSO gelost (c = 6 mg/ml / 20 mMll), nach 30 Min. bei Raumtemperatur oder 4.5 Wochen bei 4°C inkubiert und anschlieBend zur Applikation 1: 8 (v/v) mit Aqua dest. verdunnt und sofort appliziert. Aile Cis-Platinproben, auch die bei 4°C aufbewahrten, wurden bei Zimmertemperatur gelost. Hochdruckflussigkeitschromatographie- (HPLC-) und Leitfahigkeitsuntersuchungen

Es wurde eine HPLC-Eigenbauapparatur mit einer Saule 250 x 6 mm, Li Chrosorb NH2 und als Element EthylacetatiMethanollDIFOlWasser = 5: 3: 1 : 1 verwendet. Detektor: Knauer-Spektralphotometer, FiuBrate zwischen 1 und 1,8 mllmin; Probe gelost in DMSO 10 mg/mF. Die Leitfahigkeitsmessungen wurden mit einer WTW-Prazisions-WalzenmeBbrucke durchgefiihrt. 2 Fur die Aufnahme danken wir Herrn Dr. Wetzstein, Leiter der Abt. Chemische Analyse im Zentralinstitut fur Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena.

Cis-Platin und Dimethylsulfoxid

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Tabelle 1. Vertraglichkeit von Cis-Platin fiir Hiihnereymbryonal- und L-Zellen in Abhangigkeit vom Lasungsmittel und Alter der Stammlasung nach weiterer Verdiinnung in Erhaltungsmedium mit 2% Kalberserum Lasungsmittel

Aufbewahrungsdauer der Stammlasung bei 4 °C

Maximal vertragliche Dosis am 5. Beobachtungstag nach Wirkstoffzugabe L-Zellen

Tage

Hiihnerembryonalzellen ,...M/l

DMSO

0 1 3 5

31,25 62,5 125 250

7,8 62,5 125 250

Aqua dest.

a

1 3 5

15,6 15,6 31,25 31,25

7,8 7,8 15,6 15,6

0 8

31,25 31,25

7,8 7,8

DIFO

,...MJI

Ergebnisse

Vertraglichkeit von Cis-Platin fur Zellkulturen Stammlosungen wurden in Abhangigkeit vom Alter und naeh weiteren Verdiinnungen in physiologisehen Medien auf Monolayerkulturen untersueht. Die maximal tolerierten Dosen (MTD) fiir L-Zellen und primare Hiihnerembryonalzellen betrugen unabhangig vom Losungsmittel am Tage der Priiparation 7,8 bzw. 31,25 ,...MJl (Tab. 1). Eine aus der DMSO-Stammlosung bereitete Losung von Cis-Platin zeigte in Abhangigkeit von der Zeit eine deutliehe Zunahme der Vertraglichkeit, so wurde z. B. von den Zellkulturen eine Konzentration von 250 f-tMlI, hergestellt aus einer 5 Tage alten Stammlsoung, auch iiber einen Beobachtungszeitraum von 5 Tagen ohne mikroskopisch wahrnehmbare Veranderungen vertragen. Entspreehende Verdiinnungen aus Stammlosungen in Aqua dest. oder DIFO zeigten dagegen keine wesentlichen zeitabhangigen Zytotoxizitatsveranderungen (Tab. 1). In einem weiteren Versueh wurde die zunehmende Vertragliehkeit einer DMSOStammlosung dureh Probenentnahme in Stundenintervallen und weitere Verdiinnung sowie Uberimpfung auf L-Zellkulturen gepriift (Tab. 2). Als Kontrolle diente eine entspreehende wassrige Stammlosung des Wirkstoffes. Die Toxizitat der DMSOStammlosung nahm sehr langsam ab und hatte naeh 24 Std. ihren Endpunkt noch nieht erreicht. Wahrend bei dem O-Std. Ansatz noch 3,9 f-tMiI die Zellen sehadigten, wurden naeh 24 Std. bereits 125 f-tM/I toleriert (5. Beobaehtungstag). Die Toxizitat der wassrigen Stammlosung blieb im Beobaehtungszeitraum nahezu unverandert (Tab. 2).

112

M. Tonew et al.

Tabelle 2. Maximal tolerierte Dosen von Cis-Platin in 11M/I in Abhiingigkeit vom Losungsmittel und Alter der Stammlosung fiir L-Zellen nach weiterer Verdiinnung in Erhaltungsmedium mit 2 % Kiilberserum Stammlosung Alter in Std. (Zimmertemperatur)

Aqua dest. DMSO Beobachtungstag nach Wirkstoffzugabe 5 2 5 2

0 4 8 12 18 24

7,8 15,6 31,3 31,3 125 250

3,9 7,8 7,8 15,6 31,3 125

7,8

3,9

15,6

7,8

7,8

3,9

Zur Toxizitat der verwendeten Losungsmittel Fiir L-Zellen erwies sich ein Zusatz von 2 % gereinigtem DMSO und fiir Hiihnerembryonalzellen von 4 % als vertriiglich. Fiir DIFO lagen die tolerierten Dosen bei 1 % bzw. 3 %. Die Untersuchung erfolgte nach Verdiinnung im Erhaltungsmedium mit 2 % Serum durch mikroskopische Beobachtung iiber 5 T age.

Untersuchungen zur antiviralen Aktivitat von Cis-Platin. Wirkung auf extrazellulares Virus in proteinfreien Medien In T abelle 3 sind die Ergebnisse der Inaktivierung verschiedener Viren in Abhiingigkeit vom Alter der Stammlosung in verschiedenen Losungsmitteln dargestellt. Eine frisch bereitete Losung von Cis-Platin (c = 250 IlM/1 in proteinfreier Hankslosung) erwies sich unabhiingig vom Losungsmittel fiir L- wie auch FL-Zellen immer als zytotoxisch, obwohl die Einwirkungszeit auf Zellkulturen bei dieser Versuchsanordnung nur ca. 1 Std. (Virusadsorption nach der Virusinaktivierung) bei Zimmertemperatur betrug, da dann eine weitere Verdiinnung im Verhiiltnis 1: 5 durch Zugabe von Erhaltungsmedium erfolgte. Eine aus einer gealterten DMSO-Stammlosung hergestellte Verdiinnungsreihe war jedoch noch in einer Konzentration von 250 IlM/1 vertraglich und inaktivierte VSV, Vaccinia- wie auch Adenovirus Typ 5 in dieser wie auch in wesentlich geringeren Dosen (Tab. 3). Hiihnerembryonalzellen zeigten It. T abelle 1 eine etwas geringere Empfindlichkeit gegeniiber Cis-Platin-Losungen im Vergleich mit L-Zellen. Frisch hergestellte Losungen (c = 250 fA,Mll) wurden oft wiihrend des einstiindigen Kontaktes toleriert und schiidigten diese Zellen nur manchmal. Die Inaktivierung von Vacciniavirus wurde vom Losungsmittel wie auch vom Alter der entpsrechenden Stammlosung nicht beeinflulk Dies wurde durch die Befunde mit VSV und Adenovirus bestiitigt, obwohl auf Grund der grogeren Empfindlichkeit der Wirtszellen lediglich geringere Konzentrationen, in diesem Fall 25 fA,M/l, miteinander verglichen werden konnten.

Cis-Platin und Dimethylsulfoxid

113

Tabelle 3. Zur antiviralen Wirkung von Cis-Platin in Abhangigkeit vom Lasungsmittel und Alter der Stammlasung (c = 50 mMlI)

Virus

Lasungsmittel

Vaccinia

DMSO

Aqua dest.

VSV

Adeno Typ 5

Aufbewahrungsdauer der Stammlasung bei 4 °C Tage 0 3 7 45 0 3 7 120

Titerreduktion nach einstiindiger Behandlung extrazellularen Virus in % (Vaccinia *) bzw.loglo TCD 50 (VSV", Adeno"*) Substanzkonzentration in IlMiI 250 25 100ltoxisch 95 100 100 98 80

99 99

68 36 91 98 78 65 47 97

DIFO

20 45

toxisch toxisch

100 98

DMSO

0 8 60

toxisch 4,4 3,83

2,97 3,92 > 2,0

Aqua dest.

60 120

toxisch

1,17 2,33

DIFO

0 8 60 120

toxisch toxisch toxisch

1,17

0 40

toxisch > 2,66

1,17 2,17

Aqua dest.

120

toxisch

2,72

DIFO

120

toxisch

1,08

DMSO

2,33 2,77

Titer der unbehandelten Kontrollen (Mittelwert aller Versuche) : • Vacciniavirus: 318 PFU (plaquebildende Einheiten) •• VSV: 105,29 TCD50/0,2 ml .... Adenovirus Typ 5: 104 ,58 TCD 50 /O,2 ml

Untersuchungen zur Stabilitat der biologischen Wirkung einer Cis-Platin-DMSOStammlosung Eine Lasung von Cis-Platin in DMSO (c = 50 mM/l) wurde in den aus Tabelle 4 ersiehtlichen Zeitabstiinden unter weiterer Verdiinnung auf antivirale Wirkung untersueht. In einem Zeitraum von 9 Monaten hat sich die Effektivitiit beziiglieh der Inaktivierung von Vaccinia-, Vesicularstomatitis- wie auch Adenovirus Typ 5 nahezu unveriindert erhalten.

8 Zbl. Bakl. Hyg. A 257

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M. Tonew et al.

Tabelle 4. Antivirale Wirkung einer Cis-Platin-Stammlasung in DMSO (c = 50 mM/l) in Abhangigkeit vom Alter

ftM/l

Einstiindige Einwirkung auf zellfreies Virus in proteinfreier Lasung Titerdifferenz zur unbehandelten Kontrolle* in % PFU/Log lO % PFU/Log lO % PFU/Log 10 % PFU/Log lO 6 Wochen 3 Monate 6 Monate 9 Monate

Vaccinia

250 25

100 87

VSV

250 25

4,83 3,83

4,83 2,56

4,08 1,76

3,87 2,58

Adeno Typ 5

250 25

3,0

3,5 0,17

3,02

2,68 1,75

Virus

Konzentration

100 74

°

100 77

* Titer der unbehandelten Kontrollen wie in Tab. 3 angegeben

100 69

°

Zur antiviralen Wirkung von DMSO DMSO zeigte in einer Konzentration von 0,5 % in proteinfreier HankslDsung keine Inaktivierung der hier verwendeten Viren. Auch 1 %,2 % und 4 % DMSO veriinderten die Infektiositiit von Vacciniavirus nicht.

Untersuchungen zur antileukiimischen Wirkung in vivo Die frisch hergestellten und sofort applizierten Cis-Platin-LDsungen waren stark antileukamisch wirksam, unabhangig davon, ob die Substanz in Aqua dest. geiDst oder 30 Min. mit DMSO inkubiert worden war (Tab. 5 und 6). 1m Gegensatz zu dem kurz Tabelle 5. Wirksamkeit von frisch in Aqua dest. gelastem Cis-Platin gegen die experimentellen Leukamien P 388 und L 1210 der Maus Dosis mg/kg

P 388 VU%

Oberlebendel

L 1210 VU%

7,5 3,8 1,9 0,9 0,5 0,25 unbehandelte Kontrollen

-34,3 t* - 6,5 112,1 * 171,4" 111,5* 67,9*

0/12 0/12 5/12 8112 4/12 1112 0/32

Oberlebendel von msges.

von insges. -18,2 t 22,5 75,2* 62,4* 52,7* 30,9*

0112 0/12 4112 3112 0/12 0/12 0/30

VU = Verlangerung der mittleren Oberlebenszeit gegeniiber den Kontrollen, 2 Experimente gemittelt. Den Versuchszeitraum iiberlebende Tiere sind nicht in jedem Faile als geheilt zu betrachten. Mittel aus signifikanten Ergebnissen t = toxisch

12,9 12,6 8,5 9,1 * 9,4* 0,7 * -0,7 ' -1 ,6 * -1 ,6

VCr %

0/33

01 6

011 8 011 8 0/12 0112 0/12

01 6 01 6 01 6

Oberlebendel von insges.

5 Wochen mit DMSO

Mittelwerte aus signifikanten Ergebnissen + signifikante Ergebnisse VCr s. Tab. 5

*

62,5 31,0 15,5 7,5 3,8 1,9 0,9 0,5 0,25 unbehandelte Kontrollen

Dosis mg/kg

-18,7 t * 19,7 124,2* 154,8* 99,9 *

VCr %

0/33

0/12 0/12 3/12 8/12 3/12

Oberlebendel von insges.

30 Min. mit DMSO

-56,2 t+ -34,4 t+ -26,6 t+ 40,6+ 75,0+ 81,2+

VCr %

6 6 6 6 6

0/21

II 6

01 01 01 01 01

Oberlebendel von insges.

5 Wochen mit Aqua dest.

Tabelle 6. Antileukiimische Wirksamkeit von in DMSO beziehungsweise Aqua dest. gelosten Cis-Platin-Proben in Abhangigkeit vom Alterder Losungen am P 38 8-Modell der Maus

'"

e-

Vo

,... ,...

EO' >< 0:

v;-

'<

(1)

S"

t:)

0-

::>

:::

5"

E""

Q.

116

M. Tonew et al.

in DMSO gelosten Cis-Platin hatte die 5 Wochen lang in DMSO aufbewahrte Prohe keine antileukamische Wirkung mehr. Ihre Toxizitat war aher so vermindert, daB ein Vielfaches der sonst toxischen Dosis (62,5 mg/kg gegeniiher 7,5 mg/kg) vertragen wurde. Die Wirksamkeit des mit Aqua dest. (c = 0,75 mg/ml) 5 Wochen hei etwa 4°C inkuhierten Cis-Platins war im Gegensatz zur ehenso hehandelten DMSO-Losung (c der Stammlosung = 6 mg/ml) noch eindeutig vorhanden (Tah. 6). Die Toxizitat hatte sich jedoch wesentlich erhoht (ca. Faktor 4).

Diskussion In wassriger Losung unterliegt Cis-Platin hydrolytischen Reaktionen, die sich folgendermaBen formulieren lassen: [(NH3lzPtCI2]

!t H20

2

[(NH3lzPtCl(OH W + Cl-

!tH20

[(NH3lzPtCl(OH)]

+ H3 0 +

~29

[(NH3lzPt(OH2 lz]++ + 2Cl-

!tH20

[(NH3lzPt(OH 2)(OHW

+ H3 0 +

Da die Hydrolyse mit der Bildung ionischer Spezies einhergeht, laBt sie sich durch Leitfahigkeitsmessungen hei 25°C verfolgen. Die Zeitahhangigkeit der elektrolytischen Leitfahgikeit von Cis-Platinlosungen zeigt, daB nach etwa 10 Std. die Gleichgewichte im wesentlichen eingestellt sind, d. h. daB die Leitfahigkeit hei langerer Reaktionszeit nur noch sehr langsam steigt (5). Auch Losungen von Cis-Platin in DMSO verandern in Ahhangigkeit yom Alter der Losungen ihre elektrolytische Leitfahigkeit. Die diesem Phanomen zugrunde liegende chemische Reaktion lagt sich durch das Schema [(NH3lzPtCI 2]

~MSS>

[(NH3lzPtCl(DMSOW

+ Cl-

beschreiben. (5; Heyn u. Richter, unveroffentlicht). Das Gleichgewicht ist hier nach ca. 12 Std. weitgehend eingestellt. HPLC-Untersuchungen zeigen, dag Cis-Platin beim Auflosen in DMSO rasch eine chemische Reaktion mit dem Solvens eingeht. Nach 16-20 Std. ist die mit dieser Methode nachweisbare Veranderung noch nicht vollstandig beendet. Lost man, wie bei Untersuchungen der antiviralen und antileukamischen Eigenschaften beschrieben, Cis-Platin in DMSO und verdiinnt frisch bereitete derartige Losungen mit Wasser, so zeigt ihre elektrolytische Leitfahigkeit ein beschleunigtes Ansteigen mit der Zeit gegeniiber derjenigen von Losungen in reinem Wasser und in reinem DMSO. Verdiinnt man "gealterte" DMSO-Losungen von Cis-Platin mit Wasser, so findet man hohere Anfangswerte der Leitfahgikeit im Vergleich zu den aus frisch bereiteten DMSO-Losungen hergestellten Verdiinnungen; aher in heiden Fallen strehen die Leitfahigkeiten denselben Endwerten zu. Die Gleichgewichte sind nach ca. 400 Min. im wesentlichen eingestellt. Insgesamt hat man fiir derartige DMSOlWasser-Gemische von Cis-Platin nehen dem hereits erwahnten Gleichgewicht noch mit folgenden Reaktionen zu rechnen:

Cis-Platin und Dimethylsulfoxid

[(NH3hPtCl(DMSO)]

~2?

117

[(NH3hPtCl(OH zW !iHzO [(NH3hPtCl(OH)]

+ H3 0 +

Die Ergebnisse der Leitfahigkeitsuntersuchungen zeigen, daB besonders bei so starker Verdiinnung mit Wasser, wie sie bei den biologischen Untersuchungen angewandt wurde, Gleichgewichte der letztgenannten Art zu diskutieren sind. Die zeitbedingte Zunahme der Zellvertraglichkeit der Cis-Platin-Losung in DMSO laBt sich dadurch erklaren, daB entsprechend den Gleichgewichtsreaktionen der voranstehenden Art unter den angewandten experimentellen Bedingungen in Zeitabhangigkeit mehrere Platinspezies entstehen, die unterschiedlich toxisch sind. Eine frisch bereitete und sofort eingesetzte DMSO-Stammlosung zeigte sich dagegen in vitro ebenso zytotoxisch wie eine Vergleichslosung in Aqua dest. oder auch in Dimethylformamid. Dimethylformamid ist zu keiner Austauschreaktion mit Cis-Platin befahigt. Bei Stammlosungen in Aqua dest. bzw. DIFO konnten keine zeitbedingten Zytotoxizitatsanderungen gefunden werden. Obwohl zur Beurteilung der zytotoxischen Wirkung von Cis-Platin unterschiedliche Methoden verwendet wurden, sind die entsprechenden Ergebnisse doch miteinander vergleichbar. Wenn auch bei einigen Literaturdaten keine Angaben zum Losungsmittel gefunden wurden, kann nach den Ergebnissen und vorliegenden Erfahrungen geschluBfolgert werden, daB offenbar wassrige Losungen eingesetzt wurden. Die hohe Toxizitat der DMSO-Losung, die Roberts (17) beschrieb, ist nur erklarbar, wenn diese Praparation unmittelbar nach Ansetzen angewendet wurde. Zellkulturen unterschieden sich jedoch in ihrer Empfindlichkeit gegeniiber Cis-Platin auch bei Anwendung gleicher Bedingungen. So erwiesen sich HeLa-Zellen ca. dreimal so empfindlich wie chinesische Hamsterzellen, wenn die Konzentrationen verglichen wurden, die nach zweistiindiger Behandlung ein 50%iges Dberleben ermoglichten (18, 25). Unter Verwendung von Eagle-Medium mit 10 % fetalem Kalberserum als Losungsmittel fiir Cis-Platin zeigten sich normale menschliche Embryozellen (IMR 90) 5-fach empfindlicher als SV 40-transformierte VA 13-Zellen (6). Ein erweiterter Vergleich mit 8 humanen Tumorlinien ergab 10-fache Konzentrationsunterschiede beziiglich der Empfindlichkeit gegeniiber Cis-Platin nach 2-stiindiger Behandlung (14). Die Autoren stellten fest, daB die zytotoxische Wirkung mit der DNS-Interstrang-Verkniipfung besser als mit der DNS-Protein-Verkniipfung von Cis-Platin korreliert. Diese sei abhangig von der Substanz, die mit der DNS als Zielscheibe reagiert. Van den Berg (25) sah eine Ursache fiir die groBere Empfindlichkeit von HeLagegeniiber Hamsterzellen in der geringeren Fahigkeit ersterer, Liisionen ihrer DNS durch Cis-Platin bei einem "post replication repair process" auszuschalten. Dieses konnte evtl. auch als Ursache dafiir gelten, daB sich in unseren Untersuchungen LZellen gegeniiber Hiihnerembryonalzellen empfindlicher zeigten. Eine gesteigerte Reaktivitat (z. B. beziiglich einer Hemmung der zellularen Proteinsynthese) von gealterten aquatisierten Cis-Platin(II)-Komplexen in vitro wurde von Kohl et al. (10) beschrieben. In vitro wurde die Erhohung der Toxizitiit von gealterten wassrigen Losungen nicht gefunden. Die Ursache konnte der Ansatz einer c = 50 mM/1 sein, die als Suspension vorlag und offensichtlich im gelosten Anteil zu nur geringen Umsetzungsmengen fiihrte, die sich bei einer Verdiinnung dem Nachweis entzogen, wahrend der nicht geloste Bestandteil erst durch diesen Schritt in Losung ging.

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M.Tonew et al.

Die virusinaktivierende Fiihigkeit von Cis-Platin war von dem verwendeten Losungsmittel sowie seinen moglichen zeitbedingten Reaktionen mit dem Wirkstoff unabhangig. Auf Grund der besseren Zellvertraglichkeit von Cis-Platin-DMSO-Losungen konnten jedoch im Vergleich mit Aqua dest. bzw. DlFO als Losungsmittel hohere Wirkstoffkozentrationen bei der antiviralen Priifung eingesetzt werden. Untersuchungen zur Beeinflussung der Virusreplikation, wie von Tonew et al. (24) fiir Cis-PlatinlDMSO bereits beschrieben, wurden fiir andere Losungsmittelsysteme bisher noch nicht durchgefiihrt. Die von uns verwendeten Konzentrationen von DMSO (:5 0,5 % ) zeigten keinen EinfluB auf die eingesetzten Viren. Von Chan u. Gadebusch (3) wird fiir einige umhiillte DNS- und RNS-Viren die viruzide Wirkung einer 80%igen DMSO-Losung beschrieben, wah rend 50 % keine signifikante Wirkung aufwiesen. Chang u. Simon (4) berichteten iiber eine Titersenkung von Mengovirus in 6%igen und hoheren Konzentrationen DMSO. Wallis (26) sowie Larski u. Wisniewski (13) fanden mit einer 10- bzw. 5%igen DMSO-Losung sogar eine Stabilisierung von Herpeso, Masern- und Vesicularstomatitis- bzw. Newcastle disease-Virus. Diese Befunde unterstiitzen die von uns gefundenen Ergebnisse beziiglich der Unwirksamkeit der angewandten DMSO-Konzentrationen in unseren Versuchsanordnungen. Anders als bei der antiviralen Wirksamkeit in vitro verschwand in vivo mit der fallenden Toxizitat von Cis-Platin nach Alterung der Stammlosung in DMSO dessen antileukamische Wirkung. Die nach den Austauschreaktionen entstandenen Verbindungen sind also nicht mehr antileukamisch wirksam, wahrend die frisch in DMSO geloste, noch nicht umgewandelte Substanz Aktivitat aufwies. 1m Gegensatz hierzu war fiir Losungen in Aqua dest. sowohl bei sofortiger Anwendung als auch noch nach 5 Wochen eine cancerostatische Aktivitat zu finden. Die bei den wirksamen Losungen gefundenen maximalen Effekte sind beziiglich des P 388-Modells mit den aus der Literatur (16,21,27) bekannten vergleichbar, wohingegen die Wirksamkeit am L 12lO-Modell geringer war. Es ist jedoch auch zu beriicksichtigen, daB die vorliegenden Versuche zu einem relativ friihen Zeitpunkt (22. bzw. 30. Versuchstag) beendet wurden, und eine eventuelle Heilung der diesen Zeitraum iiberlebenden Tiere nicht in der Berechnung der mittleren Verlangerung der Oberlebenszeit beriicksichtigt wurde. Die geringere Wirksamkeit gegen die Leukamie L 1210 konnte im vorliegendem Fall evtl. durch die relativ groBere Anzahl implantierter neoplastischer Zellen oder auch durch eine aus friiheren Versuchen bekannte verminderte Empfindlichkeit der hier verwendeten L 1210-Linie bedingt sein (7, 8). Der Befund der zunehmenden In-vivo-Toxizitat unter Erhaltung der antileukamischen Wirkung von gealterten aquatisierten Cis-Platin-Losungen hangt moglicherweise mit der zeitabhangigen Einstellung von Austauschgleichgewichten der oben diskutierten Art zusammen. Insbesondere konnen aus den oben formulierten Komplexen [(NH 3)zPt (OH z) (OHW durch Kondensation Zweikern- und Dreikernkomplexe entstehen. Derartige Mehrkernkomplexe sind, wie Rosenberg (20) zeigen konnte, unmittelbar und erheblich toxischer als Cis-Platin, zeigen aber keinerlei cancerostatische Wirksamkeit mehr. Die sehr geringe Bildungsgeschwindigkeit dieser Komplexe kann das langsame Ansteigen der elektrolytischen Leitfahigkeit der Losungen nach langerer Reaktionszeit erklaren. Eine Herabsetzung der In-vivo-Toxizitat fiir die Maus unter Beibehaltung der can-

Cis-Platin und Dimethylsulfoxid

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cerostatischen Wirkung von Cis-Platin in hypertonischer NaCl-Losung wurde von Litterst (15) beschrieben. Zum moglichen cancerostatischen Wirkmechanismus von Cis-Platin selbst sei auf Literatur (19, 20) verwiesen. Die von uns gefundene Zytotoxizitat von frisch bereiteten Losungen von Cis-Platin in DMSO, Aqua dest. bzw. DIFO deckt sich mit den Angaben in der zitierten Literatur. Dag eine gealterte DMSO-Losung nach weiterer Verdiinnung eine ca. 25-fach bessere Vertraglichkeit fiir Zellkulturen zeigt, ist unseres Wissens fiir Cis-Platin noch nicht beschrieben worden. Dieser Praparation kommt jedoch auf Grund des Verlustes der Antitumorwirkung evtl. eine praktische Bedeutung beziiglich der erhaltengebliebenen antiviralen Wirkung zu (WP angemeldet). Die vorgestellten Ergebnisse berechtigen zu der SchluBfolgerung, daB die Antitumorwirkung von Cis-Platin offenbar nicht mit seiner antiviralen Wirkung in vitro korreliert.

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Dr. sc. nat. Marion Tonew, Zentralinstitut fur Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Beutenbergstr. 11, DDR-6900 Jena