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Über das Vorkommen von Canavanin1
Flora Bd. FlO, H. 1, S. 87 --B-1 (1 BG 1) Aus dcm Institut fiir Allgemeine Botanik
Uber das V orkommen von Canavanin 1) Yon
B. Tschiersch Mit 1 AbbiIdling illl Text (Eingegangen am 15. Juli 1860)
Canavanin, cine Aminosaure, die durch die Untenmchungen von KITM+AWA und Mitarbeiter bekannt goworden ist, hat in den lctztrn .Jahrrn wiederholt bpi Untersuchungen tiber den Stickstoff-Stoffwechsel von Mikroorganismen Verwcmlung gefunden. Es ist auf Grund seiner dem Arginin sehr iihnlichen Struktur als kompetitiver Inhibitor de·r Reaktion dieser Aminosaure benutzt ,vorden (Zusammenfassung hei: SNELL 1958, TSCHlEHSCH 1959). H2N-C-'NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COOH II I NH NH2 Arginin
H2N-C-NH-O-CH2-C112-(;H--COOH II I NH Canavanin Uber das nattirlicho Yorkommen dieser interessanten Verbindung sind erst in den letzten Jahren genauere Angaben bekannt geworden. So konnten FEARON und BELL (1955) zeigen, daB sich das Vorkommen dieser Verbindung nicht auf die Gattung Canavalia beschrankt, in der sic von KITAGAWA und TOMIYA1\U (1929) sowie von J)UIODARAN und NARAYANAN (1939) nachgewiesen worden war. Neuere Untersuchungen fLihrten zu dem Ergebnis, daB das Canavanin ill dem Samcn ciniger wciterer Papilionaceen enthalten ist (BELL 1958, TSCIHEI{SCH 1959). Obwohl von uns gezeigt werden konnte, daB sich das Vorkommen dieser Verbindung nicht auf die Samen der Pflanzen besehrankt, sondern vielmehr eine be1) Herrn Prof. Dr. K. Untersuchungen.
MOTHES
danke ich fiir die Ermoglichllng und stetI' Fiirderung dieser
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TSCHIERSCH
deutende Rolle des Canavanins im Stickstoff-Stoffwechsel der Papilionaceen angenommen werden muB, bilden gerade die Samen ein ausgezeichnetes Material fUr vergleichende Untersuchungen. Bei der Testung der Samen eines gro.Beren Papilionaceen-Sortimentes erhielten wir interessante Ergebnisse liber die Verbreitung des Vorkommens dieser Aminosaure, die im folgenden mitgeteilt werden sollen. Material und Methoden
Die Untersuchungen tiber die Verbreitung des Canavanins wurden an Samen verschiedener Herkunft durchgefUhrt. Die Samen der bei uns vorkommenden Papilionaceen wurden hauptsachlich im Botanischen Garten zu Halle und in den Anlagen des Institutes fUr Kulturpflanzenforschung in Gatersleben geerntet. Weitere Samen wurden liber Tauschlisten aus verschiedenen botanischen Garten bezogen. Die Bestimmung des Canavanins wurde nach der von FEARON (1946) eingehend untersuchten, auf Guanidinoxy-Verbindungen spezifischen Farbreaktion durchgefUhrt. Von ihm war festgestellt worden, da.B Pentacyanoferrat-Derivate mit substituierten Guanidinen unter Bildung von charakteristisch gefarbten Komplexen reagieren. Guanidinoxy-Verbindungen wie das Canavanin reagieren dabei nur in dem pH-Bereich 5,0-7,5, wahrend die Alkyl-substituierten Guanidine wie das Arginin erst im alkalischen Bereich eine Farbreaktion ergeben. Ahnliche Beobachtungen waren bereits von KITAGAWA (1937) und von ARCHIBALD (1956) gemacht worden. Eine frisch zubereitete Losung von Trinatriumpentacyanoammonioferrat (PCAF) reagiert mit Canavanin erst nach "Aktivierung" durch Einwirkung von Tageslicht, bei der eine spontane Oxydation eingeleitet wird. Das entstehende Gemisch der Ferri- und Ferro-Komplexe ist stabil und kann ohne Verlust an Aktivitat in brauner GlasfIasche bei tiefer Temperatur bis zu einem Monat aufbewahrt werden. Die Genauigkeit der Bestimmungen wurde durch in den Samenextrakten enthaltene, reduzierend wirkende Verbindungen beeintrachtigt. Wahrend fiir qualitative Teste im Reagenzglas Rohextrakte ohne weiteres verwendet werden konnen, ist fiir quantitative Bestimmungen des Canavanins eine Reinigung der Extrakte nicht zu umgehen. Wir verwendeten die von PLAISTED (1958) angegebene Methode der Reinigung von Aminosauregemischen an Dowex-50-Saulen in alkoholischem Medium. hur Bestimmung des Canavanins wurden jeweils 200 mg des trockenen und entfetteten Samenmehles mit 70 % Athanol (3 X 10 ml) extrahiert. Nach Reinigung der Extrakte an Dowex-50-Saulen aliquote Anteile der im Vakuum eingetrockneten, mit 50 % Athanol aufgenommenen Proben fUr die kolorimetrische Bestimmung des Canavanins verwend!'t. Dabpi wurden 5 ml der Canavanin enthaltenden Losung mit 4 ml Phosphatpuffpr pH 7,0 und 1 ml PCAF-Reagens versetzt. Die Messung erfolgte nach 30 Minuten illl EpPENDORF-Photometer bei 546 m,u. Die vorliegenden Cana-
Cber das Vorkommen von Canavaniu
vaninmengen wurdcn dureh Vcrgleieh mit eincr parallel hcrgestellten Eichkurvc ermittelt. Die Identifizierung des Canavanins auf dem Papierehromatogramm erfolgte naeh dem glciehen Prinzip. Die getroekneten Chromatogramme wurden mit einer PCAF-Losung (1 % in Phosphatpuffer pH 7.0) bcspriiht. :\fit Canavanin ergibt sieh sofort cine spezifisehe Rotfarbung. Ergebnisse
Bei del' papicrehromatographisehen Untersuehmlg der in den Sa,men enthaltenen freien Aminosauren zeigte es sieh, daB das Canavanin unter diesen Verbindungen die \veitaus groBte Konzentration aufweisen imnn. Bis ;m 80 % des lOsliehen Stiekstoffes kiinnen in Form diesel' Verbindung yorliegen. Aus den abgcbildeten Chromatogrammen del' in den Samen einiger Camwaninpflanzen enthaltenen freien Aminosauren ist zu erkennen, daB neben dem Canayanin nur noeh geringe Mengen anderer Aminosauren vol'handen sind (s. Abb. 1). AIle Samen, deren Extrakte auf dem Chromatogramm in del' Position des Camwanins die fUr diese Verbindung spezifisehe Farbl'eaktion erkennen lieBen. wurdpn als Canavanin-fiihrend betraehtet. In einigen Fiillen, wie bei Colu.tpa. Cumgann und Robinin wurde diese Annahme dureh die Ixolation und Identifikation del' erhaltenen Canavaninsulfat-Kristalle bestatigt. Die quantitative Bestimmung des so nachgewiesenen Canavanins ergab die in der_ folgenden Tabelle zusammengestellten Werte. Dariiber hinaus sind in del' Tabelle auch die Papilionaceen angegeben, in denen kein Canavanin naehge\viesen werden konnte (s. Tabelle). Aus den in del' Tabelle mitgeteilten Ergebnissen ist zu entnehmen, daB in den Samen von 30 Gattungpn der Papilionacppn Can
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Robinia pseudacacia
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Canavalia ensiforml::!
Abb. 1. Zusammensetzung der freien Aminosanren reifer Samon. -t -- Glutamillsanre, 5 = Asparagin:;iiure. 8 = Threonin. ~) = Alanin, 17 a = Canavallin.
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Damit haben sich fast die Halfte del' untersuchten 68 Gattungen als CanavaninPflanzen enviesen. In cineI' Anzahl von Mimosaceen und Caesalpiniaceen konnte diese Verbindung nicht gefunden werden (Albizzia lophantha, Acacia lophantha, )1imosa pudica, N eptunia gralilis, Ceratonia siliqua und Gleditschia triaranthos. In einzelnen Fallen war es miiglieh, cine griiI3ere Anzahl von Arten einer Gattung zu untersuchen. Dabei wnrden z. B. bei 5 Arten del' Gattung Camgana unterschiedliche Canavanin- Konzentrationen beobachtet. Besondere Bedeutung ist dies en Ergebnissen nicht beizumessen, da auch bei verschiedenen Jahrgangen odeI' verschiedenen Herkiinften einer Art unterschiedliche Canavanin- Konzehtrationpn gdunden wurden. Inwieweit die festgestellte Variation des Canavaningehaltes auf unterschiedliche Umweltsbedingungen zmiickzllfiihren ist, konnte nicht entschieden werden. Es ist abel' erst in letzter Zeit wiederholt demonstriert worden, daB auJ3ere Bedingungen wie Zeitpunkt del' Reife, Wittcrungsverhaltnisse, Standortbedingungen u. a. einen starken Einflu13 auf die Zusammensetzung del' liislichen Stickstofffraktion und auf die Konzentration einzelner Aminosanren haben kiinnen (Zusammenfassung bei: FOWDEK 1959). Bei del' Untersuchung eines Samensortiments sehr verschiedenel' und nicht genau definierter Herkunft kiinnen derartige Faktoren nicht beriicksichtigt werden. Die mitgeteilten Ergebnisse stellen deshalb nul' Anhaltspunkte fiir die Menge des Canavanins dar, die in den Samen del' betreffenden Gattung erwartet werden kann. Das Canavanin ist offensichtlirh eine del' wenigen Aminosauren, die nul' in einer bestimmten Gruppe von Pflanzen vorkommen. Viele del' in letzter Zeit entdeckten Aminosauren weisen eine we it allgemeinere Verhreitung auf. Es sei hier an die /-Aminohuttersaure erinnert, die bei ihrem ersten Nachweis in Pflanzen einige Aufmerksamkeit erregte und die his her in allen Organismen nachgewiesen werden konnte. in denen danach gesucht wurde. Eine Reihe anderer Aminosauren wie das p-Alanin, die p, y-Dihydroxyglutaminsaure, die a-Aminoadipinsanre, die Pipecolinsanre u. a. Bind ehenfalls in einer groJ3en Anzahl von Pflanzen aus den verschiedensten Familien gefunden worden. Andere neue Aminosauren sind dagegen hisher nul' in wenigen Pflanzen oder sogar nur in dem Objekt. aus dem sie erstmals isoliert wurden, nachgewiesen worden. So ist von del' y-Methylenglutaminsaure und ihrem Amid bisher nul' das Massenyorkommen in Arachis bekannt. Ganz ahnlich liegen die Dinge bei Theanin, a-Aminopimelinsaure, ?,-Hydrox~T-a-aminopimelinsaure, ;,-Amino-a-methylenhuttersaure, Methylprolin, H~Tdroxymethylprolin und anderen Verhindungen. Genauere Untersuchungen werden vermutlich erweisen, daJ3 auch diese Verbindungen noch in weiteren Pflanzen enthalten sind. Besonderes Interesse verdienen naturgemaJ3 die Aminosauren, deren Vorkommen auf eine engere Gruppe yon Pflanzen beschrankt ist. In del' bei Ihnen offpn-
l'brr das Vorkommen von Canavanin
sichtlich vorliegendrn physiologischen Spezialisierung ist ein Merkmal gegeben, daB auch fiir taxonomische Betrachtungen wertvoll sein konnte. Einer der gut untrrsllchten FaIle dieser Art ist das Vorkommen der Azetidin-2carbonsaure. An diesem Beispiel sind erstmals die Beziehungen zwischen dem Vorkommen einer Aminosaure und der taxonomischen Stellung der diese Verbindung enthaltenden Pflanzen eingehend gepriift worden. FOWDEN und STEWARD (1957) finden die Azetidin-2-carbonsaure nur in einigen Liliaceen, Agavaceen und AmaryIlidaceen. Innerhalb der Liliaceen kommt sie nur in etwa einem Viertel der untersuchten 89 Arten vor. Obwohl ein groBer Teil dieser Azetidin-2-carbonsaure-Pflanzen sich folgerichtig ·in das von FOWDEN und STEWAHD verwendete System von ENGLER und PRANTL (1930) einordnen lassen, traten in einigen Fallen Pflanzen auf, die die Verbin dung enthielten und nicht in dieses System paBten. In anderen Pflanzen konnte diese Verbindung nicht gefundcn werden, obwohl sie nach dem System dicht neben Azetidin -2-carbonsaure-Pflanzen stehen. Ganz ahnliche Verhaltnisse sind aus den mitgeteilten Ergebnissen der Untersuchungen liber die Verteilung des Canavanins zu ersehen. In 30 der untersuchten 68 Papilionaceen-Gattungen konnte Canavanin in zum Teil sehr groBer Menge nachgewiesen werden. Bei der Anordnung der untersuchten Pflanzen nach dem System von ENGLER und PR.\l\TL (s. Tabelle) fallt auf, daB die Sophoreae, Genisteae und Tabelle 1 Ubersicht liber das Yorkomn\en von Canavanin in den Samen einiger Papilionaceen. Angaben in mg Canavanin/1 g Trockengewicht. Sophoreae Sophora japonica Sophora speciosa Ammodendmn conolly Cladrastis ltttra . Genisteae Lupinus lulrus Lupinus albus Lupinus angustifolius Lupinus mulabilis Sparlium junceum. Genista europaea Genisla tinc/oria.. Genista ovala . Pelteria ramen/acea Laburnum alpinum Laburnum vulgare. Ulex europaeus . Cytisus supinus Cytisus purpureus Cytisus nigricans Sal'Otharnnus scoparius.
Trifolieae Ononis spinosa Ononis repens. Trigonella foenum graecum Medicago falcala Medicago sativa. Medicago lupulina Medicago pros/rala Medicago media Melilotus albus Melilotus dentata Melilotus officinalis . Trifolium pannonicum. Trifolium pratense Trifolium repens Trifolium incarnatum Trifolium alpinum Loteae Anthyllis vulneraria . Anthyllis barva J ovis Dorycnium erectum Dorycnium hirsutum.
4,73 5,42 3,48 14,33 16,27 13,95 15,05 14,73 4,55 3,82 3,96 14,03 14,68 12,62 13,05 14,22 20,50 21,16 24,05 23,86
B. Lotus cornicula/us La/us /etragonolobus Lotus siliquosus.
TSCHIEHSCH
14,95 14,33 12,87
Galegeae I ndigotera gerardiana Indigofera tine/oria Psora len bitllminosa . AmoTpha frucl'iosa. Amorpha ]Janiculata Amorpha. Amorpha. Dalea alopccuroides Dalea nana. Galega officinalis Tephrosin t'irginiana 211 illetia atTOpur]lurea 2"1 iUe/ia cmeTea . Robinia ]Jseudacaeia Robinia glutinosa Robinia hispida . Sutherlnndia frutescens. Swainsonia galegifolin Smirnowin turees/m7a {Jolutea arboreseens Colutea orientalis Coln/ca media Coln/ea ciliciC({ Coluten persim lIalirnodendron argenteu1l! Caragana arborescens Caragana fndeseens Caragann pygmaea Cnragana mierophylla Caragana brevispina Calophacl! wolyarien . Astragll Ius eieer Astragnilis ylyeiphyllos OXy/TOpis mmpcstris Glyeyrrhl:za ylabm. Glyeyrrhiza cchinata .
8,45 14,17
3,58 2,32 1,7G 35,60
32,44 32,96 13,30 10,25 41,J7 3G,82 36,9J
38,OJ 36,22 4,27 38,20 39,20
38,33 34,07 36,U2 20,96 9,49 14,G7
23,83 20,1G
HedysaHac Scorpiurus 1I7nrieatus Ornithojins slIlivus Omi/ho }ln8 perpu sillus {Joronilla I'arw CoronilllJ, coronll/a C:oronilla vayinal'is lIi}J1JOC1"eVis ('011708((
17,88 13,32 12,32 lU,50 2G,3G 18,H3 4,07
Hedysarll1n obsCllrwlt Hedysllr1l1n CIIpita/wli Onobrycilis s(J,i'ira Ebemls eretiea A lhayi 1"izyliisonml Aesch inomenr indil'll Al"lu1!is hypogllca Desllwdiurn call1/denS'I'8. Lourca rrs]lrr/iliolli." LespedezlI bieolor LesJiedeza macroN! rpll Lesj!edl'ZI! seriel'lI Viciaeap Cicer af'iel'illllill F ieil1 sa/iull Ficia eil/osl! Fieia {aba V1'cia II frojJ 11 f}11I 1"1'1/ Lens 1'8culellta LatltYfll" lal1fol'ills La/hyrus or/oratlls , Lathyrus pratens!:; La/hyrus /uberosis, Pisu 117 sa/inon Abrus jil'ecaiorills
H),B8 H,21
18,H9
15,60 3,74 3,86 2,09
Phaseoleae Glycine hisjJida , Kennedya pros/rata. Kennedya c?ccinca ETy/hrina crista. yalli Apios tubcrosa. Apios arnenealllt Mucuna pruricns 211uemln utilis ~v111elllut deeringialla , Pueraria phaseoloides CanaL'alia ens'i{ormis Canamlia ylndt'atn Cajanus indiClls. Rhynchosia pyramidalis Phaseolus nwltiflorus Phaseolus luna/us, Phaseolnswlyaris, Phaseolus munyo Fignn cylinilrim Viyna :;inrnsis Dolichos lab-lab. Doliehos bif70rus
18,23 H,9?
3H.H2 3G,53
tbrr das Y" orkommen von Canavanin
Vil:iuccte kein Canavanin en thai ten. AIle untersuchten Gattungen der Trifolieae und Loteae fiihren dagl'gen Canavanin. Uniibersichtlich werden die Verhaltnisse bei der Betrachtung der Oalegeae, Hedysureae und Phuseoleae. Es finden sich hier die typischen Canavan in-Pflanzen dicht neben Gattllngen, die diese Verbindung nicht enthalten. Abschliel3end lal3t sich liber das Vorkommen des Canavanins feststellen, daB die bisher nur in Papilionaceen und nUl" als freie Aminosaure nachgewiesene Verbindung nicht gleichmal.lig tiber dil'se Familie verteilt ist. Neben Canavanin-fiihrenden Gruppen von Pflanzen sind Canavanin-freie vorhanden, die jedoch keine Gesetzmal3igkeit in der Verteilung iiber das System der Papilionaceen erkennen lassen. Dieses Ergebnis stimmt grundsatzlich mit den von FowDEN und STEWARD (1957) iiber die Verbreitung von Azetidin-2-carbonsaure in Liliaceen mitgeteilten Beobachtungen iiberein. Die Untersuchungen reichen natiirlich nicht aus, eine Entscheidung dariiber zu fii·llen: 1. ist Canavanin "'irklich nUl" fiir Papilionaceen charakteristisch, was bis jetzt wahrscheinlieh ist, 2. sind dio Cananmin-freien und die Canavanin-haltigcn Taxa wirklich generell "frei" oder "haltig', oder wiirden ,Yeitere Untersuchungen Ausnahmen ergeben, 3. wiirden Untersuchungen ,"erschiedenor Herkiinfte derselben Spezies ein un torschiedliches ehemiselws Yl'rhaltl'n ergl'ben (Existenz von chemischell Hassen). Diesl' Analysl'n stdll'l1 l'iIll' wesentlic}ll' Erweiterung unserer Kenntnisse zur Phytochemie des Camtyanin~ dar. Trotzdem darf man nieht iibersehen, dal.l das vorgelegte ::Vlaterial zahlenmal.lig reeht bescheiden ist im Verhaltnis zum Gattungsund Artenreiehtum der Papilionaceen. Es \yjrd bestiitigt, dafS Canavanin {'in eharakteristiseher, obwohl nie ht verbindlieher Stoff der Papilionaeeen ist; er ist systematisch noch weniger ,-erbindlich als etwa das Merkmal "FiederbIatter". Die Verteilung des Canavanins innerhalb der Familie liiBt wohl einigo Besonderhoitm erkennen, die aber ohne gezwungene Deutungen nieht taxonomisch begriindbar sind. Vielmehr scheint zunaehst griil.lte Vorsicht am Platze, ,-on einem strengen systematisehen \Vert dieser \'erbindung zu sprechen. Zusammenfassung
Es wurde ein griH3eres 80rtiment von Leguminosensamen auf CanC1vanin untersucht. Dabei wurde diese Aminosaure nur in Papilionaceen, nieht aber in Mimosaeeen und Caesalpiniaceen gcfundl'n. Von 68 untersuchten Gattungen weisen 30 eine zum Teil sehr hohe Can
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B. TS('ITIEI{S!'TI, ther das Yorkommen von Canavanin
Literatur AI{('IIIILlLD, R. ;\1., I9-1G. J. BioI. Ch('Ill. t;i6, lG9. - BELL, E. A .. IDo8. Bioehem ..J. 70, GIl. ENGLEH, A., U. P]{,\NTL, K., 1930. Dip natlirlichen PfIanzpnfamilien. Bd. 10a. Willi. Engelmann, Lpipzig. - FEA]{ON, \V. R, ID-1G. Analyst. 'i0, 5G2.· Den., n. BELL, [~. A., 1955. Biochem ..J. 59, 221. .- FOWDEN, L., 1959. BioI. Hev. 33, 393. -- Ders., and STE\V.\HD, F. C., 1957. Ann. Bot. Lond. 21, 53. - KITAG.IW.I, }f., 1~j37 ..J. BiocllPlll. Tokyo 2ii, 23. Del'S., n. TmlTYAMA, T., Hl29. J. Biochem. Tokyo 11, 2G5.· ['L,IISTED, ['. H., IH58. Contrih. Boycp Tholllpson lnst. 19, 231. - SKELL, K E .. K.HY.INKAH, G. ])., U. Ih.\wA, M., lD58 ..J. BioI. ('111'111. 233, 1175. - TSCHIEHSCH, B., IH5H. Flora 147, -105. Anschrift des Verfassers: Dipl.-Biol. B. TSCHTEHS('Il, Halle/S., lnstitut fiir Allgcllll'inc Botanik, Am Kirchtor 1.
Uber das V orkommen von Canavanin 1) Yon
B. Tschiersch Mit 1 AbbiIdling illl Text (Eingegangen am 15. Juli 1860)
Canavanin, cine Aminosaure, die durch die Untenmchungen von KITM+AWA und Mitarbeiter bekannt goworden ist, hat in den lctztrn .Jahrrn wiederholt bpi Untersuchungen tiber den Stickstoff-Stoffwechsel von Mikroorganismen Verwcmlung gefunden. Es ist auf Grund seiner dem Arginin sehr iihnlichen Struktur als kompetitiver Inhibitor de·r Reaktion dieser Aminosaure benutzt ,vorden (Zusammenfassung hei: SNELL 1958, TSCHlEHSCH 1959). H2N-C-'NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COOH II I NH NH2 Arginin
H2N-C-NH-O-CH2-C112-(;H--COOH II I NH Canavanin Uber das nattirlicho Yorkommen dieser interessanten Verbindung sind erst in den letzten Jahren genauere Angaben bekannt geworden. So konnten FEARON und BELL (1955) zeigen, daB sich das Vorkommen dieser Verbindung nicht auf die Gattung Canavalia beschrankt, in der sic von KITAGAWA und TOMIYA1\U (1929) sowie von J)UIODARAN und NARAYANAN (1939) nachgewiesen worden war. Neuere Untersuchungen fLihrten zu dem Ergebnis, daB das Canavanin ill dem Samcn ciniger wciterer Papilionaceen enthalten ist (BELL 1958, TSCIHEI{SCH 1959). Obwohl von uns gezeigt werden konnte, daB sich das Vorkommen dieser Verbindung nicht auf die Samen der Pflanzen besehrankt, sondern vielmehr eine be1) Herrn Prof. Dr. K. Untersuchungen.
MOTHES
danke ich fiir die Ermoglichllng und stetI' Fiirderung dieser
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deutende Rolle des Canavanins im Stickstoff-Stoffwechsel der Papilionaceen angenommen werden muB, bilden gerade die Samen ein ausgezeichnetes Material fUr vergleichende Untersuchungen. Bei der Testung der Samen eines gro.Beren Papilionaceen-Sortimentes erhielten wir interessante Ergebnisse liber die Verbreitung des Vorkommens dieser Aminosaure, die im folgenden mitgeteilt werden sollen. Material und Methoden
Die Untersuchungen tiber die Verbreitung des Canavanins wurden an Samen verschiedener Herkunft durchgefUhrt. Die Samen der bei uns vorkommenden Papilionaceen wurden hauptsachlich im Botanischen Garten zu Halle und in den Anlagen des Institutes fUr Kulturpflanzenforschung in Gatersleben geerntet. Weitere Samen wurden liber Tauschlisten aus verschiedenen botanischen Garten bezogen. Die Bestimmung des Canavanins wurde nach der von FEARON (1946) eingehend untersuchten, auf Guanidinoxy-Verbindungen spezifischen Farbreaktion durchgefUhrt. Von ihm war festgestellt worden, da.B Pentacyanoferrat-Derivate mit substituierten Guanidinen unter Bildung von charakteristisch gefarbten Komplexen reagieren. Guanidinoxy-Verbindungen wie das Canavanin reagieren dabei nur in dem pH-Bereich 5,0-7,5, wahrend die Alkyl-substituierten Guanidine wie das Arginin erst im alkalischen Bereich eine Farbreaktion ergeben. Ahnliche Beobachtungen waren bereits von KITAGAWA (1937) und von ARCHIBALD (1956) gemacht worden. Eine frisch zubereitete Losung von Trinatriumpentacyanoammonioferrat (PCAF) reagiert mit Canavanin erst nach "Aktivierung" durch Einwirkung von Tageslicht, bei der eine spontane Oxydation eingeleitet wird. Das entstehende Gemisch der Ferri- und Ferro-Komplexe ist stabil und kann ohne Verlust an Aktivitat in brauner GlasfIasche bei tiefer Temperatur bis zu einem Monat aufbewahrt werden. Die Genauigkeit der Bestimmungen wurde durch in den Samenextrakten enthaltene, reduzierend wirkende Verbindungen beeintrachtigt. Wahrend fiir qualitative Teste im Reagenzglas Rohextrakte ohne weiteres verwendet werden konnen, ist fiir quantitative Bestimmungen des Canavanins eine Reinigung der Extrakte nicht zu umgehen. Wir verwendeten die von PLAISTED (1958) angegebene Methode der Reinigung von Aminosauregemischen an Dowex-50-Saulen in alkoholischem Medium. hur Bestimmung des Canavanins wurden jeweils 200 mg des trockenen und entfetteten Samenmehles mit 70 % Athanol (3 X 10 ml) extrahiert. Nach Reinigung der Extrakte an Dowex-50-Saulen aliquote Anteile der im Vakuum eingetrockneten, mit 50 % Athanol aufgenommenen Proben fUr die kolorimetrische Bestimmung des Canavanins verwend!'t. Dabpi wurden 5 ml der Canavanin enthaltenden Losung mit 4 ml Phosphatpuffpr pH 7,0 und 1 ml PCAF-Reagens versetzt. Die Messung erfolgte nach 30 Minuten illl EpPENDORF-Photometer bei 546 m,u. Die vorliegenden Cana-
Cber das Vorkommen von Canavaniu
vaninmengen wurdcn dureh Vcrgleieh mit eincr parallel hcrgestellten Eichkurvc ermittelt. Die Identifizierung des Canavanins auf dem Papierehromatogramm erfolgte naeh dem glciehen Prinzip. Die getroekneten Chromatogramme wurden mit einer PCAF-Losung (1 % in Phosphatpuffer pH 7.0) bcspriiht. :\fit Canavanin ergibt sieh sofort cine spezifisehe Rotfarbung. Ergebnisse
Bei del' papicrehromatographisehen Untersuehmlg der in den Sa,men enthaltenen freien Aminosauren zeigte es sieh, daB das Canavanin unter diesen Verbindungen die \veitaus groBte Konzentration aufweisen imnn. Bis ;m 80 % des lOsliehen Stiekstoffes kiinnen in Form diesel' Verbindung yorliegen. Aus den abgcbildeten Chromatogrammen del' in den Samen einiger Camwaninpflanzen enthaltenen freien Aminosauren ist zu erkennen, daB neben dem Canayanin nur noeh geringe Mengen anderer Aminosauren vol'handen sind (s. Abb. 1). AIle Samen, deren Extrakte auf dem Chromatogramm in del' Position des Camwanins die fUr diese Verbindung spezifisehe Farbl'eaktion erkennen lieBen. wurdpn als Canavanin-fiihrend betraehtet. In einigen Fiillen, wie bei Colu.tpa. Cumgann und Robinin wurde diese Annahme dureh die Ixolation und Identifikation del' erhaltenen Canavaninsulfat-Kristalle bestatigt. Die quantitative Bestimmung des so nachgewiesenen Canavanins ergab die in der_ folgenden Tabelle zusammengestellten Werte. Dariiber hinaus sind in del' Tabelle auch die Papilionaceen angegeben, in denen kein Canavanin naehge\viesen werden konnte (s. Tabelle). Aus den in del' Tabelle mitgeteilten Ergebnissen ist zu entnehmen, daB in den Samen von 30 Gattungpn der Papilionacppn Can
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~4 CJ 05
Canavalia ensiforml::!
Abb. 1. Zusammensetzung der freien Aminosanren reifer Samon. -t -- Glutamillsanre, 5 = Asparagin:;iiure. 8 = Threonin. ~) = Alanin, 17 a = Canavallin.
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Damit haben sich fast die Halfte del' untersuchten 68 Gattungen als CanavaninPflanzen enviesen. In cineI' Anzahl von Mimosaceen und Caesalpiniaceen konnte diese Verbindung nicht gefunden werden (Albizzia lophantha, Acacia lophantha, )1imosa pudica, N eptunia gralilis, Ceratonia siliqua und Gleditschia triaranthos. In einzelnen Fallen war es miiglieh, cine griiI3ere Anzahl von Arten einer Gattung zu untersuchen. Dabei wnrden z. B. bei 5 Arten del' Gattung Camgana unterschiedliche Canavanin- Konzentrationen beobachtet. Besondere Bedeutung ist dies en Ergebnissen nicht beizumessen, da auch bei verschiedenen Jahrgangen odeI' verschiedenen Herkiinften einer Art unterschiedliche Canavanin- Konzehtrationpn gdunden wurden. Inwieweit die festgestellte Variation des Canavaningehaltes auf unterschiedliche Umweltsbedingungen zmiickzllfiihren ist, konnte nicht entschieden werden. Es ist abel' erst in letzter Zeit wiederholt demonstriert worden, daB auJ3ere Bedingungen wie Zeitpunkt del' Reife, Wittcrungsverhaltnisse, Standortbedingungen u. a. einen starken Einflu13 auf die Zusammensetzung del' liislichen Stickstofffraktion und auf die Konzentration einzelner Aminosanren haben kiinnen (Zusammenfassung bei: FOWDEK 1959). Bei del' Untersuchung eines Samensortiments sehr verschiedenel' und nicht genau definierter Herkunft kiinnen derartige Faktoren nicht beriicksichtigt werden. Die mitgeteilten Ergebnisse stellen deshalb nul' Anhaltspunkte fiir die Menge des Canavanins dar, die in den Samen del' betreffenden Gattung erwartet werden kann. Das Canavanin ist offensichtlirh eine del' wenigen Aminosauren, die nul' in einer bestimmten Gruppe von Pflanzen vorkommen. Viele del' in letzter Zeit entdeckten Aminosauren weisen eine we it allgemeinere Verhreitung auf. Es sei hier an die /-Aminohuttersaure erinnert, die bei ihrem ersten Nachweis in Pflanzen einige Aufmerksamkeit erregte und die his her in allen Organismen nachgewiesen werden konnte. in denen danach gesucht wurde. Eine Reihe anderer Aminosauren wie das p-Alanin, die p, y-Dihydroxyglutaminsaure, die a-Aminoadipinsanre, die Pipecolinsanre u. a. Bind ehenfalls in einer groJ3en Anzahl von Pflanzen aus den verschiedensten Familien gefunden worden. Andere neue Aminosauren sind dagegen hisher nul' in wenigen Pflanzen oder sogar nur in dem Objekt. aus dem sie erstmals isoliert wurden, nachgewiesen worden. So ist von del' y-Methylenglutaminsaure und ihrem Amid bisher nul' das Massenyorkommen in Arachis bekannt. Ganz ahnlich liegen die Dinge bei Theanin, a-Aminopimelinsaure, ?,-Hydrox~T-a-aminopimelinsaure, ;,-Amino-a-methylenhuttersaure, Methylprolin, H~Tdroxymethylprolin und anderen Verhindungen. Genauere Untersuchungen werden vermutlich erweisen, daJ3 auch diese Verbindungen noch in weiteren Pflanzen enthalten sind. Besonderes Interesse verdienen naturgemaJ3 die Aminosauren, deren Vorkommen auf eine engere Gruppe yon Pflanzen beschrankt ist. In del' bei Ihnen offpn-
l'brr das Vorkommen von Canavanin
sichtlich vorliegendrn physiologischen Spezialisierung ist ein Merkmal gegeben, daB auch fiir taxonomische Betrachtungen wertvoll sein konnte. Einer der gut untrrsllchten FaIle dieser Art ist das Vorkommen der Azetidin-2carbonsaure. An diesem Beispiel sind erstmals die Beziehungen zwischen dem Vorkommen einer Aminosaure und der taxonomischen Stellung der diese Verbindung enthaltenden Pflanzen eingehend gepriift worden. FOWDEN und STEWARD (1957) finden die Azetidin-2-carbonsaure nur in einigen Liliaceen, Agavaceen und AmaryIlidaceen. Innerhalb der Liliaceen kommt sie nur in etwa einem Viertel der untersuchten 89 Arten vor. Obwohl ein groBer Teil dieser Azetidin-2-carbonsaure-Pflanzen sich folgerichtig ·in das von FOWDEN und STEWAHD verwendete System von ENGLER und PRANTL (1930) einordnen lassen, traten in einigen Fallen Pflanzen auf, die die Verbin dung enthielten und nicht in dieses System paBten. In anderen Pflanzen konnte diese Verbindung nicht gefundcn werden, obwohl sie nach dem System dicht neben Azetidin -2-carbonsaure-Pflanzen stehen. Ganz ahnliche Verhaltnisse sind aus den mitgeteilten Ergebnissen der Untersuchungen liber die Verteilung des Canavanins zu ersehen. In 30 der untersuchten 68 Papilionaceen-Gattungen konnte Canavanin in zum Teil sehr groBer Menge nachgewiesen werden. Bei der Anordnung der untersuchten Pflanzen nach dem System von ENGLER und PR.\l\TL (s. Tabelle) fallt auf, daB die Sophoreae, Genisteae und Tabelle 1 Ubersicht liber das Yorkomn\en von Canavanin in den Samen einiger Papilionaceen. Angaben in mg Canavanin/1 g Trockengewicht. Sophoreae Sophora japonica Sophora speciosa Ammodendmn conolly Cladrastis ltttra . Genisteae Lupinus lulrus Lupinus albus Lupinus angustifolius Lupinus mulabilis Sparlium junceum. Genista europaea Genisla tinc/oria.. Genista ovala . Pelteria ramen/acea Laburnum alpinum Laburnum vulgare. Ulex europaeus . Cytisus supinus Cytisus purpureus Cytisus nigricans Sal'Otharnnus scoparius.
Trifolieae Ononis spinosa Ononis repens. Trigonella foenum graecum Medicago falcala Medicago sativa. Medicago lupulina Medicago pros/rala Medicago media Melilotus albus Melilotus dentata Melilotus officinalis . Trifolium pannonicum. Trifolium pratense Trifolium repens Trifolium incarnatum Trifolium alpinum Loteae Anthyllis vulneraria . Anthyllis barva J ovis Dorycnium erectum Dorycnium hirsutum.
4,73 5,42 3,48 14,33 16,27 13,95 15,05 14,73 4,55 3,82 3,96 14,03 14,68 12,62 13,05 14,22 20,50 21,16 24,05 23,86
B. Lotus cornicula/us La/us /etragonolobus Lotus siliquosus.
TSCHIEHSCH
14,95 14,33 12,87
Galegeae I ndigotera gerardiana Indigofera tine/oria Psora len bitllminosa . AmoTpha frucl'iosa. Amorpha ]Janiculata Amorpha. Amorpha. Dalea alopccuroides Dalea nana. Galega officinalis Tephrosin t'irginiana 211 illetia atTOpur]lurea 2"1 iUe/ia cmeTea . Robinia ]Jseudacaeia Robinia glutinosa Robinia hispida . Sutherlnndia frutescens. Swainsonia galegifolin Smirnowin turees/m7a {Jolutea arboreseens Colutea orientalis Coln/ca media Coln/ea ciliciC({ Coluten persim lIalirnodendron argenteu1l! Caragana arborescens Caragana fndeseens Caragann pygmaea Cnragana mierophylla Caragana brevispina Calophacl! wolyarien . Astragll Ius eieer Astragnilis ylyeiphyllos OXy/TOpis mmpcstris Glyeyrrhl:za ylabm. Glyeyrrhiza cchinata .
8,45 14,17
3,58 2,32 1,7G 35,60
32,44 32,96 13,30 10,25 41,J7 3G,82 36,9J
38,OJ 36,22 4,27 38,20 39,20
38,33 34,07 36,U2 20,96 9,49 14,G7
23,83 20,1G
HedysaHac Scorpiurus 1I7nrieatus Ornithojins slIlivus Omi/ho }ln8 perpu sillus {Joronilla I'arw CoronilllJ, coronll/a C:oronilla vayinal'is lIi}J1JOC1"eVis ('011708((
17,88 13,32 12,32 lU,50 2G,3G 18,H3 4,07
Hedysarll1n obsCllrwlt Hedysllr1l1n CIIpita/wli Onobrycilis s(J,i'ira Ebemls eretiea A lhayi 1"izyliisonml Aesch inomenr indil'll Al"lu1!is hypogllca Desllwdiurn call1/denS'I'8. Lourca rrs]lrr/iliolli." LespedezlI bieolor LesJiedeza macroN! rpll Lesj!edl'ZI! seriel'lI Viciaeap Cicer af'iel'illllill F ieil1 sa/iull Ficia eil/osl! Fieia {aba V1'cia II frojJ 11 f}11I 1"1'1/ Lens 1'8culellta LatltYfll" lal1fol'ills La/hyrus or/oratlls , Lathyrus pratens!:; La/hyrus /uberosis, Pisu 117 sa/inon Abrus jil'ecaiorills
H),B8 H,21
18,H9
15,60 3,74 3,86 2,09
Phaseoleae Glycine hisjJida , Kennedya pros/rata. Kennedya c?ccinca ETy/hrina crista. yalli Apios tubcrosa. Apios arnenealllt Mucuna pruricns 211uemln utilis ~v111elllut deeringialla , Pueraria phaseoloides CanaL'alia ens'i{ormis Canamlia ylndt'atn Cajanus indiClls. Rhynchosia pyramidalis Phaseolus nwltiflorus Phaseolus luna/us, Phaseolnswlyaris, Phaseolus munyo Fignn cylinilrim Viyna :;inrnsis Dolichos lab-lab. Doliehos bif70rus
18,23 H,9?
3H.H2 3G,53
tbrr das Y" orkommen von Canavanin
Vil:iuccte kein Canavanin en thai ten. AIle untersuchten Gattungen der Trifolieae und Loteae fiihren dagl'gen Canavanin. Uniibersichtlich werden die Verhaltnisse bei der Betrachtung der Oalegeae, Hedysureae und Phuseoleae. Es finden sich hier die typischen Canavan in-Pflanzen dicht neben Gattllngen, die diese Verbindung nicht enthalten. Abschliel3end lal3t sich liber das Vorkommen des Canavanins feststellen, daB die bisher nur in Papilionaceen und nUl" als freie Aminosaure nachgewiesene Verbindung nicht gleichmal.lig tiber dil'se Familie verteilt ist. Neben Canavanin-fiihrenden Gruppen von Pflanzen sind Canavanin-freie vorhanden, die jedoch keine Gesetzmal3igkeit in der Verteilung iiber das System der Papilionaceen erkennen lassen. Dieses Ergebnis stimmt grundsatzlich mit den von FowDEN und STEWARD (1957) iiber die Verbreitung von Azetidin-2-carbonsaure in Liliaceen mitgeteilten Beobachtungen iiberein. Die Untersuchungen reichen natiirlich nicht aus, eine Entscheidung dariiber zu fii·llen: 1. ist Canavanin "'irklich nUl" fiir Papilionaceen charakteristisch, was bis jetzt wahrscheinlieh ist, 2. sind dio Cananmin-freien und die Canavanin-haltigcn Taxa wirklich generell "frei" oder "haltig', oder wiirden ,Yeitere Untersuchungen Ausnahmen ergeben, 3. wiirden Untersuchungen ,"erschiedenor Herkiinfte derselben Spezies ein un torschiedliches ehemiselws Yl'rhaltl'n ergl'ben (Existenz von chemischell Hassen). Diesl' Analysl'n stdll'l1 l'iIll' wesentlic}ll' Erweiterung unserer Kenntnisse zur Phytochemie des Camtyanin~ dar. Trotzdem darf man nieht iibersehen, dal.l das vorgelegte ::Vlaterial zahlenmal.lig reeht bescheiden ist im Verhaltnis zum Gattungsund Artenreiehtum der Papilionaceen. Es \yjrd bestiitigt, dafS Canavanin {'in eharakteristiseher, obwohl nie ht verbindlieher Stoff der Papilionaeeen ist; er ist systematisch noch weniger ,-erbindlich als etwa das Merkmal "FiederbIatter". Die Verteilung des Canavanins innerhalb der Familie liiBt wohl einigo Besonderhoitm erkennen, die aber ohne gezwungene Deutungen nieht taxonomisch begriindbar sind. Vielmehr scheint zunaehst griil.lte Vorsicht am Platze, ,-on einem strengen systematisehen \Vert dieser \'erbindung zu sprechen. Zusammenfassung
Es wurde ein griH3eres 80rtiment von Leguminosensamen auf CanC1vanin untersucht. Dabei wurde diese Aminosaure nur in Papilionaceen, nieht aber in Mimosaeeen und Caesalpiniaceen gcfundl'n. Von 68 untersuchten Gattungen weisen 30 eine zum Teil sehr hohe Can
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B. TS('ITIEI{S!'TI, ther das Yorkommen von Canavanin
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