Bestimmung der relativen Natriumpermeabilität von Maiskoleoptilenzellen aus elektrophysiologischen Messungen

Biochem. Physiol. Pflanzen 171, S. 55-62 (1977)

BioI.

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NELLES

Institut fur Biochemie der Pflanzen Halle (Saale), Forschungszentrum fur Molekularbiologie und Medizin der Akademie der Wissenschaften der DDR

Estimation of the Relative Sodium Permeability of Com Coleoptile Cells by Electro,; physiological Measurements Key Term Index: membrane potential, permeability, sodium and calcium ions, electrophysiological determination, coleoptile, indoleacetic acid; Zea mays.

-309

Summary LI E' The sodium-induced relative drop of the membrane potential - - in corn coleoptile cells

mylase

56 p. with

. 234,

EA

depends on the ionic strength as well as on the calcium ion content of the exchange medium. The drops follow linear logarithmic curves. The same situation is true for the potassium-induced drops. From these experimental findings a formula is derived which allows to calculate directly the relative sodium permeability PN&: P K. This permeability correlates with the sodium and potassium ion concentrations of the medium and maintains at the same level, if proper calcium ion concentrations (0.1 to 1.5 mM) are present. Preincubation of the coleoptiles for 16 h with 10-5 M indoleacetic acid led to a decrease of the relative sodium permeability due to an increased potassium permeability because the sodium-induced drop of the membrane potential remains unaffected.

dung,

Zusammenfassung

1963). gamon

Die durch eine Erhiihung der Natriumionenkonzentration im Medium hervorgerufene relative LIE' Potentialanderung - - hangt linear einerseits vom Logarithmus der Ionenstarke, andererseits

rthing

vom Logarithmus der Kalziumionenkonzentration des Mediums abo Gleiches gilt auch fUr eine durch die Erhiihung der Kaliumionenkonzentration des Mediums ausgeliiste relative Potentialerniedrigung (NELLES 1975). Aus diesen experimentellen Befunden wird eine einfache Beziehung abgeleitet, aus der unmittelbar die relative Natriumpermeabilitat berechnet werden hnn. Es zeigt sich, daB diese wider Erwarten von der Konzentration der Natrium- und Kaliumionen im Medium abhangt, von Kalziumionen hingegen wenig beeinfluBt wird. Eine 16stundige Inkubation des Gewebes mit 10-5 M Indolylessigsaure bewirkt eine Erhiihung der Kaliumpermeabilitat, andert die Natriumpermeabilitat dagegen nicht.

EA

Nauk

.

ratory,

Einleitung

Pflanzenzellen reagieren auf eine Anderung des Ionenmilieus des umgebenden Mediums gewohnlich durch eine Anderung der elektrischen Potentialdifferenz zwischen Medium und ZelIinnerem. Ein allgemein gtiltiger analytischer Ausdruck flir den Zusam4a*

56

A.

NELLES

menhang zwischen diesem Zellpotential und den Ionenkonzentrationen ist bisher nicht gefunden worden. Unter gewissen Bedingungen laJ3t sich dieser Zusammenhang durch eine von GOLDMAN 1943 abgeleitete und spater fUr die einwertigen Ionen Natrium, Kalium und Chlorid spezifizierte Gleichung anniihernd richtig beschreiben. Voraussetzung fUr die Anwendung dieser Gleichung ist u. a. die Kenntnis der intrazellularen und extrazellularen Konzentrationen dieser Ionen sowie der Relationen, in denen die Permeabilitaten der Zellmembran fUr diese Ionen zueinander stehen. Die experimentelle Bestimmung dieser Werte stoJ3t jedoch auf erhebliche Schwierigkeiten. Dies betrifft insbesundere die Messung der relativen Permeabilitaten. In einer vorangegangenen Publikation (NELLES 197fi) wurde gezeigt, daJ3 eine Erhohung der Kaliumionenkonzentration im Medium bei Zellen von Maiskoleoptilen zu einer Depolarisation fiihrt. Dabei ist die auf das Zellpotential in der AusgangslOsung LIE bezogene relative Potentialerniedrigung EA dem Logarithmus der Ionenstii.rke des Mediums proportional. Der zugehOrige Proportionalitatsfaktor kCa ist selbst eine Funktion der Kalziumionenkonzentration des Mediums, bei festgesetzter Kalziumionenkonzentration jedoch konstant. Das Ziel dieser Arbeit war zu priifen, ob auch im Falle einer durch Natriumionen ausgelOsten Depolarisation ahnlich einfache Relationen gelten. Da dies der Fall ist, konnte ein Formalismus abgeleitet werden, der die Berechnung der relativen Natriumpermeabilitat aus den Depolarisationseffekten gestattet. Material und Methoden Keimlinge einer zwergwiichsigen (dIdd) bzw. einer normalwiichsigen (dINN) Mutante von Zea mays L. wurden im Dunkeln im Erdbett angezogen und Koleoptilensegmente wie hiiher beschrieben priipariert. Die Gewebestiicke wurden dann 16 Stunden bei Zimmertemperatur in der Ausgangsliisung (Index A) (1,0 ml\I KCl; 0,1 mM NaCl, wo angegeben Ca(N0 3 )2 und gegebenenfalls 10- 5 M IES) inkubiert. Zur Messung der Potentialiinderung bei einer Konzentrationsiinderung des Mediums wurde eine Glasmikropipette (Spitzendurchmesser ca. 1.um, Tip-Potential kleiner 3 m V) in eine Zelle der inneren Epidermis eingestochen und das Zellpotential iiber einen Gleichspannungsverstiirker (Eingangswiderstand ca. 1014 Ohm) auf einem Kompensationsschreiber registriert. N achdem sieh das Zellpotential nach dem Einstich stabilisiert hatte (ca. 1 min), wurde bei eingestochener Mikroelektrode das AuJ3enmedium gegen eines ausgetauscht, welches neben den Bestandteilen der jeweiligen Ausgangsliisung 20 mM NaN0 3 enthielt. Die natriuminduzierte Depolarisation kann so unmittelbar registriert werden. Aus jeweils etwa 12 Einzelmessungen wurde der Mittelwert gebildet.

Ergebnisse und Diskussion

Eine ErhOhung der Natriumionenkonzentration im AuJ3enmedium fUhrt ebenso wie die Erhohung der Kaliumionenkonzentration zu einer Abnahme der elektrischen Potentialdifferenz zwischen der Vakuole von Maiskoleoptilenzellen und dem Medium. Diese Potentialanderungen konnen unmittelbar verfolgt werden, wenn eine in die Zelle eingestochene Mikroelektrode wahrend der Konzentrationsanderung des Mediums in der Zelle verbleibt. In friiheren Publikationen (NELLES 1975, 1976) konnte gezeigt werden, Abkiirzungen: IES,

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Natriumpermeabilitiit in Maiskoleoptilenzellen

57

da./3 zwischen den auf das Zellpotential in der AusgangslOsung bezogenen relativen PoLIE tentialanderungen E A und dem IonenmiIieu einfache Beziehungen bestehen. Diese relativen Potentialanderungen stehen in einem logarithmisch-linearen Zusammenhang sowohl mit der Ionenstarke der AustauschlOsung als auch mit dem Kalziumgehalt der Medien. . Dies trifft auch fUr eine Anderung der Natriumionenkonzentration zu. Auch in diesem Falle konnen diese Zusammenhange durch die Gleichungen beschrieben werden:

LIE' = EA

LIE' l' EA = k' Ca • log IA (I) und

-

(X' •

log Ca

+ B'

(II)

worin I' bzw. IA die Ionenstarke der Austauschlosung bzw. der AusgangslOsung sind. Die Kennzeichnung (') bedeutet, da.13 sich die jeweiligen Gro.l3en auf eine Anderung der Natriumionenkonzentration beziehen. Bei einer ErhOhung der Natriumionenkonzentration von 0,1 mM in der AusgangsWsung auf 20 mM in der Austauschlosung ergeben sich aus den experimentellen Werten (Abb.1) nach Ausgleichsrechnung (Methode der kleinsten Fehlerquadrate) fUr die Konstanten (x' = 0,0927 und B' = 0,1468 Dabei ist festzustellen, da.13 eine 16stiindige Vorinkubation des Gewebes mit 10--5 M Indolylessigsaure (IES) keinen Einflu.13 auf die relative Potentialanderung ausiibt. Daraus ist zu schlie.l3en, da.13 die Permeabilitat der Membran fUr Natriumionen durch IES nicht beeinflu.l3t wird. Unter Verwendung der Konstanten (x' und B' kann aus den Gleichungen (I) und (II) der Wert von k' Ca fUr jede beliebige von Null verschiedene Kalziumkonzentration berechnet werden (Abb.2). Dabei zeigt sich, da./3 k' Ca wie auch die entsprechende

0,2ij.£'

7A

t

0,1

-0.3

DO.

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- - log [Cal (mM)

1.0.

Abb. 1. Abhiingigkeit der durch Natrium induzierten relativen Potentialerniedrigung von der Kalziumionenkonzentration des Mediums in Zellen von Maiskoleoptilen. (e) Mutante d1dd; (0) Mutante d1dd nach 16 stiindiger Vorinkubation mit 10-5 M IES; CA.) Mutante dlNN.

58

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NELLES

GroBe kCa (bei einer Anderung der Kaliumionenkonzentration) mit steigendem Kalziumgehalt der Medien zunachst stark abnimmt, bei etwa 0,5 mM ein Minimum durchIauft und danach ansteigt. Aus den frtiher beziigIich der kaJiuminduzierten und hier beziiglich der natriuminduzierten Potentialanderungen festgestellten Sachverhalten kann auf einfache Weise die relative PermeabiIitat aus meBtechnisch unschwer zugangIichen elektrophysiologischen Daten berechnet werden. Dazu wird zunachst der von GOLDMAN (1943) abgeleitete und fUr die Natrium-, Kalium- und ChIoridionen spezifizierte theoretische Ansatz (III) fUr das Membranpotential in einem Nicht-Gleichgewichtssystem RT PK· [K]a A + P Na · [Na]a A + PC!· [Cl]iA EA = - . In (III) F PK . [K]i A + P Na . [Na]i A + PC! . [CI]a A (worin Pi die absoluten PermeabiIitaten fUr die Ionensorte i und [i]a A bzw. [i]iA die Konzentrationen der Ionensorte i im Zellinneren bzw. in der AuBenlosung sind), fUr die eXJ)erimentellen Bedingungen angepaBt. Unter der Annahme, daB wahrend des AusL1E ta,usches der AuBenlosung und der Messung von E A' fUr die etwa 2 min benotigt werden, die Ionenkonzentration im ZeIIinneren ungeandert bleibt, kann geschrieben werden:

und (V)

(worin [K] bzw. [Na] die entsprechenden Ionenkonzentrationen im Austauschmedium sind). In (IV) bzw. (V) sind die Ionenkonzentrationen [K] bzw. [Na] der Austauschmedien zunachst wiIlkiirlich wahlbar.

0,24 It!ca

t

-1 .2 3- .;. -

5- 0

konz,Ca [mM}

Abb.2. Abhiingigkeit des Proportionalitiitsfaktors It' Ca der Gl. (1) von der Kalziumkonzentration des Mediums.

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Natriumpermeabilitat in Maiskoleoptilenzellen

m-

.uft

mise logeatz

Wahlt man jedoch die Natriumkonzentration des Austauschmediums gerade so, da.13 die natriuminduzierte Depolarisation LI E' gleich derjenigen ist, die man durch eine bestimmte ErhOhung der Kaliumionenkonzentration erzielt, dann gilt: LlEK

tigt

ben

(VI)

Fiir diesen Fall sind [K] und [Na] nicht mehr unabhangig voneinander, sondem stehen zueinander in einer festen Relation. Unter der Bedingung (VI) folgt aus (IV) und V) nach leichter Zwischenrechnung [K] - [K]a A [Na] - [Na]a A

III)

die die Aus-

= LIE'

LI K

(VII)

LlNa

worin [K] bzw. [Na] diejenigen Konzentrationen der Austauschmedien sind, bei denen gleichgro.l3e Potentialanderungen eintreten. Aus der Gleichung (VII) geht hervor, da./3 der Quotient fUr jedes beliebige Wertepaar konstant und gleich der relativen Natriumpermeabilitat sein solIte. Mit Hilfe des friiher (NELLES 1975) fUr die ka.Iiuminduzierte und hier fiir die natriuminduzierte Depolarisation entwickelten empirischen Formalismus ist die Bestimmung der [Na]-[K]-Wertepaare der Gleichung (VII) leicht moglich. Danach ist:

IV)

LI E K

IK = EA· kca . log IA

und (V)

ium

l' LIE' = EA· k'ca ·log-

IA

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10-dk!mMj 20

Abb.3. PermeabiZitiitsverhiiltnis P Na : PH: in Koleoptilenzellen einer zwergwiichsigen Maismutante d-rdd als Funktion der Kaliumionenkonzentration im Medium. A, ohne Zusatz von IES B, nach 16stu.ndiger Inkubation mit 10-5 M IES.

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woraus flir den Fall, da13 LI Ex = LI E' ist, folgt: l' kca Ix log- = - · l o g IA k'ca IA

(VIII)

In der Tabelle 1 ist der Quotient kca/k' Ca flir verschiedene Kalziumkonzentrationen der Medien zusammengestellt. Tabelle 1. Quotienten kcs/k' CR fiir einige KaJziumkonzentrationen des Mediums

[Cal (mM)

kca/k'ca

0,05 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 6,0

1,7512 1,6827 1,7479 1,8289 1,9969 2,1114 2,2512 2,3469

Aus (VIII) kann flir jeden vorgegebenen Wert der Ionellstarke Ix einer kaIiumhaltigell Austauschlosung die Ionenstarke I' derjenigen natriumhaltigen Austauschlosung berechnet werden, mit der eine der kaliumillduzierten Depolarisation LI Ex gleiche natriumillduzierte Depolarisation LI E' zu erzielen ware. Aus der Definition der Ionenstarke 1 I = - . 2: Z2i • [i]

2

i

ergeben sich nun leicht die gesuchtell Werte: Ix - IA = LI K und l' - IA = LI Na Damit kanll (VII) geschrieben werden: PNa Ix - IA LlK (IX) Pk l' - IA LlNa wobei l' durch die Bestimmungsgleichung (VIII) mit Ix verknupft ist .. Tragt man (Ix - I A) gegen (1' - IA) in rechtwinkligen Iinearen Koordinaten auf, so sollte flir jede festgesetzte Kalziumkonzentration eine Gerade erwartet werden, deren Anstieg gleich der relativen Natriumpermeabilitat ist und deren Abweichungen voneinander den Einflu13 der Kalziumionen auf die Natriumpermeabilitat widerspiegeln sollten. Dies ist jedoch nicht der Fall. Die relative Natriumpermeabilitat, d. h. das Verhaltnis von P Na : P K , ist eine Funktion der Natrium- bzw. Kaliumionenkonzentration des Mediums (Abb. 3). Flir eine Losung mit 5 mM K+ ergibt sich ein Permeabilitatsverhaltnis von 0,35. Dieser Wert steht in gutem Einklang mit demjenigen von 0,4 bei Gerstenwurzeln (PITMAN et al. 1975). Es mu13 geschlossen werden, da13 sich die Eigenschaften der Membran, die das Verhaltnis der Na : K-Permeabilitat bestimmen, den jeweiIigen Konzentrationsverhaltnissen anpassen. Mit steigenden Ionenkonzentrationen im Medium nimmt

Natriumpermeabilitat in Maiskoleoptilenzellen

II)

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IX)

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das ionsmmt

61

die relative Natriumpermeabilitat abo Dies konnte bedeuten, da.13 entweder die absolute Kaliumpermeabilitat ansteigt oder die absolute Natriumpermeabilitat sinkt. Moglich ware allerdings auch die gleichzeitige Anderung der beiden absoluten Permeabilitaten in einer solchen Relation zueinander, da.13 die relative NatriumpermeabiIitat absinkt. Vberraschend ist auch der weitgehend fehlende Einflu.13 von Kalziumionen auf das PermeabiIitatsverhii.1tnis in den Zellen der zwergwtichsigen Koleoptilen. In einem Konzentrationsbereich von 0,05 mM bis etwa 2 mM Ca(NOs)z wird dieses Permeabilitatsverhii.1tnis praktisch nicht beeinflu.l3t (Abb.3A). Daher kann die Wirkung der Kalziumionen auf das Membranpotential, die gerade in diesem Konzentrationsbereich besonders ausgepragt ist (NELLES 1976), nicht auf eine Wechselwirkung der Kalziumionen mit der Membran, in deren Folge die Permeabilitatsverhaltnisse drastisch geandert werden, zumckgeflihrt werden. Eine 16sttindige Vorinkubation der Koleoptilen der Zwergmutante mit 10-5 M Indolylessigsaure hat auf die durch Natriumionen hervorgerufene Depolarisation keinen Einflu.13 (Abb.1). Daher kann aus den Werten von k' Ca und den fmher unter IES-Einflu.13 gemessenen Werten von kCa (NELLES 1976) in analoger Weise die relative Natriumpermeabilitat P Na : P K berechnet werden (Abb. 3B). Auch unter dem Einflu.13 dieses Wachstumsregulators ist das PermeabiIitatsverhii.ltnis von den Ionenkonzentrationen abhii.ngig. Kalziumionen bleiben in einem noch breiteren Konzentrationsbereich ohne Wirkung. Gegentiber dem unbehandelten Gewebe sind die PermeabiIitatswerte bei vergleichbaren Ionenkonzentrationen erniedrigt. Da aber die relative Potentialanderung, die durch Natriumionen hervorgerufen wird, nicht auf die IES-Behandlung anspricht, mu.13 geschlossen werden, da.13 die absolute Kaliumpermeabilitat, nicht aber die absolute NatriumpermeabiIitat beeinflu.l3t wird. Es mu.13 folglich die KaliumpermeabiIitat durch Inkubation mit IES erhOht werden. In analoger Weise kann auch das Permeabilitatsverhii.1tnis flir die normalwtichsige Mutante d1 NN berechnet werden. Es zeigt sich, da.13 sich in diesem Fall ein deutlicher Einflu.13 der Kalziumionen bemerkbar macht. Dies ist insofern bemerkenswert, als der native Kalziumgehalt in den Koleoptilen der zwergwtichsigen Form mehr. als doppelt so hoch istwie derjenige der Koleoptilen der normalwtichsigen Form (MULLER et 801.1974). Zur Bestimmung des PermeabiIitatsverhii.1tnisses P Na: P K aus elektrophysiologischen LIE Daten ist es ledigIich notwendig, die relative Potentialanderung EA bei zwei von

.

Null verschiedenen Kalziumkonzentrationen zu messen. Dabei mu.13 die Potentialii.nderung jeweils dumh eine ErhOhung der Natrium- und der Kaliumkonzentrationen separat ausgelOst werden. Insgesamt benotigt man also 4 Me.l3werte. Aus diesen kann dann das Permeabilitatsverhaltnis P N&: P K ftir jede beliebige von Null verschiedene Kalzium-, Natrium- und Kaliumionenkonzentration des Mediums berechnet werden. Dies dtirfte gegentiber der Methode der Messung von Fluxkinetiken von Radionuklidell ein betrachtlicher Vorteil sein. Frau E.

LASKE

danke ich fiir die sorgfaltige Assistenz bei den experimentellen Arbeiten.

6 Bioohem. Physiol. Pflanzen. Bd. 171

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A. NELLES, Natriumpermeabilitat in Maiskoleoptilenzellen

Literatur GOLDMAN, D. E., Potential, impedance, and rectification in membranes. J. Gen. Physiol. 27, 37-60 (1943). MULLER, E., NIEDEN, U. ZUR, NELLES, A., Zwergwuchs und Ionenhaushalt bei Mais (Zea mays L.). , Biochem. Physiol. Pflanzen 160, 505-516 (1974). NELLES, A., Das Membranpotential von Zellen der Maiskoleoptile unter dem EinfluB von Kaliumund Kalziumionen. 1. Empirische Gleichungen. Biochem. Physiol. Pflanzen 167, 541-552 (1975). - Das Membranpotential von Zellen der Maiskoleoptile unter dem EinfluB von Kalium- und Kalziumionen. II. Effekt von Gibberellinsaure und Indolylessigsaure. Biochem. Physiol. Pflanzen 169, 385-391 (1976). PITMAN, M. G., SCHAEFER, N., und WILDES, R. A., Relation between permeability to potassium and sodium ions and fusicoccin-stimulated hYdrogen-ion efflux in barley roots. Planta (Berlin) 126, 61-73 (1975). Eingegangen 19. August 1976. Anschrift des Verfassers: Dr. AXEL NELLES, Institut fur Biochemie der Pflanzen der AdW, DDR - 401 Halle/Saale, Weinberg.